CN103764815A

CN103764815A - 用于悬液细胞培养的方法和系统

Info

Publication number: CN103764815A
Application number: CN201280004747.3A
Authority: CN
Inventors: 加布里埃拉·D.c·丹宁; 理查德·E.·高特妮
Original assignee: Expression Therapeutics LLC
Current assignee: Expression Therapeutics LLC
Priority date: 2011-01-05
Filing date: 2012-01-05
Publication date: 2014-04-30
Also published as: EP2661488A1; ZA201304903B; WO2012094532A1; BR112013017281A2; US20120171724A1; CA2823639A1; KR20140036144A; EA201370151A1; JP2014504870A; MX2013007551A; AU2012204328A1

Abstract

本发明公开了一种使宿主细胞适应悬浮细胞培养的体系和方法，以及据此制备的细胞系。所述方法包括将大量未稀释的培养细胞在表面区域上连续接种，直至细胞团直观可见，然后在细胞成团时，将细胞移至悬浮培养体系。

Description

用于悬液细胞培养的方法和系统

相关申请

此专利文件根据法条35U.S.C.§119(e)，要求2011年1月5日提交的美国临时专利申请61/429,931的优先权，该申请的内容在此通过引用的方式并入本文。

背景技术

生产基于重组蛋白的生物药品是一项复杂且劳动和资本密集的尝试。目前，哺乳动物细胞被应用于大多数人蛋白的制造中。典型的哺乳动物细胞含有大量转译后修饰内容，此类修饰无法由无修饰原核细胞和无修饰单细胞真核生物完成。虽然如中国仓鼠卵巢细胞和仓鼠崽肾细胞一类的哺乳动物细胞能够忠实地完成大多数人蛋白的生物合成，其效率却远远低于细菌或酵母细胞能达到的程度。

目前市场销售的重组蛋白之中，fVIII的生产效率最为低下，也是目前每单位质量成本最高的(图1)。重组fVIII是X-染色体相关的先天出血性疾病血友病A的首选治疗方案。该治疗方案包括每周2-3次fVIII静脉注射，花费为每年约100,000-300,000美元(Bohn RL,Avorn J,Glynn RJ,Choodnovskiy I,Haschemeyer R,Aledort LM.Prophylactic use of factorVIII:an economic evaluation.Thromb Haemost.1998;79(5):932-7,在此全文引述)。因此，全世界仅有不到三分之一的血友病A患者能够得到此项治疗。有史以来，fVIII一直供不应求，价格也由于高昂的研究、开发和制造成本而一直过高。要改善血友病A及其他可采用蛋白替补疗法的单基因疾病的治疗条件，一种方法是开发生产效率更高的重组蛋白制造方法。

当代最先进的重组h-fVIII制剂一般以哺乳动物细胞，如BHK-21或中国仓鼠卵巢细胞，以大规模发酵生物反应器进行生产。可通过若干技术最大化重组h-fVIII的产量，包括(1)以DHFR/甲氨蝶呤选择法扩增h-fVIII转基因；(2)向培养基中加入fVIII稳定剂(例如：牛/人血清蛋白或利用vWf共表达),以及(3)以连续注入式发酵令细胞生长率/密度最大化。然后，通过一系列过滤、免疫亲和性、分子排阻及离子交换色谱步骤，将fVIII从条件培养基提纯。通常，还要在提纯流程中加入病毒灭活步骤来提高安全性。一旦经过提纯，就可以依照配方向fVIII材料中加入稳定剂，干燥冷冻，然后进行包装。这一标准化的制造过程已在Boedeker BG.Production processes of licensed recombinant factor VIII preparations.Semin Thromb Hemost.2001;27(4):385-94中论述，在此全文引述。

第一代重组fVIII制剂以人血清蛋白作为稳定剂，但后者理论上可能携带病毒污染物。为了减少病毒污染物的风险，出现了被认为是“不含动物制品”的第二代和第三代的fVIII制剂，以蔗糖和其他添加物作为稳定剂。由于认为新生代重组制剂比血浆源性制剂和第一代制剂具有较高的安全性，许多已接受过治疗和大多数尚未接受治疗的病患都转向了第二代和第三代fVIII制剂。这样的需求导致了数次fVIII制剂短缺，也催生了暂时性定量配给fVIII制剂的应对方针(Garber K.rFactor VIII deficit questioned.NatBiotechnol.2000;18(11):1133,在此作为参考文献引述)。

若干论文表明，重组人体fVIII的标准生产水平为<1单位/10⁶个细胞/天(Kaufman RJ,Pipe SW,Tagliavacca L,Swaroop M,Moussalli M.Biosynthesis,assembly and secretion ofcoagulation factor VIII.Blood CoagulFibrinolysis.1997;8Suppl2:S3-14.:S3-14,在此作为参考文献引述)。典型情况下，重组人体fVIII制剂成品的比活性为4000-10,000单位每毫克蛋白，而一名体重70kg的成人一次治疗的花费在2,500–5,000美元。目前，fVIII制剂具有60-80亿美元的年需求，然而事实上，该产品只能满足不到三分之一的潜在全球市场。

附图说明

图1为目前生物制药制造业的格局图示;

图2展示了从BHK-M细胞到BHK-Ms细胞的转变；BHK-M细胞适于利用一种未授权专利方法来实现悬浮，该方法包括贴壁BHK-M细胞的连续重复接种;

图3展示了无血清培养基中，BHK-Ms细胞的重组fVIII表达;

图4展示了HEK-293T细胞从贴壁到悬浮的转换；

图5展示了适应悬浮的细胞中fVIII高水平表达的证据图表；

图6为展示最佳饲喂时间表的结果的点图；

图7展示了依照在此公开的方法适应悬浮后的另一克隆系;

图8展示了依照在此公开的方法适应悬浮后的另一克隆系的密度和活力;

图9展示了依照在此公开的方法适应悬浮后的一个克隆系中fVIII的活性随密度的变化;

图10为一枚GFP转染且制造GFP病毒的细胞的图像，该细胞依照在此公开的方法适应悬浮；且

图11比较了BHK-M（贴壁）和BHK-Ms（悬液）培养平台的重组FVIII产量。

具体实施方式

我们公开一种令此前限于贴壁培养体系的哺乳动物细胞系适应悬浮细胞培养，例如但不限于滚瓶的新颖方法。我们还公开了定名为BHK-MS-310、BHK-MS-P14h和SC-293T的在重组蛋白悬液培养中表现出（较于已知的体系和方法）改良产量的新颖细胞系。另外，我们公开了一种悬液细胞病毒制造的新颖方法。在此公开的方法、体系和细胞系都具有适应性，且适应于无血清和无血蛋白的悬液培养环境。

我们这项发现的新颖性和重要性不可低估。许多对人（或动物）健康和福利至关重要的生物治疗药物，由于生产制造中似乎无法克服的深层困难，不是无法生产，就是供应量极为有限。一些情况下，生产这些蛋白的最适宜细胞系受限于贴壁细胞生产。贴壁细胞生产具有较低的效率和扩展性，且与其他方法，例如，但不限于，悬浮细胞培养，相比更不适合大规模商业化生物制造。因此，令传统的贴壁细胞系适应悬浮细胞培养（例如但不限于，从前在已知方法下无法适应的贴壁细胞系）是一项显著的成就。更进一步，对于此前成功令贴壁细胞适应悬浮细胞培养的方法，在此公开的方法和体系也可作为一种新颖的替代方法。

重组人体fVIII是一种典型的出名难以制造的生物治疗药物。

目前市场上销售的重组人体fVIII制剂的产量比其他重组生物治疗药物，例如但不限于，单克隆抗体，低100-1000倍。fVIII表达产率低对产品价格和供应量造成了强烈影响。事实上，在所有主流生物制药中，重组fVIII具有最高的价格点和最低的年产量，其药房价格为10,000,000每克，而全球总年产量不到0.5千克。

fVIII表达效率低所导致的后果之一，就是全球血友病A患者中，只有不到三分之一的人能获得fVIII。对得不到治疗的患者来说，血友病A是一种致命疾病，在青少年阶段就有中等死亡率。

要解决fVIII等生物治疗药物的生产困难，可以对生产体系的各要素进行优化——例如但不限于——其构造、表达载体、细胞体系、细胞培养条件，诸如此类。举例而言，我们描述过一种比人体fVIII每细胞生物合成效率更高的新颖重组fVIII构造，并已获得专利授权(见美国专利号7,635,763(在此作为参考文献完整引述),又及,Spencer HT,DenningG,Gautney RE,Dropulic B,Roy AJ,Baranyi L,et al.Lentiviral Vector Platform for Productionof Bioengineered Recombinant Coagulation Factor VIII.Mol Ther.2010,在此完整引述)。在我们的概念证明型实验中，将所用的重组fVIII分子称为ET-801。ET-801是一种多肽，其氨基酸序列与美国专利7,635,763中的序列号19至少有93%的相似度。

再着眼于细胞体系，我们发现BHK-M细胞系可能比其他常用的哺乳动物细胞系，例如，中国仓鼠卵巢细胞系DG44，或BHK-21细胞系，在包括但不限于ET-801的重组fVIII生产上具有较高产量。但是，BHK-M源自一种只能在贴壁条件下生长的母细胞系（ATCCPTA-4506）。如我们在此的公开，令BHK-M细胞适应悬浮细胞培养可以增加它的生产效率、可扩展性、和大规模生物制造中的可用性。

我们在此公开一种方法，其可令一种贴壁细胞系适应简单或复杂生物治疗药物生产中，基于悬液细胞的生物制造平台。我们也公开一种复杂生物治疗药物的最佳高产（与现有已知体系相比）方法和体系；悬浮细胞培养下具有改良产量（与现有已知体系相比）的重组蛋白;以及悬浮细胞培养中的病毒制造。另外，我们公开一种对产物和病毒均具有高产率的细胞系。

在此公开的新颖体系和方法，较已知体系而言具有更突出的表现。例如，我们展示此体系、方法和细胞系的产量比现有已知生产制造方法具有突出的提高，其产量在现有方法基础上提高了从至少5%到最高1000%。

我们的实施例表明，我们的新颖体系和方法的确可以，并可能更进一步地增加fVIII的产量和可扩展性，与此同时，（我们的GFP展示）也清楚表明我们的新颖方法、体系和细胞系还可以用于增加其他蛋白的产率、产量和可扩展性。我们期望这一平台将要且能够被我们和其他人所利用，以生产替代性的重组生物制药，例如，但不限于，凝血因子IX和VIIa。

更进一步，我们不仅在此展示本方法在仓鼠崽肾细胞（BHK-M）细胞系（在此称为BHK-Ms）和HEK-293T细胞系上的成功应用，与此同时，我们的新颖方法、体系也可以用于增加其他细胞系（无论其此前是否适于悬液培养）的产率、产量和可扩展性。此公开方法和体系可产生一种悬液细胞系，其可在悬液培养体系，例如但不限于，一种使用无血清或无血液成分的生产培养基中，保存多达两个月和/或无限期。

在一种变化形式中，一种令宿主细胞适应悬液培养的方法和体系，可通过一种方法实现，其内容包括：

a.在第一培养皿（例如，具有表面的培养皿）中培养一个或多个贴壁宿主细胞（例如，在生长支持培养基中）;

b.将细胞培养到一定的汇合度水平，例如但不限于，20%-100%,30%-100%,40%-100%,50%-100%,60%-100%,70%-100%,80%-100%,和/或100%汇合度;

c.将细胞从培养皿分离;

d.将细胞重悬于生长支持培养基中；

e.将细胞重新接种至一个培养皿中，在培养基中培育；

f.重复步骤(a)-(e)，直至细胞形成团集；然后

g.将细胞转移至例如但不限于旋瓶或摇瓶中；

h.以例如但不限于摇动或搅动的方式搅拌细胞。

在另一种变化形式中，一种令宿主细胞适应悬浮细胞培养的方法和体系，可通过以下步骤实施:

a.将一个或多个宿主细胞培养在具有生长支持表面的第一培养皿中；

b.允许宿主细胞在培养皿中生长，直至达到一种汇合度水平，例如，宿主细胞可以在培养皿中生长直至达到大约60%-大约100%的汇合度；

c.一旦宿主细胞达到一定的汇合度水平，就将生长支持培养基从细胞中移除；

d.可选地，洗涤该细胞，例如用缓冲液（例如，等渗缓冲液、磷酸盐缓冲盐水、或某种其他缓冲液）；

e.将细胞从培养皿中分离，例如但不限于，向细胞加入有效份量的细胞分离液（例如，胰岛素或EDTA）、物理分离（例如，细胞刮棒、移液管，等等）或其他任何一种物理、化学、酶促或其他性质的方式；

f.在生长支持条件下培育细胞，例如但不限于，约37℃和5%CO₂，直至细胞从培养皿分离；

g.将细胞重悬在有效份量的生长支持培养基中；

h.将重悬的细胞接种入新的培养皿，例如但不限于，一个和第一培养皿有相同表面面积的培养皿，可选地或附加地，一个比第一培养皿面积较大或较小的培养皿；

i.在生长支持条件下，例如但不限于约37℃和5%CO₂，培育细胞大约1至大约24小时，或大约1至大约48小时；

j.重复步骤(c)到(i)至少一次或直至细胞形成可见的团集（例如，作为团集的展示示例，见图2（标为“第10天“的图片）和图4，例如，图4(e)和4(f)）

k.将细胞转移至一种悬液培养基中，例如但不限于旋瓶或摇瓶；

I.用例如但不限于摇动或搅动的方式搅拌细胞。

宿主细胞可以是任何一种哺乳动物细胞，例如但不限于COS、CHO、HeLa、BHK-M、BHK-21、HEK-293T、小鼠骨瘤癌、以及改造后的母细胞系、杂交瘤、正常二倍体细胞、及源于初生组织体外培养所得的细胞株，和此类技术中许多其他已知种类。任何一种此前发现可适应悬浮细胞培养的哺乳动物细胞都可用于此公开的方法。更重要的是，此方法还可成功地令此前未发现可适应细胞悬液培养，因而受限于贴壁生长的细胞系获得适应，例如但不限于BHK-M。

哺乳动物细胞可以是基因改造后表达一种所需的重组多肽和/或重组病毒，或改造后表达一种所需的重组多肽和/或重组病毒的哺乳动物细胞。例如，对哺乳动物细胞的基因改造，例如，可用许多方法改造BHK-Ms，例如电穿孔、阳离子脂质体、阳离子聚合物和慢病毒载体介导的转导。基因改造可以实施于悬液适应之前，或悬液适应之后。在悬液适应之前改造细胞，可能会在选择最佳细胞系的可靠程度上带来一些优势。

此生长支持培养基可指一种营养溶液，其可以允许真核细胞的生长和维持，且可以提供下列范畴中的一种或多种：(1)盐（例如，钠、钾、镁、钙、等等），有助于培养基渗透压；(2)一种能源，其形式可以是一种碳水化合物，例如但不限于葡萄糖；(3)氨基酸，可以是一些或全部必需氨基酸；(4)维他命和/或其他有机化合物；和(5)微量元素，例如，需求量极低(例如，微摩尔级水平)的无机化合物。可选地，此生长支持溶液可补充下列成分中的一种或多种:(1)动物血清；(2)激素和其他生长因子，例如，胰岛素、转铁蛋白和上皮生长因子；和(3)植物、酵母和/或组织的水解产物，包括其蛋白水解产物。

附加地或可选地，此生长支持培养基可以是无血清培养基、合成培养基或无基质的动物衍生成分。合成培养基是已知所有成分化学结构的培养基。合成培养基可从例如Sigma和Gibco这类供应商处获得。任何一种可在此提到的条件下支持细胞生长和维持的生长支持培养基都可能被用到。熟悉此类技术的人能够为特定培养挑选合适的培养基以及其他培养变量(参见，例如，Mather J.P.et.Al.(1999)"Culture media,animal cells,large scaleproduction,"Encyclopedia of Bioprocess Technology:Fermentation,Biocatalysis,andBioseparateion,Vol.2:777-785，在此作为参考文献完整引述)。

细胞分离可用许多已知方法实现，例如但不限于向细胞中加入有效份量的细胞分离液（例如胰岛素或EDTA），物理分离（例如，细胞刮棒、移液管，等等）或其他任何一种物理、化学、酶促或其他性质的方式。

一种细胞分离酶可以包含一种离液剂，或一种酶，或两者皆有。可选地，洗涤步骤可以删去，或者只在实验流程中的某些循环中实施，而不在其他循环中实施。洗涤步骤是否适当，可根据具体情况判断，需考虑到洗涤步骤可能会打碎行程中的细胞团，由此终止或忽略此步骤。

细胞在分离步骤间的生长时长，可能因初始贴壁细胞系的性质而变化。重要的要素是，分离和重悬细胞直至细胞形成可见团集（例如，作为团集的直观示例，见图2（标为“第10天“的图片）和图4，例如，图4(e)和4(f)）。

以下实施例阐述并提供数据来证明依照此体系和方法，在一个示范系统，即100-1000ml旋瓶规模的衍生BHK-Ms和HEK-293T细胞中，能够达成贴壁细胞系对悬浮的适应，和生长、产量特征的改良。所述实施例目的在于阐述例证，而非限定本发明的适用范围。

实施例1

在实施例1中，我们提供此方法的一种典型变化形式。我们还提供数据以证明一个示范体系中，用此体系和方法可以达成一种贴壁细胞系对悬浮的适应，以及生长、产量特征的改良。在此无限定意义的实施例中，此宿主细胞为表达ET-801的衍生BHK-M细胞(衍生自一个母细胞系(ATCC PTA-4506))，其在100-1000ml旋瓶规模上适应悬浮后改称为BHK-Ms。在此实施例中，表达ET-801的BHK-Ms细胞以在此公开的方法在悬液中生长，测定以此所得的fVIII产量后，与基于贴壁细胞的fVIII产量做出比较。

宿主细胞的生成，利用了一种用于制造ET-801的新颖慢病毒表达体系(Spencer HT,Denning G,Gautney RE,Dropulic B,Roy AJ,Baranyi L,et al.Lentiviral Vector Platform forProduction of Bioengineered Recombinant Coagulation Factor VIII.Mol Ther.2010,在此作为参考文献完整引述，下文中称为"Spencer2010")。为此示范试验，我们准备了一个BHK-M细胞系，命名为3-10，其以160单位/10⁶细胞/24小时的中等水平表达重组fVIII(ET-801)。在此初步试验中，我们以一次小规模生产运行，展示了利用此新颖体系和方法，令细胞系3-10(依照Spencer2011中所展示的步骤制造)适应于悬浮后的突出蛋白产量。

在37℃和5%CO₂下，锚着依赖的BHK-M细胞被培养在100mm x20mm处理培养皿(Corning#430167)中，其中加入10ml高级达尔伯克改良伊格尔培养基/F12(AdvancedDulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12，或DMEM/F-12,Invitrogen#12634)，且按体积比例补充加入10%牛胎儿血清(Fetal Bovine Serum，或FBS,Invitrogen#10082),1%GlutaMAX-l(Invitrogen#35050),和1%盘尼西林-链霉素(Penicillin-Streptomycin,Invitrogen#15140)(下文中此培养基称为DMEM Complete或DMEM:F12Complete)。在细胞生长至100%汇合度时，即移除DMEM Complete培养基,以3ml(1x)达尔伯克磷酸盐缓冲液((1x)Dulbecco’s Phosphate-Buffered Salined，或PBS,Invitrogen#14190)洗涤细胞一次，向培养皿中均匀加入500μΙ稳定型胰蛋白酶替代酶（TrypLE Express，Invitrogen#12605)，然后将此培养皿在37℃和5%CO₂下培养5分钟。培养时间结束后，轻轻将细胞重悬在5mlDMEM Complete中，并将所有细胞（未经大量稀释或拆分）转移至一个和第一培养皿表面积相同的新培养皿中,另加入25ml DMEM Complete并允许细胞在37℃、5%CO₂的培养箱中隔夜生长。此接种过程每日重复，连续4天，直至由于细胞密度增加导致培养皿表面积短缺，细胞无法保持单层，而开始形成立体结构为止(见图2)。

至此，将细胞转移至悬液培养。在一个125ml旋瓶(Corning#3152)中加入120ml DMEMComplete,另补充1.25ml普朗尼克F-68（Pluronic F-68，10%溶液,Invitrogen24040)。细胞用dPBS洗涤，用胰酶替代物(TrypLE)自培养皿上剥离，再次培养，然后小心地如前法重悬，然后移入前面提到的旋瓶中，保持60rpm的搅拌速度并置于37℃和5%CO₂的培养箱中。通过死细胞台盼蓝（Trypan Blue，STEMCELL Technologies#07050)染色法，每日监控细胞活性。每隔2天更换旋瓶中的培养基，移除80ml剩余培养基，重新加入85ml补充有850μl普朗尼克F-68的新鲜DMEM Complete培养基。

在此初步试验中，我们演示可以用在此公开的方法，包括连续重复接种贴壁BHK-M细胞，来令BHK-M细胞适应悬浮。经过10天的连续重复接种和在37℃、95%湿度、5%CO₂下的培养，细胞达到了高度团集状态，且其生长开始脱离组织培养容器中的表面附着区域。此时，将细胞转移至摇瓶或旋瓶中，在保持相同的培养条件下，增加中度转动(60-75rpm)。在悬液培养1-2天后，细胞开始扩增，其倍增时间为24-48小时。至此，细胞适应了悬液培养，将其命名为“BHK-Ms”细胞，且由经验断定，其可在含血清或无血清培养基中保存超过2个月（也可能无限期）。

图2直观地展示了依照以上公开的方法，BHK-M细胞到BHK-Ms细胞的转变。BHK-M细胞可以依照在此公开的方法，包括连续重复接种贴壁BHK-M细胞，来适应悬浮。BHK-M细胞。在10天的连续重复接种后，细胞达到高度团集状态（如图2所示），且生长开始脱离组织培养容器中的表面附着空间。此时，可将细胞接入摇瓶或旋瓶中接受中度转动(60-75rpm)。悬液培养1-2天后，细胞开始以24-48小时的倍增时间扩增。

在此实验变化形式中，所制得的BHK-Ms克隆系3-10在1L的容积中展现了超过40天的健康而持续的扩增。在无血清生产阶段，此体系中收获了约1,000,000单位的fVIII。这代表着无显著优化的商业重组fVIII生产体系基础上50倍的产量改良。

图3所示为依照此公开方法制备的BHK-Ms细胞中，改良50倍的重组fVIII表达。每日均进行培养基完全更换，并以一步凝血分析法测定每次收集物中的fVIII活性浓度。水平线代表此公开方法中，ET-801的fVIII平均无血清产量水平（如直线上方“ET-801”所示）。以hfVIII所示的水平线代表已发表论文中的重组人体（h）凝血因子VIII的平均产量水平。

如上完整叙述的所得细胞系、其制造和使用方法，命名为BHK-MS-310，可联系发明人和/或代理人来获取。此细胞系提供改良的产品产率、在悬液培养中生长的能力、和改良的在其母细胞系中制造病毒的能力。

实施例2

在又一个实施例中，我们提供了此方法的一个示范变化形式，同时提供数据来说明一个示范系统中，依照此体系和方法令HEK-293T贴壁细胞适应悬浮，并获得改良生长特征的数据。在此实施例中，按照此公开方法在特定条件下的一种变化形式，令HEK-293T细胞适应悬浮。HEK-SC-293T细胞系提供改良的产品产率、在悬浮培养中的生长能力和改良的从母细胞系中制造病毒的能力。

此实施例中的方法如下：

a.以一个冷冻的原初HEK-293T贴壁细胞系开始；

b.在37℃、5%CO₂下，放入10cm康宁(Corning)培养皿中，加入10ml DMEM/F-12complete(附加5%Giutamax、10%FBS)以解冻；

c.令细胞在含有有效份量的生长支持培养基，例如DMEM/F-12的10cm培养皿中生长直至汇合（1-2天）；

d.每天重复下列步骤以令细胞团集，直至形成大部分不贴于培养皿表面的团块；

i.移除所有培养基；

ii.用PBS洗涤细胞（此步骤可选，且在头几次循环后可以终止）；

iii.加入700μl胰酶替代物(TrypLE,如Trypsin analogue,Inviirogen#12605)；

iv.在37℃,5%CO₂下培养5分钟；

v.将细胞小心转移至含有增量DMEM/F-12complete的新10cm培养皿中，其增量取决于细胞密度，尽量不要打碎细胞团；

vi.在37℃,5%CO₂下隔夜培养；

vii.重复步骤(i)-(vi)直至细胞形成团块；

viii.细胞形成团块后，将细胞转移至含有补充了1%V/V普朗尼克F-68（PluronicF-68）的50ml培养基(此例中为DMEM/F-12)的125ml旋瓶(Corning#3152)中；

ix.在37℃、5%CO₂下,以中等转速(60rpm)隔夜培养。

e.每日更换培养基，包括以400G转速将细胞离心5-10分钟，移除废弃培养基，将所有细胞重悬于加有1%V/V普朗尼克F-68（Pluronic F-68）的100ml培养基中，在37℃、5%CO₂和中等转速（60rpm）下隔夜培养；

f.测定细胞密度，即将一小份团集细胞以RLA(Promega#Z3051)进行细胞溶解，再以二喹啉甲酸酸分析(BCA分析)法（见Thermo Scientific#23225,操作流程，在此完整引述），将所得的蛋白水平与已知细胞密度的未团集细胞蛋白水平标准曲线比较。

图4(a)-4(f)以照片文件展示此新颖公开方法在此实验变化形式中的成功应用。图4(a)所示为初始材料，即汇合的HEK-293T细胞。图4(b)所示为第1天至第2天的连续重复接种，此期间观察到增加的细胞密度和细胞堆积。图4(c)所示为第2天至第3天继续进行的连续重复接种，此期间观察到更多细胞堆积。图4(d)所示为第3天至第4天的连续重复接种，此期间细胞团块开始在单层贴壁细胞的上方生长。图4(e)所示为第4天至第5天的连续重复接种，此期间细胞团块开始长得更大。图4(f)所示为第5天至第8天的连续重复接种，此期间细胞团块开始不依赖于贴壁。

通过每日重复步骤(e)，例如，离心且仅重悬一部分细胞（通常为80%），可以无限期地保存此培养基。

实施例2中所述细胞在适应悬浮后，加以转染。

依照上述方法，可将许多贴壁细胞系制造为悬液细胞系，与此同时，在上述的特定实施例和特定参数下所制得的细胞系，被称为HEK-SC-293T，可通过联系发明人和/或代理人获取。此细胞系提供改良的产品产率、在悬液培养中生长的能力、和改良的在其母细胞系中制造病毒的能力。

实施例3

在再一个实施例中，我们提供此方法的一个示范变化形式，及证明依照此公开方法所制得的细胞系制造重组病毒的能力的数据。转导和效价滴定可以用已知的或如Spencer2011所述的方法进行，在此以参考文献形式完整引述。

在一个进一步的变化形式中，我们公开一种方法和细胞系（命名为HEK-SC-293T，其制造和使用方法在此完全公开，且可以通过联系发明人和/或代理人及其他方式获取），用于高产率地制造病毒，例如，向在此公开的方法所制得的细胞系转导所需病毒。以下实施例展示了依照在此公开的方法适应悬浮的细胞中，第三代慢病毒的制造和浓缩。所提到的，例如，容器尺寸和所有的数量，显而易见，可以被修改和调整，以扩大或缩小生产规模。此方法可以下列步骤实施：

a.接种用于转染的细胞：

i.取一只含有50ml Complete DMEM:F12培养基，1x10⁶细胞/ml（例如，以BCA分析法测定）HEK-SC-293T悬液细胞的新旋瓶；

ii.在37℃、5%CO₂、60rpm下培养细胞；

b.转染(第1天):

i.在1个15ml圆锥管中，向质粒DNA总量（见下表1）中加入转染试剂OPTI-MEMI(Gibco)或类似制剂，令最终体积为5ml。用过滤器，例如，0.22μm的过滤器过滤消毒并转入1个新的15ml圆锥管。

表1

ii.在另一个15ml圆锥管中，向144μΙ10mg/ml聚乙烯亚胺（PEI）（PEI的计算见下表2）加入5ml的，例如，转染试剂OPTI-MEM I(Gibco)或类似制剂。用过滤器，例如，0.22μm的过滤器，过滤消毒并转入1个新的15ml圆锥管。

表2

PEI储藏液浓度	PEI量/mg质粒DNA	质粒DNA总量(mg)	PEI总量(ml)
				10mg/ml	0.8ml	180	144

iii.合并质粒DNA和PEI混合物，在室温下培养20分钟。

iv.将悬液细胞，例如，HEK-293T悬液细胞在50ml圆锥管中以1500rpm离心10分钟，丢弃条件培养基。

v.等待离心时，将DNA/PEI混合液加入50ml新鲜DMEM:F12complete(不含1%盘尼西林/链霉素)，直至约60ml的最终体积，彻底混合以获得均匀的混合液。

vi.以旋瓶中的培养基将悬液细胞，例如，HEK-293T悬液细胞，重悬在旋瓶中。

vii.在37℃,5%CO₂和60rpm转速下将细胞置于培养箱中隔夜培养，以达成转染。

c.转染后(第2天):

i.如前简述般，将转染后的悬液细胞离心，小心倒掉细胞的转染培养基，并更换为50mlDMEM:F12complete。

ii.继续在37℃、5%CO₂下的培养箱中培养细胞。

d.病毒采集/收获(第3天和第4天):

i.检查细胞状态，确认转染证据，例如，GFP细胞，在荧光显微镜下检查。对于fVIII，可以，例如，检查培养基的凝血时间。

ii.若证据表明细胞正在表达所需产物，则进行如下步骤:

1.将细胞在1,500转速下离心10分钟（移除细胞残渣）；

2.将含有病毒的培养基轻倒入无菌离心管，并将细胞，例如，HEK-293T悬液细胞,重新接种入含有50ml新鲜DMEM:F12complete的旋瓶，并继续在37℃,5%CO₂和60rpm转速下在培养箱中培养细胞；

3.用过滤器，例如，但不限于，0.45mm的过滤器，过滤含有病毒的培养基，并于4℃下储藏（最多4天）直至病毒浓缩；

4.重复如上所述步骤，采集2天。

iii.可选地，浓缩、重悬并储藏病毒。

iv.如下表格所示，为依照此公开方法所制得的适应悬浮的细胞系生产功能病毒的能力，依照Spencer2011所描述的转导BHK-M细胞的qPCR转基因拷贝数分析而测定。采集的病毒依照病毒采集日顺序加以细分，并计算每天非浓缩病毒培养基的平均效价。而后，将非浓缩效价与浓缩率相乘，得到浓缩效价估计:

表3

实施例4

以下实施例和相关数据进一步展示，细胞依照此公开方法适应悬浮后的高水平fVIII表达。以下实施例只用于说明目的，并非意味着将此公开限于特定的规模或数量等等。

依照在此公开的方法，令1个命名为ET-801的BHK-M克隆系适应无血清悬液培养，即成为我们所称的BHK-Ms细胞。令此BHK-M克隆系在1L体积规模下，做30天的扩增和生长，测定其fVIII浓度，并绘制于图5。每个数据点均代表1L培养基完整收获后的fVIII浓度。没有观察到细胞活性变化，暗示在此条件下细胞可无限期存活。此次生产运行中，总共收获了超过1百万单位的fVIII活性。由于初始材料中的高浓度ET-801的存在，首次使得以单次阳离子交换色谱分析法获得高纯度材料成为可能。830倍提纯后，分离出约4.9mg高度提纯的ET-801。基于酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸的预估含量所得的280nm时的摩尔消光系数，254,955M^-1cm^-1，计算出的比活度为3,000单位/nmol，或17,700单位/mg。

以聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对ET-801的纯度进行评估，并与重组BDD人体fVIII相比较。其中有少量对凝血酶的断链作用敏感的单链产物。没有观察到重大污染物。对提纯后的ET-801的糖基化反应、与血管性血友病因子(vWf)的相互作用、以凝血酶激活后的活性衰退都做出了评估。用凝血酶和糖类内切酶PNGase F处理ET-801，A1和A3-C1-C2（轻链）蛋白片段的相对分子量(Mr)发生了变化；PNGase F处理后，未观察到A2区域的相对分子量变化。这些数据暗示ET-801具有的糖基化模式和以前论文中对重组BDD人体fVVV和重组BDD猪fVIII的描述相一致(Doering et al.Journal of BiologicalChemistry.2004.279(8):6546-6552,在此作为参考文献完整引述)。

为确认所得ET-801在活体中的功能性，向血友病A小鼠注射了生理盐水或剂量为290单位/kg的ET-801，此浓度为可令循环fVIII活性回复鼠类正常水平的经验浓度。施与生理盐水或ET-801后，对小鼠执行断尾止血实验，并测定其在40分钟时间内的失血总量。只有注射了生理盐水的血友病A小鼠具有29.6mg/g体重的平均失血量。相比之下，注入了ET-801的小鼠平均失血量为0.1mg/g体重，显著低于对照组(P=0.029)。

可以依照上述方法从许多贴壁细胞系制造悬液细胞系，与此同时，在上述特定条件的特定实施例中得到的细胞系，及以上完整叙述的制造和使用方法，命名为BHK-MS-310-ET801,均可通过联系发明人和/或代理人获取。此细胞系提供改良的产品产率、在悬液培养中的生长能力及改良后的从母细胞系中制造病毒的能力。

实施例5

以下实施例及相关数据说明最佳饲喂时间表对细胞密度的影响。在此实施例中，每12小时，而非上述实施例中所展示的24-48小时，对悬液细胞喂以新鲜培养基。如图6所示，12小时饲喂时间表能达到和维持更高的细胞密度。

实施例6

以下数据描述另一个适应悬浮的BHK-M克隆系，命名为P14，其经过如下基因修饰：高分子聚合物载体下的哺乳动物表达质粒转染、慢病毒载体下的连续转导、并编码一种重组fVIII转基因，该转基因的产物在此称为ET-3（多肽ET-3含有的氨基酸序列与美国专利号7,635,763中序列19相似度不低于99%）。

在上述特定条件的特定实施例中得到的细胞系，以及在上述实施例和Spencer2011中完整叙述的制造和使用方法，命名为BHK-MS-P14,可通过联系发明人和/或代理人获取。此细胞系提供改良的产品产率、在悬液培养中的生长能力及改良后的从母细胞系中制造病毒的能力。

图7所示为fVIII活性(ET-3)随培养密度的变化。

图8所示为BHK-MS-P14悬液培养基的长期生长和稳定性。通过二喹啉甲酸（BCA）蛋白分析来测定总蛋白水平，并与已知BHK蛋白/细胞标准液相比较，以测定密度。

图9所示为P14克隆系在各种培养基中有效率地制造fVIII的能力，培养基包括但不限于，加有血液白蛋白或重组白蛋白的无血清或合成培养基。

实施例7

在此实施例中，我们展示依照此方法适应悬浮的细胞，可通过基因修饰表达除重组fVIII分子以外的外来转基因，例如，绿色荧光蛋白（GFP）。

为说明依照此公开方法所制得的BHK-Ms细胞的价值，我们展示它们能够随时进行基因修饰，例如，表达多种重组蛋白。因此，我们在标准转染条件下，以阳离子聚合物PEI来展示BHK-Ms的基因修饰效率。图10所示为以PEI和报告基因绿色荧光蛋白(GFP)对悬浮HEK-SC-293T细胞进行基因修饰所得的显著结果。图10为依照此公开方法所制得的适应悬浮的HEK-293T，已转染并正在制造GFP。

实施例8

以下是一种此公开方法用于试验性生产的建议变化形式。例如，对于试验性生产，一种依照此公开方法适应悬浮的贴壁细胞系，例如1个表达ET-801的BH-Ms细胞系，可以将其规模提升为，例如但不限于，含有10LBHK-Ms生产培养基的50L生物反应器（例如Xcellex)。每天可收获5至10L的条件培养基，过滤澄清，并冷冻于-80℃。可用我们此前开发并描述(Spencer HT,Denning G,Gautney RE,Dropulic B,Roy AJ,Baranyi L,et al.Lentiviral Vector Platform for Production of Bioengineered Recombinant Coagulation FactorVIII.Mol Ther.2011,在此完整引述)的一种新颖的单步骤离子交换色谱层析法，对条件培养基上的ET-801进行提纯。如上所述，商用全长重组人体fVIII的提纯工艺可能包含一个免疫亲和步骤，此类提纯引入另一种生物制剂，例如人体fVIII单克隆免疫球蛋白抗体，从而令验证工艺复杂化。而采用我们在Spencer2011中所描述的提纯过程，则可能降低生产成本，从而降低产品成本。对fVIII制剂，则可采用此前(Spencer HT,Denning G,GautneyRE,Dropulic B,Roy AJ,Baranyi L,et al.Lentiviral Vector Platform for Production ofBioengineered Recombinant Coagulation Factor VIII.Mol Ther.2011)和以下描述的方法对其纯度、加工、比活度和凝血酶激活后的衰退变化进行分析。

对新颖性的进一步考量

根据以上事例和公开，我们展示了一种令贴壁细胞适应悬液培养的方法。我们还公开了以此公开方法培养的新颖细胞系，并演示了依照此公开方法培养的悬液细胞系的优秀生产能力。为了进一步展示这些令人吃惊的杰出生产数据，可将在此公开的结果与目前市场上主要的商用fVIII制造商的数据相比较。作为规模和产量上的对比，巴克斯特公司(Baxter,Inc)2006年1月曾公布，该公司的第三代重组h-fVIII制剂ADVATE^TM自2003-2004年获得美国食品及药物管理局(FDA)和欧洲委员会(European Commission)批准以来，其累积销量超过10亿单位（约100克）。如图1所示，每种重组fVIII制剂的年估计生产量为100-200克。

作为对比，我们示范试验性规模下的fVIII生产运行，可以通过将BHK-Ms克隆系3-10接种入1L转瓶进行，其接种密度为，例如但不限于，约10⁶细胞/ml。然后，整个培养基可用于接种1个含有10L BHK-Ms生长支持培养基的50L生物反应器(e.g.,Xcellerx)。基于生产阶段的期望细胞密度，2x10⁶细胞/ml，我们用以下公式估计ET-801的日产量：fVIII日产量=2,000,000细胞/ml*100单位/1,000,000细胞*10,000ml=2,000,000单位

因此，我们期望在为期30天的生产运行中，收获含有约60,000,000单位fVIII活性的300L条件培养基。基于此前测定的比活度，17,700单位/毫克（Spencer2011），我们的期望产品产量超过3g。

如上所示，在一次为期30天、规模为1L的实验中，我们收获了超过1,000,000单位的fVIII。这清楚地表明，若将规模扩大到生物制造业规模(例如，拜耳公司(Bayer)在任何指定时间可同时运行10个或更多的200L生物反应器)，按照我们的公开所制得的细胞可以在一次为期30天，规模为1000L的实验中收获10亿单位制剂。换句话说，依照我们的方法，可以在一次为期30天，规模为1000L的实验中达到拜耳公司借由其强大的生产能力和众多员工用近3年时间所达成的产量。

因此，在此公开的方法、体系和细胞系具有显著降低成本、增加包括但不限于fVIII的短缺生物治疗药物供应的潜力。作为进一步实施例，拜耳公司曾表示，其伯克利(Berkeley)工厂需耗费1000人约250天时间，才能生产一批次其fVIII产品，KOGENATE FS,即200g制剂。我们的公开方法可以在更短的时间里，利用更少的资源，生产出远多于此的产品。例如，fVIII的年估计产量为100-200克，而我们已展示，我们在实验室规模下，利用极为有限的资源，在30天内所收获的fVIII，就已超过其年估计产量的十分之一。

图11所示为2种生产方案，一种基于ET-801的滚瓶生产，另一种基于单槽生物反应器。这突出了重组蛋白生产制造中细胞悬浮生长的好处。据保守估计，基于BHK-Ms的生产流程，可以带来超过基于BHK-M的滚瓶生产流程2倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍甚至100倍的产品产率增长。这一关键性进步，可以克服重组蛋白制药市场的技术和经济进入壁垒，增加fVIII的供应，将其提供给目前得不到fVIII的血友病A患者。

fVIII制剂特征测定的示范试验流程公开。

BHK-Ms生物合成ET-801的提纯和生化分析:重组ET-801可以用多种方法提纯，其中一种为最近所述(Spencer2011)的单步骤离子交换色谱法。辨认含fVIII的片段可以采用，例如但不限于，一次凝血分析法和十二烷基硫酸钠凝胶电泳（SDS-PAGE）加银染法。ET-801的比活度计算可以采用，例如，由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸的预估量和其在280nm波长下的吸光度来测定的摩尔消光系数(Pace CN,Vajdos F,Fee L,Grimsley G,Gray T.How tomeasure and predict the molar absorption coefficient of a protein.Protein Sci.1995;4(11):2411-23)。

最终产物比活度可以被定义为，例如，排除280nm吸光度低于0.08或活化商低于20的片段后，fVIII峰值片段比活度的加权平均数。ET-801制剂纯度可用多种生化/物理技术测定。例如，十二烷基硫酸钠凝胶电泳（SDS-PAGE）和银染法可用于测定纯度和加工程度。基于初步数据，我们预计提纯后>95%的蛋白产物会以蛋白酶PACE/furin细胞内加工后特有的异二聚体（重链/轻链）形式存在。我们也观察到少量未加工的单链产物，该产物常见于我们制备的人体fVIII、猪fVIII和人/猪杂交fVIII(Spencer HT,Denning G,Gautney RE,Dropulic B,Roy AJ,Baranyi L,et al.Lentiviral Vector Platform for Production of BioengineeredRecombinant Coagulation Factor VIII.Mol Ther.2011.;Doering C,Parker ET,Healey JF,Craddock HN,Barrow RT,Lollar P.Expression and characterization of recombinant murinefactor VIII.Thromb Haemost.2002;88(3):450-8.;Doering CB,Parker ET,Healey JF,CraddockHN,Barrow RT,Lollar P.Expression and Characterization of Recombinant Murine Factor VIII.ThrombHaemost.2002;88(3):450-8.;Doering CB,Healey JF,Parker ET,Barrow RT,Lollar P.Identification of porcine coagulation factor VIII domains responsible for high level expressionvia enhanced secretion.J Biol Chem.2004;279(8):6546-52.,在此作为参考文献引述)。

在十二烷基硫酸钠凝胶电泳（SDS-PAGE）前，也可向ET-801加入凝血酶并培养，以此确定是否彻底激活，以及是否仅存在代表异三聚体fVIIIa的A1、A2和A3-C1-C2区，还可以用肽质量指纹图谱来为ET-801制剂定性(见e.g.,Mann M,Hendrickson RC,Pandey A.Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry.Annu Rev Biochem.2001;70:437-73,在此作为参考文献引述)。简短来说，将此蛋白制剂消化后，所产生的肽分子态离子的质量可通过生成肽质谱来测定。更确定的辨识可以通过选择性地对肽离子进行串联质谱分光光度分析来达成。所得数据可用于辨识ET-801、制剂中的潜在污染物，也可用于定性所含的翻译后修饰。

高分子量fVIII聚合体的形成可能会令fVIII的提纯复杂化(Grillo AO,Edwards KL,Kashi RS,Shipley KM,Hu L,Besman MJ,et al.Conformational origin of the aggregation ofrecombinant human factor VIII.Biochemistry.2001;40(2):586-95.，在此作为参考文献引述)。有很多方法可用来检验存在于ET-801制剂中的大分子fVIII聚合体，其中包括层析高效液相色谱法(size-exclusion HPLC)。

凝血酶活化后，被活化ET-801的稳定性：要确定提纯后的ET-801的A2亚单位分离比率，可以采用此前所述的针对人或猪重组ET-801，多种人/猪杂交VIII结构和鼠科fVIII的筛选流程(Doering CB,Parker ET,Healey JF,Craddock HN,Barrow RT,Lollar P.Expressionand Characterization of Recombinant Murine Factor VIII.ThrombHaemost.2002;88(3):450-8.;Doering CB,Healey JF,Parker ET,Barrow RT,Lollar P.Identification of porcine coagulationfactor VIII domains responsible for high level expression via enhanced secretion.J Biol Chem.2004;279(8):6546-52.;Doering CB,Healey JF,Parker ET,Barrow RT,Lollar P.High-levelexpression of recombinant porcine coagulation factor VIII.JBiolChem.2002;277(41):38345-9.;Parker ET,Doering CB,Lollar P.A1subunit-mediated regulation of thrombin-activated factorVIII A2subunit dissociation.J Biol Chem.2006.,在此作为参考文献引述)。

例如，ET-801可用0.15M NaCI,0.02HEPES,2mM CaCI₂稀释至1,20,50或100nM，并以100nM凝血酶活化30秒。FVIIIa活性可以用显色分析根据时间测定。在此条件下，fVIII30秒后完全活化，在显色分析中的失活完全来源于fVIIIa的衰减(Fay PJ,Smudzin TM.Characterization of the interaction between the A2subunit and A1/A3-C1-C2dimer in humanfactor Villa.JBiolChem.1992;267(19):13246-50.;Lollar P,Parker CG.pH-dependentdenaturation of thrombin-activated porcine factor VIII.JBiolChem.1990;265(3):1688-92.;Lollar P,Parker ET.Structural basis for the decreased procoagulant activity of human factor VIIIcompared to the porcine homolog.JBiolChem.1991;266(19):12481-6.;Lollar P,Parker ET,FayPJ.Coagulant properties of hybrid human/porcine factor VIII molecules.JBiolChem.1992;267(33):23652-7.,在此作为参考文献引述)。

在血友病A鼠科模型中测定ET-801的功效：我们开发了一种功效模型来评估fVIII降低E16血友病A小鼠断尾后的死亡率或失血量的能力(Parker ET,Lollar P.A quantitativemeasure of the efficacy of factor VIII in hemophilia A mice.Thromb Haemost.2003;89(3):480-5.Incorprated herein by reference)。在此模型中，断尾前未接受fVIII的血友病A小鼠死亡率超过90%。此方法通过测定50%存活率时的估计用量(ED₅₀)，来确定重组p-VIII对猪血浆fVIII的相对功效。此方法可用来确定ET-801在活体中的ED₅₀。简要来说，先对E16血友病A小鼠执行麻醉剂1.5mg/kg氟哌利多/75mg/kg氯胺酮的腹腔内注射。然后，将小鼠在60瓦特灯源下加热3分钟，以令其尾部静脉扩张。在双盲实验设计下，以不同剂量的ET-801、BDD p-fVIII、BDD h-fVIII或生理盐水对小鼠进行尾部静脉注射。注射完成15分钟后，将小鼠置于50ml圆锥约束管中，在尾部末梢1.5cm处剪断，将残根末端置于装有7.5ml浓度为150mM的NaCI的13x100mm试管中，并保持37℃水浴。在2、4、6、24小时时分别对存活小鼠进行称重，以体重的减少作为急性失血的定量替代测量，并作为次要功效变量。ED₅₀可以用上下法测定(Dixon WJ.Staircase bioassa_y:the up-and-down method.Neurosci Biobehav Rev.1991;15(1):47-50.,在此作为参考文献引述)。死亡率等全或无类反应数据的标准差可以采用概率单位分析来估算。

结论

总而言之，依照此公开方法令细胞适应悬浮，例如但不限于BHK-Ms细胞和HEK-293T细胞，代表着生物医药制造业和病毒制造方面的显著技术进步。

ET-801是为治疗血友病A而开发的一项新颖产品，其克服了该病患者治疗中的一项重大障碍，即，fVIII制剂的花费。基于我们的初步数据，我们在此公开一项方法、体系和细胞系并要求其权利，其可令重要生物医药，例如但不限于，ET-801的产量上获得较于目前市场供应的h-fVIII制剂的显著提高。高表达水平的fVIII因子、慢病毒驱动的基因转移和表达、以及BHK-Ms细胞生产平台的各项技术进步相结合，令ET-801得以通过较目前的fVIII制剂为低的价格供应市场，因此更好地帮助血友病A的患者，并随之通过减少医疗补贴花费，带来经济效益。

如上述所示，我们在此公开的方法，可以广泛应用于不同贴壁细胞向悬液培养的转换。我们展示了所制得的细胞系与其母细胞系和/或贴壁细胞系相比，具有改良的产品产率。我们还公开和描述了依照此公开方法所制得的3种特定细胞系，BHK-MS-310、BHK-MS-P14、和HEK-SC-293T。此3种细胞系如上完整描述，每种都可在多种地点获取，也可以联系发明人和/或代理。

此公开方法与已知方法相比，在若干方面具有新颖性。用贴壁哺乳动物细胞系制备悬液细胞的已知方法，绝大多数都依赖于微球、微载体和其他类似仪器的使用。另外，有报告称血清剥夺可诱导某些哺乳动物细胞系转为悬浮。依照此公开方法制得的悬液细胞系呈团集状态(作为团集状态的直观示例，见图2（标有“第10天”的图片）和图4，例如图4(e)和4(f))。我们在此描述团集细胞悬液较于目前已知单细胞悬液的一些优势特征。

更进一步，在此公开的方法比采用微球和/或血清剥夺的方法用时更短，用料更少。我们在此演示，依照我们在此公开的方法所制得的细胞，具有可以直接从含血清转至不含血清的培养基的新颖特征，而无需经过逐步剥夺血清的步骤(例如，逐步将细胞转入血清含量越来越少的培养基，例如，10%到8%到4%等，直至0%)。废弃血清剥夺步骤是一项新颖而震撼的进步，能够节省时间和资源。另外，微球和微载体都非常昂贵，而我们方法的诸多优点中，也包括不依赖微球和/或微载体的优点，因此比需要微球和/或微载体的方法的成本更低。

本发明的如前描述，令普通技术水平的人即能掌握目前此种同类中最好形式的制造和使用方法，具有普通技术水平的人群也能够理解和领会在此包括的特定示范实例的变化形式、组合及等同形式。因此，本发明不应被限于以上描述的实例和方法，而应如所要求般，包括与本发明同范围同构思的所有实例和方法。

Claims

1.一种使宿主细胞适应悬浮细胞培养的方法，此方法包括:

使一个或多个宿主细胞在第一细胞培养皿中生长，该第一培养皿具有表面区域;

使用允许宿主细胞生长和维持的生长支持培养基；

(a)移除生长支持培养基；

(b)从培养皿上分离细胞；

(c)培养所述细胞；

(d)将所述细胞重悬于所述生长支持培养基中；

(e)接种上述重悬细胞；

(f)让所述重悬细胞生长一段时间，该一段时间为使细胞重新贴壁培养皿所需的时间；

(g)将步骤(a)-(f)重复至少一次；

(h)将细胞转移至悬浮培养瓶；

(i)搅拌细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，宿主细胞为至少一个BHK-M或HEK-293T。

3.根据权利要求2所述的方法所制得的细胞系。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，宿主细胞为HEK-293细胞。

5.根据权利要求4所述的方法所制得的细胞系。

6.用于在悬浮细胞培养中制造多肽和病毒中的至少一个的方法，该体系包括：

根据权利要求2所述的方法制造的、表达ET-801的细胞系。

7.用于产品的高产率生产的体系，包括：

根据权利要求4所述的方法制造的、表达ET-3的细胞系。