JPH03501978A - 細胞の付着および増殖のための材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、接着性動物細胞の付着および増殖の適切な基礎である表面を製造す るためのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ、登録商標ＴＥＦＬＯＮで販売 されている）および他のフルオロカーボンポリマーの化学変性に関する。

この発明は、また、ＰＴＦＥおよび他のフルオロカーボンポリマーの上記変性を 達成するための方法、および細胞付着のための化学的に変性した表面の作成方法 に関する。これらの方法によって変性したＰＴＦＥがヒト内皮細胞の付着および 増殖の基礎として機能する可能性、および血管補綴物および経皮の移植組織を含 む移植可能材料の作成におけるこれらの化学的に変性したフルオロカーボンポリ マーおよび方法の潜在的な用途に特に注意が引き付けられる。

綴物のような特定の生物材料（ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）に使用するための材 料のデザインもしくは選定においてを益に用いることが可能である。イン・ビト ロの細胞培養における内皮細胞および他の足場依存性動物細胞の付着および増殖 には、細胞付着のための適切な基礎、および血清もしくはある精製血清タンパク 質のいずれかを含有する培養培地の両方が必要である。

基礎の化学的性質に関していうと、内皮細胞のような細胞は、非親水性ポリスチ レン（細菌学的プラスチック）のような疎水性表面上または血管の補綴移植片に 普通使用されるＰＴＦＥ上には付着せず、かつうまく増殖しない。一方、内皮細 胞を含む細胞は、また、ヒドロゲルであるポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリ レート、ポリＨＥＭＡのような多くの親水性ポリマーにも付着しない。細胞は、 その表面が疎水性および親水性の両方の領域を有するミクロドメインからなるポ リマー上に付着し、かつ増殖する。この性質のミクロドメイン構造を有するポリ マーの使用は、現在の生物医学的材料領域における技術の状態である（例えば、 ＢＩＯＭＥＩ？およびＭＩＴＲＡＴＨＡＮＥの登録商標で販売されているポリウ レタン類）。最近、登録商標ＮＡＦＩＯＮで知られるパーフルオロスルホネート 異性体が内皮細胞付着および増殖に適していることが示されており（国際特許出 願ＰＣＴ／　ＡＵ８８／　００３８８　；　ＭｃＡｕｓｌａｎら、（１９８８） Ｊ、Ｂｉｏｍｅｄ、Ｍａｔｅｒ、Ｒｅｓ、、２２．９６３−９７６　；　Ｎｏｒ ｒｆｓ　ら、　（１９Ｈ）ＣＩｉｎｌｃａｌ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　、　３．１ ５３−１６２　）　、かつ８モノマー単位ごとに１つのみがスルホン化されてい る場合には非荷電路の巨大断片の疎水性および親水性側相互作用を考慮すること ができるという一般論にも適合する。

イン・ビトロで動物細胞の付着および増殖に通常使用されており、細胞付着を促 進することができる表面を製造するための技術の一つによって変性した表面はポ リスチレン（組織培養ポリスチレン）である。このポリスチレンの変性は、硫酸 を用いた処理（ＫｅｎｎｅｄｙおよびＡｘｅｌｒｏｄ　ｓ　（１９７１）Ｉｍｍ ｕｎｏｌｏｇｙ　、　２０．２５３−２５７　＞　、クロム酸または硫酸とクロ ム酸とを用いた処理（ＫｌｅｍｐｅｒｅｒおよびＫｎｏｘ　ｓ　（１９７７）Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　２６（３）、１７９−１８０　）　、 またはコロナ放電法を用いた処理（“Ｎｅｗ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂ ｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　ａｎｄＣｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　”　（Ｒ，Ｈ，Ｐａｙ ｎｅ　ａｎｄ　Ｂ、Ｊ、Ｓｍ１ｔｈ　５ｅｄｓ　）Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃ ｉｅｎｃｅＳＬｏｎｄｏｎのＭａｒｏｕｄａｓｓ　（１９７３）　）によって行 なわれている。これらの処理はヒドロキシル基を導入することであると信じられ ており、ヒドロキシル基の表面密度は細胞付着に適するポリスチレン誘導体に対 する範囲内になければならない（Ｃｕｒｔｉｓら、（１９８３）　Ｊ、Ｃｅ１ｌ 　Ｂｉｏｌｏｇｙ　９７．１５００−１５０８　、およびＣｕｒｔｉｓら、（１ ９８Ｂ）　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｓｅｔ、　８Ｂ、９−２４）。この反応において生成 したカルボキシル基は、変性ポリスチレンへの細胞付着において小さな役割しか 果たしていないように見える（Ｃｕｒｔｉｓら、１９８８）。表面に導入される スルホネート基は非常に少ない（Ｃｕｒｔｉｓら、１９８３）。

ＭｃＡｕｓ　Ｉ　ａｎらによって、ポリＨＥＭＡへの細胞付着の研究において、 細胞付着に必要な表面基とは多少異なる結果が得られた（　ＰＣＴ／ＡＵ８７１ ０００４３およびＭｃＡｕｓ　Ｉ　ａｎら、Ｊ、Ｂｉｏｍｅｄ、Ｍａｔｅｒ。

Ｒｅｓ、、１９８７）。この研究においては、非接着表面が、硫酸を用いたポリ ＨＥＭＡの加水分解エツチングにより、細胞に対して非常に高い接着性を有する 表面に変換されることが示されている。その場合、細胞のためのポリＨＥＭＡ表 面のヒドロキシル基が豊富な表面の接着性の改善は、その表面上へのカルボキル 基の部分的な導入と相関があるように思われた。

ポリマー表面への細胞付着の機構の他の面は、その表面に吸着された血清接着性 タンパク質が細胞付着反応に寄与しているというものである。組織培養ポリスチ レンに対して、血清成分フィブロネクチン（Ｐｎ）が内皮細胞の付着を指示して いることが示されている。Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄらの最近の結果（Ａｕｓｔ。

Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ　Ｓｏｃ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、１９８８　Ｍｅｅｔ ｉｎｇ、　ａｂｓｔｒａｃｔｓ１９８ｇ）は、内皮細胞の付着に必須のものとし ての二次血清成分、ビトロネクチンのポリスチレン表面への吸着を指摘している 。表面の化学的性質は、吸着したタンパク質の生物学的な潜在能力に対する重要 な効果と共に、付着した血清成分の構造に対する明敏な効果を有することができ る。ＧｒｉｎｎｅｌおよびＦｅ１ｄ　（１９８１）Ｊ、Ｂｉｏｌｌｅｄ、Ｍａｔ ｅｒ、Ｒｅｓ、、１５．３６３−３８１および（１９８２）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｈｅａ＋、　、２５７．４８８８−４８９３は、フィブロネタチンの組織培養ポ リスチレンへの接着および接着したフィブロネクチンの生物学的な潜在能力を疎 水性非変性ポリスチレンへの接着と比較している。この研究は、組織培養ポリス チレン表面に吸着したフィブロネクチンの細胞付着を促進する能力が、疎水性ポ リスチレン表面に吸着したフィブロネクチンの能力よりきわだって大きいことを 示した。これより、細胞付着に対するポリマー表面の適合性が、表面の化学的性 質および特定の活性構造の接着タンパク質（血清からのものか精製血清成分とし てか）を吸着するための表面の能力の両者に関連しているということが推測され る。

天然の血管の内腔は、血管を裏打ちして血栓形成を防ぐ内皮細胞の能力の直接の 結果であると信じられる抗血栓特性を有する。合成血管移植片はより顕著な血栓 形成表面を有し、しばしば自発性血栓症によって失敗する。移植片の表面を生理 学的に機能する内皮細胞で被覆することが可能であれば、これらの細胞が移植片 と血液との間に非血栓形成界面を自然に形成するであろうことが考えられる。そ のような内皮形成プロセスに含まれる細胞は、内在性の源からの自発的な被覆形 成によって（隣接した血管の切断端からの、さもなければ多孔性移植片を通して 移植片周辺から移動した毛細血管からの内皮細胞の移動）、または移植片への内 皮の植付けによって生じ得る。したがって、血管補綴物のデザインの１つの面は 、特に移植片が少ない血流を運搬する小ないし中サイズの動脈に使用される場合 に、内反細胞が表面上に付着し、かつ増殖し得ることを保証することである。こ のため、ポリマー表面の内皮細胞の付着および増殖を支持する能力は、補綴が有 効であることの重要な特徴である。内皮細胞の付着および増殖に適切な表面は、 他の間葉組織の内薄を支持するようであり、創傷閉合の増強および経皮移植片の 固定を含む一般的な移植適用に適している。

ＰＴＦＥ表面が、血流に伴う剪断力にさらされる内皮細胞の付着を含む細胞付着 を十分に支持し損なうということが、この材料の血管補綴への使用の限界である 。ＰＴＦＥを変性して、増強された内皮細胞の付着および増殖を支持する表面を 作成することが可能であるならば、その変性表面が未変性ＰＴＦＥよりもイン・ ビボの内皮形成プロセスに適することが期待される。

内皮細胞の付着に対して未変性ＰＴＦＢに勝るように変性したＰＴＦＥは、確か に、移植前に内皮細胞を予め植付けられた移植片の新たな取組み方における使用 に好ましい（Ｈｅｒｒｉｎｇ　５ＧａｒｄｎｅｒおよびＣ１ｏｖｅｒ、（１９７ ｇ）　Ｓｕｒｇｅｒｙ、　８４．４９ｇ−５０４＞。

種々の高エネルギーグラフト化技術による普通の疎水性フルオロカーボンポリマ ーへの強固に結合した表面カルボキシル基の導入が公知である（例えば、Ｃｈａ ｒｐｉｒｏおよびＪｅｎｃｌｒｙｃｈｏｗｓｋａ−Ｂｏｎａｍｏｕｒ　（ＩＨＯ ）　Ｐｏｌｙｍｅｒ　ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＳｃｉｅｎｃｅｓ　２０　 （３）、２０２−２０５　’）にもかかわらず、我々は得られた表面が内皮細胞 の増殖を十分に支持しないことを見出した。これは、グラフト化の水準が非常に 低い場合（約１％）もしくはより高い場合には、これらのグラフト化法によって 付与されたカルボキシル基の分布でさえ細胞付着には有益ではないことを示して いる。この発見と未変性のＰＴＦＥおよび他のフルオロカーボンポリマーへの細 胞付着の欠如とは対照的に、ポリアクリル酸鎖がグラフトされているＰＴＦＥお よび他のフルオロカーボンポリマーに対するある酸処理が、材料の物理特性に悪 影響を及ぼすことなく、改良された細胞付着および増殖特性を有する表面を作成 することが本発明者らによって見出された。

したがって、この発明は、繊維芽細胞および間葉組織由来細胞、上皮細胞および 内皮細胞のような動物（ヒトを含む）組繊細胞の付着および増殖を支持する移植 可能表面を作成するための、ＰＴＦＥおよび他のフルオロカーボンポリマーの化 学変性のための方法の開発に集められている。それがフルオロポリマー表面と接 触している内皮細胞である場合には、この方法によって作成された表面は内皮細 胞の付着および増殖を支持して融合性表面となる。そして、付着した内皮細胞は 、望ましくない血小板相互作用を阻止する抗血栓性表面を血液界面に提供する。

発明の開示 この発明は、従来技術の欠点を実質的に克服し、増強された細胞付着特性および 抗血栓症特性に起因する改良された生体適合性を有する移植可能補綴物に有用な 物質を提供することを目的とする。

この発明によると、細胞の付着および増殖のための表面の作成方法が提供される 。この方法は、 ｉ）　フルオロカーボンポリマー基材の重量が０１１％ないし２０％増加するよ うに、フルオロカーボンポリマー基材にポリアクリル酸鎖をグラフト化する工程 と、ｉｆ）　工程（１）によって生じたフルオロカーボンポリマー表面を充分に 高い温度でしばらくの間濃硫酸を用いて処理し、グラフト化したポリアクリル酸 鎖の有効割合を別々に脱炭酸化、芳香化およびスルホン化する工程と、１ｆｆ） 　工程（１１）によって生じた表面を乾燥する工程と、ｉｖ）　工程（ｉｉｉ） によって生じた表面を濃酸中に浸漬する工程と、 Ｖ）　工程（ｉｖ）によって生じた表面を中和する工程とを具備する。

場合によっては、工程（ｉ）によって生じたグラフト化した表面を、工程（１１ ）の処理の前に、室温の硫酸に浸漬しておくことができる。これは、−晩行なう ことが最善である。

必要な場合には、工程（Ｖ）によって生じた中和表面を、血清、血清もしくは（ フィブロネクチンもしくはビトロネクチンのような）結合組織由来の細胞付着因 子、または組織増殖因子で処理することができる。

工程（ｉ）における基材へのポリアクリル酸のグラフト化の好ましい方法は、γ 線照射グラフト化である。レーザーグラフト化のような他のグラフト化手段は、 適当なところで用いることができる。γ線照射グラフト化が用いられる場合には 、工程（ｉ）は、グラフト化溶液中における水溶性阻害剤を用いたポリマー表面 の処理を含むＣｈａｒｐｉｒｏの方法（Ｃｈａｒｐｉｒｏ＆Ｊｅｎｄｒｙｃｈｏ ｖｓｋａ−Ｂｏｎａｍｏｕｒ、　１９８０で考察されている）に従って行なうこ とが好ましい。

工程（ｉｆ）において、表面のグラフト化されたポリアクリル酸鎖の有効割合を 別々に脱炭酸化、芳香族化およびスルホン化するのに要する時間はポリマーの硫 酸処理が行なわれる温度に依存するが、工程（１１）の処理は硫酸を用いて１０ ５℃で２時間行なわれることが好ましい。グラフト化されたポリアクリル酸鎖の 有効割合とは、この発明の表面上における細胞の効果的な付着および増殖を導く であろう割合を指すことは当業者によって理解される。

好ましくは、工程（ｆｉｔ）において要求される乾燥は１０５℃で４時間加熱す ることにより行なわれ、工程（ｉｖ）において要求される濃酸中への浸漬は、好 ましくは、濃硝酸を用いて室温で４時間行なわれる。

工程（Ｖ）によって生じた比較的酸性の表面の中和は、好ましくは、ｐｏ　７． ４のリン酸緩衝食塩水を用いて洗浄することによって行なう。

この発明の他の面によると、前述の方法のいずれか１つによって作成された場合 にはいつでも、細胞の付着および増殖のための表面が提供される。

この発明のさらなる面によると、前述の方法のいずれか１つに従って表面を作成 することおよびその表面を細胞にさらすことを含む、表面上への細胞の付着およ び増殖を促進する方法が提供される。

好ましい基材のフルオロカーボンポリマーには、ポリアクリル酸鎖と容易にγ線 照射グラフト化することが可能なポリテトラフルオロエチレン、フッ素化エチレ ン　プロピレン、ポリクロロトリフルオロエチレンおよびフッ化ポリビニリデン が含まれる。この方法によって基材にグラフト化されたポリアクリル酸鎖は、基 材のアクリル酸もしくはアクリル酸エステルとの反応生成物であってもよい。

工程（ｉ）においてγ線照射グラフト化が行なわれた場合における、濃硝酸が使 用されている工程（ｌｖ）の後に生じる表面に対する化学変化が、電子分光法（ ＥＳＣＡ）によって研究されている。この研究は、（Ｓ　２ｐに対する）結合エ ネルギー１６７ｅＶの低濃度の表面硫黄含有基（おそらくスルホン酸）の存在を 示し、これらの数が酸処理の時間および温度に従って増加することを示している 。工程（ｉｖ）の後の生じる表面は、好ましくは、炭素原子７５個当り１個の硫 黄原子を有している。

処理済ＰＴＦＥ表面のフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）研究（全反射吸収ＡＴＲに よる）は、１ミクロン表面層における１７１０ｃｍ−’の酸基の相当の脱炭酸化 が起こっているが、他のイオン化不可能な酸化核種が部分的にそれらの位置を得 ていることを示している（１７２０−１６７０ｃｍ”のブロードピーク）。

さらに、工程（ｉ）によって生じたグラフト化された表面と工程（ｉｖ）の後の 表面とを比較するＥＳＣＡ研究は、結合エネルギー　２８８ｅＶの表面カルボキ シル基が、工程（ｉ）の後の表面における２９２ｅＶの結合エネルギーを有する ＣＦ基の等レベルの１１５存在することを示した。これらの表面カルボキシル基 のレベルは、硫酸を用いた室温および１０５℃での処理の間には減少するが、乾 燥工程（ｉｆｆ）の間には有意の変化はしない。

工程（ｉｖ）の間には、さらにカルボキシル基を付与する炭素の再酸化が起こる 。工程（Ｖ）の後、カルボキル基シグナルは、工程（ｊ）の後に観測した元のカ ルボキシルピーク（２８８ｅＶ　）のピーク高さの約７０％に減少した。

イオン交換能力は、元のグラフト化膜における１、２ｔｂｅｑ／　ｇから、１０ 分間処理で０．８２　ｍｅｑ／　ｇ　、　１８分間で０．７５ｒｔｒｅｑ／ｇお よび１時間にわたる最適処理で０゜２６　ｍｅｑ／　ｇに落下した。測定された 平衡イオン交換能力に達する時間は、この表面の脱炭酸化に応じて１時間から２ ４時間に増加した。紫外および可視分光は、処理の増加に従ってポリアクリル酸 グラフトの芳香族化が起こることを、２５０ｎｍより下から４３０ｎｍより上の ブロードな吸収ピークにおいて示した。ＰＴＦＥ（Ｑｕｉｎｔｏｎ　ｃａｎｎｕ ｌａ　ｃｏｎｎｅｃｔｏｒ　）チューブにおける１、０をこえる吸収値が約３０ ５ｎｍから５５０ｎ［Ｉｌに移動した。上の変化と一致して、ＥＳＣＡによる研 究は、工程（ｉｆ）における硫酸を用いた処理の間に、フッ素化された炭素と比 較するとフッ素化されていない炭素原子（すなわち、工程（ｉ）でグラフト化さ れたアクリル酸からの炭素）の割合が減少したことを示している。

工程（ｉｉ）の後、硫黄原子の数はＣ原子７５個に対して無視し得る数から約１ に増加し、工程（ｉｆｆ）　、（ｉｖ）および（Ｖ）での続く処理においてこの レベルを維持した。非グラフト化ＰＴＦＥ膜または管類の同様の処理にはこれら の変化は起こらなかった。

図面の簡単な説明 第１図は実施例において使用されるフロー試験システムの模式図、 第２ａ図はこの発明の表面を有する変性試料＃１上に増殖したヒツジ頚動脈内皮 （ＯＣＡＥ）細胞の顕微鏡写真、第２ｂ図はこの発明の表面を有する変性試料＃ ２上に増殖した０ＣＡＥ細胞の顕微鏡写真、 第２ｃ図は未変性ＰＴＦＥ表面上に増殖した０ＣＡＥ細胞の顕微鏡写真、 第２ｄ図はこの発明の表面を有する変性試料＃３上に増殖した０ＣＡＥ細胞の顕 微鏡写真、 第３ａ図はｒ５ＰＴＦＥへの植付けの後２４時間血清非含有培地において増殖さ せたヒト廣動脈内皮（ＨＵＡＥ）細胞の顕微鏡写真、第３ｂ図はｍＰＴＦＥへの 植付けの後２４時間血清含有培地において増殖させたＨＵＡＥ細胞の顕微鏡写真 、第３Ｃ図はｍＰＴＦＥへの植付けの後２４時間、ビトロネクチンを除去した血 清を含有する培地において増殖させたＨＵＡＥ細胞の顕微鏡写真、 第３ｄ図はＴＣＰへの植付けの後２４時間血清非含有培地において増殖させたＨ ＩＪＡＥ細胞の顕微鏡写真、第３ｅ図はＴＣＰへの植付けの後２４時間血清含有 培地において増殖させた）（ＵＡＥ細胞の顕微鏡写真、第３ｒ図はＴＣＰへの植 付けの後２４時間、ビトロネクチンを除去した血清を含有する培地で増殖させた ＨＵＡＥ細胞の顕微鏡写真、 第４図は実施例３の種々の表面上での５日間にわたるＨＵＡＥ細胞の増殖のグラ フ、 第５ａ図はＰＴＦＥ上で３日間増殖させたＨＩＪＡＥ細胞の顕微鏡写真、 第５ｂ図はｍＰＴＦＥ上で３日間増殖させたＨＵＡＥ細胞の顕微鏡写真、 第６ａ図はフィブロネクチン被覆ＴＣＰ上で３日間増殖させた）ＩＵＡＥ細胞の 顕微鏡写真、 第６ｂ図はフィブロネタチン被覆ＰＴＦＥ上で３日間増殖させたＨＬＩＡＥ細胞 の顕微鏡写真、 第６ｃ図はフィブロネクチン被覆ｍＰＴＦＥ上で３日間増殖させたＨＵＡＥ細胞 の顕微鏡写真、 第６ｄ図はフィブロネクチンで前被覆されていないｍＰＴＦＥ上で３日間増殖さ せたＨＬＩＡＥ細胞の顕微鏡写真である。

好ましい実施態様の説明 この発明をより容易に理解し、実際的な効果に至らしめるために、以下の実施例 をび照する。

ポリテトラフルオロエチレン膜（２００ミクロン厚）の一部を切り取り５ｃＪの 断片とし、アクリル酸の１０％塩化メチレン溶液に２日間浸漬した。この試料を 取りだして風乾した後、アクリル酸１０ｇと０．０３％ＣｕＣｌ□を含有する蒸 留水９０ｇとのグラフト溶液を入れた適当なガラス容器に入れた。次いで、この 試料を、コバルト６０源内で約０．０７　ＭＲａｄ／ｈｒの線量率で１６時間照 射して（絶線ｊｌ−１，１２ＭＲａｄ　）　ＰＴＦＥ上に１．２５重量９６のグ ラフト化したポリアクリル酸を付与した。次に、このグラフト化膜を蒸留水で洗 浄して乾燥した後、濃硫酸中に１０５℃で９０分間装いた。その後、明褐色の膜 を蒸留水で洗浄して９０℃で１６時間乾燥し、最後に濃硝酸に２４時間浸漬する ことによって洗浄した。組織培養の研究の前に、この断片を無菌リン酸緩衝食塩 水（ＰＢＳ）　ｐＨ７，２で洗浄した。ＰＴＦＥ膜のこれらの断片は続いて実施 例３において用いた。

２０本のカニユーレ接続チューブ（カタログ番号１１１５０−００２、Ｑｕｉｎ ｔ、ｏｎ　）ｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏ、、５ｅａｔｔｌｅνａｓｈｉｎｇｔｏ ｎ　９８１２１．２５ｍｍ長、２．８　ｍｍ　１．Ｄ、　、３．８　ｍｍ　Ｏ， Ｄ、の平滑なエツチングされていないＰＴＦＥチューブ）をアクリル酸の１０％ 塩化メチレン溶液に２日間浸漬し、その後、風乾して０．０３％ＣｕＣｌ　２水 溶液に１０％のアクリル酸を含有するグラフト溶液に入れた。これらを、約０． ０７　ＭＲａｄ／ｈｒの線量率で１６時間（総線量ｌ、１２ＭＲａｄ）γ線照射 処理してチューブ上に１．５重量２６のグラフトを付与した。次いで、グラフト 化したチューブを蒸留水で洗浄して乾燥し、室温で一晩硫酸に浸漬した。その後 、１０５℃で時間を変化させて濃硫酸に入れ、異なる性質を有する表面を得た。

ｍＰＴＦＥチューブ試料＃１の作成には９０分間の硫酸処理を用い、ｍＰＴＦＥ チューブ試料＃２の作成には１５分間の処理を用いた。これらのチューブは、処 理時間に応じて、明褐色（ｍＰＴＦＥチューブ試料＃２）から暗褐色（ｍＰＴＦ Ｅチューブ試料＃１）まで変化する異なる色をしている。次いで、これらのチュ ーブを蒸留水で洗浄して９０°Ｃで１６時間乾燥し、最後に濃硝酸に２４時間浸 漬することによって処理した。他のグラフト化カニユーレ接続チューブは、硫酸 を用いて１０５℃で２時間処理した後１０５℃で４時間乾燥し、次いで室温の硝 酸に４時間浸漬した後蒸留水で洗浄した（これらはｍＰＴＦＥチューブ試料＃３ である）。組織培養の研究の前に、全てのチューブ試料を無菌ＰＢＳでさらに洗 浄した。これらの変性ＰＴＦＥチューブは、続いて実施例２で用いた。

実施例２−変性ＰＴＦＥチューブ上へのヒツジ内皮細胞の付着および増殖 上述の実施例１において特定された手順によって変性したＰＴＦＥカニユーレ接 続チューブをアセトン中で超音波処理し、７０％エタノールで洗浄した。ｍＰＴ ＦＥチューブは、使用前の、血清非含有培養培地を数回代えて安定なｐ）（が検 出されるまでインキュベートすることによるｐＨの平衡が必要であった。

（１時間をこえる期間にわたって培地におけるｐＨインジケータの色に変化がな いことは、ｐＨの安定の充分な証明であると思われる）。ｍＰＴＦＥ試料＃３ａ のいくつかは、細胞の植付けの前に、ＰＢＳ中に４０ｕｇ／−のフィブロネクチ ン（Ｆｎ）を含有する溶液を充填し、栓をして３７℃で１時間インキュベートす ることによってウシ血漿由来のＦＤを予め被覆された（これらはｍＰＴＦＥチュ ーブ試料＃３ｂである）。

ヒツジ頚動脈内皮細胞培養（０ＣＡＥ）が、Ｊａｌ’ｆ’ｅの方法論（（１９８ ４）、“Ｂｆｏｌｏｇｙ　ｏｆ’　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１ｌｓ”’　 （Ｅ、Ａ、Ｊａｆ’ｆ’ｅ　、、ｅｄ）　Ｍａｒｔｉｎｕｓ　Ｎ１ｊｈｏｆ’ｆ ’　、　Ｂｏｓｔｏｎ）の後に確立され、２０％ウシ胎児血清、６０１℃ｇ／− ペニシリンおよび１１００Ａｌ／−ストレプトマイシンを補ったＭｃＣｏｙ　５ Ａ　（変性）培地中で一定の手順で維持されており、トリプシン−ベルセン（ｖ ｅｒｓｅｎｅ　）用いて継代されている。第５継代ないし第１２継代（それぞれ 含む）の細胞が実験作業に用いられた。予め平衡にされたｍＰＴＦＥチューブを 無菌のスクリューキャップ式ポリスチレンバイアルに別々に入れた後、各々のバ イアルに２ＸＩＯ’個の細胞を含有する増殖培地９−を加えた。この細胞懸濁液 に空気と５％ＣＯ２との混合ガスを吹き込み、バイアルを緊密にシールした。次 いで、このバイアルをＴＣＰローラーボトル内部に入れ、バッキングによって所 定の位置にしらかりと固定した。その後、積載したボトルを、３７℃でローラー 上において１　ｒ、ｐ、ｍ、で回転させた。２４時間および７２時間に培養培地 を補充し、５日後に次のフロー試験のためにチューブを移した。

進行する細胞増殖の視覚化には、選択したチューブの５ｄ長の末端部を除去し、 次いでこのチューブを２．５％（ｖ／ν）のグルタルアルデヒドを含有するＰＢ Ｓで固定し、エオシンＹで染色して蛍光顕微鏡下で観察する必要がある。細胞は 、反射光蛍光アタッチメントを有するオリンパス１訂顕微鏡を用いて観察した。

細胞付着および増殖を支持する他のチューブは、グルタミン、３ｏ＋ｇ／Ωメチ オニンおよび３５Ｓ−メチオニン２５ｕＣｉ／−を含有するダルベツコ変性イー グル培地を含む培養培地中において６時間培養し、その後さらに血清および補充 物質を有するＭｃＣｏｙｓ　５Ａを用いてインキュベートした。代謝的にラベル された細胞を有するチューブをＰＢＳで簡単に洗浄した後、第１図に示すように フロー試験システムに挿入した。

第１図のフロー試験システムはガスシリンダー１０を含み、このガスシリンダー は流ｊｔＦＩ節器１２を通過し、気圧計１４を有する減圧フラスコ１３にガスを 分配するシリンダー排出口１１を有する。チューブ１５はフラスコ１３内の細胞 培養培地１６から３７℃に保たれている水浴１７に送られている。浴排出チュー ブ１８はこれに接続している培地圧力計（ｍｅｄｉａ　ｐｒｅｓｓｕｒｅｍａｎ ｏｍｅｔｅｒ）　１９を宵しており、チューブ１８の下流はフローアダプター管 ２０および被検グラフト２１（この場合、調製したチューブ）である。さらに下 流は流量計２３に接続しているプローブ２２である。チューブ１８は三方タップ ２４で終る。この三方タップからチューブ１８は一組のガラスファイバーフィル ター２５および２６に分岐する。このフィルターによって捕獲されない物質はフ ラスコ２７内に集められる。

チューブは、２０ｍＭへペス緩衝液（ｐＨ７，２）および２０９６（ｖ／ｖ　） ウシ胎児血清を含有するＭｃＣｏｙｓ　５Ａ培地からなる流量の増加する培地を 、３７℃で特定の時間受ける。チューブから離れ、下流のフィルターに集められ た細胞を放射性の決定（液体シンチレーション計数）によって秤量した。フロー の研究の後、チューブを取り出して二分し、次いでチューブの半分は接着細胞に 対して顕微鏡技術によって検査し、他の半分上の細胞はトリプシン−ベルセンを 用いて剥がし、剥離した細胞における放射活性を測定した。

結果 表面変性の４つのレベル（前述のように、同じレベルのアクリル酸グラフトを有 しているが、続いて異なる後グラフト化変性条件にさらされているｍＰＴＦＥ試 料＃１、＃２、＃３ａおよび＃３ｂ）を有するｍＰＴＦＥチューブ上において、 ０ＣＡＥ細胞増殖を考察した。これらのチューブ上における細胞増殖を未変性Ｐ ＴＦＥカニユーレ連結管上のそれと比較した。

ｍＰＴＰＥチューブ試料＃２よりも長い時間後グラフト化変性にさらしたｍＰＴ ＦＥチューブ試料＃１、＃３ａおよび＃３ｂは、０ＣＡＥ細胞増殖を良好に支持 した。試料＃１上の細胞単層は３日で融合レベルに達しく第２ａ図を参照）、５ 日月には細胞層の離層もしくは凝集の徴候はなかった。しかしながら、合に達し ておらず、多くの細胞は互いに凝集する傾向にあり、他のものは紡錘様形態を示 した（３日後の形態として第２ｂ図を参照）。未変性ＰＴＦＥチューブは、細胞 拡張（ｃｅｌｌｓｐｒｅａｄｉｎｇ）をほとんど示さない細胞はほとんど無いに もかかわらず、０ＣＡＥ細胞の付着および増殖をほとんど支持しなかった（第２ Ｃ図を参照）。ｍＰＴＦＥチューブ試料＃３ａは細胞の付着および増殖をよく支 持しく第２ｄ図を参照）、同様の結果はｍＰＴＦＥ試料＃３ｂでも達成された（ 図示せず）。

これらの結果は、チューブ試料＃１、＃３ａおよび＝３ｂに対して記述された方 法によるＰＴＦＥチューブの化学変性が、初期の０ＣＡＥ細胞の付着および増殖 にとって未変性ＰＴＦＥチューブよりもきわだって良好であることを示している 。

フロー試験 ５日間の増殖の後内腔表面に融合層を形成する０ＣＡＥ細胞を植付けたｍＰＴＦ Ｅチューブをチューブ試料＃１と同様に調製％の細胞がチューブに付着して残存 し、６つの実験のうちの４つが表面からの細胞の損失が７％未満であるという状 況で、４ダイン／ｃＪまでの剪断力処理に耐えた。チューブ試料＃３ａおよび＃ ３ｂと同様に調製されたｍＰＴＦＥチューブは０ＣＡＥ細胞を植付けられ、これ らの細胞は動脈血管において見出された剪断力水準と同等の２０ダイン／　ｃｄ までの剪断力処理に耐えた（第１表の実験７ないし１５）。実験７ないし１０に 示すように、最少で９４．３％の細胞がチューブ試料＃３ａに付着して残存し、 実験１１ないし１５に示すように、最少９２．５％の細胞が試料＃３ｂに付着し て残存した。これらの実験は、内皮細胞がｍＰＴＦＥ表面に強固に付着すること を示している。

第１表 流体流動条件下におけるｍＰＴＦＥチューブ上での０ＣＡＥ細胞の保持 実験　流動　付着して残存　離層してフィルタープロトコル　する細胞　％　に 回収された細胞　％ｌ　ａ　７３．０　２７．０ ２　ａ　９Ｌｌ　１．９ ３　ａ　８１．０　１９．０ ４　ｂ　９３．９　６．１ ５　ｂ　９７．８　２．４ ６　ｃ　９８．１　１．９ ７　ｄ　９７．４　２．６ ８　ｄ　９４．７　５．３ ９　６　９Ｂ、７　３．３ １０　ｄ　９４．３　５．７ １１　ｄ　９７．７　２．３ １２　ｄ　９８．４　３．６ １３　ｄ　９２．５　７．５ １４　ｄ　９７．８　２．２ １５　ｄ　９７．１　２．９ 実験工ないし６はチューブ試料＃１を使用し、実験７ないしｌＯはチューブ試料 ＃３ａを使用し、および実験１１ないし１５はチューブ試料＃３ｂを使用。

細胞には以下の流動プロトコルを課した。

、ａ、　１４ｍＪ／ｒＢｉｎ　（０，８ダイン／ｃＪ）で１０分間、次いで３８ −／ｍｉｎ　（２，３ダイン／ｃｊ）で１０分間、次いで７０　ｍｊ）　／　ａ 　ｉ　ｎ（４，０ダイン／Ｃ♂）で１０分間。

ｂ、　３１ｆ＋Ｊ／ｍｉｎで５分間、次いで５８ｍｆｆ１／ａｉｎで１０分間、 次いで７０ｍＪ／ｍｉｎで９分間。

ｃ、　３８ｍｊＪ／ｍｉｎで１０分間、次いで５８ｍＪ／ｍｉｎで１０分間、次 いで７０ｍ１＋／ｍｉｎで６分間。

ｄ。６６ｒＭＩ／ｍｉｎ　（４，０ダイン／　ｃＪ　）で１０分間、次いで１３ ２ｄ／［ｌ１ｉｎ　（８ダイン／　ｃＪ　）で１０分間、次いで１９８−／ｍｉ ｒ＋（１２ダイン／ｃＪ）で１０分間、次いで２Ｂ４ｍＪ／＋＋＋１ｎ（１６ダ イン／Ｃ♂）で１０分間（次いで３３０ｍＪ／ｍ１ｎ（２０ダイン／Ｃシ）で１ ０分間。

実施例３−変性ＰＴＦＥ　！へのヒト内皮細胞の付着および増殖方法 未変性のバージンＰＴＦＥおよび上述の実施例１において特定した方法によって 変性したＰＴＦＥ　（ｍＰＴＦＥ　）膜を約５ｍｍＸ５ｍｍの方形に切出し、ア セトン中で超音波処理し、次いでさらに７０％エタノールで２時間洗浄した。ｍ ＰＴＦＥは使用前にｐＨの平衡化および安定化を必要とし、平衡化は安定なｐＨ が検出されるまで血清非含有増殖培地を数回代えることで達成した。フィブロネ クチン（Ｆｎ）で被覆しようとする試料を各々２２ｍｍ径ＴＣＰウェル（１２− ウェルクラスター皿）に入れ、Ｆｎ　４０　Ａ１ｇ／−を含有するＰＢＳの溶液 １−で覆い、３７℃で１時間インキュベートした。

ヒト謄動脈内皮細胞培養株ＣＨＬＩＡＥ）を確立し、Ｐｎで被覆した７５ｃ♂組 織培養ポリスチレン（ＴＣＰ　）フラスコ内で増殖させた。Ｆｎの被覆は、細胞 の植付けの前に、Ｆｎ　４０　ｔｒｇ／　ｒｎｆｔを含有するＰＢＳの溶液５− と−緒にフラスコを３７℃で１時間インキュベートすることにより達成した。こ の細胞は、３０％Ｖ／Ｖウシ胎児血清、繊維芽細胞増殖因子４０ｎｇ／ｍｆｆ、 内皮細胞増殖補充剤８０ｕｇ／ａｃｔ、インシュリン２０ｕｇ／ｍＪ、ペニシリ ン６０　ｕｇ／−およびストレプトマイシン１１００ｕ／−で補充したＭｃＣｏ ｙ　５Ａ　（変性）および８Ｍ８６−ライスラー培地の等景況合物からなる増殖 培地において一定の手順で維持した。この細胞はトリプシン−ベルセンを用いて 一定の手順で継代し、実験作業には第１５継代ないし第２０′１１．代（それぞ れ含む）の細胞を用いた。

細胞増殖の研究のために、予め平衡にした試料を２２−径ＴＣＰウェルに別々に 入れ、５Ｘ１０’個の細胞を含有する、ＨＬＩＡＥ細胞培養株の維持に以前用い た増殖培地２ｍｆ！を各ウェルに加えた。

この実施例のいくつかの実験においては、細胞増殖の研究における増殖培地の使 用の前に、ゼラチン−セファ０−ス・アフィニティーカラムに通すことにより、 増殖培地のウシ胎児血清成分から粘着性筒タンパク質フィブロネクチンを除去し た。ゼラチンーセファアロース力ラムで処理した血清は、フィブロネクチン含量 の免疫検定によってフィブロネクチンを含有しないことを確認した。他の実験に おいては、固相した抗ビトロネクチンモノクローナル抗体からなるアフィニティ ーカラムに通すことにより、血清粘着性糖タンパク質ビトロネクチンを同様に除 去した。このアフィニティ技術によってビトロネクチンが枯渇した血清は、ビト ロネクチン含量の免疫検定によってビトロネクチンが徹底的に取り除かれたこと を確認した。

ＨＵＡＥ細胞の付着および増殖を良好に支持することが知られているＴＣＰおよ びＦｎ被覆ＴＣＰを、特にＦｎ被覆ＴＣＰに注意を払って、対照表面とした。各 試験試料の複製をＧＬＵＴ中で２４．７２および１２０時間で固定した後、エオ シンＹの０．０５％水溶液で染色し、蛍光顕微鏡で観察した。試験試料当り任意 のｌＯ区画を撮影し、写真プリントからｃｒｌ当りの細胞数の平均および標準誤 差を決定した。

細胞の植付けの２４時間後に観察されたｍＰＴＦＥ表面に付着したＨＵＡＥ細胞 の数は、未変性ＰＴＦＥに付着した細胞の数がＴＣＰに対するそれの７４％であ るのに対して、ＴＣＰに対するそれの約８８％であった一Ｍ２表を参照。

第２表 ２４時間後の付着したＨＬＩＡＥ細胞／ｃｎｌ基材　平均細胞数／ｃｔ ±（Ｓ、Ｅ、Ｍ、） ＴＣＰ　２０１２±（１４１） ＰＴＦＥ　１４８９±（１７９） ｍＰＴＦＥ　１７７１±（３３３） ＴＣＰ／Ｆｎ　ｓｇｔｙ±（２９２） ＰＴＦＥ／Ｐｎ　３０３７±（２０２）ｍＰＴＦＥ／Ｆｎ　４０００±（３４３ ）ｍＰＴＦＥ上の）ＩＯＡ’Ｅ細胞の形態は、一般に、完全に引伸ばされたもの でありかつ紡錘様である。この形態は、細胞拡張プロセスのいくつかが起こって いるにもかかわらず、細胞が拡張して、良く付着した内皮細胞に典型的な非常に 拡張した形態を形成しないことを示している。ＩＩＩＰＴＦＥ上のＨＵＡＥ細胞 の形態は、一般に、２４時間後のＴＣＰ上のそれに類似している。

比較によると、未変性ＰＴＦＥ上に植付けられ付着したＨＵＡＥ細胞の大部分は 角が取れ、もしくは丸められており、個々の細胞の付着は未変性ＰＴＦＥ表面上 よりもｍＰＴＦＥ上のほうが良いことが明確に示されている。

培養培地の血清成分が、ＨＬＩＡＥ細胞のｍＰＴＦＥおよび組織培養プラスチッ クへの付着において果たし得る役割が決定された。

ＨＬＩＡＥ細胞が植付けられた培養培地が血清を含有しない場合には、ＨＬＩＡ Ｅ細胞はｍＰＴＦＥおよびＴＣＰ表面のいずれにおいても拡がらない（第３ａお よびｄ図を参照）。血清粘着性糖タンパクシ質フィブロネクチンおよびビトロネ クチンが、ＨＵＡＥ細胞のｍＰＴＦＥへの付着において果たし得る役割を、アフ ィニティークロマトグラフィーマトリックスを通過させることによってフィブロ ネタチンもしくはビトロネクチンの培養培地の血清成分を選択的に除去するこｅ とにより決定した。培養培地の血清成分からのフィブロネクチンの選択的な除去 は、ＨＵＡＥ細胞のｍＰＴＦＥもしくはＴＣＰへの付着および拡張を妨げない。

培養培地からのビトロネクチンの選択的な除去は、ＴＣＰ表面への細胞付着の減 少を引起こし、付着した細胞も表面上を拡がることが不可能になった（第３ｅ図 を第３ｒ図と比較）。ＨＬＩＡＥ細胞がビトロネクチンを除去した血清を含有す る培地中でｍＰＴＦＥ表面に植付けられた場合には、）ＩＵＡＥ細胞は、元の血 清を用いたｍＰＴＦＥに対する場合と同等の程度に付着しかつ拡張した（第３ｂ 図を第３ｃ図と比較）。血清拡張因子（ｓｅｔｕｍｓｐｒｅａｄｉｎｇ　ｒａｅ ｔｏｒ）エビボリンもしくは７０に拡張因子としても公知であるビトロネクチン の重要性は、以前に、組織培養ポリスチレン（Ｇｒｊｎｎａｌｌ　（１９７６） 　Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、９７．２６５−２７４および（１９７７）　Ｅ ｘｐ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、１１０．１７５−１９０　。

ＵｎｄｅｒｗｏｏｄおよびＢｅｎｎｅｔｔ　（１９８９）　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　５ｃ ｉｅｎｃｅ　（ｉｎｐｒｅｓｓ、　１９８９）参照）およびＮａｆｉｏｎ　（国 際特許比ｉｉ　ＰＣＴ／Ａｌ１８８１００３６ｇ　）のようなポリマー表面につ いて報告されている。これらの結果は、ＴＣＰ表面とは異なり、ＨＵＡＥ細胞の ｍＰＴＦＥ表面への付着にはビトロネクチンは必須ではないことを示している。

こわらの結果は、培養培地が血清を含有する場合に、ｍＰＴＦＥに付着した血清 ビトロネクチンが）ＩＩＪＡＥ細胞のｍＰＴＦＥへの付着および拡張に貢献し得 る可能性を除外するものではない。

その後の増殖を５日間にわたって監視しく第４図を参照）、第５ａ図および第５ ｂ図はそれぞれ３日間増殖した後のＰＴＦＥおよびｍＰＴＦＥ上における形態を 示す。これらの研究は、未変性ＰＴＦＥ上では細胞が増殖せず、７２時間後に細 胞がほとんど見出せない点まで細胞数が減少し、５日後には細胞の付着がないこ とが明白となったのに対して、ｍＰＴＦＥ表面上では細胞の増殖が徐々に起こる ことを示した。

ＨＩＪＡＥ細胞に関しては、Ｆｎで被覆されたＴＣＰ上の細胞の付着、細胞の形 態および増殖は、非被覆Ｔ’ＣＰ上よりも良い（第２表）。同様に、ｍＰＴＦＥ のＦｎ−被覆は、２４時間後で明らかなように、ＨＵＡＥ細胞の付着を増強する （第２表）。これは、Ｆｎ−被覆ｍＰＴＦＥおよびＦｎ−被覆ＴＣＰ表面が、非 被覆表面に見出せる付着細胞数の約２倍の数を支持するという効果を有した。Ｆ ｎ−被覆ｍＰＴＰＥはＨｔＪＡＥ細胞の付着に関してはＦｎ−被覆ＴＣＰと同等 の能力を示し、Ｆｎ−被覆ＰＴＦＥはその細胞数の約８０％を支持した。Ｆｎ− 被覆ｍＰＴＦＥ上における２４時間培養後の細胞の形態は事前にＦｎで被覆して いないｍＰＴＦＥ上よりも著しく拡がっており、一般に、Ｆｎ−被ｍ　ＴＣＰ上 で培養した細胞の形態に類似していた。その後７２時間にわたる増殖の間、Ｆｎ −被覆ｍＰＴＦＥは融合の寸前で対照Ｆｎ−被覆ＴＣＰとの類似を維持していた （第４図を参照、細胞の形態については第６ａ図を第６ｃ図と比較）。しかしな がら、良好な細胞の形態を維持しているにもかかわらず（第６ｂ図）、Ｆｎ−被 覆ＰＴＦＥ試料は５日後にＦｎ−被覆ＴＣＰの細胞数の７５％かられずか５０％ に下落する細胞数の減少を示した。これは、Ｐｎ−被覆ＰＴＦＥ表面はＦｎで被 覆されていないｍＰＴＦＥよりもわずかに良好となることを示している（第４図 および第６ｄ図）。Ｆｎ−被覆ｍＰＴＦＥおよびＦｎ−被覆ＴＣＰの両者は、５ 日間、比較し得る増殖速度で細胞数が増加し続けた。

この発明は、内皮細胞に対する適切な支持を提供する材料の評価およびデザイン に中心をおいている。この内皮細胞は、イン・ビボにおいてそれらが行なってい るような抗血栓性表面を提供しなければならない。ヒツジ頚動脈およびヒト調動 脈由来の内皮細胞を変性ＰＴＦＥ膜および変性ＰＴＦＥチューブ表面上において 連続的に増殖させることによって、変性ＰＴＦＥ表面が良好な細胞支持特性を有 することを見出した。

この結果は、このＰＴＦＥの化学的変性方法が、ＰＴＦＥの細胞接着特性の改良 に使用することが可能であり、この化学的に変性したＰＴＦＥ表面が、血管補綴 物および経皮移植物を含む移植可能物質への使用に対して未変性ＰＴＦＥよりも 優れていることを示している。

ＰＴＦＨの細胞支持能力を強化するためのこれらの実施例に記述された技術が、 拡張されたＰＴＦＥ　（ＧＯＲＥ−ＴＥＸの登録商標で販売されている）および 他のフルオロカーボンポリマーに対して適用可能であることは当業者には明らか であろう。

前記はこの発明の態様のいくつかのみを記述しており、当業者には明らかなよう に、この発明の範囲から離れることなくそれらを変形することが可能である。

国際調査報告

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞の付着および増殖のための表面の作成方法であって、 ｉ）フルオロカーボンポリマー基材に、該フルオロカーボンポリマー基材の重量 が０．１％ないし２０％増加するように、ポリアクリル酸鎖をグラフト化する工 程と、ｉｉ）工程ｉ）によって生じたフルオロカーボンポリマー表面を、グラフ ト化されたポリアクリル酸鎖の有効割合を別々に脱炭酸化、芳香族化およびスル ホン化するに充分高い温度および時間で、濃硫酸を用いて処理する工程と、ｉｉ ｉ）工程ｉｉ）によって生じた表面を乾燥する工程と、ｉｖ）工程ｉｉｉ）によ って生じた表面を濃酸に浸漬する工程と、 ｖ）工程ｉｖ）によって生じた表面を中和する工程と、を有する方法。
2. ２．中和した表面を、血清、血清もしくは結合組織由来の細胞付着因子、または 組織増殖因子のいずれかで処理する工程をさらに含む請求の範囲第１項に記載の 方法。
3. ３．前記細胞付着因子がフィブロネクチンまたはビトロネクチンを含む群から選 択される請求の範囲第２項に記載の方法。
4. ４．ポリアクリル酸鎖を、γ線照射グラフト化またはレーザーグラフト化手段の いずれかによってフルオロカーボンポリマー基材にグラフト化する請求の範囲第 １項ないし第３項のいずれか１項に記載の方法。
5. ５．工程（ｉｉ）を１０５℃の温度で２時間行なう請求の範囲第１項ないし第４ 項のいずれか１項に記載の方法。
6. ６．工程（ｉｉｉ）を１０５℃の温度で４時間行なう請求の範囲第１項ないし第 ５項のいずれか１項に記載の方法。
7. ７．工程（ｉｖ）を室温で４時間濃硝酸に浸漬することによって行なう請求の範 囲第１項ないし第６項のいずれか１項に記載の方法。
8. ８．工程（Ｖ）をｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水で洗浄することによって行なう 請求の範囲第１項ないし第７項のいずれか１項に記載の方法。
9. ９．前記フルオロカーボンポリマー基材が、ポリテトラフルオロエチレン、フッ 素化エチレンプロピレン、ポリクロロトリフルオロエチレンおよびフッ化ポリビ ニリデンを含む群から選択される請求の範囲第１項ないし第８項のいずれか１項 に記載の方法。
10. １０．請求の範囲第１項ないし第９項のいずれか１項に記載の方法によって作成 された細胞の付着および増殖のための表面。
11. １１．炭素原子７５個当り約１個の硫黄原子を含有する請求の範囲第１０項記載 の表面。
12. １２．請求の範囲第１０項または第１１項の表面を組込んだ組織移植片。
13. １３．表面上の細胞の付着および増殖を促進する方法であって、 （ａ）請求の範囲第１項ないし第９項のいずれか１項に記載の方法に従って表面 を作成することと、（ｂ）該表面を細胞にさらすことと、 を含む方法。
14. １４．付着および増殖させようとする細胞が、内皮細胞、上皮細胞、繊維芽細胞 および他の間葉組織由来細胞を含む群から選択される請求の範囲第１３項に記載 の方法。
15. １５．表面上の細胞の付着および増殖を促進する方法であって、実施例を参考と して実質的に前記の通りである方法。