CN101675073B - 细胞培养物中因子viii多肽滴度的提高 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产因子VIII多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)在用于表达所述因子VIII多肽的条件下培养表达因子VIII多肽的哺乳动物细胞，所述培养条件包括包含C2结构域配体的细胞培养基，和b)通过合适的方法从哺乳动物细胞分离表达的因子VIII多肽。

Description

细胞培养物中因子VIII多肽滴度的提高
发明领域
本发明涉及一种生产因子VIII多肽的方法，包括使用C2结构域配体，尤其是O-磷酸-L-丝氨酸(OPLS)。
发明背景
典型的血友病或血友病A是一种遗传性出血疾病。它源于与染色体X有关的血液凝结因子VIII缺陷，并且几乎只影响男性，发病率为每10,000人中1到2例。X染色体缺陷由自身不是血友病患者的女性携带者传播。血友病A的临床表现是出血倾向的增加。在利用因子VIII浓缩物的治疗被引入前，患有严重血友病的人的平均寿命低于20年。使用来自血浆的因子VIII浓缩物显著改善了血友病患者的情况，广泛地增加了平均寿命，使他们中的大多数能够过上或多或少正常的生活。但是，在血浆来源的浓缩物和它们的使用中存在某些问题，其中最严重的问题是病毒的传播。到目前为止，造成AIDS、乙肝和非甲非乙型肝炎的病毒已经严重影响人群。从那时起不同的病毒灭活方法和新的高度纯化的因子VIII浓缩物近来已被开发出来，这也为血浆来源的因子VIII确立了非常高的安全标准。
已知因子VIII(FVIII)在哺乳动物细胞中以非常低的水平表达。并且已知在无血清或无蛋白的培养基中因子VIII是不稳定的蛋白。各种物质的添加已经被用于提高因子VIII的稳定性和滴度。
WO 9743436公开了添加金属依赖性抑制剂和/或糜蛋白酶的抑制剂。
WO 88/08035和WO 87/04187公开了向因子VIII培养基中添加磷脂。还描述了von Willebrand因子(vWF)的共表达。
US 20050227913A1公开了OPLS通过结合C2结构域(2303-2332)而作为因子VIII聚集的抑制剂。聚集更少的因子VIII据称免疫原性更低。
K.Hansen，M.Kjalke，P.B.Rasmussen，L.Kongerslev，和M.Ezban，Cytotechnol.24(3)，227-234，1997，公开了使用杆菌肽A和磷脂酰丝氨酸来阻止培养基中因子VIII的降解。
WO 90/02175A1公开了在存在蛋白酶抑制剂以阻止多肽降解的条件下，通过培养真核细胞生产重组多肽的方法。
EP 1707634A1公开了相当大量的因子VIII缔合在细胞表面，可以通过用高离子强度的缓冲液清洗将其洗脱。
因此，仍然需要改进的生产方法以便提高因子VIII多肽的总产率和/或降低生产成本。
发明概述
本发明的第一个方面涉及一种生产因子VIII多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)在用于表达所述因子VIII多肽的条件下培养表达因子VIII多肽的哺乳动物细胞，所述培养条件包括包含C2结构域配体的细胞培养基，和b)通过合适的方法从哺乳动物细胞分离表达的因子VIII多肽。
本发明的第二个方面涉及一种生产因子VIII多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)在用于表达所述因子VIII多肽的条件下培养表达因子VIII多肽的哺乳动物细胞，所述培养条件包括细胞培养基，和b)通过合适的方法从哺乳动物细胞分离表达的因子VIII多肽，所述合适的方法包括向所述细胞添加C2结构域配体。
附图简述
图1.因子VIII基因序列(cDNA)(SEQ ID NO.1)。
图2A-B：O-磷酸-L-丝氨酸对FVIII生产率和FVIII蛋白比活性的影响。
图3A-C.O-磷酸-L-丝氨酸和/或植物蛋白水解物对因子VIII生产细胞的培养基中因子VIII的影响。条件A-D的特性显示于表4。
发明详述
如上所述，本发明的第一个方面涉及一种生产因子VIII多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)在用于表达所述因子VIII多肽的条件下培养表达因子VIII多肽的哺乳动物细胞，所述培养条件包括包含C2结构域配体的细胞培养基，和b)通过合适的方法从哺乳动物细胞分离表达的因子VIII多肽。
本发明的第二个方面涉及一种生产因子VIII多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)在用于表达所述因子VIII多肽的条件下培养表达因子VIII多肽的哺乳动物细胞，所述培养条件包括细胞培养基，和b)通过合适的方法从哺乳动物细胞分离表达的因子VIII多肽，所述合适的方法包括向所述细胞添加C2结构域配体。
在这两种情况下，C2结构域配体在促进细胞培养基中因子VIII多肽的滴度水平增加方面起着重要作用。
不受任何特定理论的束缚，普遍认为细胞培养基中因子VIII多肽滴度水平的增加由C2结构域配体(尤其是O-磷酸-L-丝氨酸(OPLS))引起，所述C2结构域配体单独的或与大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)和/或植物蛋白水解物组合，(i)增加细胞分泌的因子VIII多肽的量，和/或(ii)竞争与细胞结合的因子VIII多肽使其从细胞脱落，和/或(iii)减少因子VIII多肽的降解从而增加上清中存在的功能性因子VIII多肽的量。
本发明将在下文中更详细的解释。
C2结构域配体是一种能够结合或被结合于因子VIII多肽的C2结构域(见下文)的配体。优选的，C2结构域配体应当能够从细胞膜替换(竞争掉(competing off)因子VIII多肽。
在当前最优选的实施方案中，C2结构域配体是O-磷酸-L-丝氨酸(OPLS)，即分子式(HO)2P(O)OCH2CH(NH2)CO2H的分子。
合适的可选择的C2结构域配体被认为具有分子式(XO)(HO)P(O)OCH2CH(NH2)CO2H，其中X选自任选取代的C1-6-烷基，任选取代的C2-6-链烯基，任选取代的苯基，任选取代的杂芳基，任选取代的杂环基，和任选取代的苯甲基。在其一个实施方案中，X选自任选取代的C1-6-烷基，任选取代的苯甲基，和任选取代的C2-6-链烯基。
在当前上下文中，术语“C1-6-烷基”旨在表示具有1到6个碳原子的线性、环状或分枝的烃基，诸如甲基，乙基，丙基，异丙基，戊基，环戊基，己基，环己基。
类似地，术语“C2-6-链烯基”旨在表示具有2到6个碳原子并包括至少一个不饱和键的线性、环状或分枝的烃基。链烯基的实例是乙烯基，烯丙基，丁烯基，戊烯基，和己烯基。链烯基的优选实例是乙烯基，烯丙基，丁烯基，尤其是烯丙基。
在当前上下文中，即涉及术语“烷基”和“链烯基”时，术语“任选取代”旨在表示被讨论的基团可以用选自以下的基团取代一次或数次，优选的1-3次：羟基(当结合不饱和的碳原子时其以互变异构的酮形式存在)，C1-6-烷氧基(即C1-6-烷基-氧)，C2-6-链烯氧基，羧基，氧代(形成酮或醛官能度)，C1-6-烷羰基，甲酰基，芳基，芳氧基，芳氨基，芳羰基，杂芳基，杂芳氧基，杂芳氨基，杂芳羰基，杂环基，杂环氧基，杂环氨基，杂环羰基，氨基，单和双(C1-6-烷基)氨基；氨基甲酰基，单和双(C1-6-烷基)氨羰基，氨基-C1-6-烷基-氨羰基，单和双(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨羰基，C1-6-烷羰基氨基，胍基，脲基，C1-6-烷基-磺酰-氨基，C1-6-烷基-磺酰基，C1-6-烷基-亚磺酰基，C1-6-烷硫基，卤素，其中任意芳基、杂芳基和杂环基可以按照下文对于芳基、杂芳基和杂环基具体所述被取代。
术语“卤素”包括氟，氯，溴，和碘。
在当前上下文中，术语“芳基”旨在表示完全或部分芳香族碳环或环系统，诸如苯基，萘基，1，2，3，4-四氢化萘，蒽基，phenanthracyl，芘基，苯并芘基，芴基和呫吨基，其中苯基是优选的实例。
术语“杂芳基”旨在表示完全或部分芳香族碳环或环系统，其中一个或更多个碳原子已经被杂原子取代，例如，氮(＝N-或-NH-)，硫和/或氧原子。这类杂芳基的实例是苯并咪唑基，噁唑基，异噁唑基，噻唑基，异噻唑基，吡咯基，咪唑基，吡唑基，吡啶基，嘧啶基，吡嗪基，哒嗪基，呋喃基，噻吩基，喹啉基，三唑基，四唑基，异喹啉基，吲哚基尤其是苯并咪唑基，吡咯基，咪唑基，吡啶基，嘧啶基，呋喃基，噻吩基，喹啉基，四唑基，和异喹啉基。
术语“杂环基”旨在表示非芳香族碳环或环系统，其中一个或更多个碳原子已经被杂原子取代，例如氮(＝N-或-NH-)，硫和/或氧原子。这类杂环基(根据环命名)的实例是四氢呋喃，咪唑烷，哌嗪，六氢哒嗪，六氢嘧啶，diazepane，吡咯烷，哌啶，azepane，oxazinane(吗啉)和噻嗪。
在当前上下文中，即涉及术语“芳基”、“苯甲基”、“杂芳基”、“杂环基”等等(例如“芳氧基”、“杂芳羰基”，等等)，术语“任选取代”旨在表示被讨论的基团用选自以下的基团取代一次或数次，优选的1-5次，尤其是1-3次：羟基，C1-6-烷基，C1-6-烷氧基，氧代(可以表现为互变异构的烯醇形式)，羧基，C1-6-烷羰基，甲酰基，氨基，单和双(C1-6-烷基)氨基；氨基甲酰基，单和双(C1-6-烷基)氨羰基，氨基-C1-6-烷基-氨羰基，C1-6-烷羰基氨基，胍基，脲基，C1-6-烷基-磺酰-氨基，芳基-磺酰-氨基，杂芳基-磺酰-氨基，C1-6-烷基-磺酰基，C1-6-烷基-亚磺酰基，C1-6-烷磺酰氧基，硫烷基，氨基，氨基-磺酰基，单和双(C1-6烷基)氨基-磺酰基或卤素，其中代表取代基的任意烷基、烷氧基等等可以被下列基团取代：羟基，C1-6-烷氧基，C2-6-链烯氧基，氨基，单和双(C1-6-烷基)氨基，羧基，C1-6-烷基羰基氨基，卤素，C1-6烷硫基，C1-6-烷基-磺酰-氨基，或胍基。
在最感兴趣的实施方案(与本发明的第一个和第二个方面均有关)中，细胞培养基中存在的C2结构域配体(例如OPLS)浓度为0.1-100mM，诸如5-30mM，尤其是10-20mM。
还感兴趣的是以下实施方案(与本发明的第一个和第二个方面均有关)，其中在步骤b)中以1-200mM的浓度，诸如50-150mM，尤其是70-130mM，向细胞中添加C2结构域配体。
用于生产步骤的细节将在下文详细描述。
如所述，已经发现在步骤a)中可以有益的将大豆胰蛋白酶抑制(SBTI)与C2结构域配体在细胞培养基中组合。因此在当前优选的实施方案中，细胞培养基还包括大豆胰蛋白酶抑制剂。
大豆胰蛋白酶抑制剂分离自大豆(Glycine max)。来自大豆的大豆胰蛋白酶抑制剂是一种在由两个二硫键交联的单个多肽链中包含181个氨基酸残基的单体蛋白。从氨基酸序列确定的分子量是20.1kDa。大豆胰蛋白酶抑制剂通过形成1∶1化学计量的复合物抑制其靶蛋白酶。
在最典型的实施方案中，细胞培养基中大豆胰蛋白酶抑制剂的浓度为0.01-100mg/mL，诸如0.1-10mg/mL，尤其是0.3-3mg/mL。
还发现在步骤a)中可以有益的将植物蛋白水解物(有时被称为“植物来源的消化物”，或等等)与C2结构域配体(和可能还有大豆胰蛋白酶抑制剂)在细胞培养基中组合。因此在当前同等优选的实施方案中，细胞培养基还包括植物蛋白水解物。
植物蛋白水解物可以获自多种来源之一，例如商品化来源。典型的水解物是大豆蛋白水解物，小麦蛋白水解物，豌豆蛋白水解物，稻米蛋白水解物，等等。WO 01/23527A1(在此通过援引并入)公开了大豆蛋白水解物的制备和一般用途。
在最典型的实施方案中，细胞培养基中植物蛋白水解物的浓度为0.1-100mg/mL，诸如1-10mg/mL，尤其是2-7mg/mL。
因子VIII多肽
本发明适用于在哺乳动物细胞中生产因子VIII多肽。
成熟的因子VIII分子由2332个氨基酸组成，所述氨基酸可以被分为3个同源A结构域、2个同源C结构域和1个B结构域，它们按以下顺序排列A1-A2-B-A3-C1-C2。在其分泌入血浆期间，因子VIII被胞内加工为一系列金属离子连结的异二聚体，因为单链因子VIII在B-A3边界和B结构域内的不同位点被切割。这种加工产生由A1、A2和B结构域不同部分组成的重链，其分子大小范围从90kDa到200kDa。该重链通过金属离子与轻链结合，所述轻链由A3、C1和C2结构域组成(Saenko等2002)。在血浆中该异二聚体因子VIII以高亲和力与von Willebrand因子结合，保护其免遭成熟前的分解代谢。与vWF结合的未活化因子VIII的半衰期在血浆中是约12小时。
在血液凝固过程期间，通过FXa和凝血酶在重链内氨基酸Arg372和Arg740处和轻链上Arg1689处的蛋白水解切割，因子VIII被活化，导致von Willebrand因子的释放并产生活化的因子VIII异三聚体，其将在磷脂表面与FIXa和FX形成tenase复合物，条件是Ca2+存在。异三聚体由50kDa片段的A1结构域、43kDa片段的A2结构域和73kDa片段的轻链(A3-C1-C2)组成。因此因子VIII的活性形式(因子VIIIa)由A1亚基(通过二价金属离子键与凝血酶切割的A3-C1-C2轻链缔合)和游离的A2亚基(相对松散的与A1和A3结构域缔合)组成。
由通过源自B结构域的小接头连接的因子VIII的重链(HC)和轻链(LC)组成的因子VIII分子(B结构域缺失的因子VIII或BDD-FVIII)保留全长(天然)因子VIII的生物活性。
在实施本发明的方法时，治疗上有效(例如在阻止或治疗出血中有效)的任意因子VIII多肽都是相关的。这包括，但不限于，野生型人因子VIII，杂合的人/猪因子VIII和B结构域缺失的人因子VIII。
如本文使用的，“因子VIII多肽”包括，但不限于，因子VIII以及因子VIII相关的多肽。
术语“因子VIII”旨在包括，但不限于，具有如Toole等，Nature 1984，312：342-347中描述的氨基酸序列的多肽(野生型人因子VIII)，以及源自其他物种的野生型因子VIII，诸如，例如，牛，猪，犬，鼠和鲑鱼因子VIII。它还包括从一个个体到另一个体可能存在和发生的因子VIII的天然等位基因变异。此外，糖基化或其他翻译后修饰的程度和位置也可能不同，这取决于选择的宿主细胞和宿主细胞环境的性质。术语“因子VIII”还旨在包括未切割(酶原)形式的因子VIII多肽，以及已经被蛋白水解加工以产生它们相应生物活性形式的因子VIII多肽，它们可以被称为因子VIIIa。
“因子VIII相关多肽”包括，但不限于下述因子VIII多肽：相对于人因子VIII被化学修饰(即因子VIII衍生物)，和/或相对于人因子VIII包含一个或更多个氨基酸序列改变(即，因子VIII变体)，和/或相对于人因子VIII包含截短的氨基酸序列(即，因子VIII片段)。这类因子VIII相关多肽可能显示与人因子VIII不同的特性，包括稳定性，磷脂结合性，改变的比活性，等等。术语“因子VIII相关多肽”旨在包括未切割(酶原)形式的这类多肽，以及已经被蛋白水解加工以产生它们相应生物活性形式的这类多肽，它们可以被称为“因子VIIIa相关多肽”或“活化的因子VIII相关多肽”。
如本文使用的，“因子VIII相关多肽”还包括，但不限于，显示与野生型人因子VIII相比生物活性基本上相同或提高的多肽，以及与野生型人因子VIII的活性相比因子VIII生物活性已经基本上改变或降低的多肽。这些多肽包括，但不限于，已经被化学修饰的因子VIH或因子VIIIa，和已导入特定的氨基酸序列改变的因子VIII变体，这将改变或破坏多肽的生物活性。
它还包括氨基酸序列少许改变的多肽，例如，N末端改变(包括N末端氨基酸缺失或添加)的多肽，和/或相对于人因子VIII已进行了化学修饰的多肽。
因子VIII相关多肽，包括因子VIII的变体，不论是否显示与野生型因子VIII基本上相同或更好的生物活性，或，可选择地，显示与野生型因子VIII相比基本上改变或降低的生物活性，包括但不限于，通过一个或更多个氨基酸的插入、缺失或取代而具有不同于野生型因子VIIII序列的氨基酸序列的多肽。
因子VIII相关多肽(包括变体)包括当在如本说明书描述的因子VIII活性分析法中检测时显示在相同细胞类型中产生的野生型因子VIII的比活性的至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约100％，至少约110％，至少约120％，和至少约130％的那些多肽。
与野生型因子VIII相比生物活性基本上相同或提高的因子VIII相关多肽(包括变体)包括当在本说明书下文(“材料和方法”)所述的因子VIII比活性分析法中的一种或更多种中检测时显示在相同细胞类型中产生的野生型人因子VIII的比生物活性的至少约25％，诸如至少50％，至少75％，或至少90％的那些多肽。
与野生型因子VIII相比生物活性基本上降低的因子VIII相关多肽(包括变体)包括当在本说明书下文(“材料和方法”)所述的因子VIII比活性分析法中的一种或更多种中检测时显示低于在相同细胞类型中产生的野生型因子VIII的比活性的约25％，诸如低于约10％，或低于约5％的那些多肽。
因子VIII多肽的非限制性实例包括血浆来源的人因子VIII，如下所述，例如，Fulcher等；Proc.Acad.Nat.Sci.USA 1982；79：1648-1652，和Rotblat等；Biochemistry 1985；24：4294-4300，和血浆来源的猪FVIII，如下所述，例如，Fass等；Blood 1982；59：594-600和Knutson等；Blood 1982；59：615-624。因子VIII序列变体的非限制性实例描述于，例如，Lollar等；Blood 2000；95(2)：564-568(杂合的猪/人FVIII多肽)和Lollar等；Blood 2001；97(1)：169-174。
因子VIII cDNA的克隆(Wood，W.I.，等(1984)Nature 312，330-336；Vehar，G.A.，等(1984)Nature 312，337-342)使重组表达因子VIII成为可能，导致开发出数种重组因子VIII产品，其在1992到2003年之间获得管理机构批准。因子VIII的编码序列(cDNA)显示于图1。位于氨基酸Arg-740和Glu-1649之间的因子VIII多肽链的中心B结构域看起来不是完整生物活性必需的，这一事实还导致开发出B结构域缺失的因子VIII。还可参见Kjalke M，Heding A，Talbo G，Persson E，Thomsen J and Ezban M(1995)，“Amino acid residues 721-729arerequired for full Factor VIII activity”.Eur.J.Biochem：234：773-779。
步骤a)-细胞的转染和培养
细胞
表达因子VIII多肽的哺乳动物细胞通常选自内源性表达因子VIII多肽的哺乳动物细胞和已经转染了因子VIII多肽基因的哺乳动物细胞。
在当前感兴趣的后者的实施方案中，哺乳动物细胞用包括编码因子VIII多肽的核酸分子及与其可操作连接的表达调控区的表达载体转染。
蛋白在细胞中的表达是蛋白生产领域的技术人员公知的。在实施本发明时，细胞是哺乳动物细胞，更优选的是已建立的哺乳动物细胞系，包括，但不限于，CHO(例如，ATCC CCL 61)，COS-1(例如，ATCC CRL 1650)，幼仓鼠肾(BHK)，和HEK293(例如，ATCC CRL 1573；Graham等，J.Gen.Virol.36：59-72，1977)细胞系。优选的BHK细胞系是tk-ts13BHK细胞系(Waechter and Baserga，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79：1106-1110，1982)，以下称为BHK 570细胞。BHK 570细胞系获自American Type Culture Collection，12301 Parklawn Dr.，Rockville，MD20852，ATCC登录号为CRL 10314。tk-ts13BHK细胞系也获自ATCC，登录号为CRL 1632。优选的CHO细胞系是获自ATCC登录号为CCl61的CHO K1细胞系，以及细胞系CHO-DXB11和CHO-DG44。
其他合适的细胞系包括，但不限于，大鼠Hep I(大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL 1600)，大鼠Hep II(大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL 1548)，TCMK(ATCC CCL 139)，人肺(ATCC HB 8065)，NCTC 1469(ATCCCCL 9.1)；DUKX细胞(CHO细胞系)(Urlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，1980)(DUKX细胞还被称作DXB11细胞)，和DG44(CHO细胞系)(Cell，33：405，1983，以及Somatic Cell andMolecular Genetics 12：555，1986)。3T3细胞，Namalwa细胞，骨髓瘤以及骨髓瘤与其他细胞的融合体也是有用的。在一些实施方案中，细胞可以是突变或重组细胞，诸如，例如，与作为其来源的细胞类型相比，表达定性或定量不同的酶谱的细胞，所述酶催化蛋白的翻译后修饰(例如，糖基化酶诸如糖基转移酶和/或糖苷酶，或加工酶诸如前肽)。DUKX细胞(CHO细胞系)是尤其优选的。
当前优选的细胞是HEK293，COS，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，幼仓鼠肾(BHK)和骨髓瘤细胞，尤其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
细胞培养
在一些实施方案中，用于实施本发明的细胞能够在悬浮培养物中生长。如本文使用的，能够悬浮的细胞是那些可以悬浮生长而不产生大的、牢固聚集物的细胞，即，细胞是单分散性的，或以松散聚集方式生长，每个聚集物中只有少许细胞。能够悬浮的细胞包括，但不限于，无需适应或操作就能悬浮生长的细胞(诸如，例如，造血细胞或淋巴样细胞)，和通过将粘附依赖细胞(诸如，例如，上皮或成纤维细胞)向悬浮生长逐渐适应产生的能够悬浮的细胞。
用于实施本发明的细胞可以是粘附细胞(亦称为锚定依赖或粘附依赖细胞)。如本文使用的，粘附细胞是需要将自身粘附或锚定到合适表面以便增殖和生长的细胞。在本发明的一个实施方案中，使用的细胞是粘附细胞。在这些实施方案中，增殖期和生产期均包括微载体的使用。使用的粘附细胞应当能在增殖期迁移到载体(如果使用大孔载体，进入载体的内部结构)，当转移到生产生物反应器时能够迁移到新载体。如果粘附细胞自身不能充分的迁移到新载体，可以通过将包含细胞的微载体与蛋白水解酶或EDTA接触以便粘附细胞从载体释放。使用的培养基(尤其当不含动物来源的组分时)还应包含适于支持粘附细胞的组分；用于培养粘附细胞的合适培养基可以获自商业供应商，诸如，例如，Sigma。
细胞还可以是悬浮适应的或能够悬浮的细胞。如果使用这类细胞，细胞的增殖可能在悬浮液中完成，因此微载体只在生产培养容器自身的最终增殖期和生产期使用。在悬浮适应细胞的情况下，使用的微载体通常是大孔载体，其中通过物理截留到载体的内部结构使细胞粘附。但是，在这类悬浮适应细胞的情况下，细胞的增殖和生产均可在悬浮液中完成。
在这类实施方案中，哺乳动物细胞通常选自CHO，BHK，HEK293，骨髓瘤细胞，等等。
细胞培养基
除了上文提及的组分外，即C2结构域配体(是与本发明第一个方面有关的发明要求的)，任选的大豆胰蛋白酶抑制，和任选的植物蛋白水解物，细胞培养基包括大量其他组分，它们是细胞的增殖和因子VIII多肽的生产必需的(如技术人员所知的)。
术语“细胞培养基”(或简单地“培养基”)是指用于培养哺乳动物细胞的营养液，其通常提供来自下列一种或更多种类型中的至少一种组分：(1)有助于培养基的重量克分子渗透浓度的盐，例如钠、钾、镁和钙的盐；(2)能量来源，通常采用碳水化合物诸如葡萄糖的形式；(3)全部必需氨基酸，通常二十种氨基酸的基本集合；(4)以低浓度需要的维生素和/或其他有机化合物；和(5)痕量元素，其中痕量元素被定义为通常以极低浓度需要的无机化合物，通常是微摩尔范围。营养液任选可以添加来自下列类型中任一种的一种或更多种组分：(a)激素和其他生长因子诸如，例如，胰岛素，转铁蛋白，和表皮生长因子；和(b)蛋白和组织的水解物。优选的，细胞培养基不包含动物来源的任意组分。
本发明包括在不含动物来源的组分的培养基中培养哺乳动物细胞。如本文使用的，“动物来源的”组分是任何以下组分：在完整的动物中生产的(诸如，例如，从血清分离和纯化的蛋白)，或利用在完整动物中生产的组分生产的(诸如，例如，利用从动物分离和纯化的酶水解植物源材料制备的氨基酸)。相反，具有动物蛋白的序列(即，具有动物的基因组起源)但在没有在完整动物中生产和从完整动物分离及纯化的组分的培养基中通过细胞培养体外生产(诸如，例如，在重组酵母或细菌细胞或已建立的连续哺乳动物细胞系中，重组或非重组)的蛋白不是“动物来源的”组分(诸如，例如，在酵母或细菌细胞中生产的胰岛素，或在已建立的哺乳动物细胞系中生产的胰岛素，诸如，例如，CHO、BHK或HEK细胞，或在Namalwa细胞中生产的干扰素)。例如，具有动物蛋白的序列(即，具有动物的基因组起源)但由重组细胞在无动物来源组分的培养基中生产的蛋白(诸如，例如，在酵母或细菌细胞中生产的胰岛素)不是“动物来源的组分”。因此，无动物来源组分的细胞培养基是可能包含重组生产的动物蛋白的培养基；但是，这类培养基不包含，例如，动物血清或蛋白或从动物血清纯化的其他产物。这类培养基可以，例如，包含源自植物的一种或更多种组分。可以使用在本发明条件下支持细胞生长与维持的任何细胞培养基，尤其是不含动物来源组分的培养基。通常，培养基包含水，重量克分子渗透浓度调节剂，缓冲剂，能量来源，氨基酸，无机或重组的铁来源，一种或更多种合成或重组的生长因子，维生素，和辅因子。在一个实施方案中，培养基不含动物来源的组分并且不含蛋白(“无蛋白的”)。不含动物来源组分和/或蛋白的培养基可以获自商业供应商，诸如，例如，Sigma，JRH Biosciences，Gibco，Hyclone和Gemini。
在一个实施方案中，细胞培养基基本上不含血清。在另一个实施方式中，培养基是不含动物来源组分的培养基。在其他实施方案中，培养基不含蛋白(“无蛋白”)以及不含动物来源的组分。
在一个实施方案中，培养基是商品化供应的不含动物来源组分的无蛋白CHO培养基，例如，EXCELL TM(SAFC Biosciences)，PF-CHO，PF-CHO-LS，SFM4CHO或CDM4CHO(均来自Hyclone)，细胞系是CHO细胞。
在一些实施方案中，用于实施本发明的细胞被适应于在不含动物来源组分的培养基(诸如，例如，不含血清的培养基)中悬浮生长。这种适应过程描述于，例如，Scharfenberg，等，Animal Cell TechnologyDevelopments towards the 21st Century，E.C.Beuvery等(Eds.)，Kluwer Academic Publishers，pp.619-623，1995(BHK和CHO细胞)；Cruz，Biotechnol.Tech.11：117-120，1997(昆虫细胞)；Keen，Cytotechnol.17：203-211，1995(骨髓瘤细胞)；Berg等，Biotechniques 14：972-978，1993(人肾293细胞)。在特别优选的实施方案中，宿主细胞是BHK 21或CHO细胞，它们被改造以表达人因子VIII，并且已经适应于在不含血清或动物来源组分的条件下生长。
细胞培养步骤
本发明的方法通常在搅拌的培养容器中进行，通常使用draw-fill步骤类型。在该步骤中接种后细胞生长，当达到某一密度时，收集约70％的的培养物，向剩余的培养物中添加新鲜的细胞培养基到其原始体积。这通常重复约2-10次。
可选择地，可以使用微载体步骤类型。在基于微载体的步骤中，细胞迁移入载体(大孔载体)的内部结构，或使其自身粘附到载体(固相载体)的表面，或上述两者。在基于微载体的步骤中，哺乳动物细胞、微载体和细胞培养基在开始就提供给培养容器。在后面几天，如果从开始培养体积没有达到容器的最终工作体积，则可以添加额外的细胞培养基。在以后一段时间，周期性的收集包含产物的培养上清并用新的培养基液体替换，直至培养最终终止。当收集包含产物的上清时，停止培养物的振荡，例如，搅拌，以便包含细胞的载体沉降，然后包含产物的细胞培养上清部分被转移。为了提高所述步骤的总产量，在收集包含产物的上清前优选的使用冷却步骤，参见例如，WO03/029442。在一些实施方案中，在载体沉淀前将细胞培养基冷却到约18℃到约32℃之间的温度，或约20℃到约30℃之间，或约22℃到约28℃之间。
其他适用的细胞培养步骤的变型描述于WO 02/29084(NovoNordisk A/S)。
在到达生产期前(在此定期收集包含产物的培养上清用于进一步的下游处理)，可以按照适于所述具体细胞的任何方案或程序增殖细胞。增殖期可以是单步或多步法。在单步增殖步骤中，将细胞从保存物中转移并直接接种到培养容器(任选包含微载体)，在那里进行生产。在多步增殖步骤中，将细胞从保存物中转移，并通过规模逐渐增加的大量培养容器进行增殖直至进入最终的培养容器(任选包含微载体)，在那里进行生产。在增殖步骤期间，细胞在为培养而优化的条件下生长。培养条件，诸如温度，pH，溶解氧张力，溶解CO2的浓度，等等，都是已知最适于具体细胞的，对本领域技术人员来说都是显而易见的(参见，例如，Animal Cell Culture：A Practical Approach 2nd Ed.，Rickwood，D.and Hames，B.D.，eds.，Oxford University Press，New York(1992))。
在一种方法中，在一个培养容器中进行细胞培养步骤：将细胞直接接种到培养容器(任选包含微载体)，在那里将进行生产；细胞增殖直至达到合适的细胞密度，生产期开始。
在另一方法中，在至少两个不同的培养容器中进行细胞培养步骤：一个或更多个种子培养容器(第一增殖步骤)，继之以生产培养容器(最后增殖步骤，然后是生产期)。在第一增殖步骤中，表达所需多肽的细胞被接种到包含细胞培养基的种子培养容器中，增殖直至细胞达到最小的交叉接种密度。随后，将增殖的种子培养物转移到包含细胞培养基和(任选)微载体的生产培养容器。在利用微载体的步骤中，在细胞迁移到固相载体的表面或大孔载体的内外表面的条件下在该培养容器中培养细胞，它们在所述最后增殖步骤中继续生长直至载体被细胞完全占据。在所述最后增殖步骤期间，进行培养基交换以便微载体沉降到培养容器的底部，这之后去除罐容量的预定百分比并向容器中添加相应百分比罐容量的新鲜培养基。然后用培养基重悬浮微载体，在预定的时间间隔(例如每24小时)内重复培养基去除和替换这一步骤。替换培养基的量取决于细胞密度，通常可以是罐容量的10-95％，优选的25％到80％。
在悬浮步骤的情况下，例如灌流、分批或draw-fill步骤，细胞自由地悬浮生长，不固定到载体上。在悬浮细胞-灌流步骤中，细胞被接种到包含培养基(不含动物来源的组分)的种子培养容器中，增殖直至细胞达到最小交叉接种密度。随后，增殖的种子培养物被转移到包含培养基(不含动物来源的组分)的大规模培养容器中，增殖直至达到至少预定的细胞密度。在这一期间，细胞悬浮生长以便培养容器内的细胞数目增加到预定或临界值。通过用新鲜培养基连续灌流培养容器进行培养基交换。
灌流培养基的量取决于细胞密度，通常可以是每天(24小时)罐容量的10-95％，优选的25％到80％。当细胞密度达到适于启始生产期的值时，通常每24小时更换容器中的60-95％的容器培养基，诸如例如约80％。80％的培养基交换也优选的用于生产期。
在简单的分批步骤中，细胞被接种到包含培养基(不含动物来源的组分)的种子培养容器中，增殖直至细胞达到最小交叉接种密度。随后，增殖的种子培养物被转移到包含培养基(不含动物来源的组分)的大规模培养容器中。
通过向容器中添加浓缩的营养液可以延长诸如这类的分批步骤。这延长了处理时间，最终导致培养容器内FVII生产的增加。必须通过罐的最长可能操作和细胞裂解风险之间的平衡确定收集的时间。
简单的Draw-Fill步骤准确模拟重复的分批发酵。在分批发酵中，细胞在培养容器中生长，在进行到最后收集培养基。在Draw-Fill步骤中，在任意一种营养物耗尽前收集培养容器。不是从容器去除所有内容物，只是去除一定比例的罐容量(通常是罐容积的80％)。收集后，向容器中回添相同体积的新鲜培养基。然后让细胞在容器中再一次生长，在设定的天数后进行另一次80％收集。在重复的分批步骤中，收集后容器中残留的细胞可用做下一批次的接种物。
在两个期间进行Draw-Fill步骤。所述步骤的第一个期间按照与简单分批步骤相同的运行。在第一次收集后，将培养容器再次按简单分批步骤运行；但是，因为更高的原始细胞密度，该批次的长度短于第一批次。这些短的“重复批次期”是无限延续的。
进料分批Draw-Fill是利用相似于进料分批步骤中提出的类型的浓缩进料的draw-fill发酵。对简单draw-fill步骤的关注在于添加的新鲜培养基在重复的分批发酵期间可能不够维持细胞。包括进料消除了这种担心。进料还允许在draw-fill步骤中运行培养容器较长批次时间。
培养容器可以在大范围的循环次数和大范围的draw-fill体积中运行。范围和优选值可以参见下文的表1。
  选点   范围   优选的范围   更优选的值
  初始批次时期
  PH   6-8   6，6-7，6   对CHO来说是7.0和对BHK来说是6，6-7.4
  温度   28-40℃   30-37℃   对CHO来说是37℃和对BHK来说是36℃
  温度降低(任选)
  ·温度降到   26-39℃   30-36℃   32℃
  ·在以下细胞浓度温度降低   0.5-12.0x106细胞ml-1   0.5-12.0x106细胞ml-1   2.0-10x106细胞ml-1
  DOT   10-100％   20-60％   30％
  收集
  ·罐体积   10-99％   10-90％   80％
  ·收集时间   2-10天.   5-10天.   开始后9天
  进料开始   6-0gl-1   3-0gl-1   当葡萄糖＜2gl-1时
  重复批次期间
  PH   6-8   6.6-7.6   对CHO来说是7.0和对BHK来说是6.6-7.4
  温度   28-40℃   30-37℃   对CHO来说是37℃和对BHK来说是36℃
  温度降低(任选)
  -温度降低到   26-39℃   30-36℃   32℃
  -在以下细胞浓度温度降低   0.5-12.0x106细胞ml-1   0.5-12.0x106细胞ml-1   2.0-10x106细胞ml-1
  DOT   10-100％   20-60％   30％
  收集
  ·罐体积   10-99％   10-90％   80％
  ·收集时间   1-7天.   1-7天.   收集后5天
  进料开始   3-0gl-1   3-0gl-1   当葡萄糖＜2gl-1时
表1
应了解在增殖期是多步法的步骤中，增殖可以发生在大小逐渐增加的培养容器中，直至获得进入最终培养容器的足够数目的细胞。例如，可以顺序使用5L、50L、100L或500L的一个或更多个种子培养容器。种子培养容器通常具有5L到1000L之间的容量。通常，细胞以约0.2到0.4×106细胞/mL的初始密度被接种到种子培养容器，增殖直至培养物达到约1.0×106细胞/mL的细胞密度。通常，最小交叉接种密度在约0.8到约1.5×106细胞/mL之间。
适于因子VIII生产的一些选点不是必须适合种子培养物中或微载体上的细胞初始生长。例如，温度、溶解氧张力和/或pH对于两个期间来说可以是不同的。增殖期间进行培养基交换以维持细胞存活和生长，而不是收集培养上清用于下游处理。
任选的，当进入生产期和在生产期期间，可以在培养的选点进行降温。此外，当进入生产期温度时，操作pH和培养基交换频率通常变为最适于生产的值。
微载体
如本文使用的，微载体是足够小使其能够用于悬浮培养(使用不会对细胞造成显著剪切破坏的搅拌速率)的颗粒。它们是固体，多孔的，或在表面具有多孔涂层的实心。微载体可以是，例如，但不限于，基于纤维素或葡聚糖的，并且它们的表面(在多孔载体情况下是内外表面)可以是带正电荷的。更多细节可以参见WO 02/29083和“Microcarrier cell culture，principles and methods.Amersham PharmaciaBiotech.18-1140-62.Edition AA”。
有用的固体微载体包括，但不限于，Cytodex 1TM和Cytodex 2TM(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway NJ)。固相载体尤其适合于粘附细胞(锚定依赖细胞)。有用的大孔载体包括，但不限于，Cytopore1TM和Cytopore 2TM(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway NJ)。尤其优选的是Cytopore 1TM载体，其平均粒径为230um，平均孔径为30um，正电荷密度为1.1meq/g。
大规模培养条件
本发明尤其适合于大规模生产。术语“大规模生产”表示包括至少100L的培养容器的生产。在优选的实施方案中，但是，规模通常是至少250L，诸如至少500L，例如至少1000L或甚至5000L或更多。术语“大规模”可以与术语“工业化规模”和“产业化规模”互换使用。
用于大规模生产多肽的方法通常进行至少120个小时的时段，例如1-26周。
在细胞培养基步骤在至少两个不同培养容器中进行的情况下，诸如一个或更多个种子培养容器(第一增殖步骤)继之以生产培养容器(最终增殖步骤后面是生产期)，然后所述步骤通常包括将约50L的增殖种子培养物(具有约1.0×106细胞/mL)转移到包含150L细胞培养基的500L培养容器。在合适的条件下(例如，温度，pH，溶解氧张力(DOT)和搅拌速率)维持大规模培养，通过向培养容器中添加培养基逐渐增加体积。在微载体步骤的情况下，培养容器还包括对应于最终微载体浓度范围为1到10g/L的微载体量。转移后，细胞通常在前24小时内迁移到载体表面上或迁移入载体内部。
培养容器
适用于本发明的培养容器可以，例如，基于常规搅拌罐反应器(CSTR)(其中搅拌通过常规叶轮式获得)或气升式反应器(其中搅拌通过从容器底部导入空气获得)。通常控制在规定极限内的其他参数有pH，溶解氧张力(DOT)，溶解CO2的浓度和温度。溶解氧张力可以通过例如喷射纯氧来维持。溶解CO2的浓度可以通过喷射空气来维持。控温介质通常是水，根据需要加热或冷却。水可以流过环绕容器的夹套或流过浸于培养物中的管道线圈。
术语“培养容器”可以是以“罐”、“反应器”、“发酵罐”和“生物反应器”互换使用。
步骤b)-表达多肽的分离
在该步骤b)中，通过合适的方法从哺乳动物细胞分离因子VIII多肽。在一个典型实施方案中，可以将细胞从培养基中去除，并将收集物通过1.0μm和0.2μm滤器连续过滤使培养基澄清。
然后可以有利的将培养基(细胞培养上清)中的因子VIII通过阳离子交换层析来浓缩，其中富含因子VIII的组分被合并。然后通过结合抗因子VIII抗体柱(例如，F25抗体柱，参见，例如，WO 95/13301和/或Nordfang等1995(Thromb.Haemostas.54：586-590))，继之以在保持因子VIII多肽活性的条件下洗脱，对因子VIII多肽进行纯化。其他杂质可以通过通过凝胶过滤的缓冲液交换而去除。
根据本发明的第二个方面，但在涉及本发明的第一个方面时也是有用的，添加C2结构域配体以促进因子VIII多肽从细胞分离，即添加C2结构域配体(例如OPLS)以释放细胞结合的因子VIII多肽。
本发明的具体特征是因子VIII多肽可以从细胞分离，而且不灭活或破坏哺乳动物细胞。因此，在一个具体实施方案中，从细胞培养基收集表达的因子VIII多肽，而且基本上不降低细胞的生存力。此外，利用相同批次的细胞可以继续生产是有益的。
一旦包含因子VIII多肽的培养基从细胞分离，其将经历一个或更多个加工步骤以纯化所需蛋白，包括，但不限于，亲和层析，疏水性相互作用层析；离子交换层析；大小排阻层析；电泳方法(例如，制备式等电聚焦(IEF))，差异溶解性(例如，硫酸铵沉淀)，或萃取等等。一般地参见，Scopes，Protein Purification，Springer-Verlag，New York，1982；and Protein Purification，J.-C.Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989。
因子VIII多肽的纯化尤其包括抗因子VIII抗体柱上的亲和层析和蛋白水解切割的活化。
下列实例预期作为本发明的非限制性说明。
实施例
材料和方法
细胞系：利用添加核糖核苷和脱氧核糖核苷的无血清培养基，使用于转染的细胞系dhfr-CHO细胞DUKX-B11细胞(Urlaub，G.&Chasin，L.A.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77，4216-4220)适应于在悬浮培养物中生长。
表达载体：利用腺病毒SV40启动子和通过二氢叶酸还原酶选择标记的选择实现因子VIII转录。表达的因子VIII分子由源自B结构域的小接头连接的因子VIII的重链(HC)和轻链(LC)组成。B结构域已经被去除，因为这允许因子VIII的更高表达并保留因子VIII的生物活性。
转染：利用限制性内切酶的消化从质粒#815 F8-500B-pTSV7去除β内酰胺酶基因，将包含因子VIII基因的所获片段进行凝胶纯化并利用FuGENE 6(Roche)将其转染CHO DUKX-B11细胞。在添加了核糖核苷和脱氧核糖核苷和10％透析FBS的α-MEM培养基(Gibco)的6孔板中进行转染。转染后两天，将细胞转移到TC80烧瓶的α-MEM培养基(Gibco)中，该培养基不含核糖核苷和脱氧核糖核苷，但含有10％透析的FBS。在选择存活的转染子15天后，开始利用MTX的逐步扩增。细胞扩增直至1000nM MTX，在这个步骤期间进行数次亚克隆。
SF适应和细胞培养：通过在SF培养基中逐步降低FBS的浓度，使细胞适应于在无血清培养基中生长。将细胞在125mL摇瓶中适应和维持。
无血清培养基添加实验期间的细胞培养：对于培养基添加实验，如下所述，在有通气盖的50mL振荡管中，按高细胞密度灌流模式在无血清培养基中35℃培养细胞。在37℃在大的摇瓶中培养细胞。测量细胞收集物的细胞生存力，其总是＞95％。用新鲜的培养基重悬收集的细胞。将2.5mL收集并重悬的细胞添加到含添加物的2.5mL新鲜培养基得到5mL的总体积，浓度为1×107细胞/mL。然后将振荡管置于35℃和250rpm的振荡器中。24小时后，对样品进行以下分析：细胞密度，生存力，CoA，ELISA和通过Western印迹分析因子VIII蛋白的完整性。
细胞生存力分析：例如，可以按照以下描述：Mammalian CellCulture；essential techniques，1997(Wiley)Editors：A.Doyle and J.Bryan Griffiths(参见，例如，方案13和14)，测量细胞培养物的生存力。
CoA分析(因子VIII活性分析)：在钙和磷脂存在的条件下，通过因子IXa将因子X活化为因子Xa。这一生产受到因子VIII的极大刺激，因子VIII被认为是该反应的辅因子。通过使用最适量的Ca2+和磷脂及过量的因子IXa和X，因子X的活化率只依赖于因子VIII的量。因子Xa水解显色底物S-2765，从而释放发色团pNA。然后在405nm处光度法读数颜色。产生的因子Xa及颜色强度与样品中因子VIII的活性成正比。通过添加合成的凝血酶抑制剂I-2581以及底物(Chromogenix Coatest SP Factor VIII，diaPharma)阻止形成的凝血酶的S-2765水解。
因子VIII活性的其他检验：可以按照例如Kirkwood TBL，Rizza CR，Snape TJ，Rhymes IL，Austen DEG，Identification of sourcesof interlaboratory variation in factor VIII assay.B J Haematol 1981；37；559-68；或Kessels等，British Journal of Haematology，Vol.76(Suppl.1)pp.16(1990)中描述的简单体外试验进行检测因子VIII活性的其他合适分析法。因子VIII生物活性还可以通过测量制品矫正因子VIII缺陷血浆凝血时间的能力进行定量，例如，如Nilsson等，1959.(NilssonIM，Blombaeck M，Thilen A，von Francken I.，Carriers of haemophilia A-A laboratory study，Acta Med Scan 1959；165：357)所述。在该分析法中，生物活性可以表示为单位/ml血浆(1单位对应于正常合并血浆中存在的FVIII的量)。
ELISA：用针对人因子VIII的绵羊多克隆抗体预包被条状孔。样品被稀释并加到所述孔中。存在的因子VIII抗原结合包被的抗体。在清洗掉未结合的材料后，使用过氧化物酶标记的绵羊检测抗体，使其结合捕获的因子VIII。再次清洗孔，添加TMB(过氧化物酶底物四甲基联苯胺)溶液，允许其反应固定的时段。但用酸终止反应时，蓝色变为黄色。在微板读数器的450nm处分光光度测量形成的颜色。450nm的吸光度与孔上捕获的因子VIII抗原量成正比(VisuLize，FVIII抗原试剂盒，Affinity biologicals)。利用纯化的B结构域缺失的因子VIII校准所述分析法。
F25ELISA：ELISA：用针对人因子VIII的绵羊多克隆抗体预包被条状孔。样品被稀释并加到所述孔中。存在的因子VIII抗原结合包被的抗体。在清洗掉未结合的材料后，使用稀释的F25小鼠单克隆抗因子VIII抗体(其识别因子VIII重链的C端)，使其结合捕获的因子VIII。再次清洗孔，添加稀释的过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(DAKO)，使其结合捕获的F25抗体。再次清洗孔，添加TMB(过氧化物酶底物四甲基联苯胺)溶液，允许其反应固定的时段。当用酸终止反应时，蓝色变为黄色。在微板读数器的450nm处分光光度测量形成的颜色。450nm处的吸光度与孔上捕获的因子VIII抗原量成正比。利用重链因子VIII的自制标准品(其已经用F25抗体亲和纯化)校准所述分析法。
(F25抗体：参见，例如，WO 95/13301和/或Nordfang等1995(Thromb.Haemostas.54：586-590).
实施例1：向因子VIII生产细胞的无血清细胞培养基中添加OPLS
根据材料和方法中描述的实验细节，按照指定浓度向无血清的细胞培养基中添加OPLS。结果可以参见下面的表3及图2A和2B。
表3向因子VIII生产细胞的无血清细胞培养基中添加OPLS
OPLS浓度(mM) 因子VIII生产率(pcd)   因子VIII蛋白比活性(U/微克)
  0   0.061   11.0
  0.03   0.068   11.8
  0.1   0.062   12.8
  0.3   0.052   12.2
  1   0.058   12.6
  3   0.066   15.8
  10   0.10   15.4
  30   0.18   15.0
结论：
OPLS的添加增加了因子VIII生产细胞的比生产率(参见图2A)，OPLS的添加增加因子VIII的比活性(参见图2B)。
实施例2：向因子VIII生产细胞的无血清细胞培养基中添加O-磷酸-L-丝氨酸和/或植物水解物
在有滤帽的50mL管(Filter tubes 50 bioreactor，TPP)中培养BDD因子VIII生产细胞(1C5-SF细胞系)。按表4所示，向5mL CDM4CHO培养基中的2.5×106个细胞添加O-磷酸-L-丝氨酸到20mM的浓度和/或植物水解物到5mg/ml的浓度。每种条件在4个5mL培养物中检测。培养物在振荡培养箱(37℃，8％CO2和250rpm)中温育。接种后4天，1.2mL各培养物在2000×g离心5分钟，丢弃细胞沉淀。通过添加终浓度为20mM的咪唑pH 7.2和终浓度为0.02％的Tween 80来稳定上清，并将其等分为0.2mL于-80℃冷冻。
通过夹心ELISA测定各培养物的总因子VIII抗原含量。解冻并按照材料和方法中的描述分析稳定和冷冻培养基的等分试样。测定被F25抗体(其选择性结合具有完整重链C端的因子VIII)识别的因子VIII的含量。解冻并按照材料和方法中的描述利用F25ELISA分析稳定和冷冻培养基的等分试样。
对于活性试验，解冻并按照材料和方法中的描述利用CoA分析法分析稳定和冷冻培养基的等分试样。
根据从活性和总因子VIII抗原含量计算的比活性来评价各培养物的培养基中因子VIII的质量。根据F25ELISA检测到的因子VIII抗原量与总因子VIII抗原量之间的关系评价具有完整重链C端的因子VIII的比例。
利用两次添加获得的结果显示于图3A-C。这些数据证明向因子VIII生产细胞的培养物中添加O-磷酸-L-丝氨酸和/或植物水解物的有益影响。这两种添加均提高了细胞培养物中重组因子VIII的产量和质量，这两种添加剂均增加了培养基中具有完整重链C端的因子VIII的比例。此外，当O-磷酸-L-丝氨酸和植物水解物联用时，观察到对具有完整重链C端的因子VIII的比例的加性的有益影响。
表4.用因子VIII生产细胞检测的添加物
  产品   供应商   目录号
  A   无添加剂   -   -
  B   小麦谷蛋白水解物   KerryBioscience   HyPep 4605
  C   O-磷酸-L-丝氨酸   Sigma   P0878
  D   小麦谷蛋白水解物和O-磷酸-L-丝氨酸   -   -
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Figure IYZ000006644691400012
Figure IYZ000006644691400021
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Claims (11)

1.一种生产因子VIII多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)在用于表达所述因子VIII多肽的条件下培养表达因子VIII多肽的哺乳动物细胞，所述培养条件包括包含O-磷酸-L-丝氨酸的细胞培养基，和b)通过合适的方法从哺乳动物细胞分离表达的因子VIII多肽。
2.一种生产因子VIII多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)在用于表达所述因子VIII多肽的条件下培养表达因子VIII多肽的哺乳动物细胞，所述培养条件包括细胞培养基，和b)通过合适的方法从哺乳动物细胞分离表达的因子VIII多肽，所述合适的方法包括向所述细胞添加O-磷酸-L-丝氨酸。
3.如权利要求1-2中任意一项所述的方法，其中O-磷酸-L-丝氨酸以0.1-100mM的浓度存在于细胞培养基。
4.如权利要求1-2中任意一项所述的方法，其中在步骤b)中向细胞添加浓度为1-200mM的O-磷酸-L-丝氨酸。
5.如权利要求1-2中任意一项所述的方法，其中所述细胞培养基还包括大豆胰蛋白酶抑制剂。
6.如权利要求1-2中任意一项所述的方法，其中所述细胞培养基还包括植物蛋白水解物。
7.如权利要求1-2中任意一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞选自内源性表达因子VIII多肽的哺乳动物细胞和已经转染因子VIII多肽基因的哺乳动物细胞。
8.如权利要求1-2中任意一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞已经转染包括编码因子VIII多肽的核酸分子及与其可操作连接的表达调控区的表达载体。
9.如权利要求1-2中任意一项所述的方法，其中所述细胞培养基不含血清。
10.如权利要求1-2中任意一项所述的方法，其中从细胞培养基收集表达的因子VIII多肽而且不降低细胞的生存力。
11.如权利要求10所述的方法，其中利用相同批次的细胞连续生产。
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