MX2013007551A - Metodo y sistema para suspension de cultivo celular. - Google Patents

Abstract

Se describe un sistema y método para adaptar células hospedadoras a un cultivo celular en suspensión y a una línea celular en suspensión producidas de esta manera. EL método incluye el volver a sembrar en placa de modo en serie células de cultivo sustancialmente no diluidas sobre un área de superficie hasta que se visualizan hacinamientos de células y después, ante el hacinamiento de células, mover las células a un sistema de cultivo en suspensión.

Description

METODO Y SISTEMA PARA SUSPENSION DE CULTIVO CELULAR ANTECEDENTES DE LA INVENCION La elaboración de sustancias biofarmacéuticas basadas en proteína recombinante es una empresa compleja que requiere trabajo y capital. Actualmente se utilizan células de mamífero para la producción de la mayor parte de las proteínas humanas. Las células de mamífero habitualmente contienen modificaciones post-traduccionales extensas que no pueden realizarse por procariotas no modificadas o eucariotas de una sola célula no modificadas . Aunque las células de mamífero tales como las células de ovario de hámster Chino y células de riñon de hámster bebé pueden biosintetizar fielmente la mayor parte de las proteínas humanas, su eficiencia es notoriamente menor que la que se obtiene por células bacterianas o de levadura.

De las proteínas recombinantes comercializadas actualmente, fVIII se fabrica con la menor eficiencia y es por mucho la más costosa en una base por unidad de masa (figura 1). El factor fVIII recombinante es la opción de tratamiento principal para personas con trastorno de hemorragia congénita relacionada a X, hemofilia A. El tratamiento consiste de 2 a 3 infusiones intravenosas a la semana de fVIII recombinante a un costo de aproximadamente $100, 000 - $300,000 al año (Bonn RL, Avorn J, Glynn RJ, REF: 241583 Choodnovskiy I, Haschemeyer R. Aledort LM. Prophylactic use of factor VIII: an economic evaluation Thromb Haemost. 1998; 79 (5) : 932-7, incorporado en la presente en su totalidad) .

En consecuencia, el acceso al tratamiento es limitado a menos de un tercio de personas con hemofilia A en todo el mundo. Históricamente, el suministro de fVIII ha sido inadecuado y el precio ha permanecido muy elevado debido a los altos costos de investigación, desarrollo y manufactura. Una estrategia por mejorar el cuidado de hemofilia A, así como otras enfermedades monogénicas que pueden ser tratadas por tratamiento por sustitución dé proteínas es desarrollar métodos más eficientes para la elaboración de proteínas recombinantes .

Los productos de h-fVIII recombinantes más actuales habitualmente se producen por células de mamífero, por ejemplo células BHK-21 o de ovario de hámster Chino en biorreactores de fermentación a gran escala. Se pueden utilizar diversas técnicas para maximizar la producción de h-fVIII recombinante que incluyen: (1) amplificación del transgen h-fVIII utilizando selección con DHFR/metotrexato, (2) adición de agentes estabilizantes de fVIII al medio de cultivo (por ejemplo albúmina bovina/humana o coexpresión de vWf ) , y (3) maximizar el crecimiento/densidad celulares por fermentación y perfusión continua. Se puede purificar fVIII a partir de un medio de cultivo acondicionado utilizando una serie de etapas de filtración, en una afinidad, exclusión de tamaño y cromatografía de intercambio iónico. Con frecuencia se incorporan procedimientos de inactivación viral en el procedimiento de purificación para seguridad adicional. Una vez purificado, la materia prima fVIII se puede formular con agentes estabilizantes y se puede liofilizar antes de su empacado. El proceso de manufactura estándar que revisa el Boedeker BG. Production processes of licensed recombinant factor VIII preparations . Semin Thromb Hemost. 2001; 27(4) :385-94, incorporado en la presente como referencia en su totalidad.

Los productos de primera generación de fVIII recombinante se estabilizaron utilizando albúmina sérica humana que teóricamente puede albergar contaminantes virales. Para reducir el riesgo de contaminantes virales, los productos de fVIII de la segunda y tercera generación han surgido y se les ha considerado "libres de productos animales" y en vez de esto se han estabilizado con sacarosa u otros aditivos. Debido al perfil de seguridad mejorado percibido de los productos recombinantes de la generación más nueva con respecto a los productos derivados de plasma o de la primera generación, muchos pacientes tratados previamente y la mayor parte de los pacientes no tratados previamente se han desplazado a los productos de fVIII de la segunda y tercera generación. Esta demanda ha creado atajos de productos fVIII múltiples y ha llevado a la implementación de estrategias para racionar temporalmente los suministros de fVIII (Garber K. rFactor VIII déficit questioned. NatBiotechnol . 2000 ; 18 (11) : 1133 , incorporado en la presente como referencia) .

Diversas publicaciones han establecido que el nivel estándar de producción de fVIII humano recombinante es <1 unidad/106 células/día (Kaufman RJ, Pipe S , Tagliavacca L. Swaroop M. Moussalli M. Biosynthesis , assembly and secretion of coagulation factor vin. Blood CoagulFibrinolysis . 1997,8 Suppl 2 : S3 - 1 : 53 - 14 , incorporada en la presente como referencia) . Habitualmente, el producto final de fVIII humano recombinante tiene una actividad específica entre 4,000 y 10,000 unidades por miligramo de proteína y el costo de un tratamiento único para un adulto de 70 kg es $2 , 500-$5 , 000. Actualmente, los productos de fVIII representan un mercado anual de 6 a 8 miles de millones de dólares pese al hecho de que la distribución está limitada a menos de un tercio del mercado mundial potencial.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 es una representación gráfica del panomara actual en la fabricación biofarmacéutica : la figura 2 muestra la conversión de células BHK-M en células BHK-MS. Las células BHK-M se adaptan a suspensión utilizando un método pendiente de patente que involucra volver a sembrar en placa de manera seriada células BHK-M adherentes; la figura 3 muestra la expresión de fVIII recombinante a partir de células BHK-Ms en medio libre de suero ; las figuras 4a-4f muestran la conversión a suspensión de células HEK-293T adherentes; la figura 5 es un diagrama de flujo que muestra evidencia de el alto nivel de expresión de fVIII a partir de células adaptadas a suspensión¡ la figura 6 es una gráfica que muestra los resultados de un procedimiento de alimentación optimizado; la figura 7 es una gráfica que caracteriza un clon adicional adaptado a suspensión utilizando los métodos que aquí se describen; la figura 8 es una gráfica de densidad y disponibilidad en un clon adicional adaptado para suspensión utilizando los métodos que aquí se describen; la figura 9 es una gráfica de actividad de fVIII versus densidad de un clon adaptado para suspensión utilizando los métodos que aquí se describen; la figura 10 es una imagen de una célula productora de virus GFP, transfectada con GFP, adaptada para suspensión utilizando los métodos que aquí se describen; y la figura 11 compara la producción de fVIII recombinante a partir de plataformas de cultivo BHK-M (adherente) y BHK-Ms (en suspensión) .

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Se describe un método novedoso de adaptación a líneas de células de mamífero a cultivos de células en suspensión que previamente estaba limitado a sistemas de cultivo de producción adherentes, por ejemplo, pero sin limitarse a botellas giratorias. También se describen líneas de células novedosas denominadas como BKH-Ms 310, BHK-Ms-P14 y SC-293T que presentan producción aumentada (en comparación con sistemas y métodos conocidos) en cultivo celular de proteínas recombinantes . Además, se describe un método y línea celular novedosos para suspensión de producción de virus celular. Los métodos, sistemas y líneas de células que aquí se describen son todos adaptables y están adaptados a ambientes de cultivo en suspensión libre de suero y libre de proteínas sanguíneas.

La novedad e importancia del descubrimiento no puede ser subestimada. Existen muchas sustancias bioterapéuticas fundamentales para la salud y el bienestar de humanos (y animales) que no están disponibles o que presentan un suministro abrumadoramente limitado debido a las profundas y aparentemente irresolubles dificultades de manufactura. La línea celular óptima para producir estas proteínas en algunos casos se puede limitar a producción en células adherentes . La producción en células adherentes es menos eficiente, menos ampliable y de otra manera menos deseable para biomanufactura comercial a gran escala en comparación con otros métodos, por ejemplo pero sin limitarse a un cultivo celular en suspensión. Por lo tanto, es una mejora significativa la capacidad de adaptar a un cultivo en células en suspensión a líneas de células que tradicionalmente son adherentes (por ejemplo, pero sin limitarse a líneas de células adherentes previamente resistentes a adaptación por métodos conocidos) . Además, el método y sistema descrito también es un método alternativo novedoso respecto a los métodos utilizados anteriormente y con éxito para adaptar células adherentes a cultivo en células de suspensión.

El fVIII humano recombinante es un ejemplo de una sustancia bioterapéutica que es notablemente difícil de fabricar.

Los productos de fVIII humano recombinantes comercializados actualmente se producen comercialmente en niveles 100-1000 veces menores que otras sustancias bioterapéuticas recombinantes tales como, pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales . El bajo rendimiento de expresión de fVIII tiene una fuerte influencia sobre el precio del producto y la disponibilidad. De hecho, el fVIII recombinante tiene el punto de precio más alto y el volumen de producción anual más bajo de cualquier sustancia biofarmacéutica principal a un precio en farmacia de $10,000,000 por gramo y un volumen de producción total mundial anual de menos de 0.5 kilogramos.

Una consecuencia de la baja eficiencia de expresión de fVIII es que menos de un tercio de las personas con hemofilia A en todo el mundo tienen acceso a fVIII. Para aquellos excluidos del tratamiento, la hemofilia A representa una enfermedad mortal con una mediana de mortalidad en los años de adolescencia.

Para superar las dificultades de manufactura presentadas por sustancias biofarmacéuticas tales como fVIII se pueden optimizar elementos de sistema de manufactura -por ejemplo, pero si limitarse a- la construcción, el vector de expresión, la línea celular, las condiciones de cultivo celular y etc. Para ilustrar, se ha caracterizado y patentado una construcción de fVIII recombinante novedosa que es biosintetizada más eficientemente que fVIII humana en una base por célula (véase la patente de E.U.A. número 7,635,763 (incorporada en la presente como referencia en su totalidad, véase también Spencer HT, Denning G. Gautney RE, Dropulic B, Roy AJ, Baranyi L, et al., Lentiviral Vector Platform for Production of Bióengineered Recombinant Coagulation Factor VIII. Mol Ther. 2010, la cual se incorpora en la presente en su totalidad) . En nuestros experimentos de prueba de concepto que aquí se describen, se refiere a la molécula fVIII recorabinante utilizada como ET-801. ET-801 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 93% idéntica a la SEC ID NO: 19 de la patente de E.U.A. número 7,635,763.

Regresando a la línea celular, se ha encontrado que la línea celular BHK-M puede producir otras líneas de células de mamífero utilizadas comúnmente, por ejemplo la línea celular de ovario de hámster Chino DG44 o las líneas de células BKH-21, para la producción de fVIII recombinante que incluyen, pero que no se limitan a ET-801. No obstante, BHK-M se deriva de una línea celular originales (ATCC PTA-4506) que es permisiva únicamente a través de crecimiento bajo condiciones adherentes . Como se describe en la presente, la adaptación de células BHK-M a cultivos de células en suspensión puede incrementar su eficiencia de producción, capacidad de ampliación y utilidad en procesos de biomanufactura a gran escala.

En la presente se describe un método de adaptación de una línea celular adherentes a una plataforma de biomanufactura basada en células en suspensión para sustancias bioterapéuticas la cual puede ser una sustancia bioterapéutica sencilla o compleja. También se describe un método y sistema optimizado para producir altos rendimientos (en comparación con los sistemas conocidos actualmente) de sustancias bioterapéuticas complejas; producción aumentada (en comparación con los sistemas conocidos actualmente) de proteínas recombinantes en cultivo celular en suspensión; y producción de virus en cultivo celular en suspensión. De manera adicional se describe una línea celular para producción de alto rendimiento de productos y virus.

El sistema y método novedosos que aquí se describen han mostrado un desempeño extraordinario con respecto a los sistemas conocidos, como se demuestra por los datos que se presentan. Por ejemplo, se demuestra que este sistema, método y línea celular supera, la producción de los métodos de manufactura conocidos actualmente por un grado sorprendente y extraordinario el cual puede ser de por lo menos 5% y hasta de 1000% mayor que los métodos conocidos.

Aunque los ejemplos demuestran que el sistema y método novedoso aumenta y puede aumentar adicionalmente la capacidad de manufactura y la capacidad de crecimiento de fVIII, es evidente (a partir de la demostración con GFP) que el método, sistema y línea celular novedoso también se puede aplicar para incrementar el rendimiento, capacidad de manufactura y capacidad de crecimiento de otras proteínas. Se anticipa que esta plataforma será utilizada y podrá ser utilizada por los solicitantes y otros para la fabricación de sustancias biof rmacéuticas recombinantes alternativas, por ejemplo, pero sin limitarse a los factores de coagulación IX y Vlla.

Además, aunque aquí en la presente se demuestra una aplicación exitosa del método con una línea celular derivadas de riñon de hámster bebé (BHK-M, por sus siglas en inglés) (denominada en la presente como BKH-Ms) y una línea celular HEK-293T, el método y sistema novedoso también se puede aplicar para aumentar el rendimiento, la capacidad de manufactura y la capacidad de crecimiento de otras líneas de células (que previamente hayan o no sido susceptibles de cultivo en suspensión) . El método y sistema que se describe resulta en una línea celular en suspensión que se puede manipular hasta dos meses y/o de modo indefinido en un sistema de cultivo en suspensión, por ejemplo pero sin limitarse a un sistema de cultivo que utiliza un medio de producción libre de suero y de componentes de la sangre.

En una variación, un método y un sistema para adaptar células hospedadoras a un cultivo de suspensión se puede realizar por un método que comprende: a. Hacer crecer una o más células hospedadoras adherentes (por ejemplo, en un medio de soporte de crecimiento) sobre un primer recipiente de cultivo (por ejemplo, un recipiente de cultivo con una superficie) ,· b. Hacer crecer las células hasta un nivel de confluencia, por ejemplo, pero sin limitarse a 20%-100%, 30%-100%, 40%-100%, 50%-100%, 60%-100%, 70%-100%, 80%-100% y/o 100% de confluencia; c. Disociar las células del recipiente de culti o; d. Resuspender las células en medio de soporte de crecimiento; e . Volver a sembrar en placa sobre un recipiente de cultivo y hacer crecer las células en un medio de soporte de crecimiento; f. Repetir las etapas (a) - (e) hasta que las células hayan formado hacinamientos; y g. Transferir las células a un cultivo de suspensión, por ejemplo, pero sin limitarse a un matraz giratorio o de agitación,- h. Agitar las células, por ejemplo pero sin limitarse a agitación o movimiento.

En otra variación, un método y sistema para adaptar células hospedadoras a cultivo celular en suspensión se puede realizar de acuerdo con las siguientes etapas: a. se hacen crecer una o más células hospedadoras sobre un primer recipiente de cultivo que tiene una superficie de soporte de crecimiento, b. se permite que las células hospedadoras crezcan sobre el recipiente de cultivo hasta que hayan alcanzado un nivel de confluencia, por ejemplo, las células hospedadoras se pueden hacer crecer sobre el recipiente de cultivo hasta que hayan alcanzado aproximadamente 60%-aproximadamente 100% de confluencia, c. remover el medio de soporte de crecimiento de las células una vez que las células hospedadoras han alcanzado un nivel de confluencia, d. opcionalmente, lavar las células, por ejemplo, con un amortiguador (por ejemplo una solución amortiguadora isotónica, por ejemplo solución salina amortiguada con fosfato o algún otro amortiguador) , e. disociar las células del recipiente de cultivo, por ejemplo pero sin limitarse a agregar una cantidad efectiva de solución de disociación de células a las células (por ejemplo, tripsina o EDTA) , disociar mecánicamente (por ejemplo, con un raspador de células, una pipeta, etc.), o de cualquier otra manera mecánica, química, enzimática u otra; f. incubar las células bajo condiciones de soporte de crecimiento, por ejemplo pero sin limitarse a aproximadamente 37 °C y 5% de C02 hasta que las células se disocian del recipiente de cultivo; g. resuspender las células en una cantidad eficaz de medio de soporte de crecimiento; h. sembrar en placa las células resuspendidas en un recipiente de cultivo nuevo, por ejemplo pero sin limitarse a un recipiente de cultivo con la misma área superficial que el primer recipiente de cultivo, de manera alternativa o adicional un recipiente de cultivo con un área superficial mayor o menor que la del primer recipiente de cultivo; i. hacer crecer las células durante aproximadamente 1 a aproximadamente 24 horas, o aproximadamente 1 a aproximadamente 48 horas bajo condiciones de soporte de crecimiento, por ejemplo pero sin limitarse a aproximadamente 37°C y 5% de C02; j . repetir las etapas (c) a (i) por lo menos aproximadamente 1 vez o hasta que las células hayan formado hacinamientos visibles (por ejemplo, para un ejemplo visual del hacinamiento, véase la figura 2 (lámina marcada como "día 10") y las figuras 4a-4f, por ejemplo las figuras 4e y 4f, k. transferir las células a un cultivo en suspensión, por ejemplo pero sin limitarse a un matraz giratorio o de agitación; 1. agitar las células, por ejemplo pero sin limitarse a batido o agitación.

La célula hospedadora puede ser cualquier tipo de célula de mamífero, por ejemplo, pero sin limitarse a células COS, CHO, HeLa, BHK-M, BHK-21, HEK-293T, mielomas murinos así como líneas de células primarias transformadas, hibridomas, células diploides normales y cepas de células derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, entre muchos otros conocidos en el ámbito. Cualquier célula de mamífero que previamente se ha demostrado que es susceptible de adaptación a cultivo celular en suspensión se puede utilizar en el método que aquí se describe. De manera más importante, el método ha demostrado que adapta exitosamente líneas de células que previamente no se han adaptado a cultivo en suspensión y por lo tanto se ha limitado a crecimiento adherente, tal como, pero sin limitarse a BHK-M.

Las células de mamífero pueden ser células de mamífero modificadas genéticamente que expresen un polipéptido recombinante y/o un virus de interés recombinante, o células de mamífero modificadas que expresen un polipéptido recombinante y/o un virus recombinante de interés. Por ejemplo, la modificación genética de las líneas de células de mamífero, por ejemplo BHK-Ms se puede realizar utilizando, entre otros métodos, electroporación, liposomas catiónicos, polímeros catiónicos y transducción mediada por vector lentiviral. La modificación genética se puede realizar en la célula hospedadora antes de adaptación a suspensión o después de adaptación a suspensión. La modificación de las células antes de adaptación a suspensión puede tener ciertas ventajas o puede permitir seleccionar de manera más confiable clonas óptimas .

El medio de soporte de crecimiento puede hacer referencia a una solución nutriente la cual permite el crecimiento y mantenimiento de células eucarióticas que pueden proporcionar una o más de las siguientes categorías: (1) sales (por ejemplo, sodio, potasio, magnesio, calcio, etc.), que contribuyen a la osmolalidad del medio; (2) una fuente de energía, las cuales pueden estar en forma de carbohidratos tales como, pero sin limitarse a glucosa; (3) aminoácidos, los cuales pueden ser algunos o todos los aminoácidos esenciales; (4) vitaminas y/u otros compuestos orgánicos; y (5) elementos en trazas, por ejemplo compuestos inorgánicos que se pueden requerir en concentraciones muy bajas (por ejemplo, en el intervalo micromolar) . La solución de soporte de crecimiento opcionalmente se puede suplementar con uno o más de los componentes de cualquiera de las siguientes categorías: (1) suero animal; (2) hormonas y otros factores de crecimiento tales como, por ejemplo, insulina, transferrina y factor de crecimiento epidérmico; y (3) hidrolizados de plantas, levaduras y/o tejidos que incluyen hidrolizados de proteínas de los mismos.

De manera adicional o alternativa, el medio de soporte de crecimiento puede ser un medio libre de suero, un medio definido químicamente o un medio que carece de componentes derivados de animales. Un medio definido químicamente son medios en los cuales todos los componentes tienen una estructura química conocida. Un medio definido químicamente está disponible de proveedores comerciales tales como, por ejemplo, Sigma y Gibco. Cualquier medio de soporte de crecimiento que soporte el crecimiento y mantenimiento de células bajo las condiciones que aquí se proporcionan se puede utilizar. Una persona experta en el ámbito será capaz de seleccionar adecuadamente para un cultivo particular el medio apropiado así como otras variables de cultivo (véase, por ejemplo, Mather J. P. et al. (1999) "Culture media, animal cells, large scale production, "Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis , and Bioseparation, Vol . 2:777-785, la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) .

La disociación celular se puede obtener por muchos métodos conocidos, por ejemplo pero sin limitarse a agregar una cantidad efectiva de solución de disociación celular a las células (por ejemplo, tripsina o EDTA) , disociación mecánica (por ejemplo raspador de células, pipeta, etc.), o cualquier otra manera mecánica, química, enzimática o de otro tipo.

Una encima de disociación celular puede comprender un agente caotrópico o una enzima o ambos . La etapa de lavado opcionalmente se puede suprimir o se puede realizar sobre algunas rondas del protocolo y no en otras. Lo aconsejable de la etapa de lavado se determina fácilmente en una base caso por caso en consideración a que la etapa de lavado puede romper los hacinamientos de células que se forman y por lo tanto puede suspenderse o posiblemente omitirse.

La cantidad de tiempo que las células están creciendo entre cada etapa de disociación puede variar dependiendo de la naturaleza de la línea celular adherentes iniciales . El factor importante es que las células se disocian y resuspenden hasta que las células forman hacinamientos visibles (por ejemplo, para un ejemplo visual de hacinamiento véase la figura 2 (lámina marcada como "día 10") y las figuras 4a-af, por ejemplo las figuras 4e y 4f.

Los siguientes ejemplos ilustran y proporcionan datos que soportan el uso del sistema y método para obtener adaptación de líneas de células adherentes a suspensión y también un crecimiento mejorado y características de producción en un sistema ejemplar, células derivadas de BH -Ms y HEK-293T a escala de matraz de agitación de 100-1000 mi. Los ejemplos se pretende que sean ilustrativos y no limitan el alcance de la invención.

EJEMPLO 1 En un primer ejemplo se proporciona una variación ejemplar del método. También se proporcionan datos que ilustran el uso del método para adaptarlo a una suspensión de una línea celular adherentes y obtener crecimiento y producción mejorados en el sistema ejemplar. En este ejemplo no limitante, las células hospedadoras ejemplares se derivan de células BHK-M (derivadas de una línea celular originales (ATCC PTA-4506) ) que expresan ET-801 el cual, cuando se adapta a suspensión se denominan BKH-Ms a escala de matraz de agitación de 100-1000 mi. En este ejemplo, las células BHK-Ms que expresan ET-801 se hacen crecer en suspensión de acuerdo con el método descrito. Se mide la producción de fVIII resultante y se compara con la producción de fVIII basado en células adherentes .

Se generan células hospedadoras utilizando un sistema de expresión lentiviral para la producción de ET-801 (Spencer HT, Denning G, Gautney RE, Dropulic B, Roy AJ, Baranyi L, et al. Lentiviral Vector Platform for Production of Bioengineered Recombinant Coagulation Factor VIII. Mol Ther. 2010, incorporada en la presente como referencia en su totalidad, denominado en lo siguiente como "Spencer 2010". Para este experimento ejemplar se obtuvo un clon BHK-M, denominado 3-10 que expresa fVIII recombinante (ET-801) a una media de nivel de 160 unidades/10e células/24 h. En este experimento preliminar se ilustran los extraordinarios resultados de producción de proteína utilizando el sistema y método novedosos para adaptar a suspensión el clon 3-10 (elaborado de acuerdo con el procedimiento descrito en Spencer 2011, el cual se incorpora en la presente en su totalidad) al realizar una corrida de fabricación a pequeña escala.

Se hacen crecer células BHK-M dependientes de anclaje a 37°C y 5% de C02 en recipientes tratados con cultivo celular de 100 mm x 20 mm (Corning #430167) en 10 mi de medio de Eagle modificado por Dulbecco avanzado/F12 (DMEM/F-12, Invitrogen #12634) suplementado con suero bovino fetal 10% (FBS, Invitrogen #10082), GlutaMAX-I 1% (Invitrogen #35050) y 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen #15140) en volumen (a continuación denominado como DMEM completo o DMEM:F12 completo) . Cuando las células han crecido a 100% de confluencia, se elimina el medio DMEM completo, las células se lavan una vez con 3 mi de (lx) solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco (dPBS, Invitrogen #14190) , 500 µ? de TrypLE Express (Invitrogen #12605) se agrega uniformemente a través del recipiente y el recipiente se incuba a 37°C y 5% de C02 durante 5 minutos. Después del período de incubación las células se resuspenden ligeramente en 5 mi de DMEM completo y todas las células (sin dilución sustancial o división) se transfieren a un recipiente nuevo de la misma área superficial del primer recipiente, con 25 mi adicionales de DMEM completo y se permite que continúen creciendo en el incubador durante la noche a 37°C y 5% de C02. Este proceso de siembra en placa se repite cada día durante 4 días hasta que las células comienzan a formar estructuras tridimensionales debido a un incremento en la densidad celular lo que genera una carencia de área superficial en el recipiente para las células para que sedimenten en monocapas (véase la figura 2) .

En este punto las células se transfieren a cultivo de suspensión. Se prepara un matraz de agitación de 125 mi (Corning #3152) por llenado con 120 ral de DMEM completo suplementado con 1.25 mi adicionales de Pluronic F-68 (solución 10%, Invitrogen 24040) . Las células se lavan con dPBS, se separan del recipiente de cultivo con TrypLE, se incuban y se resuspenden cuidadosamente como en lo anterior y después se transfectan a los matraces de agitación mencionados antes y se mantienen en agitación a 60 rpm dentro de un incubador a 37°C y 5% de C02. La viabilidad celular se monitorea diariamente por tinción para detectar células muertas con azul de tripán (STEMCELL Technologies #07050) . Cada tercer día los medios dentro del matraz se cambian eliminando 80 mi del medio remanente y sustituyéndolo con 85 mi de DMEM completo fresco suplementado con 850 µ? de Pluronic F-68.

En este experimento preliminar, demostramos que las células BHK-M se pueden adaptar a suspensión utilizando el método descrito que involucra volver a sembrar en placa, de manera seriada células BHK-M adherentes . Después de 10 días de volver a sembrar en placa en serie, mientras se cultiva a 37°C, 95% de humedad y 5% de C02 , las células adoptan un estado altamente hacinado y su crecimiento de vuelve independiente del espacio de separación de superficie dentro del recipiente de cultivo de tejido. En este punto, las células se cambian a un agitador o matraces giratorios y se mantienen bajo condiciones de cultivo idénticas con la adición de rotación moderada (60-75 rpm) . En los siguientes 1-2 días de cultivo de suspensión las células comienzan a expande se con un tiempo de duplicación de 24-48 h. En este punto, las células se adaptan a cultivo de suspensión, proporcionándoles la designación de células "BHK-Ms" y se pueden mantener en medio que contiene suero o libre de suero durante más de dos meses (de manera similar a indefinido) determinado empíricamente .

La figura 2 muestra visualmente la conversión de células BHK-M a células BHK-Ms por el método experimental descrito en lo anterior. Las células BHK-M se adaptan a suspensión utilizando el método descrito que involucra resembrado en placa de manera en serie de células BHK-M adherentes. Después de 10 días de resembrado en placa de manera en serie las células adoptan un estado altamente hacinado (como se observa en la figura 2) y su crecimiento se vuelve independiente del espacio de unión de superficie dentro del recipiente de cultivo de tejido. En este punto, las células se siembran en matraces de agitación o giratorios ajustados a rotación moderada (60 - 75 rpm) . En los siguientes 1 - 2 días de cultivo de suspensión las células comienzan a expandirse con un tiempo de duplicación de 24 - 48 h.

En esta variación del experimento, los clones 3-10 de BHK-Ms resultantes demuestran expansión robusta y sostenida durante más de 40 días a escala de 1 litro. Durante la fase de producción libre de suero, se cosechan aproximadamente 1,000,000 de unidades de fVIII del sistema. Esto representa una mejora de aproximadamente 50 veces con respecto a los sistemas de producción de fVIII humano recombinante comerciales sin optimización significativa alguna.

La figura 3 demuestra la mejora en 50 veces que resulta de la expresión de fVIII recombinante a partir de BHK-Ms generadas por el método que se describe. Se realizaron cambios de medio completo diariamente y la concentración de actividad de fVIII de cada recolección se determinó por análisis de coagulación en una etapa. Las líneas horizontales representan la media de nivel de producción de fVIII libre de suero para ET-801 (indicado por "ET-801" por encima de la línea) de acuerdo con el método descrito. La línea horizontal indicada por fVIII representa la media de niveles de producción publicados para factor VIII humano (h) recombinante .

La- línea de célula resultante, el método de elaboración y el uso se describen completamente en lo anterior se denominan BHK-Ms-310 y está disponible al ponerse en contacto con los inventores y/o el beneficiario. Esta línea celular proporciona rendimiento de producto aumentada, capacidad para crecer en cultivo de suspensión y capacidad aumentada para producir virus diferente de su línea celular original.

EJEMPLO 2 En un segundo ejemplo se proporciona una variación ejemplar del método y datos que ilustran el uso del sistema y método para adaptarlo a suspensión y obtener . características de crecimiento mejoradas en un sistema ejemplar, células adherentes HEK-293T. En este ejemplo células HEK-293T se adaptan a suspensión de acuerdo con variación del método descrito bajo condiciones designadas. La línea celular que resulta del siguiente método se denomina HEK-SC-293T. La línea celular HEK-SC-293T proporciona rendimiento de producto aumentado, capacidad para crecer en cultivo de suspensión y capacidad mejorada para proporcionar virus sobre su línea celular original.

El método de acuerdo con este ejemplo es el siguiente: a. Iniciar con una línea celular unida HEK-293T previamente no expuesta, congelada, b. Recalentar en 10 mi de DMEM/F-12 completo con Glutamax 5%, FBS 10%) en un recipiente Corning de 10 cm aproximadamente a 37°C, 5% de C02; c . Hacer crecer las células a confluencia en el recipiente de 10 cm en una cantidad eficaz de medio de soporte de crecimiento, tal como DMEM/F-12 completo (1-2 días) ; d. Hacinar las células por repetición de las siguientes etapas cada día hasta que se forman hacinamientos los cuales sustancialmente no están unidos a la superficie de la placa; i. Remover todo medio, ii. Lavar las células con PBS (esta etapa es opcional y se suspende después del primer par de ciclos) , iii. Agregar 700 µ? de TrypLE (análogo de tripsina, Invitrogen #12605) . iv. Incubar durante 5 min aproximadamente 37°C, 5% de C02. v. Transferir cuidadosamente todas las células a un recipiente nuevo de 10 cm con cantidades cada vez mayores de DMEM/F-12 completo dependiendo de la densidad celular, intentando no romper los hacinamientos. vi. Incubar durante la noche aproximadamente a 37°C, 5% de C02 vii. Repetir las etapas (i) a (vi) hasta que las células han formado hacinamientos, viii. Después de que las células han formado hacinamientos, transferir las células a un matraz giratorio de 125 mi (Corning #3152) con 50 mi de medio (DMEM/F-12 completo, en este caso) suplementado con Pluronic F-68 1% V/V, ix. incubar durante la noche a aproximadamente 37°C, 5% de C02 con rotación moderada (60 rpm) . e. Cambiar diariamente el medio que consiste de células peletizadas aproximadamente 400G durante 5 a 10 minutos, remover el medio agotado, resuspender todas las células en 100 mi de medio suplementado con Pluronic F-68 1% V/V. Incubar durante la noche a aproximadamente 37°C, 5% de C02 con rotación moderada (60 rpm) . f . Medir la densidad celular al comparar las concentraciones de proteína de una alícuota de células hacinadas Usadas con RLA (Promega #Z3051) con una curva estándar de concentraciones de proteína a densidades de células conocidas de células no hacinadas utilizando el kit del análisis de ácido bicinconínico (análisis BCA) (véase Thermo Scientific #23225, protocolo de equipo, el cual se incorpora en la presente en su totalidad) .

Las figuras 4a-4f demuestran a través de documentación fotográfica el éxito del método descrito novedoso en esta variación experimental. La figura 4a muestra el material inicial, células HEK-293T adherentes confluentes. La figura 4b muestra los días 1-2 de la siembra nuevamente en placa, en serie, momento en el cual se incrementó la densidad celular y se observó apilamiento de células. La figura 4c muestra los días 2-3 de resiembra en placa en serie continua, tiempo en el cual se observa m s apilado de células. La figura 4d muestra los días 3-4 de resiembra en placa, de manera seriada, tiempo durante el cual los agregados de células comenzaron a crecer alrededor de la monocapa de células adherentes. La figura 4e muestra los días 4-5 de la resiembra en placa, de manera seriada, tiempo durante el cual los agregados celulares comienzan a crecer más grandes. La figura 4f muestra los días 5-8 de resiembra en placa, tiempo en el cual los agregados de células se volvieron independientes del anclaje.

El cultivo se puede mantener indefinidamente repitiendo la etapa (e) , por ejemplo, la etapa de peletización, diariamente mientras únicamente se resuspende una fracción (habitualmente ~80%) de las células.

Las células de acuerdo con este ejemplo 2 se transfectan después de que se adaptan a suspensión.

Aunque el método anterior se puede utilizar para producir una línea celular de suspensión para muchas líneas de células adherentes, la línea de célula resultante a partir de este ejemplo particular con los parámetros específicos establecidos en lo anterior, el método de elaboración y uso han sido descritos completamente en lo anterior, se denomina como HEK-SC-293T y está disponible al ponerse en contacto con los inventores y/o el beneficiario. Esta línea de célula proporciona un rendimiento de producto aumentada, capacidad para crecer en cultivo de suspensión y capacidad mejorada para producir virus con respecto a su línea celular original.

EJEMPLO 3 En un tercer ejemplo se propone una variación ejemplar del método y datos que ilustran la capacidad de la línea celular resultante del método descrito para producir un virus recombinante . La transducción para titulado se puede realizar por métodos conocidos o como se describe en Spencer 2011, incorporado en la presente como referencia en su totalidad.

En una variación adicional se describe un método y una línea celular (denominada HEK-SC-293T, el método de elaboración y uso descrito completamente en la presente está disponible, entre otros medios, al ponerse en contacto con los inventores y/o el beneficiario) para producción de virus de alto rendimiento, por ejemplo por transducción con el virus de interés de . una línea celular de acuerdo con el método que aquí se describe. El siguiente ejemplo ilustra la producción y concentración de lentivirus de tercera generación a partir de células adaptadas para suspensión de acuerdo con los métodos descritos. La referencia, por ejemplo, a tamaños de recipiente y todas las cantidades, por supuesto, se puede modificar y ajustar para aumento o disminución de producción. El método se puede demostrar por las siguientes etapas: a. Siembra de células para transfección: i . Se comienza con un matraz nuevo que contiene suspensión de células HEK-SC-293T a 1 x 106 células/ml (por ejemplo, determinado por el análisis BCA) en 50 mi de DMEM : F12 completo ii. Se incuban las células a 37°C, 5% de C02, 60 rpm b. Transfección (día 1) : i. En un tubo cónico de 15 mi se combina la cantidad total de ADN plasmídico (véase tabla 1 abajo) en un volumen final de 5 mi de, por ejemplo, OPTI-MEM, I (Gibco) o un producto similar. Se esteriliza por filtración a través de un filtro, por ejemplo un filtro de 0.22 µp\ en un tubo cónico nuevo de 15 mi.

TABLA 1 ii. En un tubo cónico de 15 mi separado se combinan 144 µ? de 10 mg/ml de polietilenimina (PEI) (véase tabla 2 a continuación para el cálculo de PEI) con 5 mi, por ejemplo, de OPTI-MEM I (Gibco) o un producto similar.

Se esteriliza por filtración a través de un filtro, por ejemplo un filtro de 0.22 µp? en un tubo cónico nuevo de 15 mi.

TABLA 2 5 -LO iii. Se combina el ADN plasmidico y las mezclas de PEI y se incuban a temperatura ambiente durante 20 minutos. iv. Se peletizan las células en suspensión, por ejemplo células en suspensión HEK-293T en un tubo cónico de 50 mi a 1500 rpm durante 10 minutos, se desecha el medio 15 acondicionado. v. Mientras se realiza la péletización se agrega una mezcla de ADN/PEI a 50 mi de DME : F12 completo fresco (que carece de 1% de penicilina/estreptomicina) para un volumen final de -60 mi y se combina perfectamente para 0 asegurar una mezcla homogénea. vi. Se resuspenden las células en suspensión, por ejemplo células de suspensión HEK-293T en un matraz giratorio utilizando un medio a partir del matraz. vii . Se transfectan las células durante la noche 5 por incubación a 37°C en un incubador con 5% de C02 a 60 rpm. c. Post-transfección (día. 2): i. Se peletizan las células de suspensión transfectadas como se indica previamente y se decanta cuidadosamente el medio de transducción de las células y se sustituye con 50 mi de DMEM: F12 completo. ii. Se continúa el cultivo celular a 37°C el incubador con 5% de C02 d. Recolección de virus/cosecha (días 3 y 4) : i . Se examina la condición de las células en búsqueda de evidencia de transacción, por ejemplo con células de verificación para células GFP bajo un microscopio fluorescente. Para fVIII, uno puede verificar, por ejemplo, el medio para tiempos de coagulación. ii. Si las pruebas muestran que las células están expresando el producto deseado, se procede como sigue: 1. Se peletizan las células a 1500 rpm durante 10 minutos (por ejemplo para eliminar los residuos de células) . 2. Se decanta el virus que contiene el medio en una botella centrífuga estéril y se vuelven a sembrar las células en suspensión, por ejemplo células de suspensión HEK-293T de regreso al matraz giratorio con 50 mi de DMEM : F12 completo fresco y se continúa cultivando las células en una incubadora a 37°C con 5% de C02 a 60 rpm. 3. Se filtra el medio que contiene el virus a través de un filtro, por ejemplo, pero sin limitarse a un filtro de 0.45 mm y se almacena a 4°C (hasta por aproximadamente 4 días) hasta que está listo para concentración del virus. 4. Se recolecta durante 2 días al repetir las etapas indicadas en lo anterior. iii . Opcionalmente se concentra, resuspende y almacena el virus. iv. La siguiente tabla 3 ilustra la capacidad de las líneas de células adaptadas para suspensión de acuerdo con el método descrito para producir virus funcional, medido por el análisis del número de copias del transgen qPCR de células BHK-M transducidas como se describe en Spencer 2011. El virus recolectado se subdivide por vía secuencial de recolección de virus y título promedio para el virus no concentrado que contiene medio se calcula para cada día. El título concentrado calculado después se calcula al multiplicar el título no concentrado entre la velocidad de concentración .

TABLA 3 EJEMPLO 4 El siguiente ejemplo y datos asociados demuestran adicionalmente el alto nivel de expresión de fVIII a partir de células adaptadas a suspensión de acuerdo con los métodos descritos. El siguiente ejemplo es para propósitos ilustrativos únicamente y no se pretende que limite la descripción a una escala o cantidades particulares, etc.

Se adapta un clon de BHK-M que expresa ET-801, denominado 3-10 a un cultivo en suspensión libre de suero de acuerdo con el método que aquí se describe - y por lo tanto se vuelve lo que hemos denominado como una célula BHK-Ms. El clon BHK-M se expande y se hace crecer a escala de 1 litro durante 30 días y se mide la concentración de fVIII y se gráfica en la figura 5. Cada punto de datos representa la concentración de fVIII a partir de la cosecha media de 1 litro completo. No se observa cambio en la viabilidad celular lo que sugiere que la supervivencia celular bajo estas condiciones es indefinida. En total se recolectaron durante esta corrida de producción más de 1 millón de unidades de actividad fVIII. Debido a la alta concentración de ET-801 en el material inicial, fue posible, por primera vez, obtener un material altamente purificado utilizando un único procedimiento de cromatografía de intercambio catiónico. Se aislaron aproximadamente 4.9 mg de ET-801 altamente purificado con una purificación de 830 veces. El material final se calcula que tiene una actividad específica de 3,000 unidades/nmol o 17,700 unidades/mg utilizando un coeficiente de extinción molar a 280 nm de 254,955 M"1cm"1 en base en el contenido predicho de tirosina, triptofano y cisteína.

Se determinó la pureza de ET-801 por SDS-PAGE y se comparó con fVIII humano BDD recombinante . Una cantidad pequeña del material de cadena única, el cual fue sensible a separación por trombina estaba presente. No se observaron contaminantes mayores. Se determinó el ET-801 purificado por glucosilación, interacción con vWf y extinción de actividad después de activación por trombina. El tratamiento de ET-801 con trombina y endoglucosidasa PNGasa F resuelto en un cambio en Mr para los fragmentos de proteína Al y A3-C1-C2 (cadena ligera) . No se observó cambió en Mr del dominio A2 después del tratamiento con PNGasa F. Estos datos sugieren que un patrón de glucosilación para ET-801 que es consistente con aquel que se ha descrito previamente para BDD recombinante humana y BDD porcino de fVIII (Doering et al. Journal of Biological Chemistry. 2004. 279 (8) : 6546-6552, incorporado en la presente como referencia en su totalidad) .

Para confirmar la funcionalidad in vivo del ET-801 producido, se suministró por infusión a ratones con hemofilia A ya sea solución salina o ET-801 a una dosis de 290 unidades/kg, lo cual se determinó empíricamente que restaura la actividad de fVIII circulante a niveles murinos casi normales. Después de la administración de solución salina o de ET-801, se sometió a los ratones a un reto hemostático utilizando transfección de la cola y se determinó la pérdida de sangre total después de un período de 40 minutos. Los ratones con hemofilia A a los que se les inyectó únicamente solución salina presentan una pérdida media de sangre de 29.6 mg/g de peso corporal. En contraste, a los ratones que se les suministró por infusión ET-801 mostraron una pérdida de sangre de 0.1 mg/g de peso corporal, lo cual es significativamente menor que los controles (P = 0.029) .

Aunque el método anterior se puede utilizar para producir una línea celular en suspensión para muchas líneas de células adherentes, la línea de célula resultante a partir de este ejemplo particular con los parámetros específicos establecidos en lo anterior, el método de elaboración y la utilización que se ha descrito completamente en lo anterior se denomina BHK-MS-310-ET801 y está disponible al ponerse en contacto con los inventores y/o el beneficiario. Esta línea celular proporciona un rendimiento de producto mejorado, capacidad de crecimiento de cultivo en suspensión y capacidad mejorada para producir virus con respecto a la línea celular originales.

EJEMPLO 5 El siguiente ejemplo y los datos asociados ilustran el efecto sobre la densidad celular de un procedimiento de alimentación optimizado. En este ejemplo las células en suspensión se volvieron a alimentar con medio fresco cada 12 horas en vez de cada 24-48 horas, como se ilustra en los ejemplos anteriores. Utilizando un protocolo de alimentación de 12 horas demostramos que se puede obtener y mantener una mayor densidad celular, como se ilustra por la figura 6.

EJEMPLO 6 Los siguientes datos caracterizan un clon BHK-M adicional adaptado para suspensión, denominado P14 el cual ha sido modificado genéticamente por transfección facilitada por polímero de un plásmido de expresión de mamífero, transducción en serie utilizando un vector lentiviral, codificación de un transgen para fVIII recombinante, producto del cual se denomina en la presente como ET-3 (ÉT-3 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos aproximadamente 99% idéntica a la SEC ID NO: 19 de la patente de E.U.A. número 7,635,763).

La línea celular resultante de este ejemplo particular con los parámetros específicos establecidos en lo anterior, el método de elaboración y la utilización se describen completamente en los ejemplos anteriores en combinación con los métodos de Spencer 2011, se denomina BHK-MS-P14 y están disponibles al ponerse en contacto con los inventores y/o el beneficiario. Esta línea celular proporciona un rendimiento de producto mejorado, capacidad para crecer el cultivo en suspensión y capacidad, mejorada para producir virus con respecto a la línea celular original .

La figura 7 ilustra la actividad de fVIII (ET-3) como una función de la densidad de cultivo.

La figura 8 ilustra el crecimiento a largo plazo en la estabilidad de un cultivo de suspensión BHK-MS-P14. se realizaron determinaciones de densidad al medir los niveles de proteína total utilizando el análisis de proteína de ácido bicinconínico (BCA) y al compararlos con proteína BHK conocida/estándares celulares.

La figura 9 ilustra que el clon P14 es capaz de producción eficiente de fVIII en una diversidad de medios, que incluyen pero que no se limitan a medios libres de suero o definidos químicamente suplementados con albúmina derivada de sangre o recombinante.

EJEMPLO 7 En este ejemplo demostramos que las células adaptadas a suspensión de acuerdo con este método pueden ser modificadas genéticamente para expresar un transgen extraño diferente de la molécula fvill recombinante. Por ejemplo, GFP .

Para demostrar el valor de las células BHK-Ms de acuerdo con los métodos que se describen, demostramos que fácilmente pueden ser modificadas genéticamente, por ejemplo, para que expresen una diversidad de proteínas recorabinantes . Por lo tanto, ilustramos la eficiencia de modificaciones genéticas a BHK-Ms utilizando el polímero catiónico PEI bajo condiciones de transfección estándar. La figura 10 demuestra la modificación genética significativa de la suspensión de células HEK-SC-293T utilizando PEI y un plásmido que codifica para proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés) como un indicador. La figura 10 son células HEK-293T productoras de GFP, transfectadas con GFP adaptadas a suspensión, de acuerdo con los métodos que se describen.

EJEMPLO 8 Lo siguiente es una variación propuesta del método descrito para producción piloto. Por ejemplo, para producción piloto, una línea celular adherentes adaptadas a suspensión por el método que se describe, por ejemplo un clon BHK-Ms que expresa ET-8Q1 puede hacerse crecer a, por ejemplo, pero sin limitarse un biorreactor de 50 litros (por ejemplo, Xcellex) que contiene 10 litros de medio de producción BH -Ms . De cinco a 10 litros de medio acondicionado se puede cosechar diariamente, clarificados por filtración y congelados a -80°C. Se puede purificar ET-801 a partir del medio condicionado utilizando un protocolo de cromatografía de intercambio iónico de una sola etapa novedoso que hemos desarrollado y descrito previamente (Spencer HT, Denning G, Gautney RE, Dropulic B, Roy AJ, Baranyi L, et al. Lentiviral Vector Platform for Production of Bioengineered Recombinant Coagulation Factor VIII. Mol Ther. 2011, incorporado en la presente en su totalidad) . Como se establece en lo anterior, la purificación de fVIII humano recombinante de longitud completa comercial puede involucrar una etapa de inmunoafinidad que puede complicar el proceso de validación debido a la presencia de otro producto biológico en la purificación, por ejemplo una inmunoglobulina monoclonal anti-fVIII humano. El uso del proceso de purificación que se describe en Spencer 2011 también puede llevar a una reducción en los costos de fabricación y por lo tanto costos reducidos de artículos. La preparación de fVIII se puede analizar para pureza, procesamiento, actividad específica y la cinética de extinción después de la activación de trombina, como se ha descrito previamente (Spencer HT, Denning G, Gautney RE, Dropulic B, Roy AJ, Baranyi L, et al . Lentiviral Vector Platform for Production of Bioengineered Recombinant Coagulation Factor VIII. Mol Ther. 2011) y en lo siguiente.

CONSIDERACIONES ADICIONALES RESPECTO A LA NOVEDAD ' De acuerdo a los ejemplos y la descripción se demuestra un método de adaptación de células adherentes a cultivo en suspensión. También se describen líneas de células novedosas producidas por el método descrito y se demuestran las capacidades de producción superiores de las lineas de células en suspensión producidas de acuerdo con los métodos descritos . Para, ilustrar adicionalmente los resultados de producción sorprendentes y extraordinarios, los resultados que aquí se describen se pueden comparar contra los resultados que se obtienen por el mercado actual de los principales fabricantes de fVIII comerciales. Para comparación de escala y productividad, Baxter Inc anunció en enero del 2006 que las ventas acumulativas de su producto h-fVIII recombinante de tercera generación, ADVATEMR, sobrepasan mil millones de unidades (aproximadamente 100 gramos) desde su aprobación por la FDA y la comisión Europea en 2003-2004. Como lo muestra la figura 1, la producción anual calculada para cada uno de los productos fVIII recombinantes comerciales es de 100-200 gramos.

En comparación, en la corrida de producción fVIII a escala piloto ejemplar se puede realizar al sembrar BHK-Ms clon 3-10 en un matraz giratorio de 1 litro, el cual puede crecer a una densidad, por ejemplo, pero sin limitarse, de aproximadamente 106 células/ml. El cultivo completo después se puede utilizar para sembrar un biorreactor de 50 litros (por ejemplo, Xcellerx) que contiene 10 litros de medio de producción BHK-Ms . En base en una densidad de células esperadas de 2 x 106 células/ml en la fase de producción calculamos la producción diaria de ET-801 utilizando el siguiente cálculo: producción diaria de Mil = 2-°° 000 100 ? 10,000 mi = 2,000,000 de unidades mi 1,000,000 de células Por lo tanto se espera que durante el curso de una corrida de producción de 30 días se recolectarán 300 litros de medio acondicionado que contienen aproximadamente 60,000,000 de unidades de actividad fVIII. Con una actividad específica determinada previamente de 17,700 unidades/miligramo (Spencer 2011) esperamos un rendimiento de producto que exceda de 3 gramos .

Como se demuestra, en una corrida de 1 1 de 30 días recolectamos más de 1,000,000 de unidades de fVIII. Es claro que, aumentado a escala de biomanufactura (por ejemplo, Bayer corre 10 o más biorreactores de 200 1 en paralelo en cualquier momento dado) , las células producidas de acuerdo con nuestra descripción pueden producir mil millones de unidades en una corrida de 1000 1 de 30 días. En otras palabras, lo que le toma a Bayer casi 3 años de llevar a cabo con sus extensas capacidades de fabricación y equipo, nuestro método lo puede llevar a cabo en una corrida de 1000 1 de 30 días.

Por lo tanto, el método, sistema y las líneas de células descritas en la presente prometen una reducción significativa en cuanto a costos y un incremento en la disponibilidad de sustancias bioterapéuticas necesarias de modo crítico tales como, pero sin limitarse a fVIII. Como un ejemplo adicional, Bayer ha establecido que en sitio en Berkeley, requiere más de 1000 personas durante aproximadamente 250 días para fabricar un lote de su producto fvill, KOGENATE FS . Esto representa 200 gramos de producto. El método que se se describe es capaz de producir mucho más producto en menos tiempo utilizando menos recursos. Por ejemplo, la producción anual calculada de fVIII es de 100-200 gramos. Se ha demostrado que se puede producir, a escala de laboratorio con recursos muy limitados y en 30 días más de un décimo de la producción anual calculada de fVIII.

La figura 11 muestra dos esquemas de manufactura, uno basado en producción en botellas giratorias de ET-801 y el otro basado en un biorreactor de tanque único. Esto enfatiza los beneficios del crecimiento de células en suspensión en la elaboración de proteínas recombinantes .

En base en cálculos conservadores, la fabricación basada en BHK-Ms puede incrementar el rendimiento de producto en más de 2 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces o incluso 100 veces con respecto a la fabricación en botellas giratorias basado en BHK-M. Este desarrollo clave puede superar las barreras de entrada técnica y económica al mercado comercial farmacéutico de proteínas recombinantes lo cual puede incrementar el suministro de factor VIII en 2/3 de aquellos con hemofilia A quienes actualmente no tienen acceso.

Descripción del protocolo experimental ejemplar para caracterización del producto fVIll.

Purificación y análisis bioquímico de ET-801 biosintetizado por BHK-Ms : Se puede purificar ET-801 recombinante, entre otras técnicas, utilizando un procedimiento de cromatografía de intercambio iónico de una etapa como se describe recientemente (Spencer, 2011) . Se pueden identificar las fracciones que contienen fVIII, por ejemplo, pero sin limitarse a análisis de coagulación de una etapa y tinción con plata después de electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) . Se puede calcular la actividad específica de ET-801, por ejemplo, mediante la utilización de un coeficiente de extinción molar determinada a partir del contenido predicho de tirosina, triptofano y cisteína y la absorbancia a 280 nm (Pace CN, Vajdos F, Fee L, Grimsley G, Gray T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci. 1995 ; 4 (11) : 2411-23 ) .

La actividad específica del material final se puede definir, por ejemplo, como el promedio del número ponderado de las actividades específicas de las fracciones pico de fVIII excluyendo cualquier fracción que demuestra una absorbancia a 280 nm menor de 0.08 o un cociente de activación menor de 20. La pureza de la preparación ET-801 se puede determinar utilizando técnicas bioquímicas/físicas múltiples. Como un ejemplo, se puede utilizar SDS-PAGE y tinción con plata para determinar la pureza y procesamiento. Se espera, en base en datos preliminares, que >95% de material proteínico purificado esté presente en forma heterodimérica (cadena pesada/cadena ligera) característica del procesamiento intracelular PACE/furina. También se observa una cantidad pequeña de material de cadena sencilla no procesada lo cual típicamente se observa en nuestras preparaciones de f III híbrido humano, porcino y humano/porcino (Spencer HT, Denning G, Gautney RE, Dropulic B, Roy AJ, Baranyi L, et al. Lentiviral Vector Platform for Production of Bioengineered Recombinant Coagulation Factor VIII. Mol Ther. 2011.; Doering C. Parker ET, Healey JF, Craddock HN, Barrow RT, Lollar P. Expression and characterization of recombinant murine factor VIII. Thromb Haemost. 2002 ; 88 (3 ) : 450-8. ; Doering CB, Parker ET, Healey JF, Craddock HN, Barrow RT, Lollar P. Expression and Characterization of Recombinant Murine Factor VIII. ThrombHaemost . 2002 ; 88 (3) 450-8. ; Doering CB, Healey JF, Parker ET, Barrow RT, Lollar P. Identification of porcine coagulation factor VIII domains resposible for high level expression via enhanced secretion. J Biol Chem. 2004 ,-279 (8) : 6546-52. , incorporado en la presente como referencia) .

ET-801 también se puede incubar con trombina antes de SDS-PAGE para confirmar activación completa y presencia de únicamente las bandas Al, A2 y A3-C1-C2, representativas de fVIII heterotriraérico . La preparación de ET-801 se puede caracterizar por huella dactilar de masa peptídica (véase, por ejemplo, Mann M, Hendrickson RC, Pandey A. Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry . Annu Rev Biochem. 2001;70:437-73, incorporado en la presente como referencia) . Brevemente, la preparación de proteína se puede digerir y las masas de los iones moleculares peptídicos se pueden determinar y por lo tanto se obtiene un espectro de masa peptídica. Una identificación más definitiva después se puede obtener al realizar un análisis espectrofotométrico en masa en tándem de los iones peptídicos seleccionados. Los datos obtenidos se pueden utilizar para verificar la identidad de ET-801, identificar los contaminantes potenciales contenidos dentro de la preparación y caracterizar las modificaciones post-traduccionales presentes .

La formación de los agregados de fVIII de peso molecular alto puede ser una complicación de la purificación de fVIII (Grillo AO, Edwards KL, Kashi RS . Shipley KM, Hu L, Besman MJ, et al. Conformational origin of the aggregation of recombinant human factor VIII. Biochemistry . 2001 ; 40 (2 ): 586-95., incorporado en la presente como referencia). Entre otros métodos se puede utilizar la cromatografía líquida de alta resolución con exclusión de tamaño (HPLC, por sus siglas en inglés) para analizar la preparación ET-801 para la presencia de agregados fVIII grandes .

Estabilidad de ET-801 activado después de activación de trombina: Se puede realizar un análisis sistemático de ET-801 purificado para la velocidad de disociación de la subunidad A2 utilizando un procedimiento descrito previamente para la caracterización de ET-801 porcina, humana recombinante , diversas construcciones del híbrido humano/porcino de factor VIII y fVIII murino (Doering CB. Parker ET, Healey JF( Craddock HN, Barrow RT, Lollar P. Expression and characterization of Recombinant Murine Factor VIII. ThrombHaemost . 2002;88 (3) :450-8. ; Doering CB, Healey JF, Parker ET, Barrow RT, Lollar P. Identification of porcine coagulation factor VIII domains responsible for high level expression via enhanced secretion. J Biol Chem. 2004 ; 279 (8) : 6546-52. ; Doering CB, Healey JF, Parker ET, Barrow RT, Lollar P. High-level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII. JBiolChem. 2002 ; 277 (41) : 38345-9. ; Parket ET, Doering CB, Lollar P. Al subunit-mediated regulation of thrombin-activated factor VIII A2 subunit dissociation. J. Biol Chem. 2006., incorporado en la presente como referencia.

Por ejemplo, ET-801 se puede diluir a 1, 20, 50 ó 100 nM en NaCl 0.15 M, HEPES 0.02 y CaCl2 2 mM y se puede activar con 100 nM de trombina durante 30 segundos. Se puede medir la actividad del fVIIIa como una función del tiempo por un análisis cromogénico. Bajo estas condiciones, fVIII está completamente activado por 30 segundos y hay pérdida de actividad en el análisis debido completamente a extinción de fVIIIa (Fay PJ, Smudzin TM. Characterization of the interaction between the A2 subunit and A1/A3-C1-C2 dimer in human factor Villa, JBiolChem. 1992 ; 267 (19) : 13246-50. ; Lollar P. Parket CG. pH-dependent denaturation of thrombin-activated porcine factor VIII. JBioChem. 1990 ;265 (3) : 1688-92. ; Lollar P, Parket ET. Structural basis for the decreased procoagulant activity of human factor VIII compared to the porcine homolog. JBiolChem. 1991; 266 (19) : 12481-6. ; Lollar P, Parket et, Fay PJ. Coagulant properties of hybrid human/porcine factor VIII molecules. JBiolChem. 1992 ; 267 (33) : 23652-7. , incorporado en la presente como referencia.

Determinación de la eficacia de ET-801 en un modelo murino de hemofilia A: Se ha desarrollado un modelo de eficiencia para determinar la capacidad de fVIII para disminuir la mortalidad o pérdida de sangre en ratones con hemofilia A E16 después de transección de la cola (Parket ET, Lollar P. A quantitative measure of the efficacy of factor VIII in hemophilia A mice. Thromb Haemost. 2003 ; 89 (3 ) : 408-5. Incorporado en la presente como referencia) . En este modelo, la mortalidad de los ratones con hemofilia A es más de 90% a menos que reciban fVIII antes de la transección de la cola. Este método se puede utilizar para determinar la eficacia comparativa de p-VIII recombinante en fVIII derivado de plasma porcino al medir la dosis estimada que resulta en 50% de supervivencia (DE50) . Este método se puede utilizar para determinar la DE50 para ET-801 in vivo. Brevemente, los ratones con hemofilia A E16 se les administra primero una inyección intraperitoneal de una solución anestésica de 1.5 mg/kg de droperidol/75 mg/kg de ketamina. Después se les calienta bajo una lámpara de 60 batios durante 3 minutos para dilatar las venas de la cola. En un diseño del tipo dobleciego, se administran intravenosamente en la vena de la cola cantidades variables de ET-801, BDD p-fVlll, BDD h-fVIII o solución salina. Quince minutos después de la inyección a los ratones se les coloca en un tubo de limitación cónica de 50 mi, 1 cm distal de la cola se transfecta y se coloca un vertedero en un tubo de ensayo de 13 x 100 mm que contiene 7.5 mi de NaCl 150 mM que se mantiene en un baño maría a 37°C. Los ratones sobrevivientes se les pesa a las 2, 4, 6 y 24 horas. La pérdida de peso corporal, como una medida afín cuantitativa de la pérdida de sangre aguda se utilizará como una variable de eficacia secundaria. La DE50 se puede determinar utilizando el método de aumento y disminución (Dixon J. Staircasé bioassay:the up-and-dow method. Neurosci Biobehav Rev. 1991 ; 15 (1) : 47-50. , incorporado en la presente como referencia) . La desviación estándar en las respuestas de todo o nada tal como los datos de mortalidad se pueden calcular utilizando análisis probit.

COMENTARIOS CONCLUYENTES Resumiendo, las células adaptadas a suspensión de acuerdo con el método descrito, por ejemplo pero sin limitarse a células BH -Ms y células HEK-293T representan un avance tecnológico significativo en la elaboración de sustancias bioterapéuticas y producción de virus.

ET-801 es un producto novedoso en el desarrollo para el tratamiento de hemofilia A que supera la barrera principal al tratamiento de pacientes afectados, es decir, el costo de productos de fV II. En base en nuestros datos preliminares se describen y reivindican en la presente un método, sistema y línea celular que puede ser utilizado para obtener niveles de producción significativamente mayores para sustancias bioterapéuticas importantes tales como, pero sin limitarse a ET-801, que lo que se obtiene para los productos de h-fVIII comercializados actualmente. Los avances tecnológicos combinados de los elementos fVIII de alta expresión, transferencia y expresión de genes impulsada por lentivirus y utilización de la plataforma de células BH -Ms para la elaboración permitirá que ET-801 sea comercializado a un costo menor que los productos fVIII actuales y por lo tanto un mejor soporte para pacientes con hemofilia A y al mismo tiempo proporcionará un beneficio económico a través de costos de cuidados de la salud subsidiados reducidos.

Se demuestra en lo anterior que el método que aquí se describe puede ser utilizado de manera general para modificar diferentes líneas de células adherentes a cultivo de suspensión. Se ilustra que las líneas de células resultantes tienen características de rendimiento aumentado de producto con respecto a la línea celular original y/o adherente. También se describen y caracterizan tres líneas de células específicas elaboradas por el método descrito, BHK-MS-310 , BHK-MS-P14 y HECK-SC-293T . Cada una de estas líneas de células, al ser caracterizadas completamente en lo anterior, también están disponibles, entre otros lugares, al ponerse en contacto con los inventores y/o beneficiario.

El método descrito es novedoso con respecto a los métodos conocidos por diversos motivos . Los métodos conocidos de preparación de células en suspensión a partir de líneas de células de mamífero adherentes se basan predominantemente en el uso de microesferas , microportadores y otros dispositivos similares. Adicionalmente . se ha informado que la supresión de suministro de suero puede transformar algunas líneas de células de mamífero a suspensión. Las líneas de células de suspensión que resultan del método descrito presentan un estado de hacinamiento (para un ejemplo visual del estado de hacinamiento véase la figura 2 (lámina marcada como "día 10") y figuras 4a-4f, por ejemplo, las figuras 4e y 4f . En la presente se caracterizan algunas ventajas de una suspensión de células hacinadas con respecto a suspensiones de células solas que se conocen actualmente .

Además, el método que se describe aquí requiere mucho menos tiempo y menos materiales que los métodos que utilizan microesferas y/o supresión de suero. Se ha demostrado que la característica novedosa de las células de acuerdo con el método descrito es poder pasar directamente de medio que contiene suero a libre de suero sin necesidad de etapas en serie con disminución de suero (por ejemplo, transferencia de manera seriada de las células a medio que contiene cantidades reducidas de suero, por ejemplo, 10%, después 8%, después 4%, etc., hasta que lleguen a 0%) . Se ha eliminado la necesidad de supresión de suero lo cual es una ventaja novedosa y sorprendente que ahorra tiempo y recursos. Adicionalmente, las microesferas y los microportadores son extremadamente costosos, y por lo tanto el método no se basa en tener microesferas y/o microportadoras , entre otras ventajas lo que reduce costos con respecto a los métodos que requieren microportadores y/o microesferas.

Aunque la descripción escrita precedente de la invención permite a una persona habitualmente experta en el ámbito realizar y utilizar lo que actualmente se considera como el mejor modo de la misma, aquellos con habilidad habitual comprenderán y apreciarán la existencia de variaciones, combinaciones y equivalentes de la modalidad ejemplar específica y los métodos de la presente. La invención por lo tanto no debe limitarse por la modalidad y método descritos en lo anterior sino por todas las modalidades en métodos dentro del alcance y espíritu de la invención como se ha reivindicado.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (7)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para adaptar células hospedadoras a un cultivo celular en suspensión, caracterizado porque comprende : hacer crecer una o más de las células hospedadoras en un primer recipiente de cultivo, el primer recipiente de cultivo tiene un área de superficie; utilizar un medio de soporte de crecimiento que permite el crecimiento y mantenimiento de las células hospedadoras ; (a) remover el medio de soporte de crecimiento; (b) desasociar las células del recipiente de cultivo; (c) incubar las células; (d) resuspender las células en el medio de soporte de crecimiento; sembrar en placa las células resuspendidas ; hacer crecer las células por la cantidad tiempo requerida para que las células se vuelvan a adherir al recipiente de cultivo; repetir las etapas (a) - (f ) por lo menos una vez; (h) transferrir células a un matraz de cultivo en suspensión; (i) agitar las células.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células hospedadoras son por lo menos una BHK-M o HEK-293T.

3. Una línea celular caracterizada porque se produce de conformidad con la reivindicación 2.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células hospedadoras son células HEK-293.

5. Una línea celular caracterizada porque se produce de conformidad con la reivindicación 4.

6. Un método para producir por lo menos un polipéptido y un virus en un cultivo celular en suspensión, caracterizado porque comprende: una línea celular producida de conformidad con la reivindicación 2, que expresa ET-801.

7. Un sistema para producción de alto rendimiento de un producto, caracterizado porque comprende: una línea celular producida de conformidad con la reivindicación 4, que expresa ET-3.