CN109932224A - 一种富集提取循环肿瘤dna的方法 - Google Patents

一种富集提取循环肿瘤dna的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109932224A
CN109932224A CN201711366365.6A CN201711366365A CN109932224A CN 109932224 A CN109932224 A CN 109932224A CN 201711366365 A CN201711366365 A CN 201711366365A CN 109932224 A CN109932224 A CN 109932224A
Authority
CN
China
Prior art keywords
circulating tumor
tumor dna
enrichment
extracted
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711366365.6A
Other languages
English (en)
Inventor
梁鑫淼
李秀玲
张小菲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Original Assignee
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian Institute of Chemical Physics of CAS filed Critical Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority to CN201711366365.6A priority Critical patent/CN109932224A/zh
Publication of CN109932224A publication Critical patent/CN109932224A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Abstract

本发明提供了一种富集提取循环肿瘤DNA的方法，属生物技术领域。本发明具体步骤如下：1)将循环肿瘤DNA富集材料装入移液枪枪头或者凝胶上样吸头中，形成微固相萃取柱，采用洗脱液和上样液活化及平衡微固相萃取柱，将生物样品溶解于上样液中，并上样到微固相萃取柱上，循环肿瘤DNA富集材料与生物样品的质量比为100‑1000:1；2)采用5‑200倍柱体积的淋洗液冲洗萃取柱，3)采用5‑100倍柱体积的洗脱液洗脱得DNA；上述整个过程在10‑60℃进行。所述循环肿瘤DNA富集材料为双组分聚合物功能化材料。本发明方法在提取循环肿瘤DNA方面表现出了高选择性和高通量等特点，可以实现对循环肿瘤DNA的有效分离和富集。

Description

一种富集提取循环肿瘤DNA的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种富集提取循环肿瘤DNA的方法。
背景技术
循环肿瘤DNA，即ctDNA(circulating tumor DNA)，是指肿瘤细胞经过细胞凋亡或者坏死产生的DNA片段释放进入循环系统。ctDNA存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液中。由于ctDNA半衰期为1小时左右，能准确反映肿瘤当前情况，所以ctDNA可以作为组织活检的非侵入性替代方案。另外，ctDNA在癌症早期诊断、预后和测定药物治疗反应中发挥作用。
目前主流的ctDNA突变检测技术包括基于PCR扩增技术和基于DNA序列检测技术两类。但是不管哪种测序技术，都需要都对DNA进行富集和提取，以降低对扩增或者后续测序的干扰。
ctDNA的主要提取方法主要是基于硅球、磁性小球的固相萃取方法和基于苯酚-氯仿的液液提取方法。主要问题是提取效率和重现性。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种富集提取循环肿瘤DNA的方法。
一种富集提取循环肿瘤DNA的方法，采用柱固相萃取模式，具体步骤如下：
1)将循环肿瘤DNA富集材料装入移液枪枪头或者凝胶上样吸头中，形成微固相萃取柱，采用洗脱液和上样液活化及平衡微固相萃取柱，将生物样品溶解于上样液中，并上到微固相萃取柱上，循环肿瘤DNA富集材料与生物样品的质量比为100～1000:1；
2)采用5-200倍柱体积的淋洗液冲洗萃取柱，淋洗液pH 0-7；
3)采用5-100倍柱体积的洗脱液洗脱得循环肿瘤DNA，洗脱液pH 10-12；
上述整个过程在10-60℃进行。
所述循环肿瘤DNA富集材料为双组分聚合物功能化材料。
所述双组分聚合物功能化材料，其结构如下：
其中R为羧基、硝基、甲基、甲酸乙酯基或氢；X＝0.01-0.5。
所述双组分聚合物功能化材料基底的材料为Si、Cu、Ag、Au、Pt、CuO、Fe3O4、多孔SiO2、多孔Al2O3、多孔TiO2或多孔ZrO2中的任意一种或者两种以上任意比例的混合。
所述双组分聚合物功能化材料的制备方法为：利用原子转移自由基聚合反应机制，将双组分功能共聚物接枝到无机半导体或金属或金属氧化物表面上，获得智能响应性聚合物功能表面；所述的无机半导体为Si或SiO2，所述的金属为Au、Ag或Pt，金属氧化物为CuO、Al2O3、TiO2、ZrO2或Fe3O4。
所述双组分聚合物功能化材料的制备方法具体为：在25mL的烧瓶中依次加入0.4mmol异丙基丙烯酰胺，0.1mmol的硫脲功能单体，二者摩尔比为4：1，同时加入6mL H2O以及6mL DMF作溶剂；在搅拌下通入氮气，待单体充分溶解之后，在氮气保护下加入催化剂CuBr 0.032g以及PMDETA或联吡啶配体0.16mL，随后反应体系抽真空—充氮气，除去反应体系中残余的氧气；将溴化处理过的Si,、SiO2、Au、Ag、Pt、CuO、Al2O3、TiO2、ZrO2或Fe3O4浸入配置好的反应溶液；将烧瓶的温度控制在60℃静置反应4—6小时；反应结束后用DMF，H2O依次洗涤聚合物接枝表面，得到双组分共聚物。此双组分共聚物的功能化表面的厚度为10-50nm，氮气吹干表面后置于真空干燥器中备用。
所述硫脲功能单体结构式为：
所述双组分聚合物功能化材料材料的粒径是0.2-50μm,孔径为
所述生物样品为血液、滑膜液、脑脊液或尿液。
所述上样液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇；有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，所述上样液中有机溶剂体积为10-50％，pH 0-7。
所述洗脱液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇；有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，所述洗脱液中有机溶剂体积为10-50％，pH 10-12。
所述淋洗液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇；有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，所述淋洗液中有机溶剂的体积为0-50％，pH 0-7。
本发明的有益效果为：本发明方法在提取循环肿瘤DNA方面表现出了高选择性和高通量等特点，可以实现对循环肿瘤DNA的有效分离和富集。
具体实施方式
实施例1
双组分聚合物功能化材料如下：
其中R为羧基、硝基、甲基、甲酸乙酯基或氢；X＝0.01-0.5。
本发明中，基底的材料为Si、Cu、Ag、Au、Pt、CuO、Fe3O4、多孔SiO2、多孔Al2O3、多孔TiO2或多孔ZrO2中的任意一种或者两种以上任意比例的混合。
以X＝0.2为例，在25ml三口烧瓶中依次加入0.4mmol异丙基丙烯酰胺，0.1mmol的硫脲功能单体，二者摩尔比为4:1，同时加入6mL去离子水以及6mL DMF作溶剂；在搅拌下通入氮气，待单体充分溶解之后，在氮气保护下加入催化剂CuBr 0.032g以及联吡啶类配体0.16mL，随后反应体系抽真空—充氮气，除去反应体系中残余的氧气；将溴化处理过的基底浸入配置好的反应溶液；将烧瓶的温度控制在60-80℃静置反应4-24小时；反应结束后用N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)和去离子水依次洗涤聚合物接枝表面，得到循环肿瘤DNA富集材料，此循环肿瘤DNA富集材料表面双组分共聚物膜的厚度为10-80nm，氮气吹干表面后置于真空干燥器中备用。
在本实施例中，选用的基底材料为硅胶，其结构式为：
实施例2
一种富集提取循环肿瘤DNA的方法，采用柱固相萃取模式，所述循环肿瘤DNA富集材料采用实施例1制备的双组分聚合物功能化材料，具体步骤如下：
1)将循环肿瘤DNA富集材料装入移液枪枪头或者凝胶上样吸头中，形成微固相萃取柱，采用洗脱液和上样液活化及平衡微固相萃取柱，将生物样品溶解于上样液中，并上到微固相萃取柱上，循环肿瘤DNA富集材料与生物样品的质量比为1000:1；
2)采用5-200倍柱体积的淋洗液冲洗萃取柱，淋洗液pH 0-7；
3)采用5-100倍柱体积的洗脱液洗脱得DNA，洗脱液pH 10-12；
上述整个过程在10-60℃进行。
所述上样液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙醇；有机酸为三氟乙酸，所述上样液中有机溶剂体积为10-50％，pH 0-7。
所述洗脱液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙醇；有机酸为三氟乙酸，所述洗脱液中有机溶剂体积为10-50％，pH 10-12。
所述淋洗液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙醇；有机酸为三氟乙酸，所述淋洗液中有机溶剂的体积为0-50％，pH 0-7。
经过标准品评价，经过才DNA富集材料提取后，DNA的提取回收率是83％，覆盖度是85％。
实施例3
一种富集提取循环肿瘤DNA的方法，采用柱固相萃取模式，所述循环肿瘤DNA富集材料采用实施例1制备的双组分聚合物功能化材料，具体步骤如下：
1)将循环肿瘤DNA富集材料装入移液枪枪头或者凝胶上样吸头中，形成微固相萃取柱，采用洗脱液和上样液活化及平衡微固相萃取柱，将生物样品溶解于上样液中，并上到微固相萃取柱上，循环肿瘤DNA富集材料与生物样品的质量比为1000:1；
2)采用5-200倍柱体积的淋洗液冲洗萃取柱，淋洗液pH 0-7；
3)采用5-100倍柱体积的洗脱液洗脱得DNA，洗脱液pH 10-12；
上述整个过程在10-60℃进行。
所述上样液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈；有机酸为甲酸；所述上样液中有机溶剂体积为10-50％，pH 0-7。
所述洗脱液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈；有机酸为甲酸，所述洗脱液中有机溶剂体积为10-50％，pH 10-12。
所述淋洗液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈有机酸为甲酸，所述淋洗液中有机溶剂的体积为0-50％，pH 0-7。
经过标准品评价，经过才DNA富集材料提取后，DNA的提取回收率是83％，覆盖度是85％。
实施例4
一种富集提取循环肿瘤DNA的方法，采用柱固相萃取模式，所述循环肿瘤DNA富集材料采用实施例1制备的双组分聚合物功能化材料，具体步骤如下：
1)将循环肿瘤DNA富集材料装入移液枪枪头或者凝胶上样吸头中，形成微固相萃取柱，采用洗脱液和上样液活化及平衡微固相萃取柱，将生物样品溶解于上样液中，并上到微固相萃取柱上，循环肿瘤DNA富集材料与生物样品的质量比为500:1；
2)采用5-200倍柱体积的淋洗液冲洗萃取柱，淋洗液pH 0-7；
3)采用5-100倍柱体积的洗脱液洗脱得DNA，洗脱液pH 10-12；
上述整个过程在10-60℃进行。
所述上样液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为甲醇；有机酸为乙酸，所述上样液中有机溶剂体积为10-50％，pH 0-7。
所述洗脱液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为甲醇；有机酸为乙酸，所述洗脱液中有机溶剂体积为10-50％，pH 10-12。
所述淋洗液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为甲醇；有机酸为乙酸，所述淋洗液中有机溶剂的体积为0-50％，pH 0-7。
经过标准品评价，经过才DNA富集材料提取后，DNA的提取回收率是84％，覆盖度是86％。

Claims (10)

1.一种富集提取循环肿瘤DNA的方法，其特征在于采用柱固相萃取模式，具体步骤如下：
1)将循环肿瘤DNA富集材料装入移液枪枪头或者凝胶上样吸头中，形成微固相萃取柱，采用洗脱液和上样液活化及平衡微固相萃取柱，将生物样品溶解于上样液中，并上到微固相萃取柱上，循环肿瘤DNA富集材料与生物样品的质量比为100～1000:1；
2)采用5-200倍柱体积的淋洗液冲洗萃取柱，淋洗液pH 0-7；
3)采用5-100倍柱体积的洗脱液洗脱得循环肿瘤DNA，洗脱液pH 10-12；
上述整个过程在10-60℃进行；
所述循环肿瘤DNA富集材料为双组分聚合物功能化材料。
2.根据权利要求1所述富集提取循环肿瘤DNA的方法，其特征在于所述双组分聚合物功能化材料，其结构如下：
其中R为羧基、硝基、甲基、甲酸乙酯基或氢；X＝0.01-0.5；
所述双组分聚合物功能化材料基底的材料为Si、Cu、Ag、Au、Pt、CuO、Fe3O4、多孔SiO2、多孔Al2O3、多孔TiO2或多孔ZrO2中的任意一种或者两种以上任意比例的混合。
3.根据权利要求1所述的富集提取循环肿瘤DNA的方法，其特征在于所述双组分聚合物功能化材料的制备方法为：利用原子转移自由基聚合反应机制，将双组分功能共聚物接枝到无机半导体、金属或金属氧化物表面上，获得智能响应性聚合物功能表面；所述的无机半导体为Si或SiO2，所述的金属为Au、Ag或Pt，金属氧化物为CuO、Al2O3、TiO2、ZrO2或Fe3O4。
4.根据权利要求3所述的富集提取循环肿瘤DNA的方法，其特征在于所述双组分聚合物功能化材料的制备方法具体为：在25mL的烧瓶中依次加入0.4mmol异丙基丙烯酰胺，0.1mmol的硫脲功能单体，二者摩尔比为4：1，同时加入6mL H2O以及6mL DMF作溶剂；在搅拌下通入氮气，待单体充分溶解之后，在氮气保护下加入催化剂CuBr 0.032g以及PMDETA或联吡啶配体0.16mL，随后反应体系抽真空—充氮气，除去反应体系中残余的氧气；将溴化处理过的Si,、SiO2、Au、Ag、Pt、CuO、Al2O3、TiO2、ZrO2或Fe3O4中的任意一种或者两种以上任意比例的混合物浸入配置好的反应溶液；将烧瓶的温度控制在60℃静置反应4～6小时；反应结束后用DMF，H2O依次洗涤聚合物接枝表面，得到双组分共聚物；此双组分共聚物的功能化表面的厚度为10-50nm，氮气吹干表面后置于真空干燥器中备用。
5.根据权利要求4所述的富集提取循环肿瘤DNA的方法，其特征在于所述硫脲功能单体结构式为：
6.根据权利要求1所述的富集提取循环肿瘤DNA的方法，其特征在于所述双组分聚合物功能化材料材料的粒径是0.2-50μm,孔径为
7.根据权利要求1所述的富集提取循环肿瘤DNA的方法，其特征在于所述生物样品为血液、滑膜液、脑脊液或尿液。
8.根据权利要求1所述的富集提取循环肿瘤DNA的方法，其特征在于所述上样液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇；有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，所述上样液中有机溶剂体积为10-50％，pH0-7。
9.根据权利要求1所述的富集提取循环肿瘤DNA的方法，其特征在于所述洗脱液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇；有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，所述洗脱液中有机溶剂体积为10-50％，pH10-12。
10.根据权利要求1所述的富集提取循环肿瘤DNA的方法，其特征在于所述淋洗液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇；有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，所述淋洗液中有机溶剂的体积为0-50％，pH0-7。
CN201711366365.6A 2017-12-18 2017-12-18 一种富集提取循环肿瘤dna的方法 Pending CN109932224A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711366365.6A CN109932224A (zh) 2017-12-18 2017-12-18 一种富集提取循环肿瘤dna的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711366365.6A CN109932224A (zh) 2017-12-18 2017-12-18 一种富集提取循环肿瘤dna的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109932224A true CN109932224A (zh) 2019-06-25

Family

ID=66982738

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711366365.6A Pending CN109932224A (zh) 2017-12-18 2017-12-18 一种富集提取循环肿瘤dna的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109932224A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1946479A (zh) * 2004-04-05 2007-04-11 通用电气健康护理生物科学股份公司 一种制备分离基质的方法
CN106749884A (zh) * 2016-11-18 2017-05-31 武汉理工大学 一种磷酸化肽富集材料及其制备方法与应用
CN106770867A (zh) * 2016-11-18 2017-05-31 武汉理工大学 一种富集检测磷酸化蛋白的方法
CN107119145A (zh) * 2017-07-13 2017-09-01 深圳瑞科生物科技有限公司 一种基于ddPCR定量检测ctDNA的方法
CN107209190A (zh) * 2014-10-29 2017-09-26 比利时意志有限责任公司 用于富集循环肿瘤dna的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1946479A (zh) * 2004-04-05 2007-04-11 通用电气健康护理生物科学股份公司 一种制备分离基质的方法
CN107209190A (zh) * 2014-10-29 2017-09-26 比利时意志有限责任公司 用于富集循环肿瘤dna的方法
CN106749884A (zh) * 2016-11-18 2017-05-31 武汉理工大学 一种磷酸化肽富集材料及其制备方法与应用
CN106770867A (zh) * 2016-11-18 2017-05-31 武汉理工大学 一种富集检测磷酸化蛋白的方法
CN107119145A (zh) * 2017-07-13 2017-09-01 深圳瑞科生物科技有限公司 一种基于ddPCR定量检测ctDNA的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUANGYAN QING等: "Hydrogen bond based smart polymer for highly selective and tunable capture of multiply phosphorylated peptides", 《NATURE COMMUNICATIONS》 *
PENG DING等: "Disaccharide-driven transition of macroscopic properties: from molecular recognition to glycopeptide enrichment", 《CHEM. COMMUN》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107469653B (zh) 一种富集和分离诺氟沙星的分子印迹复合膜的合成方法
Xu et al. Fluorescent boronic acid polymer grafted on silica particles for affinity separation of saccharides
CN104897756B (zh) 一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器及其制备方法
CN105648070A (zh) 基于酶循环放大及纳米颗粒增强spr检测核酸或细胞的方法
CN110208348B (zh) 一种以Nafion为引发剂通过电化学介导的原子转移自由基聚合反应的肺癌检测盒
CN107589163A (zh) 一种用于mecp2突变基因检测的电化学传感器制备方法
CN105693960B (zh) 一种谷氨酸表面分子印迹聚合物硅胶微球的制备方法
CN107727714A (zh) 一种基于碳纳米角及TiO2介晶纳米材料的比率型电化学发光免疫传感器的制备方法
CN102952245A (zh) 一种环境友好的多羟基聚合物分子刷的制备方法
CN104258826A (zh) 一种活性/可控介孔材料表面离子印迹聚合物及其制备方法与应用
CN110004225B (zh) 一种肿瘤化疗药个体化基因检测试剂盒、引物及方法
CN105153367A (zh) 一种双氰胺介孔表面分子印迹聚合物微球的制备方法
CN105254707A (zh) 基于二肽的聚合物材料及其在糖分离和糖肽富集中的应用
CN106749884A (zh) 一种磷酸化肽富集材料及其制备方法与应用
CN112881505A (zh) 一种MXene增敏烷基间苯二酚分子印迹电化学传感器的制备方法和应用
CN102527350A (zh) 双酚a伪模板分子印迹搅拌棒及其制备方法
CN105289558B (zh) 多组分嵌段亲水共聚物‑硅胶杂化色谱填料的制备及应用
CN108265050A (zh) 一种血浆直接亚硫酸氢盐转化的方法及其应用
CN109932224A (zh) 一种富集提取循环肿瘤dna的方法
CN101724691B (zh) CD11a、CD70基因甲基化水平定量检测方法
CN115010940A (zh) 一种铝基金属有机骨架材料及其制备方法和应用
CN111574666B (zh) 化合物提取板及其制备方法和应用
Luo et al. Molecularly imprinted layer-coated monodisperse spherical silica microparticles toward affinity-enrichment of isoflavonoid glycosides from Radix puerariae
CN109929832A (zh) 一种双组分聚合物功能化材料富集提取循环肿瘤dna的方法
CN113061524A (zh) 一种双层微流控芯片、包含该芯片的乳腺癌miRNA检测试剂盒及制备方法、检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190625