KR101594805B1

KR101594805B1 - 세포 배양물에서 인자 ｖｉｉｉ 폴리펩티드 역가의 개선

Info

Publication number: KR101594805B1
Application number: KR1020097023500A
Authority: KR
Inventors: 라우스트 브루운 존센; 이다 힐덴; 게르트 볼트; 토마스 독 스틴스트럽
Original assignee: 노보 노르디스크 에이/에스
Priority date: 2007-05-04
Filing date: 2008-04-30
Publication date: 2016-02-17
Also published as: AU2008248627A1; CN101675073B; EP2144929A1; AU2008248627B2; US9982033B2; CA2684951A1; ES2379846T3; JP5506664B2; EP1988101A1; EP2144929B1; US20100120094A1; RU2009143635A; ATE540975T1; WO2008135501A1; BRPI0811177A2; PL2144929T3; RU2477318C2; JP2010525829A; KR20100016430A; CN101675073A

Abstract

본 발명은 인자 VIII의 생산 방법에 관한 것이며, 본 방법은 a) 상기 인자 VIII 폴리펩티드의 발현을 위한 조건하에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 발현하는 포유동물 세포를 배양하는 단계(상기 배양 조건은 C2-도메인 리간드를 포함하는 세포 배양 배지를 수반한다), b) 적당한 수단에 의해 포유동물 세포로부터 발현된 인자 VIII 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함하는 인자 VIII 폴리펩티드의 생산 방법을 포함한다.

인자 VIII 폴리펩티드, C2-도메인 리간드, O-포스포-L-세린, 혈우병

Description

세포 배양물에서 인자 ＶＩＩＩ 폴리펩티드 역가의 개선{IMPROVEMENT OF FACTOR VIII POLYPEPTIDE TITERS IN CELL CULTURES}

본 발명은 C2-도메인 리간드, 특히 O-포스포-L-세린(OPLS)의 사용을 수반하는 인자 VIII 폴리펩티드의 제조를 위한 방법에 관한 것이다.

고전 혈우병 또는 혈우병 A형은 유전적인 출혈성 질환이다. 이는 혈액응고 인자 VIII의 염색체 X-연관 결핍증으로부터 초래되며, 10,000명 당 1 내지 2명의 발병률로 거의 배타적으로 남성에게 영향을 미친다. X-염색체 결함은 자신은 혈우병이 아닌 여성 매개자에 의해 전달된다. 혈우병 A형의 임상적 발현은 증가된 출혈경향이다. 인자 VIII 농축물에 의한 치료가 도입되기 전, 심각한 혈우병이 있는 사람에 대한 평균 수명 기간은 20년 미만이었다. 혈장으로부터 인자 VIII의 농축물의 사용은 혈우병 환자들을 위한 상황을 상당히 개선시켜 평균 수명 기간을 크게 증가시켰고, 그들 중 대부분은 어느 정도 정상 수명을 사는 가능성을 제공하였다. 그러나, 혈장-유래 농축물 및 그것의 사용과 관련된 특정의 문제들이 있었으며, 이것들 중 가장 심각한 것은 바이러스의 전달이었다. 지금까지, AIDS, B형 간염, 및 비-A형 비-B형 간염의 원인이 되는 바이러스는 집단에 심각하게 타격을 입혔다. 그때 이래로 혈장 유래 인자 VIII에 대한 매우 높은 안전성 표준을 확립한 다른 바이러 스 불활성화 방법 및 새로 고도로 정제된 인자 VIII 농축물들이 최근에 개발되었다.

인자 VIII (FVIII)은 포유동물 세포에서 매우 낮은 수준에서 발현되는 것으로 알려져 있다. 또한, 인자 VIII은 무혈청 또는 무 단백질 배지에서 불안정한 단백질인 것으로 알려져 있다. 다양한 물질의 첨가가 인자 VIII의 안정성 및 역가를 개선시키기 위해 사용되었다.

WO 9743436은 금속 의존성 억제제 및/또는 키모트립신의 억제제의 첨가를 개시한다.

WO 88/08035 및 WO 87/04187은 인자 VIII 배양 배지에 인지질의 첨가를 개시한다. 또한 폰빌레브란트 인자(von Willebrand factor: vWF)의 공동-발현이 기술된다.

US 2005 0227913 A1은 C2-도메인(2303-2332)에 결합함에 의한 인자 VIII의 응집 억제제로서 OPLS를 개시한다. 덜 응집된 인자 VIII은 덜 면역성이라고 주장한다.

K. Hansen, M. Kjalke, P.B. Rasmussen, L. Kongerslev, and M. Ezban, Cytotechnol. 24 (3), 227-234, 1997은 배지에서 인자 VIII의 분해를 방지하기 위한 바시트라신 A 및 포스파티딜세린의 사용을 개시한다.

WO 90/02175 A1은 폴리펩티드(들)의 분해를 방지하기 위한 프로테아제 억제제의 존재하에서 진핵 세포를 배양함으로써 재조합 폴리펩티드(들)을 생산하는 공정들을 개시한다.

EP 1707634 A1은 인자 VIII의 실질적인 양이 세포 표면과 관련되고 높은 이온 강도의 완충제로 세척함으로써 제거될 수 있음을 개시한다.

인자 VIII 폴리펩티드의 전반적인 수율을 개선시키고 및/또는 생산 비용을 감소시키기 위해 개선된 생산 방법에 대한 필요가 여전히 존재한다.

발명의 개요

본 발명의 제 1 양태는 인자 VIII 폴리펩티드의 생산을 위한 방법에 관한 것이며, 본 방법은 a) 상기 인자 VIII 폴리펩티드의 발현을 위한 조건하에서 인자 VIII 폴리펩티드를 발현하는 포유동물 세포를 배양하는 단계(상기 배양 조건은 C2-도메인 리간드를 포함하는 세포 배양 배지를 수반한다), b) 적당한 수단에 의해 포유동물 세포로부터 발현된 인자 VIII 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함한다.

본 발명의 제 2 양태는 인자 VIII 폴리펩티드의 생산을 위한 방법에 관한 것이며, 본 방법은 a) 상기 인자 VIII 폴리펩티드의 발현을 위한 조건하에서 인자 VIII 폴리펩티드를 발현하는 포유동물 세포를 배양하는 단계(상기 배양 조건은 세포 배양 배지를 수반한다), 및 b) 적당한 수단에 의해 포유동물 세포로부터 발현된 인자 VIII 폴리펩티드를 분리하는 단계(상기 적당한 수단은 상기 세포에 C2-도메인 리간드의 첨가를 수반한다)를 포함한다.

도 1. 인자 VIII 유전자 서열 (cDNA) (SEQ ID NO. 1).

도 2A-B: FVIII 생산성 및 FVIII 단백질 비활성에 대한 O-포스포-L-세린의 효과.

도 3A-C. 인자 VIII 생산 세포의 배지에서 인자 VIII에 대한 O-포스포-L-세린 및/또는 식물 단백질 가수분해물의 효과. 조건 A-D의 상세는 표 4에 나타낸다.

발명의 상세한 설명

상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 제 1 양태는 인자 VIII 폴리펩티드의 생산을 위한 방법에 관한 것이며, 본 방법은 a) 상기 인자 VIII 폴리펩티드의 발현을 위한 조건하에서 인자 VIII 폴리펩티드를 발현하는 포유동물 세포를 배양하는 단계(상기 배양 조건은 C2-도메인 리간드를 포함하는 세포 배양 배지를 수반한다), 및 b) 적당한 수단에 의해 포유동물 세포로부터 발현된 인자 VIII 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함한다.

두 경우에서, C2-도메인 리간드는 세포 배양 배지에서 증가된 인자 VIII 폴리펩티드 역가 수준을 조성하는데 중요한 역할을 한다.

어떤 특정 이론에 의해 구속되지 않고, 세포 배양 배지에서 인자 VIII 폴리펩티드 역가 수준의 증가는, 단독으로 또는 대두 트립신 억제제 (SBTI) 및/또는 식 물 단백질 가수 분해물과 조합하여, (i) 세포에 의해 분비된 인자 VIII 폴리펩티드의 양을 증가시키는, 및/또는 (ii) 세포-결합 인자 VIII 폴리펩티드를 경쟁시켜 세포에서 떼어내는, 및/또는 (iii) 인자 VIII 폴리펩티드의 분해를 감소시키고 그리고 이에 의해 상청액에 존재하는 기능적 인자 VIII 폴리펩티드의 양을 증가시키는 C2-도메인 리간드(특히 O-포스포-L-세린(OPLS))에 의해 초래된다.

본 발명은 하기에서 더욱 상세하게 설명될 것이다.

C2-도메인 리간드는 인자 VIII 폴리펩티드의 C2-도메인(하기 참조)에 결합가능한 또는 결합한 리간드이다. 바람직하게는, C2-도메인 리간드는 세포막으로부터 인자 VIII 폴리펩티드를 이동(경쟁시켜 떼어냄)시킬 수 있어야 한다.

현재 가장 바람직한 구체예에서, C2-도메인 리간드는 O-포스포-L-세린 (OPLS), 즉 화학식 (HO)₂P(O)OCH₂CH(NH₂)CO₂H의 분자이다.

적당한 또 다른 C2-도메인 리간드는 화학식 (XO)(HO)P(O)OCH₂CH(NH₂)CO₂H를 갖는 것들인 것으로 생각되며, X는 선택적으로 치환된 C₁ _-6-알킬, 선택적으로 치환된 C₂ _-6-알케닐, 선택적으로 치환된 페닐, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 및 선택적으로 치환된 벤질로부터 선택된다. 그것의 한 구체예에서, X는 선택적으로 치환된 C₁ _-6-알킬, 선택적으로 치환된 벤질, 및 선택적으로 치환된 C₂ _-6-알케닐로부터 선택된다.

본 내용에서, 용어 "C₁ _-6-알킬"은 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, 펜틸, 시클로펜틸, 헥실, 시클로헥실과 같은 1 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 선형, 고리형 또는 분지된 탄화수소 기를 의미하는 것으로 의도된다.

유사하게, 용어 "C₂ _-6-알케닐"은 2 내지 6개의 탄소 원자를 가지고 적어도 하나의 불포화 결합을 포함하는 선형, 고리형 또는 분지된 탄화수소 기를 의미하는 것으로 의도된다. 알케닐기의 예는 비닐, 알릴, 부테닐, 펜테닐, 및 헥세닐이다. 알케닐의 바람직한 예는 비닐, 알릴, 부테닐, 특히 알릴이다.

본 내용에서, 즉, 용어 "알킬" 및 "알케닐"과 관련하여, 용어 "선택적으로 치환된"은 당해 기가, 히드록시(불포화 탄소 원자에 결합될 때 호변체의 케토 형태로 존재할 수 있다), C₁ _-6-알콕시 (즉, C₁ _-6-알킬-옥시), C₂ _-6-알케닐옥시, 카르복시, 옥소(케토 또는 알데히드 작용기를 형성), C₁ _-6-알킬카르보닐, 포르밀, 아릴, 아릴옥시, 아릴아미노, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴아미노, 헤테로아릴카르보닐, 헤테로시클릴, 헤테로시클릴옥시, 헤테로시클릴아미노, 헤테로시클릴카르보닐, 아미노, 모노- 및 디(C₁ _-6-알킬)아미노; 카르바모일, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노카르보닐, 아미노-C₁ _-6-알킬-아미노카르보닐, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노-C₁ _-6-알킬-아미노카르보닐, C₁ _-6-알킬카르보닐아미노, 구아니디노, 카르바미도, C₁ _-6-알킬-술포닐-아미노, C₁ _-6-알킬-술포닐, C_1-6-알킬-술피닐, C₁ _-6-알킬티오, 할로겐으로부터 선택되는 기(들)로 한 번 또는 여러 번, 바람직하게는 1-3회 치환될 수 있음을 의미하는 것으로 의도되며, 상기에서 어떤 아릴, 헤테로아릴 및 헤테 로시클릴은 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴에 대해 하기에 구체적으로 기술되는 바와 같이 치환될 수 있다.

용어 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도를 포함한다.

본 내용에서, 용어 "아릴"은 페닐, 나프틸, 1,2,3,4-테트라히드로나프틸, 안트라실, 페난트라실, 피레닐, 벤조피레닐, 플루오레닐 및 크산테닐과 같은 완전히 또는 부분적으로 방향족 탄소고리 환 또는 환 시스템을 의미하는 것으로 의도되며, 이들 중 페닐이 바람직한 예이다.

용어 "헤테로아릴"은 하나 이상의 탄소 원자가 헤테로원자, 예를 들어, 질소(=N- 또는 -NH-), 황, 및/또는 산소 원자로 치환된 완전히 또는 부분적으로 방향족 탄소고리 환 또는 환 시스템을 의미하는 것으로 의도된다. 이러한 헤테로아릴 기의 예는 벤즈이미다졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 피리디닐, 피리미디닐, 피라지닐, 피리다지닐, 푸릴, 티에닐, 퀴놀릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 이소퀴놀릴, 인돌릴, 특히 벤즈이미다졸릴, 피롤릴, 이미다졸릴, 피리디닐, 피리미디닐, 푸릴, 티에닐, 퀴놀릴, 테트라졸릴, 및 이소퀴놀릴이다.

용어 "헤테로시클릴"은 하나 이상의 탄소 원자가 헤테로원자, 예를 들어, 질소(=N- 또는 -NH-), 황, 및/또는 산소 원자로 치환된 비-방향족 탄소고리 환 또는 환 시스템을 의미하는 것으로 의도된다. 이러한 헤테로시클릴 기(환에 따라 명명됨)의 예는 테트라히드로푸란, 이미다졸리딘, 피페라진, 헥사히드로피리다진, 헥사히드로피리미딘, 디아제판, 피롤리딘, 피페리딘, 아제판, 옥사지난(모르폴린) 및 티아지난이다.

본 내용에서, 즉, 용어 "아릴", "벤질", "헤테로아릴", "헤테로시클릴" 등(예를 들어, "아릴옥시", "헤테르아릴카르보닐" 등)과 관련하여, 용어 "선택적으로 치환된"은 당해 기가 히드록시, C₁ _-6-알킬, C₁ _-6-알콕시, 옥소(호변체 엔올 형태로 나타낼 수 있다), 카르복시, C₁ _-6-알킬카르보닐, 포르밀, 아미노, 모노- 및 디(C₁ _-6-알킬)아미노; 카르바모일, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노카르보닐, 아미노-C₁ _-6-알킬-아미노카르보닐, C₁ _-6-알킬카르보닐아미노, 구아니디노, 카르바미도, C₁ _-6-알킬-술포닐-아미노, 아릴-술포닐-아미노, 헤테로아릴-술포닐-아미노, C₁ _-6-알킬-술포닐, C₁ _-6-알킬-술피닐, C₁ _-6-알킬술포닐옥시, 술파닐, 아미노, 아미노-술포닐, 모노- 및 디(C₁ _-6-알킬)아미노-술포닐 또는 할로겐으로부터 선택되는 기로 한 번 또는 여러 번, 바람직하게는 1-5회, 특히 1-3회 치환될 수 있음을 의미하도록 의도되며, 상기에서 치환기를 나타내는 어떤 알킬, 알콕시 등은 히드록시, C₁ _-6-알콕시, C₂ _-6-알케닐옥시, 아미노, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노, 카르복시, C₁ _-6-알킬카르보닐아미노, 할로겐, C₁ _-6-알킬티오, C₁ _-6-알킬-술포닐-아미노, 또는 구아니디노로 치환될 수 있다.

가장 관심있는 구체예에서(본 발명의 제 1 및 제 2 양태 둘 다에 관련됨), C2-도메인 리간드(예를 들어, OPLS)는 0.1-100 mM, 예로써, 5-30 mM, 특히 10-20 mM의 농도로 세포 배양 배지에서 존재한다.

또한 관심있는 것은, C2-도메인 리간드가 1-200 mM, 예로써, 50-150 mM, 특히 70-130 mM의 농도로 단계 b)에서 세포에 첨가되는 구체예에서(본 발명의 제 1 및 제 2 양태 둘 다에 관련됨)이다.

제조 단계에 대한 상세한 것은 하기에서 추가로 상세하게 논의될 것이다.

말하자면, 대두 트립신 억제(SBTI)는 단계 a)에서의 세포 배양 배지에서 C2-도메인 리간드와 조합하는 것이 유리할 수도 있음이 발견되었다. 따라서 현재 바람직한 구체예에서, 세포 배양 배지는 추가로 대두 트립신 억제제를 포함한다.

대두 트립신 억제제는 글리신 맥스(Glycine max)로부터 분리된다. 대두로부터의 대두 트립신 억제제는 2개의 이황화 다리에 의해 가교결합된 단일 폴리펩티드 사슬에서 181개의 아미노산 잔기를 함유하는 모노머 단백질이다. 아미노산 서열로부터 결정된 분자량은 20.1 kDa이다. 대두 트립신 억제제는 1:1 화학량론적 복합체를 형성함으로써 그것의 표적 프로테아제를 억제한다.

가장 전형적인 구체예에서, 세포 배양 배지 내 대두 트립신 억제제의 농도는 0.01-100 mg/mL, 예로써 0.1-10 mg/mL, 특히 0.3-3 mg/mL이다.

식물 단백질 가수분해물(때때로 "식물-유래 분해" 등으로서 언급됨)은 유리하게는 단계 a)에서의 세포 배양 배지에서 C2-도메인 리간드(및 가능하게는 또한 대두 트립신 억제제)와 조합될 수 있음이 또한 밝혀졌다. 따라서, 현재 동등하게 바람직한 구체예에서, 세포 배양 배지는 추가로 식물 단백질 가수분해물을 포함한다.

식물 단백질 가수분해물은 다양한 공급원 중 하나, 예를 들어, 상업적 공급 원으로부터 얻을 수 있다. 전형적인 종류의 가수분해물은 콩 단백질 가수분해물, 밀 단백질 가수분해물, 완두 단백질 가수분해물, 쌀 단백질 가수분해물 등이 있다. 본원에 참고로써 포함되는 WO 01/23527 A1은 콩 단백질 가수분해물의 제조 및 일반적 사용을 개시한다.

가장 전형적인 구체예에서, 세포 배양 배지에서 식물 단백질 가수분해물의 농도는 0.1-100 mg/mL, 예로써, 1-10 mg/mL, 특히 2-7 mg/mL이다.

인자 VIII 폴리펩티드

본 발명은 포유동물 세포에서 인자 VIII 폴리펩티드의 생산을 위해 적응되어있다.

성숙 인자 VIII 분자는 A1-A2-B-A3-C1-C2의 순서로 배열되는 3개의 동종 A 도메인, 2개의 동종 C 도메인 및 B 도메인으로 그룹화될 수 있는 2332개의 아미노산으로 구성된다. 혈장에 그것의 분비 동안 인자 VIII은 세포 내에서 처리되어 단일 사슬 인자 VIII이 B-A3 경계에서 및 B-도메인 내 다른 자리에서 절단되기 때문에 일련의 금속-이온 결합 헤테로다이머로 된다. 이 처리는 A1, A2 및 B-도메인의 다양한 부분으로 구성되며, 90 kDa 내지 200 kDa의 범위에 있는 분자 크기를 가지는 중쇄를 유발한다. 중쇄는 금속 이온을 통해 A3, C1 및 C2 도메인으로 구성되는 경쇄에 결합된다(Saenko et al. 2002). 혈장에서 이 헤테로다이머 인자 VIII은 그것을 너무 이른 이화작용으로부터 보호하는 폰빌레브란트 인자에 높은 친화도로 결합한다. vWF에 결합된 비활성화된 인자 VIII의 반감기는 혈장에서 약 12시간이다.

혈액 응고 과정 동안, 인자 VIII은 중쇄 내 아미노산 Arg372 및 Arg740에서 및 경쇄 내 Arg1689에서 FXa 및 트롬빈에 의한 단백질 가수분해 절단을 통해 활성화되어 폰빌레브란트 인자의 방출을 야기하고, Ca² ⁺가 존재한다면 인지질 표면에서 FIXa 및 FX와의 테나아제 복합체를 형성할 활성화된 인자 VIII 헤테로트리머를 발생시킨다. 헤테로트리머는 A1 도메인, 50 kDa 단편, A2 도메인 43 kDa 단편 및 경쇄(A3-C1-C2), 73 kDa 단편으로 구성된다. 따라서 인자 VIII의 활성 형태(인자 VIIIa)는 트롬빈-절단된 A3-C1-C2 경쇄에 2가의 금속 이온 결합을 통해 회합된 A1 서브유닛과 A1 및 A3 도메인과 상대적으로 느슨하게 결합된 자유 A2 서브유닛으로 구성된다.

B-도메인(인자 VIII 또는 BDD-FVIII이 결핍된 B-도메인)으로부터 유도된 작은 링커와 연결된 인자 VIII의 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)로 구성되는 인자 VIII 분자는 전장(고유) 인자 VIII의 생물학적 활성을 보유한다.

본 발명의 방법을 실시하는데 있어서, 치료에 유용한, 예를 들어 출혈을 예방 또는 치료하는데 효과적인 어떤 인자 VIII 폴리펩티드도 적절할 수 있다. 이는, 제한 없이, 야생형 인간 인자 VIII, 하이브리드 인간/돼지 인자 VIII 및 인간 인자 VIII이 결핍된 B-도메인을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같은, "인자 VIII 폴리펩티드"는, 제한 없이, 인자 VIII 및 인자 VIII-관련 폴리펩티드를 포함한다.

용어 "인자 VIII"은, 제한 없이, Toole et al., Nature 1984, 312: 342-347 (야생형 인간 인자 VIII)에서 기술하는 바와 같은 아미노산 서열을 가지는 폴리펩 티드 및, 예를 들어, 소, 돼지, 개, 쥐, 및 연어 인자 VIII과 같은 다른 종들로부터 유래된 야생형 인자 VIII을 포함하는 것으로 의도된다. 이는 또한 개체마다 존재하고 발생할 수 있는 인자 VIII의 천연 대립형질 변이를 포함한다. 또한, 글로코실화 또는 다른 번역 후 변형의 정도 및 위치는 선택된 숙주 세포 및 숙주 세포 환경의 특성에 따라 다양할 수 있다. 용어 "인자 VIII"은 또한 그것의 절단되지 않은 (치모겐) 형태의 인자 VIII 폴리펩티드, 및 단백질가수분해로 처리되어 인자 VIIIa로 지칭할 수 있는 그것들 각각의 생활성 형태를 수득 것들을 포함하도록 의도된다.

"인자 VIII-관련 폴리펩티드"는 제한 없이, 인간 인자 VIII에 비하여 화학적으로 변형된(즉, 인자 VIII 유도체) 및/또는 인간 인자 VIII에 비하여 하나 이상의 아미노산 서열 변경을 함유하는(즉, 인자 VIII 변이체), 및/또는 인간 인자 VIII에 비하여 끝이 잘린 아미노산을 함유하는(즉, 인자 VIII 분획) 인자 VIII 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 인자 VIII-관련 폴리펩티드는 안정성, 인지질 결합, 변경된 비활성 등을 포함하는 인간 인자 VIII에 비하여 다른 특성을 나타낼 수 있다. 용어 "인자 VIII-관련 폴리펩티드"는 그것의 절단되지 않은 (치모겐) 형태의 이러한 폴리펩티드, 및 단백질 가수분해로 처리되어 "인간 VIIIa-관련 폴리펩티드" 또는 "활성화된 인자 VIII-관련 폴리펩티드"로 지칭할 수 있는 그것들 각각의 생활성 형태를 수득하는 것들을 포함하도록 의도된다.

본원에 사용된 바와 같은 "인자 VIII-관련 폴리펩티드"는 또한, 제한 없이, 야생형 인간 인자 VIII에 비하여 실질적으로 동일한 또는 개선된 생물학적 활성을 나타내는 폴리펩티드, 뿐만 아니라 인자 VIII 생물학적 활성이 야생형 인간 인자 VIII의 활성에 비하여 실질적으로 변형 또는 감소된 폴리펩티드를 포함한다. 이들 폴리펩티드는, 제한 없이, 폴리펩티드의 화학적으로 변형된 인자 VIII 또는 인자 VIIIa 그리고 생활성을 변형 또는 분열시키는 특이적 아미노산 서열 변형이 도입된 인자 VIII 변이체를 포함한다.

이는 또한 약간 변형된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 예를 들어, N-말단 아미노산 결실 또는 첨가를 포함하는 변형된 N-말단 끝을 가지는 폴리펩티드, 및/또는 인간 인자 VIII에 비하여 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 포함한다.

인자 VIII의 변이체를 포함하는 인자 VIII-관련 폴리펩티드는, 야생형 인자 VIII과 실질적으로 동일하거나 또는 보다 나은 생활성을 나타내든지, 또 다르게는 야생형 인자 VIII에 대한 실질적으로 변형된 또는 감소된 생활성을 나타내든지, 제한 없이, 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 야생형 인자 VIII의 서열과 다른 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함한다.

변이체를 포함하는 인자 VIII-관련 폴리펩티드는 본 발명에서 기술되는 바와 같이 인자 VIII 활성 분석에서 시험했을 때, 동일한 세포형에서 생산된 야생형 인자 VIII의 비활성의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 적어도 약 120%, 및 적어도 약 130%를 나타내는 것들을 포함한다.

야생형 인자 VIII에 대한 실질적으로 동일한 또는 개선된 생물학적 활성을 가지는 변이체를 포함하는 인자 VIII-관련 폴리펩티드는 본 설명에서 이하("재료 및 방법")에 기술되는 바와 같이 하나 이상의 특이적 인자 VIII 활성 분석에서 시험했을 때, 동일한 세포형에서 생산된 야생형 인간 인자 VIII의 특이적 생물학적 활성의 적어도 약 25%, 예로써 적어도 50%, 적어도 75%, 또는 적어도 90%를 나타내는 것들을 포함한다 .

본 설명에서 하기 기술("재료 및 방법")되는 바와 같은 특이적 인자 VIII 활성 분석 중 하나 이상에서 시험될 때, 야생형 인자 VIII에 비하여 실질적으로 감소된 생물학적 활성을 가지는, 변이체를 포함하여 인자 VIII-관련 폴리펩티드는 동일한 세포형에서 생산된 야생형 인자 VIII의 비활성의 약 25% 미만, 예로써, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만을 나타내는 것들이다.

인자 VIII 폴리펩티드의 비-제한적 예는, 예를 들어, Fulcher et al.; Proc. Acad. Nat. Sci. USA 1982; 79: 1648-1652, 및 Rotblat et al.; Biochemistry 1985; 24:4294-4300에 기술되는 바와 같은 혈장-유래 인간 인자 VIII, 및, 예를 들어, Fass et al.; Blood 1982; 59: 594-600 및 Knutson et al.; Blood 1982; 59: 615-624에서 기술되는 바와 같은 혈장-유래 돼지 FVIII을 포함한다. 인자 VIII 서열 변이체의 비-제한적 예는, 예를 들어, Lollar et al.; Blood 2000; 95(2): 564-568 (하이브리드 돼지/인간 FVIII 폴리펩티드) 및 Lollar et al.; Blood 2001; 97(1) : 169-174에서 기술된다.

인자 VIII에 대한 cDNA의 클로닝(Wood, W. I., et al. (1984) Nature 312, 330-336; Vehar, G.A., et al. (1984) Nature 312, 337-342)은 인자 VIII을 재조합 에 의해 발현하여 1992년과 2003년 사이에 규제 기관에 의해 승인된 몇몇의 재조합 인자 VIII 생산물의 발달을 가져올 수 있었다. 인자 VIII에 대한 코딩 서열(cDNA)을 도 1에 나타낸다. 아미노산 Arg-740과 Glu-1649 사이에 속하는 인자 VIII 폴리펩티드 사슬의 중앙 B 도메인이 완전한 생물학적 활성에 필요한 것 같지는 않다는 사실은 또한 B-도메인이 결핍된 인자 VIII의 발달을 가져왔다. 또한 Kjalke M, Heding A, Talbo G, Persson E, Thomsen J and Ezban M (1995), "Amino acid residues 721-729 are required for full Factor VIII activity". Eur. J. Biochem: 234: 773-779 참조.

단계 a) - 세포의 트랜스펙션 및 배양

세포

인자 VIII 폴리펩티드를 발현하는 포유동물 세포는 인자 VIII 폴리펩티드를 내인성으로 발현하는 포유동물 세포 및 인자 VIII 폴리펩티드에 대한 유전자로 트랜스펙션된 포유동물 세포로 구성되는 군으로부터 전형적으로 선택된다.

후자의 한 가지 현재 흥미로운 구체예에서, 포유동물 세포는 인자 VIII 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 그것에 작용가능하게 연결된 발현 조절 영역을 포함하는 발현 벡터로 트랜스펙션되었다.

세포에서 단백질의 발현은 단백질 생산의 분야에서 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 실시에서, 세포들은 포유동물 세포이고, 더 바람직하게는 제한 없이, CHO (예를 들어, ATCC CCL 61), COS-1 (예를 들어, ATCC CRL 1650), 새끼 햄스터 신장 (BHK), 및 HEK293 (예를 들어, ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) 셀 라인을 포함하는 확립된 포유동물 셀 라인이다. 바람직한 BHK 셀 라인은 이후에 BHK 570 세포로서 언급되는 tk^-ts13 BHK 셀 라인이다(Waechter and Baserga, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 79: 1106-1110, 1982). BHK 570 셀 라인은 ATCC 등록 번호 CRL 10314 하에서 ATCC(American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852)로부터 이용가능하다. tk^-ts13 BHK 셀 라인은 또한 등록 번호 CRL 1632 하에서 ATCC로부터 이용가능하다. 바람직한 CHO 셀 라인은 등록 번호 CCI61 하에서 ATCC로부터 이용가능한 CHO K1 셀 라인, 및 셀 라인 CHO-DXB11 및 CHO-DG44이다.

다른 적당한 셀 라인은, 제한 없이, 래트 Hep I (래트 간암; ATCC CRL 1600), 래트 Hep II (래트 간암; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), 인간 폐 (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1); DUKX 세포(CHO 셀 라인) (Urlaub and Chasin, Proc . Natl . Acad . Sci USA 77:4216-4220, 1980) (또한 DXB11 세포로도 언급되는 DUKX 세포), 및 DG44 (CHO 셀 라인) (Cell, 33: 405, 1983, 및 Somatic Cell and Molecular Genetics 12: 555, 1986)를 포함한다. 또한, 3T3 세포, 나말와 세포, 골수종 및 골수종과 다른 세포와의 융합이 유용하다. 일부 구체예에서, 세포는, 세포들이 유래되는 세포 유형보다는 예를 들어서, 단백질의 번역 후 변형을 촉매하는 질적 또는 양적으로 다른 범위의 효소들(예를 들어, 글리코실 트랜스퍼라제 및/또는 글리코시다아제와 같은 글리코실화 효소, 또는 프로펩티드와 같은 처리 효소)을 발현하는 세포와 같은 돌연변이 또는 재조합 세포일 수 있다. DUKX 세포(CHO 셀 라인)가 특히 바람직하다.

현재 바람직한 세포는 HEK293, COS, 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 및 골수종 세포, 특히 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포이다.

세포 배양

일부 구체예에서, 본 발명을 실시하는데 사용된 세포들은 현탁 배양물에서 성장할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은, 현탁-컴피턴트 세포는 크고, 견고한 응고물 없이 현탁액에서 성장할 수 있는 것들, 즉, 응고물 마다 단지 몇 개의 세포들을 가지는 느슨한 응고물에서 단분산 또는 성장하는 세포이다. 현탁-컴피턴트 세포는, 제한 없이, 적응(adaptation) 또는 조작 없이 현탁액에서 성장하는 세포(예로써, 조혈 세포 또는 림프 세포) 및 현탁액 성장에 대해 부착-의존적 세포의 점진적 적응에 의한 현탁-컴피턴트로 만들어진 세포(예로써, 상피 또는 섬유아세포)를 포함한다.

본 발명을 실행하는데 사용된 세포는 부착 세포(또한 앵커리지-의존성 또는 부착-의존성 세포로도 알려짐)일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은, 부착세포는 증식과 성장에 적당한 표면에 그 자체를 부착 또는 고정시키는데 필요한 것들이다. 본 발명의 한 구체예에서, 사용된 세포는 부착 세포이다. 이들 구체예에서, 증식 단계와 생산 단계는 둘 다 마이크로담체의 사용을 포함한다. 사용된 부착 세포들은 증식 단계(들) 동안 담체상으로(대공성(macroporous) 담체가 사용된다면 담체의 내부 구조로) 이동할 수 있어야 하고, 생산 바이오리액터로 옮겨질 때 새로운 담체로 이동할 수 있어야 한다. 부착 세포가 스스로 새로운 담체에 충분히 이동할 수 없다면, 그것들은 세포-함유 마이크로담체를 단백질 가수분해 효소 또는 EDTA와 접촉시킴으로써 담체로부터 유리될 수 있다. 사용된 배지(특히 동물-유래 성분이 없을 때)는 부착 세포를 지지하는데 적당한 성분들을 추가로 함유하여야 하며; 부착 세포의 배양을 위한 적당한 배지는, 예를 들어, Sigma와 같은 상업적 공급업자로부터 이용가능하다.

세포는 또한 현탁액-적응 또는 현탁액-컴피턴트 세포일 수 있다. 이러한 세포들이 사용된다면, 세포의 증식은 현탁액에서 행해질 수 있고, 따라서 마이크로담체는 단지 생산 배양물 용기 자체에서 최종 증식 단계에서 및 생산 단계에서 사용된다. 현탁액-적응된 세포의 경우에, 사용된 마이크로담체는 전형적으로 대공성 담체이고, 세포는 담체의 내부 구조 안쪽의 물리적 포착에 의해 부착된다. 그러나, 이러한 현탁액-적응된 세포의 경우에, 세포의 증식과 생산은 둘 다 현탁액에서 행해질 수 있다.

이러한 구체예에서, 포유동물 세포는 전형적으로 CHO, BHK, HEK293, 골수종 세포 등으로부터 선택된다.

세포 배양 배지

상기 언급한 성분들, 즉 C2-도메인 리간드(본 발명의 제 1 양태에 속하는 본 발명에 대해 요구됨), 선택적 대두 트립신 억제, 및 선택적 식물 단백질 가수분해물에 더하여, 세포 배양 배지는 세포의 증식 및 인자 VIII 폴리펩티드의 생산에 필요한 -당업자는 알것임-많은 다른 성분들을 포함한다.

용어 "세포 배양 배지" (또는 단순히 "배지")는 전형적으로 하기 카테고리 중 하나 이상으로부터 적어도 한 성분을 제공하는 성장하는 포유동물 세포에 대해 사용된 영양용액을 말한다: (1) 예를 들면, 배지의 삼투질 농도(osmolality)에 기여하는 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘의 염; (2) 에너지원, 보통 글루코오스와 같은 탄수화물의 형태; (3) 모든 필수 아미노산, 및 보통 20개의 아미노산의 기본 세트; (4) 저 농도로 요구되는 비타민 및/또는 다른 유기 화합물; 및 (5) 미량원소, 미량원소는 전형적으로 매우 낮은 농도, 보통 마이크로몰 범위로 요구되는 무기 화합물로서 정의됨. 영양용액은 선택적으로 하기 카테고리 중 어떤 것으로부터 하나 이상의 성분으로 보충될 수 있다: (a) 호르몬 및 기타 성장 인자, 예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 및 상피성장인자; 및 (b) 단백질 및 조직의 가수분해물. 바람직하게는, 세포 배양 배지는 동물 기원의 어떤 성분도 함유하지 않는다.

본 발명은 동물-유래 성분을 결핍하는 배지에서 포유동물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, "동물-유래" 성분은 무손상 동물에서 생산되는 어떤 성분(예를 들어, 혈청으로부터 분리 및 정제된 단백질), 또는 무손상 동물에서 생산된 성분을 사용하여 제조된 어떤 성분(예를 들어, 동물로부터 분리 및 정제된 효소를 사용하여 식물 공급원 물질을 가수분해하여 만든 아미노산)이다. 대조적으로, 무손상 동물로부터 생산되고, 그로부터 분리되고 정제된 성분들을 결핍하는 배지에서, 동물 단백질의 서열을 가지지만(즉, 동물에서 게놈 기원을 가짐) 세포 배양물에서 시험관 내에서(예를 들어, 재조합 효모 또는 박테리아 세포에서 또는 확립된 연속적 포유동물 셀 라인, 재조합체 등에서) 생산되는 단백질은 "동물-유래" 성분이 아니다(예를 들어, 효모 또는 박테리아 세포에서 생산된 인슐린, 또 는 예를 들어, CHO, BHK 또는 HEK 세포와 같은 확립된 포유동물 셀 라인에서 생산된 인슐린, 또는 나말와 세포에서 생산된 인터페론과 같은 것들). 예를 들어, 동물 단백질의 서열을 가지지만(즉, 동물에서 게놈 기원을 가짐) 동물 유래 성분(예로써, 효모 또는 박테리아 세포에서 생산된 인슐린)을 결핍한 배지에서 재조합 세포에서 생산되는 단백질은 "동물-유래 성분"이 아니다. 따라서, 동물-유래 성분을 결핍한 세포 배양 배지는 재조합적으로 제조된 동물 단백질을 함유하는 배지이며; 그러나 이러한 배지는, 예를 들어, 동물 혈청 또는 단백질 또는 동물 혈청으로부터 정제된 다른 생산물을 함유하지 않는다. 예를 들어, 이러한 배지는 식물로부터 유래된 하나 이상의 성분을 함유할 수도 있다. 어떤 세포 배양 배지, 특히 본 발명의 조건하에서 세포 성장 및 유지를 지탱하는 동물-유래 성분을 결핍하는 배지가 사용될 수 있다. 전형적으로, 배지는 물, 삼투질 농도 조절제, 완충제, 에너지원, 아미노산, 무기 또는 재조합 철 공급원, 하나 이상의 합성 또는 재조합체 성장 인자, 비타민, 및 보조인자를 함유한다. 한 구체예에서, 배지는 동물-유래 성분을 결핍하며, 단백질을 결핍한다("무-단백질"). 동물-유래 성분 및/또는 단백질을 결핍하는 배지는, 예를 들어, Sigma, JRH Biosciences, Gibco, Hyclone 및 Gemini와 같은 상업적 공급업자로부터 이용가능하다.

한 구체예에서, 세포 배양 배지는 본질적으로 무혈청이다. 다른 구체예에서, 배지는 동물-유래 성분을 결핍하는 배지이다. 추가 구체예에서, 배지는 동물-유래 성분을 결핍할 뿐 아니라 단백질을 결핍한다("무단백질").

한 구체예에서, 배지는, 예를 들어, EXCELL™ (SAFC Biosciences), PF-CHO, PF-CHO-LS, SFM4CH0, 또는 CDM4CH0 (모두 Hyclone제)와 같은 동물-유래 성분을 결핍하는 상업적으로 이용가능한 무-단백질 CHO 배지이며, 셀 라인은 CHO 세포이다.

일부 구체예에서, 본 발명을 실시하는데 사용되는 세포는, 예를 들어, 배지 결핍 혈청과 같은 동물-유래 성분을 결핍한 배지에서 현탁액 성장에 적응되어있다. 이러한 적응 과정은, 예를 들어, Scharfenberg, et al., Animal Cell Technology Developments towards the 21 ^st Century, E. C. Beuvery et al. (Eds.), Kluwer Academic Publishers, pp. 619-623, 1995 (BHK 및 CHO 세포); Cruz, Biotechnol . Tech. 11 : 117-120, 1997 (곤충 세포); Keen, Cytotechnol . 17: 203-211, 1995 (골수종 세포); Berg et al., Biotechniques 14:972-978, 1993 (인간 신장 293 세포)에서 기술된다. 특히 바람직한 구체예에서, 숙주 세포는 인간 인자 VIII을 발현하도록 처리되고 혈청 또는 동물-유래 성분의 부재하에서 성장하도록 적응된 BHK 21 또는 CHO 세포이다.

세포 배양 과정

본 발명의 방법은 교반된 배양 용기에서 전형적으로 수행되며 회수-충전 공정 유형이 전형적으로 사용된다. 이 처리에서, 세포는 접종 후 성장되고, 특정 밀도가 도달될 때, 배양물의 약 70%를 수확하고, 남은 배양물에 신선한 세포 배양 배지를 그것의 본래 부피까지 공급한다. 이것은 전형적으로 약 2-10회 반복한다.

또 다르게는, 마이크로담체 처리 유형이 사용될 수 있다. 마이크로담체-기재 공정에서, 세포는 담체의 내부 구조(거대기공 담체) 안으로 이동하거나 또는 담체 (고체 담체)의 표면에 그 자체가 부착되거나, 또는 둘 다이다. 마이크로담체-기재 공정에서, 포유동물 세포, 마이크로담체 및 세포 배양 배지가 초기에 배양 용기에 공급된다. 다음날, 배양물 부피가 초기의 용기의 최종 작업 부피에 이르지 않았다면 추가의 세포 배양 배지가 공급될 수 있다. 다음 기간 동안, 배양이 최종적으로 종결될 때까지, 생산물-함유 배양 상청액의 주기적인 수확 및 새로운 배지액으로의 교체를 수행한다. 생산물-함유 상청액을 수확할 때, 교반, 예를 들어 배양물의 교반을 중단하고 세포-함유 담체는 침강하도록 둔 후 이어서 생산물-함유 세포 배양물 상청액의 부분을 제거한다. 과정의 전체적인 생산량을 개선하기 위해, 바람직하게는 생산물-함유 상청액의 수확 전에 냉각 단계를 적용한다, 예를 들어, WO 03/029442 참조. 일부 구체예에서, 담체가 침강하는 것을 허용하기 전에 세포 배양 배지는 약 18℃ 내지 약 32℃, 또는 약 20℃ 내지 약 30℃, 또는 약 22℃ 내지 약 28℃의 온도로 냉각된다.

세포 배양 과정의 다른 적용가능한 변형은 WO 02/29084 (Novo Nordisk A/S)에 기재되어 있다.

추가의 하류 처리를 위한 생산물-함유 배양물 상청액의 정기적인 수확을 수행하는 생성 단계에 도달하기 전에, 세포는 당해 특정 세포에 적당할 수 있는 어떤 계획안 또는 일상과정에 따라서 증식된다. 증식 단계는 단일 단계 또는 다단계 과정일 수 있다. 단일 단계 증식 과정에서는, 세포를 저장소로부터 제거하고 생산이 일어나게 될 배양 용기(선택적으로 마이크로담체를 함유)에 직접 접종한다. 다단계 증식 공정에서는, 세포를 저장소로부터 제거하고 생산이 일어나게 될 최종 배양 용 기(선택적으로 마이크로담체를 함유)에 도달할 때까지 점진적으로 증가하는 크기의 다수의 배양 용기를 통해 증식된다. 증식 단계 동안, 세포는 성장에 최적화된 조건하에서 성장된다. 온도, pH, 용존산소 분압, 용존 CO₂의 농도 등과 같은 배양 조건은 특정 세포에 대해 최적이라고 알려진 것들이고, 이 분야의 당업자에게 명백할 것이다(예를 들어, Animal Cell Culture : A Practical Approach 2 ^nd Ed., Rickwood, D. and Hames, B. D., eds., Oxford University Press, New York (1992) 참조).

한 접근에서, 세포 배양 공정은 한 배양 용기에서 조작된다: 세포를 생산이 일어나는 배양 용기(선택적으로 마이크로담체를 함유)에 직접 접종하고; 적당한 세포 밀도가 도달되고 생산 단계가 시작될 때까지 세포는 증식된다.

다른 접근에서, 세포 배양 공정은 적어도 두 개의 분리된 배양 용기에서 조작된다: 하나 이상의 씨드 배양 용기(들)(제 1 증식 단계(들)) 다음에 생산 배양 용기(최종 증식 단계 후 생산 단계). 제 1 증식 단계에서, 요망되는 폴리펩티드를 발현하는 세포를 세포 배양 배지를 함유하는 씨드 배양 용기에 접종하고 세포가 최소의 크로스-씨딩 밀도에 도달할 때까지 증식시킨다. 이후에, 증식된 씨드 배양물을 세포 배양 배지 및 (선택적으로) 마이크로담체를 함유하는 생산 배양 용기에 옮긴다. 마이크로담체를 사용하는 공정의 경우에, 세포를 고체 담체의 표면 또는 대공성 담체의 외부 및 내부 표면으로 이동하는 조건하에서 세포를 이 배양 용기 내에서 배양하고, 담체가 세포에 의해 완전히 콜로니 형성될 때까지 그것들을 이 최종 증식 단계에서 계속해서 성장시킨다. 이 최종 증식 단계 동안 배지 교환은, 마 이크로담체가 배양 용기의 바닥에 침강하게 한 후 탱크 부피의 정해진 비율을 제거하고 신선한 배지의 대응하는 비율의 탱크 부피를 용기에 첨가함으로써, 수행된다. 마이크로담체는 그 다음 배지에 재현탁시키고 배지 제거 및 교체의 이 공정을 정해진 시간간격으로, 예를 들어, 매 24시간마다 반복한다. 교체되는 배지의 양은 세포 밀도에 의존하며 전형적으로 탱크 부피의 10-95%, 바람직하게는 25% 내지 80%일 수 있다.

현탁 공정, 예를 들어, 관류, 배치(batch) 또는 회수-충전 공정의 경우에, 세포는 담체에서 고정되지 않고 자유롭게 현탁성장된다. 현탁 세포-관류 공정에서, 세포는 동물-유래 성분을 결핍하는 배양 배지를 함유하는 씨드 배양 용기에 접종되고, 세포가 최소 크로스-씨딩 밀도에 도달할 때까지 증식된다. 이어서, 증식된 씨드 배양물을 동물-유래 성분을 결핍하는 배양 배지를 함유하는 대규모의 배양 용기에 옮기고 적어도 정해진 세포 밀도가 도달될 때까지 증식시킨다. 이 단계에서, 세포는 현탁상태로 성장시켜 정해진 값 또는 임계값으로 증가하도록 배양 용기 내의 세포 수를 허용한다. 배지 교환은 신선한 배지로 배양 용기를 계속하여 관류시킴으로써 수행된다.

관류된 배지의 양은 세포 밀도에 의존하며, 전형적으로 1일 당(24 시간) 탱크 부피의 10-95%, 바람직하게는 25% 내지 80%일 수 있다. 세포 밀도가 생산 단계의 개시를 위해 적당한 값에 도달할 때, 탱크에서 탱크 배지의 60-95%를, 예를 들어, 약 80%를 전형적으로 24시간 마다 바꾼다. 80% 배지 교환은 또한 생산 단계에서 바람직하게 사용된다.

단순 배치 공정에서는, 세포를 동물-유래 성분을 결핍하는 배양 배지를 함유하는 씨드 배양 용기에 접종하고 세포가 최소 크로스-씨딩 밀도에 도달할 때까지 증식된다. 이어서, 증식된 씨드 배양물을 동물-유래 성분을 결핍하는 배양 배지를 함유하는 대규모 배양 용기에 옮긴다.

이와 같은 배치 공정은 탱크에 농축된 영양 용액을 공급함으로써 연장될 수 있다. 이는 공정 시간을 연장하며, 궁극적으로 배양 용기에서 FVII 생산의 증가를 이끈다. 수확 시기는 탱크의 가장 긴 가능한 조작과 세포 용해의 위험 사이의 균형으로서 결정되어야 한다.

단순 회수-충전 공정은 반복된 배치 발효와 상당히 비슷하다. 배치 발효에서, 세포는 배양 용기에서 성장하고 배지는 실행의 마지막에 수확된다. 회수-충전 공정에서, 배양 용기는 어떤 영양분도 고갈되기 전에 수확된다. 용기로부터 모든 내용물을 제거하는 대신에, 단지 탱크 부피의 부분을 제거한다(전형적으로 탱크 부피의 80%). 수확 후, 동일한 부피의 신선한 배지를 용기에 다시 첨가한다. 세포를 그 후 용기에서 한 번 더 성장시키고 또다시 80% 수확을 정해진 일 수 후에 취한다. 반복된 배치 공정에서, 수확 후 용기에 남은 세포들은 다음 배치를 위한 접종물로서 사용될 수 있다.

회수-충전 공정은 2단계로 조작된다. 본 공정의 제 1 단계는 단순 배치 공정과 동일하게 조작된다. 제 1 수확 후, 배양 용기는 다시 단순 배치 공정으로서 조작되지만; 그러나, 배치의 길이는 더 높은 초기 세포 밀도 때문에 제 1 배치보다 더 짧다. 이들 짧은 '반복된 배치 단계'는 한정없이 계속된다.

유가식 회수-충전은 유가식 공정에서 제안된 유형과 유사한 농축된 공급에 의한 회수-충전 발효이다. 단순 회수-충전 공정에 관한 염려는 첨가된 신선한 배지는 반복된 배치 발효보다 세포를 지탱하기에 충분하지 않을 수도 있다는 점이다. 공급의 포함은 이런 걱정을 제거한다. 공급은 또한 회수-충전 공정에서 긴 배치 시간으로 배양물 용기를 조작하는 것을 허용할 것이다.

배양 용기는 광대한 범위의 주기 횟수 및 광대한 범위의 회수-충전 부피내에서 조작될 수 있다. 범위 및 바람직한 값은 하기 표 1에서 볼 수 있다.

증식 단계가 다단계 과정인 공정에서, 최종 배양 용기에 들어가기 위해 충분한 수의 세포들이 얻어질 때까지 증식은 점진적으로 증가하는 크기의 배양물 용기에서 일어날 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 5 L, 50 L, 100 L 또는 500 L의 하나 이상의 씨드 배양물 용기가 순차적으로 사용될 수 있다. 씨드 배양물 용기는 전형적으로 5 L 내지 1000 L의 용량을 가진다. 전형적으로, 세포는 약 0.2 내지 0.4 x 10⁶ 세포/mL의 초기 밀도에서 씨드 배양 용기에 접종하고, 약 1.0 x 10⁶ 세포/mL의 세포 밀도에 도달할 때까지 증식시킨다. 전형적으로, 최소 크로스-씨딩 밀도는 약 0.8 내지 약 1.5 x 10⁶ 세포/mL 사이이다.

인자 VIII의 생산에 적당한 세트 포인트의 어떤 것은 씨드 배양물이나 아니면 마이크로담체에서 세포의 초기 성장에 반드시 적당한 것은 아니다. 예를 들어, 온도, 용존 산소 분압, 및/또는 pH는 두 단계에에 대해 다를 수 있다. 증식 동안 배지 교환은 하류 처리를 위해 배양 상청액을 수확하기 위해서가 아니라 세포가 생존하고 성장하도록 유지시키기 위해 행해진다.

선택적으로, 배양의 온도 세트 포인트의 하강은 생산 단계에 들어갈 때 및 생산 단계 동안 사용될 수 있다. 게다가, 생산 단계에 들어갈 때, 온도, 조작 pH 및 배지 교환 빈도는 전형적으로 생산을 위한 최적의 값으로 바뀐다.

마이크로담체

본원에 사용된 바와 같은, 마이크로담체는 현탁 배양물에서 사용되기에 충분히 작은 입자이다(세포에 대한 상당한 전단 손상을 야기하지 않는 교반속도로). 그것들은 고체이며, 다공성이고, 또는 표면에 다공성 코팅을 갖는 고체 코어를 가진다. 마이크로담체는, 예를 들어, 제한 없이, 셀룰로오스- 또는 덱스트란계이며, 그것의 표면(다공성 담체의 경우에 외부 및 내부 표면)은 양으로 하전될 수 있다. 추가 상세한 것은 WO 02/29083 및 "Microcarrier cell culture, principles and methods. Amersham Pharmacia Biotech. 18-1140-62. Edition AA"에서 찾을 수 있다.

유용한 고체 마이크로담체는, 제한 없이, Cytodex 1™ 및 Cytodex 2™ (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway NJ)를 포함한다. 고체 담체는 부착 세포에 특히 적당하다(앵커리지 의존 세포). 유용한 대공성 담체는, 제한 없이, Cytopore 1™ 및 Cytopore 2™(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway NJ)를 포함한다. 230 um의 평균 입자 직경, 30 um의 평균 기공 크기, 및 1.1 meq/g의 양전하 밀도를 가지는 Cytopore 1™담체가 특히 바람직하다.

대규모 배양 조건

본 발명은 대규모 생산에 특히 적합하다. 용어 "대규모 생산"은 적어도 100L의 배양 용기를 수반하는 생산을 의미한다. 그러나 바람직한 구체예에서, 규모는 전형적으로 적어도 250L, 예로써, 적어도 500L, 예를 들어, 적어도 1000L 또는 심지어 5000 L 이상이다. 용어 "대규모"는 "산업적-규모" 및 "생산-규모"과 서로 바꾸어서 사용될 수 있다.

폴리펩티드의 대규모 생산을 위한 방법은 적어도 120시간, 예를 들어, 1-26주의 기간에 걸쳐 전형적으로 행해진다.

세포 배양 공정이 하나 이상의 씨드 배양 용기(들)(제 1 증식 단계(들))와 같은 적어도 2개의 분리된 배양 용기와 이어서 생산 배양 용기(최종 증식 단계 후 생산 단계)에서 조작되는 경우, 공정은 전형적으로 약 50L의 증식된 씨드 배양(약 1.0 x 10⁶ 세포/mL를 가짐)을 150L의 세포 배양 배지를 함유하는 500L 배양 용기에 옮기는 것을 수반한다. 대규모 배양은, 예를 들어, 온도, pH, 용존 산소 분압(DOT), 및 교반속도의 적절한 조건하에서 유지되며, 부피는 배양 용기에 배지를 첨가함으로써 점진적으로 증가된다. 마이크로담체 공정의 경우에, 배양 용기는 또한 1 내지 10 g/L의 범위에서 최종 마이크로담체 농도에 해당하는 마이크로담체의 양을 포함한다. 옮긴 후, 세포는 전형적으로 처음 24시간 내에 담체의 표면 또는 담체의 내부로 이동한다.

배양 용기

본 발명에서 적용가능한 배양 용기는, 예를 들어, 통상적인 임펠러 종류에 의해 교반이 얻어지는 통상적인 교반탱크반응기(CSTR) 또는 용기의 바닥으로부터 공기를 도입함으로써 교반이 얻어지는 에어리프트 반응기를 기반으로 할 수 있다. 명시적 한계 내에서 전형적으로 조절되는 추가 변수들 중에는 pH, 용존 산소 분압(DOT), 용존 CO₂의 농도 및 온도가 있다. 용존 산소 분압은 예를 들면, 순수한 산소 분사에 의해 유지될 수 있다. 용존 CO₂의 농도는 공기 분사에 의해 유지될 수 있다. 온도-조절 배지는 전형적으로 물이며, 필요에 따라 가열 또는 냉각된다. 물은 용기를 둘러싸는 재킷을 통해 또는 배양물에 담그어진 파이핑 코일을 통해 통과시킬 수 있다.

용어 "배양 용기"는 "탱크", "반응기", "발효조" 및 "바이오리액터"와 서로 바꾸어 사용될 수 있다.

단계 b) - 발현된 폴리펩티드의 분리

이 단계 b)에서, 인자 VIII 폴리펩티드는 적절한 수단에 의해 포유동물 세포로부터 분리될 것이다. 전형적인 구체예에서, 세포는 배지로부터 제거될 수 있고 배지는 1.0 μm 및 0.2 μm 필터를 통한 수확물의 순차적 여과에 의해 정화될 수 있다.

배지(세포 배양물 상청액)중의 인자 VIII는 이후에 유리하게는 인자 VIII이 풍부한 분획들을 모으는 양이온-교환 크로마토그래피에 의해 농도를 높일 수 있다. 인자 VIII 폴리펩티드는 그 후 항-인자 VIII 항체 컬럼에 결합시킨 후(예를 들어, F25 항체 컬럼, 예를 들어, WO 95/13301 및/또는 Nordfang et al. 1995 (Thromb. Haemostas. 54:586-590) 참조) 인자 VIII 폴리펩티드 활성을 보존하는 조건하에서 용리함으로써 정제될 수 있다. 더 이상의 불순물은 겔-여과에 의한 완충제 교환에 의해 제거될 수 있다.

본 발명의 제 2 양태에 따라서, 그리고 또한 본 발명의 제 1 양태에 관해서도 유용하게는, C2-도메인 리간드는 세포로부터 인자 VIII 폴리펩티드의 분리를 촉진시키기 위해 첨가되며, 즉, C2-도메인 리간드(예를 들어, OPLS)는 세포-결합 인자 VIII 폴리펩티드를 유리시키기 위해 첨가된다.

본 발명의 구체적 특징은 인자 VIII 폴리펩티드가 포유동물 세포의 불활성화 또는 파괴 없이 세포로부터 분리될 수 있다는 점이다. 따라서, 특정 구체예에서, 발현된 인자 VIII 폴리펩티드는 실질적으로 세포의 생존능력의 감소 없이 세포 배양 배지로부터 수확된다. 게다가, 생산이 동일 배치의 세포를 사용하여 계속될 수 있다면 유리하다.

일단 인자 VIII 폴리펩티드를 함유하는 배지가 세포로부터 분리되면, 제한 없이, 친화도 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피; 이온-교환 크로마토그래피; 크기 배제 크로마토그래피; 전기영동 처리(예를 들어, 분취 등전 집속 (IEF)), 차별 용해도(예를 들어, 황산암모늄 침전), 또는 추출 등을 포함하는 요망되는 단백질을 정제하기 위한 하나 이상의 공정 단계를 받게할 수 있다. 일반적으로, Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; 및 Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 참조.

인자 VIII 폴리펩티드의 정제는 특히 항-인자 VIII 항체 컬럼에서 친화도 크로마토그래피 및 단백질 가수분해에 의한 활성화를 수반할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명의 비-제한적 예시로서 의도된다.

재료 및 방법

셀 라인: 트랜스펙션을 위해 사용된 셀 라인, dhfr-CHO 세포 DUKX-B11 세포 (Urlaub, G. & Chasin, L. A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220)를 리보뉴클레오시드 및 데옥시리보뉴클레오시드를 보충한 무혈청 배지를 사용하여 배양물에서 성장하도록 적응시켰다.

발현 벡터: 인자 VIII 전사는 아데노바이러스-SV40 프로모터 및 디-히드로폴레이트 환원효소 선택 마커에 의한 선택을 사용하여 달성된다. 발현된 인자 VIII 분자는 B-도메인으로부터 유도된 소형 링커로 연결된 인자 VIII의 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)로 구성된다. B-도메인을 제거하였는데, 이것은 인자 VIII의 더 높은 발현을 허용하며, 인자 VIII의 생물학적 활성을 보유하게하기 때문이다.

트랜스펙션 : β-락타마아제 유전자를 플라스미드 #815 F8-500B-pTSV7로부터 제한 효소에 의한 분해로써 제거하였고, 인자 VIII 유전자를 함유하는 결과된 단편을 겔링제하고 FuGENE 6(Roche)을 사용하여 CHO DUKX-B11 세포의 트랜스펙션을 위해 사용하였다. 트랜스펙션을 리보뉴클레오시드 및 데옥시리보뉴클레오시드 10% 투석 FBS를 보충한 α-MEM 배지 (Gibco)에서 6-웰 플레이트에서 수행하였다. 트랜스펙션 후 2일 후, 세포를 리보뉴클레오시드 및 데옥시리보뉴클레오시드는 없지만 10% 투석 FBS는 있는 α-MEM 배지(Gibco)에 TC80 플라스크에 옮겼다. 15일 동안 살아남은 트랜스펙턴트의 선택 후 MTX에 의한 단계적 증폭을 시작하였다. 세포를 1000 nM MTX까지 증폭시켰고 이 과정 동안 몇 번의 서브-클로닝을 수행하였다.

SF 적응 및 세포 배양 : 세포를 SF 배지 중의 FBS의 농도를 단계적으로 감소시킴으로써 무혈청 배지에서 성장에 적응시켰하였다. 세포를 125mL 쉐이커 플라스크에서 적응 및 유지시켰다.

무혈청 배지 보충 실험 동안 세포 배양: 배지 보충 실험을 위해 세포를 하기 기술하는 바와 같이, 35℃에서 벤티드 캡을 가지는 50 mL 쉐이커 튜브에서 높은 세 포 밀도 관류 모델에서 배양하였다. 세포를 37℃에서 큰 쉐이커 플라스크에서 배양하였다. 세포 생존능력을 세포 수확시 측정하였고, 이는 항상 > 95%이었다. 수확한 세포를 신선한 배지에 재현탁하였다. 2.5 mL의 수확 및 재현탁한 세포를 보충물을 함유하는 2.5mL의 신선한 배지에 첨가하여 1 x 10⁷ 세포/mL 농도로 총 5mL의 부피를 제공하였다. 쉐이커 튜브를 이후에 35℃ 및 250 rpm에서 쉐이커에 두었다. 24 시간 후, 샘플을 세포 밀도, 생존능력, CoA, ELISA 및 웨스턴 블롯에 의한 인자 VIII 단백질 일체성을 분석하였다.

세포 생존능력: 예를 들어, Mammalian Cell Culture; essential techniques, 1997 (Wiley) Editors: A. Doyle and J. Bryan Griffiths (예를 들어, 프로토콜 13 및 14 참조)에서 기술되는 바와 같이 세포 배양물의 생존능력을 측정하였다.

CoA 분석 (인자 VIII 활성 분석): 칼슘 및 인지질의 존재하에서, 인자 X는 인자 IXa에 의해 인자 Xa로 활성화된다. 이 발생은 이 반응에서 보조인자로서 생각될 수 있는 인자 VIII에 의해 크게 자극된다. Ca² ⁺ 및 인지질의 최적량 및 인자 IXa 및 X의 과량을 사용함으로써, 인자 X의 활성화 속도는 단지 인자 VIII의 양에 의존한다. 인자 Xa는 발색성 기질 S-2765를 가수분해하여 발색성 기, pNA를 유리시킨다. 색은 이후에 405nm에서 광도측정으로 판독한다. 발생된 인자 Xa 및 색상의 강도는 샘플이 제제가 인자 VIII 활성과 비례한다. 형성된 트롬빈에 의한 S-2765의 가수분해는 기질과 함께 합성 트롬빈 억제제, I-2581의 첨가에 의해 방지된다 (Chromogenix Coatest SP Factor VIII, diaPharma).

인자 VIII 활성을 위한 다른 시험: 인자 VIII 활성을 검출하기 위한 추가의 적당한 분석이, 예를 들어, Kirkwood TBL, Rizza CR, Snape TJ, Rhymes IL, Austen DEG, Identification of sources of interlaboratory variation in factor VIII assay. B J Haematol 1981; 37; 559-68.; 또는 Kessels et al., British Journal of Haematology, Vol. 76 (Suppl.l) pp. 16 (1990))에 기술되는 바와 같이 단순 시험관 내 시험으로서 수행될 수 있다. 인자 VIII 생물학적 활성은 또한 예를 들어, Nilsson et al., 1959.(Nilsson IM, Blombaeck M, Thilen A, von Francken I., Carriers of haemophilia A - A laboratory study, Acta Med Scan 1959; 165:357)에서 기술되는 바와 같이 제제가 인자 VIII-결핍 혈장의 응고 시간을 교정하는 능력을 측정함으로써 정량화될 수 있다. 이 분석에서, 생물학적 활성은 단위/ml 혈장으로서 표현된다(1 단위는 정상의 모은 혈장에서 존재하는 FVIII의 양에 해당한다).

ELISA : 스트립 웰을 인간 인자 VIII에 대한 양 다클론성 항체로 미리 코팅한다. 샘플을 희석하고 웰에 적용한다. 존재하는 인자 VIII 항원은 코팅된 항체에 결합한다. 미결합 물질을 세척하여 제거한 후, 페록시다아제-표지된 양(sheep) 검출 항체를 적용하고 포획한 인자 VIII에 결합하게한다. 웰을 다시 세척하고 TMB(페록시다아제 기질 테트라메틸벤지딘)의 용액을 적용하고 고정된 시간의 기간 동안 반응시킨다. 푸른 색이 전개되고 산에 의해 반응을 퀀칭 시 황색으로 변한다. 형성된 색을 마이크로플레이트 판독기에서 450nm에서 분광측광으로 검정한다. 450nm에서 흡광도는 웰에서 포획된 인자 VIII 항원의 양에 직접적으로 비례한다(VisuLize, FVIII antigen kit, Affinity biologicals). 분석은 정제된 B 도메인 결핍 인자 VIII을 사용하여 검정한다.

F25 ELISA : ELISA : 스트립 웰을 인간 인자 VIII에 대한 양 다클론성 항체로 사전 코팅한다. 샘플을 희석하고 웰에 적용한다. 존재하는 인자 VIII 항원은 코팅된 항체에 결합한다. 미결합 물질을 세척하여 제거한 후, 인자 VIII 중쇄의 C-말단을 인식하는 희석된 F25 마우스 단클론성 항-인자 VIII 항체를 적용하고 포획된 인자 VIII에 결합하게 한다. 웰을 다시 세척하고, 희석한 페록시다아제-표지된 염소 항-마우스 IgG(DAKO)를 적용하고 포획한 F25 항체에 결합시킨다. 웰을 다시 세척하고 TMB(페록시다아제 기질 테트라메틸벤지딘)의 용액을 적용하고 고정된 시간의 기간 동안 반응시킨다. 푸른 색이 전개되고 이것은 산에 의해 반응을 퀀칭 시 황색으로 변한다. 형성된 색을 마이크로플레이트 판독기에서 450nm에서 분광측광으로 검정한다. 450nm에서 흡광도는 웰에 포획된 인자 VIII 항원의 양에 직접 비례한다. 분석은 F25 항체로 정제된 친화도를 가지는 중쇄 인자 VIII의 하우스 표준을 사용하여 검정한다.

(F25 항체: 예를 들어, WO 95/13301 및/또는 Nordfang et al. 1995 (Thromb. Haemostas. 54:586-590 참조).

실시예 1: 인자 VIII 을 생산하는 세포의 무혈청 세포 배양 배지에 OPLS 를 보충

OPLS를 재료 및 방법하에서 기술된 실험의 상세 내용에 따라서 표시된 농도로 무혈청 세포 배양 배지에 보충하였다. 결과를 하기 표 3 및 도 2A 및 도 2B에서 볼 수 있다.

결론:

OPLS의 첨가는 인자 VIII 생산 세포의 특이적 생산성을 증가시키고(도 2A 참조) OPLS의 첨가는 인자 VIII의 비활성을 증가시킨다(도 2B 참조).

실시예 2: 인자 VIII 의 무혈청 세포 배양 배지에 O- 포스포 -L-세린 및/또는 식물 가수분해물을 보충

BDD 인자 VIII 생산 세포(1C5-SF 셀 라인)를 필터 캡을 가지는 50mL 튜브(필터 튜브 50 바이오리액터, TPP)에서 배양하였다. 5 mL CDM4CHO 배지 중에서 2.5 X 10⁶ 세포를 표 4에서 나타내는 바와 같이 20mM의 농도로 O-포스포-L-세린 및/또는 5 mg/ml의 농도로 식물 가수분해물로 보충하였다. 각 조건을 4개의 5mL 배양물에서 시험하였다. 배양물을 진탕 인큐베이터에서 배양하였다(37 ℃, 8 % CO₂ 및 250 rpm). 씨딩 후 4일 후, 1.2 mL의 각각의 배양물을 5분 동안 2000 × g 원심분리하였고, 세포 펠렛을 버렸다. 상청액을 pH 7.2의 이미다졸을 20mM의 최종 농도로 그리고 Tween 80을 0.02%의 최종농도로 첨가하여 안정화시켰고 -80℃에서 0.2mL의 알리쿼트들을 냉동시켰다.

각 배양물의 총 인자 VIII 항원 함량을 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. 안정화시키고 냉동시킨 배지의 알리쿼트들을 해동시키고 재료 및 방법에서 기술한 바와 같이 분석하였다. 무손상 중쇄 C-말단을 가지는 인자 VIII을 선택적으로 결합하는 F25 항체에 의해 인식되는 인자 VIII의 함량을 측정하였다. 안정화되고 냉동된 배지의 알리쿼트들을 해동시키고 재료 및 방법에서 기술한 바와 같이 F25 ELISA로 분석하였다.

활성 시험을 위해, 안정화시키고 냉동시킨 배지의 알리쿼트들을 해동시키고 재료 및 방법에서 기술한 바와 같이 CoA 분석으로 분석하였다.

각 배양물의 배지에서 인자 VIII의 품질을 활성 및 총 인자 VIII 항원 함량으로부터 계산한 비활성으로 평가하였다. 무손상 중쇄 C-말단을 가지는 인자 VIII의 비율을 F25 ELISA로 검출된 인자 VIII 항원의 양과 총 인자 VIII 항원 양 사이의 관계로부터 평가하였다.

두 보충물로 얻은 결과를 도 3A-C에 나타낸다. 이들 데이터는 O-포스포-L-세린 또는 인자 VIII 생산 세포의 배양물에 대한 식물 가수분해물 중 하나를 첨가하는 것의 유리한 효과를 증명한다. 보충물은 둘 다 세포 배양물로부터 재조합 인자 VIII의 수율 및 품질을 개선하였고, 첨가물은 둘 다 배지에서 무손상 중쇄 C-말단을 가지는 인자 VIII의 비율을 증가시켰다. 게다가, 무손상 중쇄 C-말단을 가지는 인자 VIII의 비율에 대한 부가적인 유리한 효과가 O-포스포-L-세린과 식물 가수분해물을 조합하여 사용할 때 나타났다.

SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> IMPROVEMENT OF FACTOR VIII POLYPEPTIDE TITERS IN CELL CULTURES <130> 7605.000-EP <160> 1 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 4416 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> FVIII cDNA <400> 1 atggaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60 accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120 ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180 acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240 gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300 gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360 ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420 gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480 aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540 gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600 gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact 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Claims

a) 인자 VIII 폴리펩티드의 발현을 위한 조건하에서 인자 VIII 폴리펩티드를 발현하는 포유동물 세포를 배양하는 단계로서, 배양 조건이 C2-도메인 리간드를 포함하는 세포 배양 배지를 수반하는 단계, b) 포유동물 세포로부터 발현된 인자 VIII 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함하며, 여기서 C2-도메인 리간드는 O-포스포-L-세린(OPLS)인, 인자 VIII 폴리펩티드의 생산 방법.
a) 인자 VIII 폴리펩티드의 발현을 위한 조건하에서 인자 VIII 폴리펩티드를 발현하는 포유동물 세포를 배양하는 단계로서, 배양 조건이 세포 배양 배지를 수반하는 단계, b) 포유동물 세포로부터 발현된 인자 VIII 폴리펩티드를 분리하는 단계로서, 분리 단계가 상기 세포에 C2-도메인 리간드를 첨가하는 것을 포함하는 단계를 포함하며, 여기서 C2-도메인 리간드는 O-포스포-L-세린(OPLS)인, 인자 VIII 폴리펩티드의 생산 방법.
삭제
제1 항 또는 제2 항에 있어서, C2-도메인 리간드는 0.1-100 mM의 농도로 세포 배양 배지에서 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, C2-도메인 리간드는 1-200mM의 농도로 단계 b)에서 세포에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, 세포 배양 배지는 대두 트립신 억제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, 세포 배양 배지는 식물 단백질 가수분해물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, 포유동물 세포는 인자 VIII 폴리펩티드를 내인성으로 발현하는 포유동물 세포 및 인자 VIII 폴리펩티드를 위한 유전자로 트랜스펙션된 포유동물 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, 포유동물 세포는 인자 VIII 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 그것에 작동가능하게 연결되는 발현 조절 영역을 포함하는 발현 벡터로 트랜스펙션되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, 세포 배양 배지는 무혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, 발현된 인자 VIII 폴리펩티드는 세포의 생존능력의 감소 없이 세포 배양 배지로부터 수확되는 것을 특징으로 하는 방법.
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