JPH02171182A - 付着依存性細胞用増殖助剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、付着依存性細胞用無血清ないし低血清含有培
地において、固定化プロテアーゼインヒビターを有効成
分とする付着依存性細胞用増殖助剤に関する。

〔従来の技術〕

付着依存性細胞を用いた有用物質の工業的生産等には、
先ず細胞を増殖することが必須であるが、付着依存性細
胞の増殖には浮遊系細胞のそれと異なり培養担体への付
着が必要である。付着依存性細胞、例えば動物細胞を培
養する場合には従来から牛胎児血清や子牛血清などを通
常５〜１０％Ｖ／Ｖ添加した血清含有培地が用いられて
いる。

しかしこのような血清含有培地は、血清自体が高価であ
るにもかかわらず、血清のロフト間の品質差があり、同
一品質の血清を得ることが困難であるとの欠点があり、
また培養された細胞培養物からの目的有用物質の単離、
精製も困難となる欠点があり、近年安価な低血清含有培
地ないし無血清培地について研究されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

無血清培地としては、例えばＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４
０，ハムＦ−１２などを基礎培地として、これにインシ
ュリン、トランスフェリン、ＥＧＦ、ファイプロネクチ
ンなどの血清代替成分を適宜選択組合せて添加した培地
が用いられていた。

ところがこのような無血清培地や低血清含有培地を用い
る培養においては小規模での培養を可能とするが、工業
的生産の如くの大量培養においては増殖速度、細胞密度
、細胞の安定性などの点で血清含有培地による場合に比
べて、なお多くの改良を必要としている。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、より有用な無血清培地ないし低血清含有
培地を構築するこうを目的として、付着依存性細胞であ
るヒト組織由来細胞の継代培養を行った後、血清を用い
る場合と同様に速やかに細胞の増殖促進を示し、または
増殖を安定的に維持する物質の検索を行った。その結果
、遊離のプロテアーゼインヒビターが細胞の増殖を抑制
するに対して、全く意外にも固定化プロテアーゼインヒ
ビターは細胞の増殖を安定に維持し、かつ細胞増殖を促
進する効果を有することを見出し、固定化プロテアーゼ
インヒビターが付着依存性細胞の増殖助剤となり得るこ
とを見出した。

本発明は上記の知見に基づいて完成されたもので、付着
依存性細胞用無血清ないし低血清含有培地において、固
定化プロテアーゼインヒビターを有効成分とする付着依
存性細胞用増殖助剤であるまず本発明における付着依存
性細胞とは、培養担体への付着が細胞増殖の必須要因で
ある細胞で一般的には付着性の動物細胞が例示され、例
え、ぼ正常および胎児組織由来の付着性正常２倍体初代
または株化細胞ならびに癌およびその他の組織由来付着
性正常２倍体初代または株化細胞が挙げられる。具体的
には、ヒト組織由来細胞、例えばヒト腎癌細胞ＴＲＣ−
２９Ｒ（微工研菌寄第１０２７４号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−
１０２７４））およびヒト肺癌細胞ＴＬＣ−９Ａ　（特
開昭６２−３８３２５号公報）などが例示される。

ヒト腎癌細胞ＴＲＣ−２９Ｒの性状は下記に示すとおり
である。

■形態：上皮細胞様、 ■染色体数：高３倍体域である染色体数７４本のモーダ
ル・ナンバーを示すことを特徴とする染色体数の分布モ
ード、 ■継代培養＝無限な継代培養、 ■機能的特徴：ヒトーＣ３Ｆ産生、 ■細胞増殖性：細胞の増殖が進み、飽和状態になると重
層状に増殖する傾向が見られる。特に、５〜２０％牛脂
児血清を含むＲＰＫＩ−１６４０培地において増殖性良
く、ボピュレイション・ダブリング・タイムは２９±６
時間である。

また固定化プロテアーゼインヒビターとはプロテアーゼ
インヒビターを不溶性または親水性の固定化担体に固定
化したものを示し、本発明に使用しうるプロテアーゼイ
ンヒビターとしてはプロテアーゼ、例えばトリプシンな
どを有効に阻害するものであればよく、例えばα１−プ
ロテア−ゼ・インヒビター、α１−マイクログロブリン
、オボインヒビター、ウシ膵臓トリプシンインヒビター
、ダイズトリブシン・インヒビター、リママメ・インヒ
ビター、ナンキンマメ・インヒビターインゲンマメ・イ
ンヒビター、マングマメ・インヒビター、フジマメ・イ
ンヒビター、タチナタマメ・インヒビター、フジマメ・
インヒビター、ポテト・インヒビター、ストレプトミセ
スズブチリシン・インヒビター、プラスミノストレプチ
ン、抗プロテアーゼ抗体およびその他の合成プロテアー
ゼインヒビター、例えばベンズアミジン塩酸塩、ｐ−ア
ミノベンズアミジン塩酸塩、フッ化フェニルメチルスル
ホニル、ｐ−トルエンスルホニル−し−リジンクロルメ
チルケトン塩酸塩等が挙げられる。さらに、細胞培養の
ために固定化プロテアーゼインヒビターを細菌、カビ等
の微生物のコンタミの防止のために、熱殺菌が可能な合
成プロテアーゼインヒビター、例えばベンズアミジン塩
酸塩、ｐ−アミノベンズアミジン塩酸塩、フッ化フェニ
ルメチルスルホニル、Ｐ−トルエンスルホニル−し−リ
ジンクロルメチルケトン塩酸塩等、が好ましい。

固定化担体としては、プロテアーゼインヒビターを固定
化するための官能基、例えばアミノ基、イミノ基、カル
ボキシル基、アルデヒド基、カルボニル基、ヒドロギシ
ル基、チオール基、アミド基、シアノ基、イソシアノ基
など、またはこれらの官能基から誘導された、少なくと
もプロテアーゼインヒビターを固定化するための反応性
基を有していればよく、何ら限定されるものではなく、
例えばアルブミンやゼラチンなどの蛋白質の不溶化した
もの、アガロース、セルロース、セファロース、デキス
トリンやキトサンなどの多糖類のエピクロルヒドリン処
理による不溶化したものや臭化シアン処理やその他のア
ミノ基導入試薬、チオール基導入試薬やカルボキシル基
導入試薬などの公知の反応性基導入試薬を用いて処理し
た不溶性半合成高分子系担体、また例えばアクリロニト
リル、アクリル酸、アクリル酸エステル、メタアクリル
酸、メタアクリル酸エステル、ビニルアルコール、酢酸
ビニル、スチレン、アミノスチレン、クロルスチレン、
スルホスチレン、マレイン酸、フマル酸などのモノマー
からなる重合体または他の七ツマ−との共重合体や例え
ばヒドロキシメチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシ
エチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メ
タ）アクリレート等のヒドロキシアルキル（メタ）アク
リレート、（メタ）アクリルアミド、グリシジル（メタ
）アクリレートなどのモノマーとの共重合体の親水性担
体や、さらにそれらのハイポーラスなものなどの合成高
分子系担体やケイ素やアルミニウムなどの無機化合物ま
たはそのハイポーラス無機化合物の不溶性無機系担体な
どが挙げられる。

プロテアーゼインヒビターを固定化担体に固定化するに
当たっては、固定化担体のハイポーラス吸着能に基づく
吸着固定化を行ってもよく、または固定化担体の有する
官能基またはそれに導入した官能基とプロテアーゼイン
ヒビターの有する官能基またはそれに導入した官能基ま
たはその反応性基とを必要に応じて架橋剤を用いて共有
結合または抱合せしめてもよい。また官能基を導入する
場合にはスペーサー導入のための試薬を用いてもよく、
例えばスクシニルアルデヒド、グルタルアルデヒド、ア
ジボアルデヒド、などのジアルデヒド化合物、ω−アミ
ノ酪酸、ω−アミノグルタミン酸などのアミノ酸化合物
またはその酸クロライド、スクシンイミドエステル、ｐ
−ニトロフェニルエステルなどの反応性誘導体、マロン
酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸などのジカルボ
ン酸化合物またはその反応性誘導体、ヘキサメチレンジ
アミン、デカメチレンジアミンなどのジアミン化合物、
３−（２”−ビリジルージチオ）プロピオン酸、３−（
２”−ピリジル−Ｎ−オキシド−ジチオ）プロピオン酸
、３−（２”　−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオ
ン酸などのチオカルボン酸化合物またはその反応性誘導
体、Ｓ−アセチルメルカプトカプトサクシニック・アン
ハイドライド、２−アミノエタンチオール、Ｔ−アミノ
プロピルエトキシシランなどの試薬の１種または２種以
上を用いてアルデヒド基、カルボキシル基、アミノ基、
チオール基などの官能基を導入してもよい。さらにこの
ような固定化担体およびプロテアーゼインヒビターの共
有結合体を得るに当たっては、この固定化担体、プロテ
アーゼインヒビターの有するアミノ基、水酸基、カルボ
キシル基、チオール基などの官能基またはその反応性誘
導体やさらに導入された官能基またはその反応性誘導体
に基づいて、必要に応じて両者を結合しえる架橋試薬を
用いて得られる。また架橋試薬としては、アミノ基、水
酸基、カルボキシル基、チオール基などの官能基と反応
し得る基を２つ以上有する多官能性試薬であればよく、
例えばスクシニルアルデヒド、グルタルアルデヒド、ア
ジボアルデヒド、などのジアルデヒド化合物、マロン酸
、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸などのジカルボン
酸化合物またはその反応性誘導体、ヘキサメチレンジイ
ソシアナート、２．４−）ルエンジイソシアナートなど
のジイソシアナート化合物、マレイミド安息香酸、マレ
イミドフェニル酢酸などのマレイミドカルボン酸化合物
またはその反応性誘４体、Ｎ、Ｎ’　−エチレンビスマ
レイミド、ＮＩＮ’　−ｏ−フェニレンジマレイミドな
どのシマレイミド化合物、ビスジアゾベンジジン、ジエ
チルマロンイミデート、ジメチルアジピンイミデート、
Ｎ、Ｎ’　−ポリメチレンビスヨードアセトアミドや３
−（２“−ピリジル−ジチオ）プロピオン酸、３−（２
“−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオン酸などのチ
オカルボン酸化合物またはその反応性誘導体、Ｎ−（２
−（２°−、ビリジルージチオ）エチル）−３−（２°
−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオンアミド、１−
（２”−ベンゾチアゾリル−ジチオ）−２−（２’　−
ピリジル−ジチオ）エタンなどのジチオ化合物、エチレ
ングリコールジグリシジルエーテル、■、４−ブタンジ
オールジグリシジルエーテル等のジグリシジルエーテル
化合物またはその反応性誘導体が挙げられ、これらの試
薬は、用いる固定化担体およびプロテアーゼインヒビタ
ーの結合に関与するアミノ基、水酸基、カルボキシル基
、アルデヒド基、チオール基などの官能基を考慮して選
択使用すればよく、またその反応媒体としては、例えば
水、緩衝液、アセトン、アルコール、ＤＭＦ、ＤＭＳｏ
などの有機溶媒、または含水有機溶媒、クロロホルム、
メチレンクロライド、エチレンクロライド、石油エーテ
ルなどの有機溶媒を適宜選択使用すればよい。さらに固
定化後、適宜固定化プロテアーゼインヒビターを単離し
、溶媒にて洗浄すればよい。また入手の容易な市販品で
ある固定化プロテアーゼインヒビターとして、Ｂｅｎｚ
ａｍｉｄｉｎｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ　（ファル
マシア社製、商品名）のゲル状物や磁性体を固定化担体
に保持させた磁気により使用後の分離回収が可能である
ｐ−Ａｍｉｎｏ−Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ−Ａｇａｒｏ
ｓｅ　　（磁気分離用）（ステロ−ジンバイオケミカル
社製、商品名）を用いることもできる。

固定化プロテアーゼインヒビターの形状は、用する固定
化担体の形状に基づき粒子状や繊維状等のどのような形
状であってもよく、その大きさはその後の分離回収のし
易すさ等を考慮して適宜変更しうるが、通常粒子状で粒
径１００μｍ〜１ｍｍ程度のものが使用される。また、
固定化プロテアーゼインヒビターゲル（含水率８５〜９
５％）１ｍｌ当りトリプシン約５〜２０ｍｇが結合し得
、ゲル１ｍｌで５０．ｃｚｇ／ｍｊ！）リブシン液約３
００ｍｊ！を処理できるが、好ましくは５０〜２００ｍ
ｆの範囲で調製すればよい。

本発明の培養法は、細胞の増殖を目的とする種々の培養
手段に使用でき、例えば付着依存性細胞の大量培養にも
好適である。このような培養において、培養担体は培養
用容器壁等であってもよいが、培養時の該細胞の付着表
面積を増加せしめ栄養分の補給やガス交換が容易とせし
めるため、マイクロキャリアー（以下、Ｍｃと略す）を
用いることがより好ましい。Ｍｅとしては、デキストラ
ン、変性コラーゲン、ガラス、ポリスチレン、ポリアク
リルアミドやセルロース等がよく利用され、動物細胞の
培養においては、通常、粒径１００〜２００μｍの粒状
物が使用される。また、このようなＭｃに磁性体を保持
せしめた磁性体保持担体を培養担体として使用すること
も以後の分離回１収に有用であり好ましく、さらに好ま
しくはＭｃ内部に磁性体を含有せしめた培養担体を使用
して培養してもよい。また、この固定化プロテアーゼイ
ンヒビクーを、無血清ないし低血清含有培地に添加する
が、その固定化プロテアーゼインヒビターの量としては
、プロテアーゼインヒビターの培地濃度として、少なく
とも０．０５ｍＭ添加すればよく、通常０．３ｍＭ〜５
ｍＭ程度、好ましくは０．５ｍＭ〜２ｍＭ程度である。

また本発明における無血清培地とは特に限定されるもの
ではな（、例えばホワイト（Ｗｈｉｔｅ　）の培地、フ
ィシャ−（Ｆｉｓｈｅｒ）の培地、パーカー（Ｐａｒｋ
ｅｒ　）の培地、アーレ（Ｅａｒｌｅ　）の培地、ウェ
イマウス（ＷａｙＨｏｕｔｈ）の培地、イーグル（Ｅａ
ｇｌｅ）の培地、パック（Ｐａｃｋ）の培地、ハム（ｌ
ｌａｍ　）の培地、トロウェル（Ｔｒｏｗｅｌｌ　）の
培地、マックコイ（Ｍｃｃｏｙ　）の培地、ムーア（Ｍ
ｏｏｒｅ　）の培地、ウィリアムズ・メディウム（Ｗｉ
ｌｌｉａｍ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ）Ｅ培地などの種々の基
礎培地とその改変培地、さらにそれらの混合培地が挙げ
られる。さらに例示すれば、組成公知のフィシャーの培
地としてはＶ−６１４、バーカーの培地としてはＭ１５
０、Ｍ２Ｂ５、Ｍ２Ｏ３、Ｍ８５８、Ｍ２Ｏ３、ＣＭＲ
Ｌ−１０６６、ＣＭＲＬ−１４１５、アーレの培地とし
てはＮＣＴＣ１０９、ＮＣＴＣｌ　３５、ウェイマウス
の培地としてはＭＢ７５２／ＬＢＭＥ、イーグルの培地
としてはＭＥＭ、ダルベツコＭＥＭ、ジョウワリンク、
アルファＭＥＭ、パックの培地としてはＮ１５、Ｎ１６
、ハムの培地としてはＦ７、ＦＩＯ１Ｆ１２、トロウェ
ルの培地としてはＴ７、マックコイの培地としてはフッ
クコイ５Ａ、ムーアの培地としてはＲＰＭＩ−１６２９
、ＲＰＭＩ−１６３０、ＲＰＭＩ−１６３４、ＲＰＭＩ
−１６４０などの培地またはそれらの混合培地が挙げら
れる。また、例えばＭＥＭ培地、１９９培地、ハム培地
、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＣＭＲＬ−１０６６培地、
ＮＣＴＣ１０９培地等の組成においては、種々のアミノ
酸類、ビタミン類、無機塩類やその他グルコース等を添
加調製したものでも良い、さらに、このような培地にお
いて、リン脂質、脂肪酸好ましくは不飽和脂肪酸、アミ
ン化合物好ましくはエタノールアミン、インシュリン、
グルカゴン、ソマトスフチン、パラサイロイドホルモン
（ＰＴＨ）　、チロプロティン・リリージングホルモン
、ルテイニング・ホルモン・リリージングホルモン、（
ＬＨ−ＲＨ）、セレン、トランスフェリン、アルブミン
、エビデルマル・グロス・ファクター（ＥＧＦ）、ファ
イブロブラスト・グロス・ファクター（ＦＧＦ）、プロ
スタグランジン、例えばプロスタグランジンＦ２α、プ
ロスタグランジンＥＩ、トリョードチロニン、ハイドロ
コーチシン、プロゲステロン、テストステロン、エスト
ラジオール、ラクトアルブミン、その他抗生物質などか
ら選択した一種以上の化合物を添加調整してもよい。

また、低血清含有培地とは、具体的には、上記無血清培
地等に例えば０．５％以下の血清を添加調整した培地を
示す。

次いで付着依存性細胞の培養に当たっては、上記の如（
調整された培地に通常ｌＸｌ０’〜５×１０６個／　ｍ
　ｌの細胞濃度となるように添加して移植すればよく、
培養条件は細胞の種類により適宜変更し得るが、動物細
胞の場合には通常３７°Ｃ１５％ＣＯ□、１００％相対
湿度の条件にて９６時間以上培養を行えばよい。

〔実施例〕

次いで本発明の実施例を挙げるが、本発明はこれらによ
って何ら限定されるものではない。

実施例１ 径１０ｃｍのシャーレにて２％牛脂児血清（以下ＦＣ３
という）含有ＲＰＭＩ−１６４０（日永製薬製）培地で
４日間培養したヒト腎臓癌細胞由来の株化細胞ＴＲＣ−
２９Ｒ株をトリプシン（バイオザイム・ラボラトリ−社
製；５００ＯＮＦＵ／ｍｇ）を５０μｇ　／　ｍ　ｌ含
有、マグネシウム、カルシウム不含のリン酸緩衝塩類溶
液（以下、ＰＢＳ　（−）という）で３７°Ｃ１１０分
間処理して細胞を分散させ、ＰＢＳ（−）で３回洗浄し
た。

次いでこの細胞を、各種増殖因子を含有するＲＰＭＩ−
１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製ＲＰＭＩ−１６４０培地
に１０　ｎｇ／ｍ／！ＥＧＦ　（東洋紡績社製）、５μ
ｇ　／　ｍ　ｊ！ベインュリン（シグマ゛社製）、１μ
ｇ／ｍｊ１ランスフェリン（シグマ社製）、１μＭ硫酸
第一鉄（和光純薬社製）　、０．０１χ（Ｗ／Ｖ）低分
子ゼラチン（■ニッピ社製）、１０μｇ／ｍ１葉酸（和
光純薬社製）、ｌｏｍＭヘベス（シグマ社製）　、０．
３χ（Ｗ／Ｖ）重曹（和光純薬社製）、１１００ｕ／ｍ
ｌ！ペニシリンＧ（明治製菓社製）、１００μｇ　／　
ｍ　ｌ硫酸ストレプトマイシン（明治製菓社製）を補添
した培地；以下、無血清培地という）に２Ｘ１０’セル
／ｍｌ細胞濃度になるように懸濁して細胞浮遊液を得た
。

また固定化プロテアーゼインヒビター含有培地は、予め
熱殺菌（オートクレーブで１２１℃、１５分）したベン
ズアミジンセファロース６Ｂ（固定化−ＰＡＢと称する
）を、無血清培地にプロテアーゼインヒビター濃度とし
て０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ濃度となるよう
に添加して調製した。さらに対照として、同一濃度の遊
離のプロテアーゼインヒビターを無血清培地に添加して
使用した。

次いで１．２４穴マルチプレート（Ｎｕｎｃ社製）４こ
前記の細胞浮遊液を０．５ｍｌづつ播種した後、調製し
た各濃度のプロテアーゼインヒビター含有培地の０．５
ｍｌを分注して全ｆｉ　１　ｍ　ｌとした。その後、３
７°Ｃの炭酸ガスインキュベーター内で６日間培養した
。この培養による増殖細胞を剥離分散させ、細胞数計測
装置（コールタ−社製；商品名コールタ−カウンター）
を用いて細胞数を計測した。その結果を第１図に示すも
ので、図中、・は固定化プロテアーゼインヒビター含有
培地の場合を示し、Ｏは遊離のプロテアーゼインヒビタ
ー含有培地の場合を示す。

この第１図に示す通り、対照とする′ｆ１離のプロテア
ーゼインヒビター含有培地での細胞増殖はプロテアーゼ
インヒビター濃度の増加とともに抑制的の作用したもの
であった。しかし本発明の固定化プロテアーゼインヒビ
ター含有培地では、プロテアーゼインヒビター濃度に影
響されることなく、付着依存性細胞が安定な増殖を示し
た。

実施例２ 実施例１で調製した各種のプロテアーゼインヒビター含
有培地（プロテアーゼインヒビター濃度２ｍＭおよび０
．５ｍＭを使用）に、トリプシンを２μｇ／ｍｌ、５ｔ
ｔｇ／ｍｌ、ｌＯｕｇ／ｍｌ濃度になるように添加して
トリプシン残留培地を調製した。

次いで２４穴マルチプレートに、実施例１で調製した細
胞浮遊液を０．５ｍｌづつ播種した後、調製した各濃度
のトリプシン残留培地を０．５ｍｌづつ分注して全量１
　ｍ　ｌとした。これを、３７°Ｃの炭酸ガスインキュ
ベーク−内で６日間培養した。その結果を第２図（トリ
プシン濃度２μｇＺｍｌ使■の場合）、第３図（トリプ
シン濃度５μｇ／ｍｌ使用の場合）、第４は（トリプシ
ン濃度１０μｇ／ｍｌ使用の場合）に示すもので、各図
中、Ｏは固定化プロテアーゼインヒビターのプロテアー
ゼインヒビター培地最終濃度１ｍＭ含有培地の場合を示
し、・は固定化プロテアーゼインヒビターのプロテアー
ゼインヒビター培地最終濃度０．２５ｍＭ含有培地の場
合を示し、Δは遊離のプロテアーゼインヒビターのプロ
テアーゼインヒビター培地最終濃度１ｍＭ含有培地の場
合を示し、ムは遊離のプロテアーゼインヒビターのプロ
テアーゼインヒビター培地最終濃度０．２５ｍＭ含有培
地の場合を示し、口はプロテアーゼインヒビター無添加
の培地による細胞増殖曲線を示した。

この結果、遊離のプロテアーゼインヒビターは、プロテ
アーゼインヒビター無添加の培地による細胞増殖に比較
して、僅かな増殖を促進する場合も観察されたが、全般
には付着依存性細胞の増殖を抑制する傾向が見られた。

ところが、本発明の固定化プロテアーゼインヒビター添
加培地における細胞の増殖は、プロテアーゼインヒビタ
ー無添加の培地による細胞増殖に比較して増殖を促進す
る効果が認められた。

〔発明の効果〕

本発明における固定化プロテアーゼインヒビターは、遊
離のプロテアーゼインヒビターの作用と全（異なり、細
胞培養において安定な増殖を維持せしめ、またプロテア
ーゼインヒビター無添加の培地による細胞増殖に比較し
て増殖を促進する効果が認められるものであるが、推定
であって限定するものではないが、固定化プロテアーゼ
インヒビター自体が細胞増殖因子であると考察するもの
ではなく、細胞増殖は無血清培地における各種の増殖因
子によると推定され、固定化プロテアーゼインヒビター
自体は上記の如くの増殖を補助する助剤的効果を発揮し
たものと推測され、本発明の効果を細胞増殖助剤とした
ものである。

また以上の効果の確認は無血清培地で行いプロテアーゼ
インヒビター無添加の培地による細胞増殖に比較して増
殖を促進する増殖助剤の効果を認めたものであるが、無
血清培地の代わりに低血清含有培地においても同様の効
果が得られるものである。

このように固定化プロテアーゼインヒビターを付着依存
性細胞の増殖助剤として使用することにより、無血清な
いし低血清含有培地においても、より安定に細胞増殖を
なすことが可能となり、無血清ないし低血清含有培地に
おける付着依存性細胞の効率的な培養法および培養のた
めの有用な培地組成物を提供するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図、 第２図、 第３図およ、び第４図は、 細胞 増殖曲線を示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）付着依存性細胞用無血清ないし低血清含有培地に
   おいて、固定化プロテアーゼインヒビターを有効成分と
   する付着依存性細胞用増殖助剤。
2. （２）固定化プロテアーゼインヒビターにおけるプロテ
   アーゼインヒビターの培地濃度が、少なくとも０．０５
   ｍＭである請求項（１）記載の増殖助剤。
3. （３）付着依存性細胞が、ヒト組織由来細胞である請求
   項（１）記載の増殖助剤。
4. （４）ヒト組織由来細胞が、ヒト腎癌由来細胞ＴＲＣ−
   ２９Ｒ（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０２７４）である請求項（１
   ）記載の増殖助剤。