PL192072B1

PL192072B1 - Sposób wytwarzania rekombinowanego czynnika VIII i pożywka hodowlana do wytwarzania rekombinowanego czynnika VIII

Info

Publication number: PL192072B1
Application number: PL325862A
Authority: PL
Inventors: Sham-Yuen Chan; Kathleen Harris
Original assignee: Bayer Corp
Priority date: 1997-04-18
Filing date: 1998-04-17
Publication date: 2006-08-31
Also published as: EP0872487A3; US5804420A; SK49798A3; KR19980081531A; TW490469B; AU6198298A; CZ115698A3; HK1018797A1; PL325862A1; EP0872487A2; HUP9800901A2; RU2222547C2; UA66340C2; CO4790112A1; JP4257685B2; NZ330183A; HUP9800901A3; ES2273380T3; DK0872487T3; BRPI9801092B8

Abstract

1. Sposób wytwarzania rekombinowanego czynnika VIII z komórek ssaczych niosacych jego gen, znamienny tym, ze obejmuje hodowanie tych komórek ssaczego gospodarza w pozywce wolnej od bialek pochodzenia osoczowego z dodatkiem polioli i jonów miedzi. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rekombinowanego czynnika VIII i pożywka hodowlana do wytwarzania rekombinowanego czynnika VIII.

Hemofilia A jest genetycznym, recesywnym zaburzeniem związanym z chromosomem X, spowodowanym nieprawidłową budową cząsteczki czynnika VIII albo jego brakiem, co powoduje skłonność do krwawienia. W celu zwalczenia krwawień hemofilitycy są leczeni czynnikiem VIII. Po raz pierwszy czynnik VIII wyizolowano z osocza ludzkiego. Jednakże, leczenie czynnikiem VIII pochodzącym z osocza związane jest z przenoszeniem niektórych wirusów ludzkich, takich jak wirusy zapalenia wątroby i ludzki wirus niedoboru odporności.

Wraz z rozwinięciem technologii rekombinacji DNA, wyjaśniono budowę czynnika VIII i jego genu. Produkt transkrypcji genu, pochodzący z 26 egzonów, jest cząsteczką mRNA o długości około 9000 zasad, kodującą duże białko o 2351 aminokwasach. Badania strukturalne czynnika VIII wskazują, że jest to glikoproteina zawierająca znaczną liczbę reszt węglowodanów.

cDNA kodujący czynnik VIII sklonowano i poddano stabilnej ekspresji w komórkach nerki noworodkowej chomika (BHK-21) i komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO). Opracowano komercyjne procesy produkcji rekombinowanego czynnika VIII do leczenia hemofilii A. Rekombinowany czynnik VIII obecnie wytwarza się w komórkach ssaczych zmodyfikowanych genetycznie, unikając w ten sposób wykorzystywania osocza i minimalizując jakiekolwiek potencjalne ryzyko przeniesienia wirusa.

Amplifikacja genu stała się metodą z wyboru w celu uzyskania wysoce produktywnych linii komórkowych wytwarzających białka o zastosowaniu terapeutycznym. Strategia amplifikacji obejmuje połączenie jednostki transkrypcyjnej kodującej pożądane białko ze znacznikiem ulegającym amplifikacji, takim jak reduktaza dihydrofolianowa. W celu przeniesienia DNA wektora do komórek biorcy stosuje się techniki transfekcji. Populacje komórek selekcjonuje się pod kątem wzrostu oporności na wybrany lek, taki jak metotreksat. Ustalenie stabilnego klonu komórek uzyskuje się metodą granicznych rozcieńczeń. Takie klony komórek adaptuje się do bezsurowiczych pożywek produkcyjnych i bada się wytwarzanie pożądanego białka.

W przypadku białek labilnych, takich jak czynnik VIII, podczas procesów produkcji i oczyszczania dodaje się albuminę ludzką jako stabilizator. Jakkolwiek albuminę poddaje się etapowi inaktywacji wirusów przez pasteryzację, byłoby ideałem wytwarzanie rekombinowanego czynnika VIII całkowicie bez obecności ludzkich albo zwierzęcych białek krwi. Obecnie, stwierdzono, że jest to możliwe przez zastosowanie nowej pożywki hodowlanej dla komórek. Szczegóły opisano poniżej.

Sposób wytwarzania rekombinowanego czynnika VIII (rFYIII) w komórkach ssaczych niosących jego gen według wynalazku obejmuje hodowanie tych komórek gospodarza ssaczego w pożywce wolnej od białek pochodzenia osoczowego z dodatkiem polioli i jonów miedzi. Korzystnie poliolem jest polimer Pluronic F-68, występujący w pożywce w stężeniu od około 0,025 do około 0,2% wagowych. Korzystnie pożywka zawiera siarczan miedzi w ilości od około 50 nm do około 800 nM.

Korzystnie pożywka zawiera też sole metali śladowych takich jak mangan, molibden, krzem, lit i chrom. Korzystnie pożywka dodatkowo zawiera jony manganu w ilości od około 1,5 nM do około 4,5 nM, jony molibdenu w ilości od około 1,5 nM do około 4,5 nM, jony krzemu w ilości od około 75nM do około 300nM, jony chromu w ilości od około 1,0 nM do około 4,0 nM, a jony litu w ilości od około 120 nm do około 480 nM.

Ostatnie osiągnięcia techniki ekspresji białka rekombinowanego umożliwiły wytwarzanie znacznych ilości białka w komórkach ssaczych. Korzystnie komórki gospodarza przydatne w sposobie według wynalazku do wytwarzania czynnika VIII obejmują linie komórkowe takie jak komórki nerki noworodkowej chomika (BHK), komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) i ludzkie komórki nerki płodowej (HEK). Szczególnie korzystne są to komórki nerki noworodkowej chomika, a zwłaszcza transfekowane genem zdolnym do kierowania ekspresją czynnika VIII, takie jak opisane w Wood i in. (1984) (w tym takie pochodne jak odmiany klonalne i ich potomstwo). Takie linie komórkowe zdeponowano w American Type Culture Collection pod numerem ATCC CRL-8544.

Pożądana linia komórkowa gospodarza niosąca gen czynnika VIII jest zwykle zaadaptowana do wzrostu jako hodowle w zawiesinie w pożywkach pozbawionych białka, które uzupełniono lipoproteiną.

W zakres wynalazku wchodzi pożywka hodowlana do wytwarzania rekombinowanego czynnika VIII obejmująca (a) pożywkę podstawową (b) poliol; i (c) jony miedzi, przy czym pożywka hodowlana jest wolna od białka pochodzenia osoczowego.

PL 192 072 B1

Korzystnie pożywka hodowlana ponadto zawiera co najmniej jeden metal śladowy wybrany z grupy składającej się z manganu, molibdenu, krzemu, chromu i litu. Korzystnie jony miedzi są obecne w ilości od około 50 do około 800 nM. Korzystnie pożywka ponadto zawiera jony molibdenu w ilości od około 1,5 do około 4,5 nM, lub jony litu w ilości 120 do 480 nM. Pożywka hodowlana według wynalazku korzystnie ponadto zawiera insulinę wytwarzaną metodą rekombinacji.

Pożywka podstawowa wybrana do hodowli komórek gospodarza nie jest kluczowa dla wynalazku i może być dowolną pożywką albo kombinacją znanych pożywek, które są przydatne do hodowania komórek ssaczych. W handlu dostępne są pożywki takie jak pożywka Eagle'a w modyfikacji Dulbecco, pożywka F-12 Ham'a, minimalna niezbędna pożywka Eagle'a i RPMI-1640 itp. W stanie techniki konwencjonalne jest dodawanie czynników wzrostowych, takich jak rekombinowana insulina.

Z powodu labilności czynnika VIII, produktywność komórek rekombinowanych komórek gospodarza w warunkach wolnych od białka jest znacznie zmniejszona. Albuminę surowicy ludzkiej stosuje się często jako dodatek do hodowli bezsurowiczych przy wytwarzaniu białek rekombinowanych. Albumina surowicy ludzkiej służy wielu celom, w tym:

(1) jako nośnik kwasów tłuszczowych, cholesterolu i witamin lipofilowych, hormonów steroidowych i czynników wzrostowych;

(2) jako środek ochronny przed uszkodzeniami spowodowanymi siłami tnącymi;

(3) jako bufor zmian pH; i (4) jako regulator ciśnienia osmotycznego.

Inną krytyczną rolą albuminy jest prawdopodobnie ochrona białek labilnych, takich jak czynnik VIII przed proteolizą, gdy służy jako substrat proteaz.

Zanieczyszczenia obecne w preparatach albuminy mogą również przyczyniać się do stabilizującego efektu albumin. Stwierdzono, że czynniki takie jak lipoproteina (Chan, 1996) mogą zastąpić albuminę surowicy ludzkiej podczas wytwarzania rekombinowanego czynnika VIII w warunkach bezsurowiczych.

Próby opracowania pożywki produkcyjnej wolnej od albuminy pochodzącej z ludzkiego osocza doprowadziły do niniejszego wynalazku, pożywki podstawowej wolnej od białek, do wytwarzania rekombinowanego czynnika VIII. Korzystna pożywka obejmuje minimalną niezbędną pożywkę w modyfikacji Dulbecco i pożywkę F-12 Ham'a (w stosunku wagowym 50:50) z dodatkiem rekombinowanej insuliny (Nucellin, Eli Lilly) w stężeniu 10 mg/ml i FeSO,^EDTA (50 mM). Z wyłączeniem wytwarzania czynnika VIII, rekombinowane komórki BHK rosną dobrze w tej podstawowej pożywce wolnej od białka.

Nieoczekiwanie, okazało się, że dodatek poliolu, takiego jak PluronicF-68, nie wywiera wpływu na wzrost, ale zwiększa swoiście wytwarzanie czynnika VIII przez komórki BHK. Nieoczekiwanie, dodatek siarczanu miedzi dalej zwiększa wytwarzanie czynnikaVIII. Również dodatek szeregu metali śladowych takich jak mangan, molibden, krzem, lit i chrom prowadzi do dalszego wzrostu wytwarzania czynnika VIII. Opracowano ciągły proces wytwarzania czynnika VIII w warunkach wolnych od białka pochodzącego z ludzkiego osocza. Dalsze informacje dotyczące zastosowania polioli typu Pluronic można znaleźć w pracy Papoutsakis (1991) i Schmolka (1977).

Pluronic F-68, poliglikol (BASF, Wyandot) jest powszechnie stosowany w celu zapobiegania pienieniu występującemu w hodowlach podczas mieszania oraz w celu ochrony komórek przed siłami ścinającymi oraz uszkodzeniami przez pęcherzyki gazu w hodowlach barbotowanych. Pluronic F-68 jest niejonowym kopolimerem blokowym o średnim ciężarze cząsteczkowym 8400, składającym się zcentralnego bloku poli(oksypropylenu) (20% wagowo) i bloków poli(oksyetylenu) na obu końcach. Intensywne badania roli Pluronic F-68 wskazują, że działa on jako surfaktant i zapobiega uszkodzeniom komórek przez odciąganie komórek od pęcherzyków tworzonych w bioreaktorach podczas mieszania albo barbotowania. Jednakże, niektórzy badacze zauważyli dobroczynny wpływ Pluronic F-68 na wzrost w hodowlach, w których siły ścinające są minimalne (Mizrahi, 1975; Murhammer i Goochee, 1990). Równoczesne oczyszczanie lipidów z Pluronic F-68 podczas oczyszczania produktu dostarcza niepotwierdzonych danych, że polimery Pluronic mogą zastąpić albuminę, nie tylko jako surfaktant, ale mogą również działać jako nośnik lipidów. Pluronic F-68 może również zapobiec zabijaniu komórki wwyniku uszkodzenia błony, dopóki nie nastąpi naprawa, prawdopodobnie przez wbudowywanie się do błony. Rola Pluronic F-68 jako bufora jonów metali jest całkowicie nieznana.

Jakkolwiek istnieją doniesienia, że Pluronic F-68 w pożywkach może zwiększyć objętościową produktywność, mechanizm działania wydaje się polegać na utrzymywaniu żywotności komórek (Schneider, 1989; Qi, 1996). Zgodnie z naszą wiedzą właśnie po raz pierwszy zaobserwowano swoisty wpływ Pluronic F-68 na zwiększenie wytwarzania konkretnego produktu białkowego. Ponieważ żywot4

PL 192 072 B1 ność i tempo wzrostu są porównywalne w niniejszym układzie z i bez Pluronicu F-68, utrzymywanie żywotności komórek nie może być mechanizmem działania Pluronicu F-68 w tym układzie. Jednakże, wpływ dodatku Pluronicu F-68 jest natychmiastowy i gwałtowny, niezależnie od mechanizmu działania.

Oczekuje się, że szereg innych polioli powinno mieć podobny wpływ. Poliole takie obejmują niejonowe kopolimery blokowe poli(oksyetylenu) i poi(oksypropylenu) o ciężarze cząsteczkowym w zakresie od około 1000 do około 16000.

Oprócz konwencjonalnych technik hodowli w zawiesinie, takich jak wytrząsane butelki, butelki z mieszalnikami i butelki typu „roller”, sposób według wynalazku można również zastosować w bioreaktorach z perfuzją i bioreaktorach okresowych. Po hodowli komórek, czynnik VIII można odzyskać z zużytej pożywki standardową metodyką, taką jak ultrafiltracja albo wirowanie. Jeżeli jest to konieczne, odzyskany czynnik VIII można oczyszczać, przykładowo, przez chromatografię jonowymienną albo żelową, chromatografię powinowactwa immunologicznego albo chelatacji metalu itp.

W znaczeniu tu zastosowanym, „pożywka wolna od białka ludzkiego albo zwierzęcego jest pożywką hodowlaną, która nie zawiera żadnego białka pochodzącego ze źródeł ludzkich albo zwierzęcych. Białka, które izoluje się ze źródeł ludzkich albo zwierzęcych, wiążą się z ryzykiem zanieczyszczeń wirusowych. Tak więc, celem pożywki wolnej od białka ludzkiego albo zwierzęcego jest eliminacja albo znaczne ograniczenie ryzyka przeniesienia wirusa.

P r z y k ł a d 1: Komórki nerki noworodkowej chomika (BHK-21) transfekowane genem zdolnym do kierowania ekspresją czynnika VIII otrzymano z Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornia, USA. Linię komórkową wytworzono, jak to opisano w Wood i in., (1984) i zdeponowano w American Type Culture Collection pod numerem ATCC CRL-8544. Odmiany klonalne tej linii komórkowej również otrzymano od Genentech, Inc., i zastosowano we wszystkich przykładach.

Komórki BHK-21 zawierające gen kodujący czynnik VIII hodowano jako zawiesinę w wytrząsanych butelkach stosując bezsurowiczą pożywkę podstawową zawierającą: pożywkę F-12 Ham'a i minimalną niezbędną pożywkę Dulbecco (w stosunku wagowym 50:50), Nucellin (rekombinowana insulina, 5-10 (mg/ml), FeSO₄^EDTA (50 mM) i MgCl₂ (15 mM). Komórki utrzymywano i pasażowano w odstępach 48 godzinnych. Komórki wirowano przy 800 x g przez 5 minut, liczono i ponownie wysiewano z gęstością 1 x 10⁶ komórek/ml. Każda z butelek zawierała 50-100 ml świeżej pożywki. Butelki umieszczano na wytrząsarce, inkubowano w 37°C i utrzymywano jako hodowlę w zawiesinie przez delikatne mieszanie z prędkością 90-110 obr./min. Wpływ poliolu takiego jak Pluronic F-68 (0,1%), określony poniżej jako F-68, oraz siarczanu miedzi (50 nM) na wytwarzanie czynnika VIII badano w butelkach do wytrząsania. Czynnik VIII oceniano ilościowo testem chromogennym. Test jest dostępny w handlu jako Coatest VIII:C/4 z firmy Baxter HealthCare Products. Komórki utrzymywano w ten sposób przez 24 dni. Aktywność czynnika VIII w każdej z pożywek, oznaczoną za pomocą zestawu Coatest VIII:C/4 przedstawiono w tabeli 1.

T a b e l a 1

Warunki	Miano (U/ml)	Produktywność właściwa (mU/komórkę/-dzień)	% wzrostu w stosunku do pożywki podstawowej
Pożywka podstawowa	0,15 ± 0,07*	0,026 ± 0,013	0
Podstawowa + F-68 (0,1%)**	0,24 ± 0,04	0,052 ± 0,013	200
Podstawowa + F-68 (0,1%) + Cu (50 nM)	0,42 ± 0,09	0,091 ± 0,013	350

* Średnia z 36 próbek ± odchylenie standardowe. Komórki badano pod względem wytwarzania czynnika VIII w ciągu 24 dni, jak to opisano wyżej.

** Miareczkowanie wykazało, że 0,1% stanowi optymalną dawkę Pluronic F-68. Zwiększenie stężenia do 0,3% nie wpływało na wytwarzanie czynnika VIII. Badania zależności od dawki wykazały, że 50-800 nM siarczanu miedzi jest optymalne do wytwarzania czynnika VIII.

Jak pokazano w tabeli 1, dodatek Pluronic F-68 samego albo, korzystnie, w kombinacji z siarczanem miedzi, istotnie zwiększa miano i produktywność właściwą komórek BHK zawierających gen kodujący czynnik VIII w warunkach bezbiałkowych.

P rz y k ł a d 2: W celu dalszej optymalizacji wytwarzania czynnika VIII w warunkach bezbiałkowych, do bezbiałkowej pożywki produkcyjnej dodano metali śladowych. Następnie, badano wytwarzanie czynnika VIII w układzie do hodowli ciągłej w wytrząsanych butelkach,, jaki opisano w przykłaPL 192 072 B1 dzie 1, przez 16 dni. Dane przedstawiono w tabeli 2. Pod nieobecność siarczanu miedzi, metale śladowe nie mają wpływu na produktywność czynnika VIII. Patrz tabela2.

Tabe la 2

Warunki	Miano (U/ml)	Produktywność właściwa (mU/komórkę/-dzień)	% wzrostu w stosunku do pożywki podstawowej + F-68
Pożywka podstawowa + F-68	0,46 ± 0,011	0,065 ± 0,013	0
Podstawowa + F-68 + Cu	0,53 ± 0,15	0,078 ± 0,026	120
Podstawowa + F-68 + Cu + metale*	0,73 ± 0,16	0, 104 ± 0, 026	160

* Metale obejmowały CuSO4»5H2O (50 nM), MnSCU (3 nM), Na2SiO3»9H2O (1,5 mM), [NH4] 6Mo7O24»4H2O (3 nM), CrK(SO4)2»4H2O (1,5 nM) i LiCl (236 nM).

Przykład 3: Wpływ metali śladowych i miedzi na wytwarzanie czynnika VIII dalej badano wfermentorze perfuzyjnym. Dwa 1,5-litrowe fermentory zasiedlono odmianą klonalną BHK z gęstością 2 x 10⁶ komórek/ml stosując pożywkę podstawową opisaną w tabeli 1. Fermentor perfundowano wtempie 0,5 l/dzień. Jeden z fermentorów zachowano jako kontrolę, zaś drugi uzupełniono miedzią imetalami śladowymi, jak to opisano w tabeli2. Fermentory utrzymywano przez 15 dni ze średnią gęstością komórek równą ~2-3x10⁶ komórek/ml. Jak pokazano w tabeli3, dodanie Pluronicu F-68, miedzi i metali śladowych istotnie zwiększyło produktywność właściwą komórek BHK niosących gen kodujący czynnik VIII w warunkach bezbiałkowych i przy ciągłej perfuzji. Ten sposób wytwarzania można łatwo zaadaptować do większych fermentorów (200-500 litrów) wyposażonych w urządzenia zatrzymujące komórki, takie jak odstojniki.

Tabe la 3

Dni	Produktywność właściwa (mU/komórkę/dzień)
Pożywka podstawowa	Cu + metale
1	0,02	0,04
2	0,02	0,05
3	0,02	0,045
4	0,018	0,05
5	0,02	0,05
6	0,035	0,06
7	0,025	0,055
8	0,02	0,04
9	0, 025	0,06
10	0,02	0,065
11	0,025	0,07
12	0,025	0,065
13	0,02	0,06
14	0,03	0,06
15	0,02	0,05

Powyższe przykłady dostarczono w celu zilustrowania, nie zaś w celu ograniczania niniejszego wynalazku, który określają jedynie zastrzeżenia.

Claims

1. Sposób wytwarzania rekombinowanego czynnika VIII z komórek ssaczych niosących jego gen, znamienny tym, że obejmuje hodowanie tych komórek ssaczego gospodarza w pożywce wolnej od białek pochodzenia osoczowego z dodatkiem polioli i jonów miedzi.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że poliolem jest Pluronic F-68 i występuje w pożywce w stężeniu od około 0,025 do około 0,2% wagowych.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pożywka zawiera siarczan miedzi w ilości od około 50 nM do około 800 nM.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pożywka zawiera dodatkowo jony manganu w ilości od około 1,5 nM do około 4,5 nM.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pożywka zawiera dodatkowo jony molibdenu w ilości od około 1,5 nM do około 4,5 nM.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pożywka zawiera dodatkowo jony krzemu w ilości od około 75 nM do około 300 nM.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pożywka zawiera dodatkowo jony chromu w ilości od około 1,0 nM do około 4,0 nM.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pożywka zawiera dodatkowo jony litu w ilości od około 120 nM do około 480 nM.

9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że komórka ssaczego gospodarza wybrana jest z grupy składającej się z komórki nerki noworodkowej chomika, ludzkiej komórki nerki płodowej i komórki jajnika chomika chińskiego.

10. Pożywka hodowlana do wytwarzania rekombinowanego czynnika VIII, znamienna tym, że obejmuje:

(a) pożywkę podstawową;

(b) poliol; i (c) jony miedzi, przy czym pożywka hodowlana jest wolna od białka pochodzenia osoczowego.

11. Pożywka według zastrz. 10, znamienna tym, że ponadto zawiera co najmniej jeden metal śladowy wybrany z grupy składającej się z manganu, molibdenu, krzemu, chromu i litu.

12. Pożywka według zastrz. 10, znamienna tym, że zawiera jony miedzi w ilości od około 50 do około 800 nM.

13. Pożywka według zastrz. 11, znamienna tym, że ponadto zawiera jony molibdenu obecne w ilości od około 1,5 do około 4,5 nM.

14. Pożywka według zastrz. 11, znamienna tym, że ponadto zawiera jony litu obecne w ilości 120 do 480 nM.

15. Pożywka według zastrz. 10 albo 11, znamienna tym, że ponadto zawiera insulinę wytwarzaną metodą rekombinacji.