KR101157437B1 - 포유류 공급원 성분이 없는 ｃ. 히스톨리티쿰용 성장 배지 - Google Patents

포유류 공급원 성분이 없는 ｃ. 히스톨리티쿰용 성장 배지 Download PDF

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Abstract

본 발명은 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 의 배양용의 개선된 배지 및 콜라겐분해효소의 생명공학적 제조를 위한 배양 상청액을 제공한다. 본 발명에 따른 영양분 배지는 비-포유동물 공급원, 바람직하게는 식물-유래 펩톤으로부터의 하나 이상의 펩톤을 포함한다. 상기 배지는 부가적으로 생선 젤라틴을 포함할 수 있다. 본 발명은 상기 배지, 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 콜라겐분해효소를 포함하는 배양 상청액, 및 상기 콜라겐분해효소의 제조 방법을 제공한다.

Description

포유류 공급원 성분이 없는 Ｃ. 히스톨리티쿰용 성장 배지 {GROWTH MEDIUM FOR C. HISTOLYTICUM WITHOUT INGREDIENTS OF MAMALIAN SOURCES}
본 발명은 미생물학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 용 배양 배지의 최적화에 관한 것이다.
클로스트리디움 (Clostridium) 속은 내생포자를 생성할 수 있는 절대 혐기성균인 막대형 그람-양성 박테리아에 속한다. 클로스트리디움 (Clostridium) 에는 통상의 부유 박테리아 뿐 아니라 C. 보툴리눔 (C. botulinum), C. 디피실 (C. difficile), C. 페르프린겐 (C. perfringens), C. 테타니 (C. tetani), 및 C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 을 비롯한 중요한 병원체가 포함된다. 후자는 외독소이며, 예를 들어 기체 괴저 확장을 용이하게 함으로써 발병 인자로서 작용하는 콜라겐분해효소를 생성하는 것으로 알려져 있다. 콜라겐분해효소는 정상적으로는 근육 세포 및 기타 신체 기관 중의 결합 조직을 표적으로 한다. 결합 조직에 대한 잠재적인 가수분해 활성으로 인해, 콜라겐분해효소 및 테르몰리신과 같은 기타 프로테인분해효소가 시험관 내 조직 해리에 사용된다.
C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 은 토양에서 단리될 수 있다. 그러나, 박테리아는 거의 상처에서 발견되지 않는다. C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 은 엄격하게 혐기성이지는 않으며, 호기성으로 인큐베이션된 배지에서 약하게 성장할 수 있다. 배양물에서, 단백질 및 펩티드가 펩티드 결합을 가수분해할 수 있는 다양한 효소를 분비하는 C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 의 주요 탄소 공급원이다.
기술적 적용을 위해, C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 으로부터의 콜라겐분해효소, 즉, 유형 I 및 유형 II 의 콜라겐분해효소가 예를 들어, 시험관내 기관 조직의 해리에 특히 중요하다. 중요하게는, 췌장 조직의 콜라겐분해효소 소화는 현재 인간 섬 (islet) 세포의 준비 및 단리에 사용된다. 그러나, 다수의 다른 상이한 특이적인 세포 유형은 지방 조직으로부터의 지방 세포, 간으로부터의 간세포, 연골로부터의 연골세포, 심장으로부터의 근육세포, 및 뼈로부터의 골모세포를 비롯한 수행 결합조직으로부터 단리된다.
C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 이 간단한 액체 배지에서 대량으로 배양될 수 있고, 이것이 배양 배지 내로 분비되는 상당한 양의 단백질 가수분해 효소를 정규적으로 생성하는 것이 실시적인 장점이다.
RO 51768 호에는 콜라겐분해효소를 생성하기 위한 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 의 성장용 배지로, 펩톤 및 파라핀 오일이 함유된 배지가 기재되어 있다.
RU 2180002 호에는 카세인 및 대두 오일 케이크 가수분해물을 포함하는 클로 스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 의 콜라겐분해효소의 발효 및 정제용 배지가 기재되어 있다. 추가 성분은 이수소나트륨 포스페이트 모노히드레이트, 일수소칼륨 포스페이트 디히드레이트, 피리독신, 리보플라빈, 티아민 브로마이드, 엽산, 칼슘 판토테네이트, 니코틴산, 리포산 및 비오틴이였다.
WO 2003/025136 호에는 클로스트리디움 콜라게노보란스 (Clostridium collagenovorans) 로부터의 셀룰로오스 및 콜라겐분해효소의 생성용의 젤라틴계 발효 배지가 기재되어 있다.
WO 2007/089851 호에는 C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 의 발효에 유용한 배지 조성물 및 방법이 기재되어 있다. 배지의 단백질성 구성요소에는 피톤 펩톤, 효모 추출물, 프로테오스 펩톤, 트립톤 및 다양한 식물성 추출물이 포함되었다. 돼지-유래 프로테오스 펩톤이 이러한 조건 하에서 콜라겐분해효소를 배양 브로스 내로 분비하는 C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 균주의 성장을 부양하는 것이 발견되었다. 프로테오스 펩톤이 함유된 배양 배지는 함께 분비되는 클로스트리파인 프로테아제의 함량을 감소시키기 위해 최적화되었다.
C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 의 배양물은 뇌-심장 침출배지 (brain-heart infusion: BHI 배지) 와 같은 동물 유래 생성물의 사용을 실존적으로 필요로 한다 (예를 들어, Jozwiak, J., et al., Enzyme and Microbial Technology 39 (2006) 28-31). 그러나, 배지 중 포유류 기원의 단백질성 물질의 필요성은 배지의 가능한 오염에 대한 염려를 불러일으킨다. 특히, 배지가 임의의 전염성 해면상 뇌증 (TSE) 야기제 또는 기타 감염 및 유해제로 감염될 수 있다는 염려는, 이러한 배양물로부터 유래된 임의의 인자, 특히 치료 적용에서의 유용성에 제한을 가한다.
그러므로, 현 시점에서의 C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 용 배양 배지는 특정의 단점을 가지고 있다. 이러한 관점에서, C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 의 성장을 부양하기 위한 배지용의 대안적인 조성물을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 본 발명의 특정한 초점은 포유류 유래 성분이 없는 성장 배지를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 의 발효에 유용한 액체 배지를 제공하는 것을 목적으로 한다. 부가적으로는, 콜라겐분해효소 활성을 가진 효소를, 바람직하게는 배양 상청액으로부터 대규모로 효소를 경제적으로 정제할 수 있는 양으로 배양 배지 내로 분비하도록 부양하는 배지를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 출원인은 놀랍게도 생선 젤라틴과 비-포유류 공급원 유래의 펩톤의 조합 으로 상기 기술적 문제를 해결함을 발견하였다.
발명의 요약
본 발명의 제 1 양상은 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 의 성장 및 콜라겐분해효소의 분비를 부양하기 위한 액체 조성물로서, 상기 조성물은 물, 비-포유류 공급원의 펩톤 및 생선 젤라틴을 포함한다. 본 발명의 추가 양상은 본 발명에 따른 멸균된 액체 조성물이다. 그러나, 본 발명의 추가 양상은 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 을 배양하고 그로부터 콜라겐분해효소 활성이 있는 프로테아제를 분비하기 위한 본 발명에 따른 조성물의 용도이다. 그러나, 본 발명의 추가 양상은 상청액이 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 함유하고, 하기 (a) ~ (c) 단계로, 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 함유하는 배양 상청액을 제조하는 것을 포함하는, 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 액체 배양물의 상청액의 제조 방법이다: (a) 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 박테리아의 접종물을 함유하는 본 발명에 따른 멸균 조성물을 제공하는 단계; (b) 박테리아를 성장 및 배양시켜 (= 배양물, 바람직하게는 배치 배양물 제조), 박테리아가 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 액상 내로 분비하는 단계; (c) 액상으로부터 세포 및 기타 미립자 물질을 분리시키는 단계. 또한, 본 발명의 추가 양상은 하기 (a) ~ (c) 단계의 방법에 의해 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 으로부터 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 포함하는 배양 상청액을 수득하여 수득가능한, 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 으로부터의 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 포함하는 배양 상청액이다: (a) 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 박테리아의 접종물을 함유하는 본 발명에 따른 멸균 조성물을 제공하는 단계; (b) 박테리아를 성장 및 배양시켜, 박테리아가 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 액상 내로 분비하는 단계; (c) 액상으로부터 세포 및 기타 미립자 물질을 분리시키는 단계. 또한, 본 발명의 추가 양상은 하기 (a) ~ (d) 단계로 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 으로부터 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 정제된 프로테아제를 제조하는 것을 포함하는, 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 으로부터의 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 정제된 프로테아제의 제조 방법이다: (a) 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 박테리아의 접종물을 함유하는 본 발명에 따른 멸균 조성물을 제공하는 단계; (b) 박테리아를 성장 및 배양시켜, 박테리아가 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 액상 내로 분비하는 단계; (c) 액상으로부터 세포 및 기타 미립자 물질을 분리시켜, 배양 상청액을 수득하는 단계; (d) 배양 상청액으로부터 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 단리하는 단계.
발명의 상세한 설명
특정 용어는 특정 의미로 사용되거나, 본 발명의 본 명세서에 처음으로 정의 된다. 본 발명의 목적을 위해, 사용되는 용어는 이에 대한 정의가 하기 언급된 정의와 상충하는 또는 부분적으로 상응하는 경우가 존재하는 때를 제외하고는 당업계에 허용된 정의에 의해 정의된다. 정의가 상충할 시, 용어의 의미는 하기 언급되는 정의 중 임의의 것에 의해 처음으로 정의된다.
본 발명은 [Bond, M., D., van Wart, H., E. Biochemistry 23 (1984), 3077-3085] 및 [Bond, M., D. van Wart, H.. E., Biochemistry 23 (1984), 3085-3091] 에 이전에 기재된 바와 같은 유형 I 및 유형 II 의 C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 콜라겐분해효소 (EC 3.4.24.3) 를 말한다.
용어 "포함하는" 은 본 발명의 명세서 및 청구의 범위에서 "~ 이 포함되나, 반드시 이에 제한되는 것은 아님" 을 의미하는 것으로 사용된다.
관사는 하나 또는 하나 초과 (즉, 하나 이상) 의 물건의 문법적 대상을 말하는 것으로 본원에 사용된다. 예를 들어, "화합물" 은 하나의 화합물 또는 하나 초과의 화합물을 의미한다.
농도 범위와 같은 수치 값의 범위를 지정하는 경우, 범위는 첫번째 값 n1 과 두번째 값 n2 사이의 단어 "내지" 에 의해 지시된다. 지정된 범위의 하위 경계는 첫번째 값과 동일하거나 그 초과의 값인 것으로 이해된다. 지정된 범위의 상위 경계는 두번째 값과 동일하거나 그 미만의 값인 것으로 이해된다. 그러므로, 지정된 범위인 값 x 는 n1 ≤ x ≤ n2 로 제시된다.
다르게 언급되지 않는 경우, 수치 값 n 과 함께 사용되는 용어 "약" 및 기호 "~" ("약 n", "~n") 은 수치 값 ±5% 값의, 즉, n - 0.05 * n ≤ x ≤ n + 0.05 * n 으로 제시된 간격에서의 값 x 를 표시하는 것으로 이해된다. 수치 값 n 과 함께 사용되는 용어 "약" 또는 기호 "~" 이 본 발명의 바람직한 구현예를 기술하는 경우, 다르게 지시되지 않는 경우 n 의 값이 가장 바람직하다.
박테리아 "성장" 은 하나의 박테리아가 이분열이라고 불리는 과정 동안 2 개의 동일한 딸세포로 분열하는 것이다. 그러므로, 박테리아 집단의 국부적 더블링 (doubling) 이 일어난다. 분열로부터의 모든 딸세포가 반드시 살아남지는 않는다. 그러나, 생존 수가 평균 단일체를 초과하는 경우, 박테리아 집단은 기하급수적인 성장을 겪는다. 배치 배양물 중의 기하급수적인 박테리아 성장 곡선의 측정은 직접 및 개별적 (현미경, 유세포 분석기), 직접 및 포괄적 (생물량), 간접 및 개별적 (콜로니 계수), 또는 간접 및 포괄적 (가장 유망한 수, 탁도, 양분 섭취) 방법에 의한 박테리아 산출 (세포 계수)과 같은 잘 공지된 실시를 사용하여 모니터링할 수 있다. 배치 배양물에서의 박테리아 성장은 4 개의 상이한 상: 지연상 (A), 기하급수상 또는 로그상 (B), 정지상 (C), 및 사멸상 (D) 으로 모델링될 수 있다.
(A) "지연상" 동안, 박테리아는 스스로를 성장 조건에 적응시킨다. 이것은 각각의 박테리아가 성숙하나 아직 분열할 수는 없는 기간이다. (B) "기하급수상" (또한 종종 "대수" 또는 "로그" 상이라고 불림) 은 세포 더블링을 특징으로 하는 기간이다. 단위 시간 당 출현하는 새로운 박테리아의 수는 현 집단과 비례한다. 성장이 제한되지 않는다면, 더블링은 일정한 속도로 지속되어 세포의 수 및 집단 증가 속도 모두가 각 연속 시간에 2 배가 될 것이다. 실제 성장 속 도는, 세포 분열 사건 빈도 및 모든 딸세포 생존 가능성에 영향을 주는 성장 조건에 따라 다르다. 그러나, 이내 배지 중의 영양분이 고갈되고, 폐기물이 농축되므로, 기하급수적 성장이 무한히 지속될 수는 없다. (C) "정지상" 동안, 영양분 결핍 및 독성 생성물의 축적의 결과 성장 속도는 저하된다. 박테리아가 이들에게 이용가능한 자원을 고갈시키기 시작하면서 상기 상에 도달한다. (D) 사멸상에서, 박테리아는 영양분을 소모하고 사멸한다. 포자 형성 종은 상기 상에서 포자형성을 진행한다.
실제로는, 심지어 배치 배양에서도, 4 가지 상이 잘 정의되지 않는다. 세포는 명백하고 연속적인 촉진 없이 동시에 번식하지 않으며, 대수상 성장은 종종 결코 일정한 속도는 아니나 대신 천천히 감소하는 속도로의, 영양분 농도가 감소하고 폐기물 농도가 증가되는 것에 직면하여 번식 및 휴식 모두에 대한 압력에 대한 일정한 확률적인 반응이다.
"펩톤" 은 단백질의 아미노산으로의 가수분해 동안 중간체로서 형성되는 임의의 다양한 수용성 화합물의 혼합물인 것으로 이해된다. 펩톤은 종종 동물 조직, 우유, 식물 또는 미생물 배양물과 같은 천연 산물의 효소 소화 또는 산 가수분해에 의해 수득된다. 대부분의 유기체의 성장을 촉진 및 유지시킬 수 있는 다수의 이용가능한 펩톤 및 추출물이 있다. 펩톤은 단백질 단편을 포함하고, 단편의 조성은 가수분해 개시시 존재하는 단백질의 조성에 따라 다르다.
종종 펩톤 생성을 위한 단백질 공급원은 육류 및 유제품의 생성 동안 발생되는 폐기물이다. 그러나, 다양한 펩톤이 식물 공급원으로부터 이용가능하다. 가수분해 처리 전 공급원 물질 및 이의 임의의 가공 (예컨대 공급원의 특정 정도의 단백질성 성분으로의 정제) 에 따라, 펩티드 또는 아미노산 이외의 다수의 화합물이 펩톤의 일부일 수 있다.
예를 들어 펩톤은 하나 이상의 단백질 가수분해 효소에 의해 소화되는 동물 우유 또는 고기로부터 유래될 수 있다. 작은 펩티드를 함유하는 것 외에도, 산출된 분무-건조된 물질에는 지방, 금속, 염, 비타민 및 많은 기타 생물학적 화합물이 포함될 수 있다. 펩톤-함유 배지에 대한 또다른 예는 또한 본원에서 "BHI" 로 언급되는 뇌-심장 침출브로스이다. BHI 는 까다로운 미생물에 특히 유용한 매우 영양가가 높은 범용 성장 배지이다. 이것은 끓인 소 심장 및 뇌로부터의 영양분을 회수하여 제조된다. 끓는 절차 동안 가용성 인자는 브로스 내로 방출된다. 그 다음 브로스는 용이한 분배를 위해 분말로 전환될 수 있다.
용어 "젤라틴" 은 다세포 동물 (후생동물) 의 콜라겐 함유 결합조직으로부터 추출된 고체 또는 반고체 성분을 말한다. 본원에서 집합적으로 "콜라겐" 으로 언급되는 콜라겐 단백질은 세포외 매트릭스에서 구조적 기능을 한다. 콜라겐 단백질은 포유류와 같은 고등 동물 뿐 아니라 심지어 매우 원시적인 해면에서도 발생하는 것으로 알려져 있다.
콜라겐은 모든 동물의 피부 및 뼈에서 발견되는 주요한 구조 단백질이다. 콜라겐 분자는 삼중 나선 배열로 서로 둘러져 있는 3 개의 개별적인 폴리펩티드 사슬 (알파 사슬) 로 이루어진다. 상기 삼중 나선은 콜라겐 분자 사이의 수소 결합에 의해 안정화되며, 이것은 동물이 나이가 들면서 일어난다. 3 개의 알파 사슬의 콜라겐 분자는 길이는 3000 Å (0.3 마이크론) 및 직경은 15 Å 정도로 측정된다. 각 알파 사슬은 서로 연결된 대략 1050 개의 아미노산을 갖는다. 각 알파 사슬에는 20 개의 상이한 아미노산이 있고, 각 젤라틴의 동물 유형에 대해서는, 이들 아미노산은 특이적인 반복 패턴이 있다. 아미노산 내용물의 1/3 을 나타내는 글리신은 2 개의 다른 아미노산으로의 반복되는 서열이 있다. 이것은 글리신-x-y 로 표시될 것이다. x 는 프롤린이고 y 는 히드록시프롤린 잔기라는 것이 통상적이다.
젤라틴은 콜라겐 단백질의 비가역적으로 가수분해된 형태이고, 피부, 뼈, 연골, 결합조직, 기관 및 일부 창자로부터 추출된 콜라겐의 부분적인 가수분해에 의해 생성된다. 젤라틴의 화학 조성은 콜레겐의 조성과 유사하다. 젤라틴은 개별 콜라겐 가닥 사이의 자연적 분자 결합이 분해되는 경우 좀더 쉽게 재배열되는 형태로 형성된다. 그러므로, 젤라틴은 가열되는 경우 용융되고, 다시 냉각되는 경우 고화된다. 물을 가하면, 이것은 반고체 콜로이드 젤을 형성한다. 농도에 따라, 젤라틴은 물에서 고점성의 용액을 형성할 수 있으며, 냉각시 젤 상태가 된다.
특정 형태의 젤라틴은 식품 산업에서의 성분으로 사용된다. 이를 위해, 소, 돼지 및 말과 같은 포유 동물로부터 대량의 젤라틴이 생성된다. 그러나, 대안적 공급원으로부터의 젤라틴, 예를 들어, 생선 젤라틴이 알려져 있다. 생선으로부터의 젤라틴의 추출 방법은 수년간 알려져 있었다. 이러한 방법에서, 콜라겐이 풍부한 생선 피부 (특히 온수성 생선) 및 좁은 범위에서, 부레를 젤라틴 을 형성 및 추출하기 위해 처리한다. 배지느러미 및 비늘이 있는 생선 (코셔 (kosher) 생선) 은 정통파 유대교도, 무슬림 및 많은 채식주의자에게 좀더 환영받는 공급원을 나타낸다.
박테리아 및 진균류와 같은 미생물의 성장용 영양 배지에서, 펩톤 및 젤라틴은 예를 들어 탄소 및/또는 질소에 대한 유기 공급원을 담당할 수 있다.
생명 공학 산업에서, 약학적 공정에 사용하기 위한 다수의 기술적 효소는 대규모 발효 공정으로 생성된다. 이에 대한 예는 기관 조직의 해리 및 해리된 기관 조직으로부터 표적 세포의 연이은 단리를 위한 C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 콜라겐분해효소이다. 기술적 효소를 제조하기 위한 미생물 배양물이 성장 배지로부터 성분을 섭취하기 때문에, 포유류 병원성 작용제가 없는 펩톤 및 추출물을 개발하는 것이 바람직하다. 프리온 및 BSE 와 관련해 특이 안전성이 있다.
본 발명을 위해, 본 문헌의 저자는 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 용 배지 중 영양분으로서 비-포유류 공급원으로부터의 펩톤을 평가하였다. 상기 연구의 목표는 (i) 박테리아의 성장을 부양하고 (ii) 콜라겐분해효소 활성을 가진 효소를 배양 배지 내로 분비하는 것을 자극하는 액체 배지를 제공하는 것이었다. 특히 바람직한 배지는 배양 상청액 중 높은 부피 활성을 자극하였다. 이를 위해, 표 1a 에 열거된 다수의 식물-유래 성분 (실시예 3 참조) 을 상이한 농도로 사용하여 표 2 에 열거된 펩톤계 영양분 배지를 제조하였다. 식물-유래 펩톤을 참조 펩톤으로서 C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 의 성장 및 콜라겐분해효소의 분비를 부양하는 것으로 이미 알려진 BHI 와 비교하였다. 비교 배양 실험을 하기 실시예 5 에 기재하고, 세포 밀도 (OD 로 측정됨) 및 상청액 중의 콜라겐분해효소 활성과 관련된 결과를 또한 표 2 에 제시한다.
배양물을 정지상에 도달할 때까지 성장시켰다. 하기 파라미터를 각 배양물의 성장 (기하급수적) 상 뿐 아니라 정지상 동안 모니터링하였다.
3.7% BHI 를 함유하는 펩톤계 영양분 배지가 부피 활성과 관련하여 최고의 결과를 산출하였다는 것은 매우 놀라운 것이 아니지만, 5% VG100 (배양물 번호 82) 또는 2.5% SP6, 2.5% VG100 (배양물 번호 185a) 또는 1.5% SP6, 1.5% VG100 (배양물 번호 195) 또는 5% BP (배양물 번호 145) 를 함유하는 영양분 배지가 매우 유사한 결과, 즉 약 400 U/l 내지 약 495 U/l 의 부피 활성을 산출하였다는 것은 매우 놀라운 결과이다. 그러므로, 본 발명의 하나의 양상은 C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 의 성장 및 콜라겐분해효소의 분비를 부양하는 조성물로서, 상기 조성물은 물 및 하기: (a) 완두로부터의 VG100 식물성 펩톤 No.1 (VG100), 농도 5% [w/v], (b) 잠두 (Broad bean) 펩톤 (BP), 농도 5% [w/v], (c) VG100 과 대두 펩톤 No110 파파인 소화물 (SP6) 의 조합물, 각각 농도 2.5% [w/v], 및 VG100 과 SP6 의 조합물, 각각 농도 1.5% [w/v] 로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물 공급원 유래의 펩톤 영양분을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서 조성물은 액체 조성물이다. 본 발명의 추가의 바람직한 구현예에서 조성물은 pH 가 약 7.2 내지 약 7.4 이고 더욱 바람직하게는 조성물은 추가의 성분을 포함하지 않는다. 이 러한 조성물은 배치 배양물에서 C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 를 경제적으로 성장시키고 동물-유래 성분의 완전한 부재 하에 콜라겐분해효소 활성을 가진 효소를 생성하기 위한 첫번째 근거를 제공한다.
배양 상청액에서 콜라겐분해효소 부피 활성을 추가로 최적화시키기 위해, 펩톤계 영양분과 상이한 젤라틴의 조합이 사용된 성장 실험에서 배지를 시험하였다. 젤라틴은 표 1b 에 열거된다 (실시예 3 참조). 3.7% [w/v] BHI 와 3% G1 의 조합이 참조로서 사용되었다.
매우 놀랍게도, 생선 젤라틴은 배양 상청액 중의 콜라겐분해효소 부피 활성을 향상시키는 것으로 볼 수 있을 것이다 (실시예 6, 표 3 참조). 그러므로, 본 발명의 또다른 양상은 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 의 성장 및 그로부터 콜라겐분해효소 활성을 가진 효소의 분비를 위한 영양분 배지 중의 생선 젤라틴의 용도이다. 본 발명의 추가 양상은 물, 비-포유류 공급원으로부터의 펩톤 및 생선 젤라틴을 포함하는 조성물이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 조성물은 액체 영양분 배지이다. 이와 관련해 본 발명에 따른 조성물에서, 화합물, 즉 펩톤(들) 및 젤라틴(들) 및 임의의 다른 성분은 물에 용해되는, 즉 용액을 형성하는 것으로 이해된다. 임의의 젤라틴 성분으로 인해, 용액의 점도는 순수한 물보다 높을 수 있다.
생선 젤라틴은 포유류 공급원으로부터의 통상적인 젤라틴과 아미노산 함량이 상이하다. 모든 젤라틴은 동일한 20 개의 아미노산으로 구성됨에도 불구하고, 생선 젤라틴은 포유류 공급원으로부터의 젤라틴과 비교하면 소량의 이미노산, 프롤 린 및 히드록시프롤린을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 생선 젤라틴의 히드록시프롤린 함량은 소가죽 젤라틴과 비교하여 약 78% 내지 약 56% 이다. 본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서, 생선 젤라틴의 프롤린 함량은 소가죽 젤라틴과 비교하여 약 93% 내지 약 74% 이다.
본 발명에 따른 영양분 배지에 사용될 수 있는 시판 생선 젤라틴에는 여러 유형이 있다. 본 발명의 매우 바람직한 구현예에서 생선 젤라틴은 (i) 고분자량 생선 젤라틴, (ii) 액체 생선 젤라틴, (iii) 코셔 종 생선으로부터의 젤라틴 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 코셔라고 하는 생선은 배지느러미 및 비늘을 가져야만 하고; 조게, 즉, 수생 무척주동물, 예컨대 연체동물, 갑각류, 극피동물, 및 기타 비-생선 수생 동물군은 코셔가 아니다. 그러므로, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 생선의 코셔 종으로부터의 젤라틴은 배지느러미 및 비늘을 가진 생선 종 (물고기) 으로부터의 젤라틴이다.
본 발명의 매우 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 중의 생선 젤라틴의 농도는 약 2% 내지 약 10% 로, 여기서 백분율은 단리된 생선 젤라틴이 건조 물질인 경우 중량/부피로, 단리된 생선 젤라틴이 액체 물질인 경우 부피/부피로 나타낸다. 본 발명의 더욱 더 바람직한 구현예에서, 생선 젤라틴의 농도는 약 3% 내지 약 8% 이다.
본 발명에 따르면, 영양분 조성물 중의 펩톤은 비-포유류 공급원으로부터의 펩톤이다. 본 발명의 매우 바람직한 구현예에서, 펩톤은 식물 생성물이다. 더욱 더 바람직하게는, 펩톤은 대두, 잠두, 완두, 감자 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물 공급원으로부터의 펩톤이다. 더욱 바람직하게는, 펩톤은 완두로부터의 Oxoid VG100 식물성 펩톤 No.1 (VG100), 완두로부터의 Oxoid VG200 식물성 펩톤 포스페이트 브로스 (VG200), Merck TSB CASO-Bouillion 동물성 미함유 (TSB), Invitrogen 대두 펩톤 No110 파파인 소화물 (SP6), Fluka 잠두 펩톤 (BP), 감자로부터의 Organotechnie 식물 펩톤 E1 (E1P), 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
영양분 배지의 구성 및 펩톤 농도와 관련해 특히, 본 발명에 따른 조성물이 2 가지 이상의 상이한 펩톤을 포함하는 것이 본 발명의 더욱 더 바람직한 구현예이고, 여기서 조성물 중의 식물 펩톤의 집합체 농도는 약 2 중량%/부피 내지 약 10 중량%/부피이다. 더욱 더 바람직하게는, 조성물 중의 식물 펩톤의 집합체 농도는 약 3 중량%/부피 내지 약 5 중량%/부피이다.
본 발명의 또다른 더욱 바람직한 구현예에서, 단일 유형의 펩톤이 본 발명의 영양분 조성물에 존재하며, 펩톤은 BP, E1P, 대두 펩톤 E110, VG100, 및 VG200 으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 조성물 중의 펩톤의 농도는 약 5 중량%/부피이다. 본 발명의 또다른 더욱 바람직한 구현예에서, 단일 유형의 펩톤이 본 발명의 영양분 조성물에 존재하며, 펩톤은 VG100 이고, 조성물 중의 펩톤의 농도는 약 2 중량%/부피이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 조성물의 pH 는 pH 7 내지 pH 8 이다. 더욱 더 바람직한 것은 약 pH 7.2 내지 약 pH 7.4 의 pH 이다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 멸균되고, 즉, 조성 물은 임의의 자가-복제 유기체가 없도록 제조된다. 멸균화는 당업자에게 공지된 표준 방법, 예를 들어 오토클레이브와 같은 열 처리에 의해 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 박테리아의 배양에 특히 유용하다. 그러므로 본 발명의 가장 바람직한 구현예는 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 박테리아의 접종물을 부가적으로 포함하는 본 발명에 따른 조성물이다. 상기 관점에서 동등하게 바람직한 것은 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 의 배양 및 그로부터 콜라겐분해효소 활성을 가진 프로테아제를 분비하기 위한 본 발명에 따른 조성물의 용도이다.
따라서, 본 발명의 또다른 양상은 하기 단계를 포함하는, 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 으로부터의 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 정제된 프로테아제의 제조 방법이다: (a) 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 박테리아의 접종물을 함유하는 본 발명에 따른 멸균 조성물을 제공하는 단계; (b) 박테리아를 성장 및 배양시켜, 박테리아가 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 액상 내로 분비하는 단계; (c) 액상으로부터 세포 및 기타 미립자 물질을 분리시켜, 배양 상청액을 수득하는 단계; (d) 배양 상청액으로부터 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 정제하여; 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 으로부터 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 정제된 프로테아제를 제조하는 단계.
또한, 본 발명의 또다른 양상은 하기 방법에 의해 수득가능한, 클로스트리디 움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 으로부터의 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 포함하는 배양 상청액이다: (a) 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 박테리아의 접종물을 함유하는 본 발명에 따른 멸균 조성물을 제공하는 단계; (b) 박테리아를 성장 및 배양시켜, 박테리아가 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 액상 내로 분비하는 단계; (c) 액상으로부터 세포 및 기타 미립자 물질을 분리시켜; 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 으로부터 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 포함하는 배양 상청액을 수득하는 단계. 본 발명에 따른 배양 상청액은 콜라겐분해효소 뿐 아니라 기타 분비된 단백질을 포함하는 복합 혼합물이다. 본 발명의 더욱 더 바람직한 구현예에서 상청액은 정지상 중의 액체 배양물로부터 수득된다.
본 발명에 따른 상청액은 그 안에 함유된 하나 이상의 성분의 정제에 직접적으로 사용될 수 있다. 대안적으로는, 상청액은, 예를 들어 동결된 형태로 저장될 수 있다. 그러나, 가장 바람직한 것은 상청액의 동결건조물을 저장하는 것이다. 그러므로, 본 발명의 추가 양상은 본 발명에 따른 상청액의 동결건조물이다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 바람직한 구현예를 나타내는 하기 항목에 의해 기재된다.
1. 물, 비-포유류 공급원으로부터의 펩톤 및 생선 젤라틴을 포함하는 액체 조성물.
2. 제 1 항목에 있어서, 생선 젤라틴이 고분자량 생선 젤라틴, 코셔 종의 생선으로부터의 젤라틴, 액체 생선 젤라틴, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 2 항목에 있어서, 생선 젤라틴이 고분자량 생선 젤라틴, 코셔 생선 젤라틴, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 1 항목 내지 제 3 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 조성물 중의 생선 젤라틴의 농도가 약 2% 내지 약 10% 이고, 여기서 백분율은 단리된 생선 젤라틴이 건조 물질인 경우 중량/부피로, 단리된 생선 젤라틴이 액체 물질인 경우 부피/부피로 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 4 항목에 있어서, 생선 젤라틴의 농도가 약 3% 내지 약 8% 인 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 1 항목 내지 제 5 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 비-포유류 공급원의 펩톤이 생선 펩톤이 아닌 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제 6 항목에 있어서, 비-포유류 공급원의 펩톤이 식물 생성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 제 7 항목에 있어서, 펩톤의 식물 공급원이 대두, 잠두, 완두, 감자, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물 공급원으로부터인 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 제 8 항목에 있어서, 펩톤이 완두로부터의 VG100 식물성 펩톤 No.1 (VG100), 완두로부터의 VG200 식물성 펩톤 포스페이트 브로스 (VG200), TSB CASO-Bouillion 동물성 미함유 (TSB), 대두 펩톤 No110 파파인 소화물 (SP6), 잠두 펩톤 (BP), 감자로부터의 식물 펩톤 E1 (E1P), 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 제 9 항목에 있어서, 조성물이 2 가지 이상의 상이한 펩톤을 포함하고, 여기서 조성물 중의 식물 펩톤의 집합체 농도가 약 2 중량%/부피 내지 약 10 중량%/부피인 것을 특징으로 하는 조성물.
11. 제 10 항목에 있어서, 식물 펩톤의 집합체 농도가 약 3 중량%/부피 내지 약 5 중량%/부피인 것을 특징으로 하는 조성물.
12. 제 9 항목에 있어서, 펩톤이 BP, E1P, 대두 펩톤 E110, VG100, 및 VG200 으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조성물 중의 펩톤의 농도가 약 5 중량%/부피인 것을 특징으로 하는 조성물.
13. 제 9 항목에 있어서, 펩톤이 VG100 이고, 조성물 중의 펩톤의 농도가 약 2 중량%/부피인 것을 특징으로 하는 조성물.
14. 제 1 항목 내지 제 13 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 조성물의 pH 가 pH 7 내지 pH 8 인 것을 특징으로 하는 조성물.
15. 제 1 항목 내지 제 14 항목 중 어느 한 항목에 따른 멸균 조성물.
16. 제 15 항목에 있어서, 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 박테리아의 접종물을 부가적으로 포함하는 조성물.
17. 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 의 배양 및 그로부터 콜라겐분해효소 활성을 가진 프로테아제를 분비하기 위한 제 15 항목 또는 제 16 항목에 따른 조성물의 용도.
18. 상청액이 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 함유하고, 하기 (a) ~ (c) 단계로, 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 함유하는 배양 상청액을 제조하는 것을 포함하는, 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 액체 배양물의 상청액의 제조 방법:
(a) 제 16 항목에 따른 접종물을 함유하는 멸균 조성물을 제공하는 단계;
(b) 박테리아를 성장 및 배양시켜, 박테리아가 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 액상 내로 분비하는 단계;
(c) 액상으로부터 세포 및 기타 미립자 물질을 분리시켜, 배양 상청액을 수득하는 단계.
19. 하기 (a) ~ (d) 단계로 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 으로부터 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 정제된 프로테아제를 제조하는 것을 포함하는, 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 으로부터의 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 정제된 프로테아제의 제조 방법:
(a) 제 16 항목에 따른 접종물을 함유하는 멸균 조성물을 제공하는 단계;
(b) 박테리아를 성장 및 배양시켜, 박테리아가 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 액상 내로 분비하는 단계;
(c) 액상으로부터 세포 및 기타 미립자 물질을 분리시켜, 배양 상청액을 수 득하는 단계;
(d) 배양 상청액으로부터 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 단리하는 단계.
20. 하기 (a) ~ (c) 단계의 방법에 의해 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 으로부터 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 포함하는 배양 상청액을 수득하여 수득가능한, 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 으로부터의 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 포함하는 배양 상청액:
(a) 제 16 항목에 따른 접종물을 함유하는 멸균 조성물을 제공하는 단계;
(b) 박테리아를 성장 및 배양시켜, 박테리아가 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 액상 내로 분비하는 단계;
(c) 액상으로부터 세포 및 기타 미립자 물질을 분리시키는 단계.
본 발명의 C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 의 성장용 배지는, 포유류 유래 성분이 없고, C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 의 발효에 유용하며, 콜라겐분해효소 활성을 가진 효소를 배양 상청액으로부터 대규모로 경제적으로 정제할 수 있는 양으로 배양 배지 내로 분비하도록 한다.
하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 이의 참 범주는 청구의 범위에 언급된다. 본 발명의 취지로부터 벗어나지 않고 언급된 절차에 변형 이 가해질 수 있다는 것으로 이해된다.
실시예 1
일반적인 작업 조건
일반적으로, 박테리아 또는 박테리아 배양물과 관련된 모든 작업 단계는 미생물학의 표준 실험 실시를 적용하는 멸균 조건하에서 수행되었다. 혐기성 배양은 30℃ 온도의 인큐베이터의 질소 분위기하에서 유지되었다. 접종물 이동은 수직 층류 후드 (laminar flow hood) 내에서 주위 (즉, 산소 함유) 분위기 하에 수행되었다. 본 명세서에 기재된 모든 배지는 오토클레이브에 의해 살균되었다. pH 7.2 - pH 7.4 범위로의 pH 의 조정은 다르게 지시되지 않는다면, 오토클레이브 전에 수행되었다. 다르게 지시되지 않는다면, 임의의 각 배지 1 l 당 1 mM CaCl2 를 첨가하였다. 오토클레이브된 배지의 분취물의 pH 변화를 정규적으로 확인하였다.
실시예 2
C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 박테리아의 종자 배양물, 종자 은행 및 출발 배양물
ATCC 21000 의 유래물인 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 균주 BMTU 1175 를 pH 7.2 로 조정된 pH 의, 물에 용해된 3.7% 의 BHI 및 3.0% 의 G1 로 이루어진 액체 성장 배지 100 ml 의 부피의 접종물로 사용하였다. 578 nm (= OD578nm) 에서의 광학 밀도가 5.6 에 도달할 때까지 약 26 시간 동안 혐기성 조건하에서 배양물을 인큐베이션하였다. 상기 액체 배양물 1 ml 의 분취물을 앰플에 밀봉하고, 동결시키고, 액체 질소의 기체 상에 저장하였다. 분취물을 출발 배양물로서 추가 사용하기 위해 1 차 종자 은행으로서 사용하였다.
상이한 배지 중의 성장 실험용 출발 배양물을 1 ml 종자 은행 앰플 함량으로, 5% [w/v] VG100 을 함유하는 100 ml 의 액체 배지를 인큐베이션하고, 박테리아를 혐기성 조건하에서 30℃ 에서 밤새 또는 37℃ 에서 약 8 시간 동안 인큐베이션하여 제조하였다. 이하 추가 기재되는 액체 배지 (통상 100 ml 또는 200 ml 부피) 를 약 2-4 ml 의 출발 배양물로 각각 접종하였다.
실시예 3
상이한 배지 중의 C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 의 배양물
상이한 성장 배지 중의 C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 의 성장을 측정하였다. 액체 배양물을 교반 없이 플라스크에서 인큐베이션하였다. 다르게 표시되지 않는다면, 배양물의 인큐베이션을 40 시간 지속하였다. 각 실험 동안 상이한 시점에서, 배양물로부터 하나 이상의 샘플을 수집하고, 액체 배양물의 OD578nm, 배양 상청액의 pH 및 배양 상청액 중의 콜라겐분해효소 단백질 가수분해 활성 (실시예 4 참조) 을 측정하였다.
표 1a 및 1b 에 열거된 성분을 사용하여 액체 배지를 제조하였다. 다르게 표시되지 않는다면, % 로 제시된 성분의 농도는 오토클레이브 전 조정된, % 중량/부피 [w/v] 를 나타낸다. 예를 들어, 제시된 화합물의 3% [w/v] 농도는 3 g/배지 100 ml 에 해당한다. 액체 성분인 G4 의 경우, % 로 제시된 농도는 % 부피/부피를 나타낸다.
pH 7.2 - pH 7.4 범위로의 pH 의 조정은 다르게 지시되지 않는다면, 오토클레이브 전에 수행되었다. 다르게 지시되지 않는다면, 임의의 각 배지 1 l 당 1 mM CaCl2 를 첨가하였다.
표 1a
성장 배지 중에서 시험된 시판되는 펩톤 화합물
약어 화합물 공급원 공급자, 상품명 또는 카달로그 번호
A2SC 대두 펩톤 A2 SC 대두 Organotechnie, 19649
A3SC 대두 펩톤 A3 SC 대두 Organotechnie, 19685
A482 완두 펩톤 A482 완두 Organotechnie, AI275
AM41 대두 펩톤 AM41 대두 Organotechnie, AI230
BHI 뇌-심장 침출배지 소 BD (Difco), 0037-8
BP 잠두 펩톤 잠두 Fluka, 93491
E1 밀 펩톤 E1 밀 Organotechnie, 19559
E110 대두 펩톤 E110 대두 Organotechnie, AI885
E1P 식물 펩톤 E1 감자 Organotechnie, 19025
E430 밀 펩톤 E430 밀 Organotechnie, AI233
ET1 식물 펩톤 ET1 감자 Organotechnie, 19725
YE 효모 추출물 효모 BD (Difco), 886-08-1
L85 프로테오스 펩톤 포유류 공급원 Oxoid, LP0085
SP4 대두 펩톤 대두 Biofac Denmark, 21
SP5 대두 가루로부터의 펩톤 (파파인 소화물) 대두 Merck, 7212
SP6 대두 펩톤 No110 (파파인 소화물) 대두 Invitrogen, 152-90059
SP7 Hy Pep 1510 대두 Kerry, 1510
SP8 Hy Pep 5603 대두 Kerry, 5603
T 트립톤 박토 우유 (소) BD (Difco), 123-08-4
TSB TSB (CASO-Bouillion, 동물성 미함유) 식물 Merck, 525
VG100 식물성 펩톤 No 1 완두 Oxoid, VG0100
VG101 식물성 펩톤 브로스 완두 Oxoid, VG0101
VG200 식물성 펩톤 포스페이트 브로스 완두 Oxoid, VG0200
VG300 베지에톤 (Veggietone) 대두 펩톤 대두 Oxoid, VG0300
표 1b
성장 배지 중에서 시험된 시판되는 젤라틴 화합물
약어 화합물 공급원 공급자, 상품명 또는 카달로그 번호
G1 젤리타-졸 (Gelita-Sol) D 돼지/소 DGF Stoess, Gelita-Sol D
G2 고분자량 건조 생선 젤라틴 생선 Kenney&Ross, HMWD
G3 코셔 건조 생선 젤라틴 생선 Kenney&Ross, KD
G4 액체 생선 젤라틴 생선 Kenney&Ross, HIPURE LIQUID GELATIN (Technical Gelatin)
G2T G2 의 트립신 소화물 생선 G2 를 물에 용해시킨다; 멸균 전 트립신‡ 을 최종 농도 70 mg/ml 로 첨가하고; 혼합물을 1 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션한 후 오토클레이브하였다.
G3T G3 의 트립신 소화물 생선 G3 을 물에 용해시킨다; 멸균 전 트립신‡ 을 최종 농도 70 mg/ml 로 첨가하고; 혼합물을 1 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션한 후 오토클레이브하였다.
‡ 재조합적으로 생성된 트립신, Roche Applied Science (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany).
실시예 4
콜라겐분해효소 단백질 가수분해 활성을 측정하기 위한 검정법
콜라겐분해효소 단백질 가수분해 활성은 합성 펩티드 기질을 사용하는 Wuensch 단위 (Wuensch, E., Heidrich, H., Z., Physiol. Chem. 333 (1963) 149-159) 로의 표준 방법에 의해 측정되었다. 콜라겐분해효소 단백질 가수분해 활성은 Leu 과 Gly 잔기 사이의 개질된 기질 ("Wuensch") 펩티드 4-페닐아조-벤질옥시카르보닐-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg (Bachem M1715) 의 가수분해를 촉매화한다. 활성 1 단위 (U) 는 25℃, pH 7.1 에서 1 분 당 1 μM 펩티드의 가수분해로 정의된 다.
기질 펩티드 (또한 "기질" 로 언급됨) 는 용액 중에 1 mg/ml 의 농도로 제공되었다. 먼저 10 mg 기질 펩티드를 0.2 ml 메탄올에 용해시켰다. 0.1 M TrisHCl, pH 7.1 을 첨가하여 용액의 부피를 10 ml 로 증가시켰다. 추가 시약은 물 중 0.1 M CaCl2 용액 및 물 중에 5 부피부 에틸 아세테이트 및 1 부피부 0.025 M 시트르산으로 이루어진 추출 혼합물이였다. 건조 튜브를 0.35-0.4 g (NH4)2SO4 를 함유하는 시험관으로 제공하였다. 각 건조 튜브를 사용하기 전에 파라필름으로 밀봉하였다.
하기 파이펫팅 계획 및 작업 흐름에 따라 대조군 및 샘플 반응을 시험관에서 설정하였다:
단계 용액 대조군 시험관 샘플 시험관
1 기질 펩티드 1 ml 1 ml
CaCl2 0.2 ml 0.2 ml
혼합, 25℃ 로 가온
2 샘플 물질§ - 0.05 ml
0.1 M TrisHCl, pH 7.1 0.05 ml -
혼합, 25℃ 에서 15 분 동안 인큐베이션; 인큐베이션 후 인큐베이션 용액의 분취물을 일정량의 추출 혼합물에 옮긴다
3 단계 2 의 인큐베이션 용액 0.5 ml 0.5 ml
추출 혼합물 6 ml 6 ml
20 초 동안 교반에 의해 즉시 혼합, 약 3 ml 의 에틸 아세테이트 상을 건조 튜브로 옮김, 교반에 의해 혼합하고 상청액을 큐벳으로 옮김; 320 nm 에서 여기 (A) 측정, 큐벳 광 경로 = 1 cm.
4 부피 활성 계산 [U/ml] = ΔA * d * 0.794
A: 측정된 여기값
d: 희석 인자
ΔA = A샘플 - A대조군
§ 콜라겐분해효소 단백질 가수분해 활성을 갖는 하나 이상의 효소를 포함하는 용액. 필요하다면, 본 검정법에 사용되는 샘플 물질은 용액을 희석하여 제조되었다. 각 측정을 위해, 각각의 희석 인자 (d) 가 조정되고, 최종적으로 0.3 내지 1.0 의 여기 값을 산출하기 위해 선택되었다. 그러나, 통상적으로는 박테리아 세포 및 데브리스로부터 정화된 미희석된 배양 상청액을 검정하였다. 부가적으로는, 공지된 양의 콜라겐분해효소가 있고 활성이 공지된 표준을 참조로서 시험하였다.
콜라겐분해효소 유형 I 및 유형 II 효소를 모두 함유하는 혼합물에서, 측정된 콜라겐분해효소 II 의 활성은 기질로서 Wuensch 펩티드를 사용하는 활성 검정법을 수행하는 경우, 항상 콜라겐분해효소 I 의 활성보다 컸다. 그러므로, 적용된 조건 하에서 임의의 측정된 단백질 가수분해 활성은 주로 콜라겐분해효소 유형 II 를 반영한다.
실시예 5
상이한 배지 중의 C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 의 성장: 젤라틴을 첨가하지 않은 펩톤계 배지
표 2 는 C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 의 배양을 위한 다수의 배지를 제공한다. 각 표 란에는 각 배지의 성분을 제시한다. 일부 경우 pH 는 배지의 멸균 및 접종 전에 조정된 것이다. pH 값이 표에 적혀있지 않은 경우는, 다르게 표시되지 않는다면 pH 를 KOH 로 pH 7.2 내지 pH 7.4 의 값으로 조정한 후 배지에 접종시킨다. 배양물을 표준 조건하에서 약 40 시간 동안의 인큐베이션에 상응하는 정지상으로 성장시켰다. 배양이 종료되었을 때 578 nm (또한 "OD" 로 언급됨) 에서의 광학 밀도 뿐 아니라, 세포 상청액 중의 콜라겐분해효소 활성을 측정하였다 (실시예 4 참조). 표에서 부피 활성은 배지 1 l 당 Wuensch 단위로 제시된다 (또한 표에 적힌 데이터에서 "U/l" 로 언급됨).
표 2
접종 전 액체 배지의 조성 및 pH, C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 의 성장 수율 및 배양 상청액 중의 콜라겐분해효소 활성; 배지를 콜라겐분해효소 부피 활성에 따라 순위를 매겼다.
Figure 112009035148958-pat00001
Figure 112009035148958-pat00002
Figure 112009035148958-pat00003
펩톤만을 함유하는 (즉, 임의의의 젤라틴이 첨가되지 않음) 배지 중에서 BHI 가 C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 콜라겐분해효소의 배양 상청액 내로의 분비를 자극하는데 가장 효과적이었다는 것이 주시되었다. 또한 콜라겐분해효소의 부피 활성은 단지 배양물의 OD 의 작용만은 아니었던 것이 발견되었다.
실시예 6
상이한 배지 중의 C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 의 성장: 젤라틴을 함유하는 펩톤계 배지
상이한 공급원으로부터의 상이한 유형의 젤라틴을 펩톤 배지에 첨가하였다. 표 3 은 C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 의 배양을 위한 다수의 배지를 제공한다. 각 표 란에는 각 배지의 성분을 제시한다. 일부 경우 pH 는 배지의 멸균 및 접종 전에 조정된 것이다. pH 값이 표에 적혀있지 않은 경우는, 다르게 표시되지 않는다면 pH 를 KOH 로 pH 7.2 내지 pH 7.4 의 값으로 조정한 후 배지에 접종시킨다. 배양물을 표준 조건하에서 약 40 시간 동안의 인큐베이션에 상응하는 정지상으로 성장시켰다. 배양이 종료되었을 때 578 nm (또한 "OD" 로 언급됨) 에서의 광학 밀도 뿐 아니라, 세포 상청액 중의 콜라겐분해효소 활성을 측정하였다 (실시예 4 참조). 표에서 부피 활성은 배지 1 l 당 Wuensch 단위로 제시된다 (또한 표에 적힌 데이터에서 "U/l" 로 언급됨).
표 3
접종 전 액체 배지의 조성 및 pH, C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 의 성장 수율 및 배양 상청액 중의 콜라겐분해효소 활성; 배지를 콜라겐분해효소 부피 활성에 따라 순위를 매겼다.
Figure 112009035148958-pat00004
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콜라겐분해효소 부피 활성과 관련하여 특정 식물 펩톤을 생선 젤라틴과 함께 함유하는 조성물은, 포유류 공급원으로부터인 3.7% BHI 및 3% G1 을 함유하는 표준 배지와 적어도 동일하고 대부분 우세하였다는 것이 주시되었다. 그러므로, 다수의 신규 배지는 C. 히스톨리티쿰 (C. histolyticum) 의 성장 및 배양 및 이러한 배양물의 상청액으로부터의 콜라겐분해효소 프로테아제(들) 의 제조를 위해 제공된다.

Claims (15)

  1. 물, 생선 젤라틴 및 생선 펩톤을 제외한 비-포유류 공급원으로부터의 펩톤을 포함하는 액체 조성물로서, 조성물 중의 생선 젤라틴의 농도가 2% 내지 10% 이고, 여기서 백분율은 단리된 생선 젤라틴이 건조 물질인 경우 중량/부피로, 단리된 생선 젤라틴이 액체 물질인 경우 부피/부피로 나타내는 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 생선 젤라틴이 고분자량 생선 젤라틴, 코셔 종의 생선으로부터의 젤라틴, 액체 생선 젤라틴, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 조성물 중의 생선 젤라틴의 농도가 3% 내지 8% 인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 비-포유류 공급원의 펩톤이 식물 생성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 펩톤의 식물 공급원이 대두, 잠두, 완두, 감자, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물 공급원으로부터인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 조성물이 2 가지 이상의 상이한 펩톤을 포함하고, 여기서 조성물 중의 식물 펩톤의 집합체 농도가 2 중량%/부피 내지 10 중량%/부피인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 펩톤이 BP, E1P, 대두 펩톤 E110, VG100, 및 VG200 으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조성물 중의 펩톤의 농도가 5 중량%/부피인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 6 항에 있어서, 펩톤이 VG100 이고, 조성물 중의 펩톤의 농도가 2 중량%/부피인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서, 조성물의 pH 가 pH 7 내지 pH 8 인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 멸균 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 박테리아의 접종물을 부가적으로 포함하는 조성물.
  12. 제 10 항에 있어서, 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 의 성장 및 배양 및 그로부터 콜라겐분해효소 활성을 가진 프로테아제를 분비하기 위해 사용되는 조성물.
  13. 상청액이 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 함유하고, 하기 (a) ~ (c) 단계로, 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 함유하는 배양 상청액을 제조하는 것을 포함하는, 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 액체 배양물의 상청액의 제조 방법:
    (a) 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 박테리아의 접종물을 함유하는 제 10 항에 따른 멸균 조성물을 제공하는 단계;
    (b) 박테리아를 성장 및 배양시켜, 박테리아가 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 액상 내로 분비하는 단계;
    (c) 액상으로부터 세포 및 기타 미립자 물질을 분리시키는 단계.
  14. 삭제
  15. 하기 (a) ~ (d) 단계로 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 으로부터 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 정제된 프로테아제를 제조하는 것을 포함하는, 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 으로부터의 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 정제된 프로테아제의 제조 방법:
    (a) 클로스트리디움 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 박테리아의 접종물을 함유하는 제 10 항에 따른 멸균 조성물을 제공하는 단계;
    (b) 박테리아를 성장 및 배양시켜, 박테리아가 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 액상 내로 분비하는 단계;
    (c) 액상으로부터 세포 및 기타 미립자 물질을 분리시켜, 배양 상청액을 수득하는 단계;
    (d) 배양 상청액으로부터 콜라겐분해효소 활성을 가진 하나 이상의 프로테아제를 단리하는 단계.
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