KR19980081531A - 단백질을 함유하지 않는 배지에서의 재조합 인자 ⅷ의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

폴리올 공중합체가 추가된 단백질이 없는 배지에서, 알부민과 같은 동물에서 유래된 단백질의 부재하에, 바람직하게는 구리와 같은 미량 금속의 존재하에서 세포를 배양함으로써 포유류 세포로부터 재조합 인자 VIII을 연속식으로 비교적 대량으로 제조할 수 있다. 매우 바람직한 실시 형태에서, 배지는 플루로닉 (Pluronic) F-68로 공지된 폴리글리콜, 황산구리, 황산제일철/EDTA 착화합물, 및 망간, 몰리브덴, 규소, 리튬 및 크롬과 같은 미량 금속의 염을 함유한다.

Description

단백질을 함유하지 않는 배지에서의 재조합 인자 Ⅷ의 제조 방법
본 발명은 일반적으로 재조합 인자 VIII의 제조에 관한 것으로서, 특히 혈청 또는 단백질을 함유하지 않는 배지에서 재조합 인자 VIII의 제조에 관한 것이다.
혈우병 A는 결손 또는 결함이 있는 인자 VIII 분자로 인해 출혈을 일으키는 X-연쇄 열성 유전병이다. 혈우병 환자들은 인자 VIII로 출혈 증상 발현을 조절해서 치료한다. 역사적으로 인자 VIII은 인간의 혈장으로부터 분리되었다. 그러나, 혈장에서 유래된 인자 VIII을 이용한 치료는 간염 및 인간의 면역 결핍 바이러스와 같은 몇몇 인간 바이러스의 전염과 관련이 있었다.
재조합 DNA 기술의 도래로, 인간 인자 VIII 및 그의 유전자의 구조가 밝혀졌다. 26개 엑손으로부터 유도되는 유전자의 전사물은 2351개 아미노산의 거대 단백질을 암호화하는 ∼9000개 염기 길이의 mRNA 분자이다. 인자 VIII에 대한 구조적인 연구 결과, 인자 VIII은 상당수의 탄수화물 잔기를 함유하는 당단백질인 것으로 나타났다.
인자 VIII에 대한 cDNA 암호화를 어린 햄스터 신장 (BHK-21) 및 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 클로닝하고 안정하게 발현시켰다. 혈우병 A의 치료를 위한 재조합 인자 VIII의 상업적인 제조 방법을 개발하였다. 재조합 인자 VIII은 현재 유전공학적으로 처리된 포유류 세포에 의해 제조되며, 따라서 혈장에 의존할 필요가 없으며, 바이러스 감염에 대한 가능한 어떤 위험도 최소화 하였다.
유전자 증폭은 치료 단백질의 고생산 세포주 (cell lines)를 유도하기 위해 선택된 방법이었다. 증폭 방법은 목적하는 단백질을 암호화하는 전사체를 디히드로폴레이트 환원 효소와 같은 증폭 가능한 표지 (marker)에 연결하는 것을 포함한다. 이어서, 벡터 DNA를 숙주 세포로 운반시키는데 트랜스펙션 (transfection) 기술을 사용한다. 메토트렉세이트와 같은 특정 약물에 대한 내성이 증가된 세포 모집단을 선택한다. 안정한 세포 클론은 희석 클로닝을 제한함으로써 설정된다. 이어서, 이런 세포 클론들을 혈청-무함유 생산 배지에 적응시키고, 목적하는 단백질의 생산을 모니터한다.
인자 VIII과 같은 불안정한 단백질의 제조 및 정제 과정 중에는 인간 알부민이 안정화제로 첨가되었다. 알부민을 살균에 의한 바이러스 불활성화 단계를 거치게 한다 하더라도, 인간 및 동물의 혈청 단백질이 완전히 존재하지 않을 때 재조합 인자 VIII을 제조할 수 있다면 이상적일 것이다. 본 발명자는 본 발명에 이르러 신규한 세포 배양 배지를 사용함으로써 이러한 것이 가능함을 발견하였다. 상세한 것은 후술한다.
인간 또는 동물에서 유래된 혈장 단백질의 부재하에, 포유 동물 세포로부터 재조합 인자 VIII (rFVIII)을 비교적 다량으로 연속 생산하는 방법은 플루로닉 (Pluronic) F-68과 같은 폴리올 중합체가 추가된 단백질-무함유 배지에서 포유 동물의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다. 바람직한 배지는 황산구리, 황산제일철/EDTA 착화합물 및 망간, 몰리브덴, 규소, 리튬 및 크롬과 같은 미량 금속의 염을 함유한다.
최근의 재조합 단백질 발현 기술의 발전은 포유 동물 세포에서 단백질을 다량으로 제조하는 것을 가능하게 만들었다. 인자 VIII 제조에 적당한 숙주 세포들로서는 어린 햄스터 신장 (BHK) 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 및 인간의 태아 신장 (HEK) 세포와 같은 세포주를 포함한다. 어린 햄스터 신장 세포, 특히 Wood 등 (1984)에 의해 기재된 인자 VIII의 발현을 조작할 수 있는 유전자로 트랜스펙션된 것들이 특히 바람직하다 (클론 변이체 및 그의 자손과 같은 유도체 포함). 이러한 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)에 기탁해서 수탁 번호 ATCC CRL-8544를 지정받았다.
인자 VIII 유전자를 운반하는 목적하는 숙주 세포주는 전형적으로 리포 단백질이 추가된 단백질-무함유 생산 배지에서 현탁 배양액으로 성장시키는 것이 적당하다. 숙주 세포주의 배양을 위해 선택된 기초 배지는 본 발명에서는 중요하지 않고, 포유 동물 세포를 배양하는데 적당한, 당업계에 공지된 것 중의 하나 또는 이들의 조합이면 무방하다. Dulbecco's Modified Eagle 배지, Ham's 배지 F-12, Eagle's Minimal Essential 배지 및 RPMI-1640 배지 등과 같은 배지가 시판중이다. 재조합 인슐린과 같은 성장 인자를 추가하는 것은 당업계에서 통상적이다.
인자 VIII의 변성하기 쉬운 성질 때문에, 처리된 숙주 세포의 생산성은 단백질-무함유 조건하에서 급격하게 감소한다. 인간 혈청 알부민은 재조합 단백질의 제조시 혈청-무함유 배양 보조물로 통상적으로 사용된다. 인간 혈청 알부민은 (1) 지방산, 콜레스테롤 및 지용성 비타민, 스테로이드 호르몬 및 성장 인자의 운반체, (2) 전단력으로 인한 손상에 대한 보호제, (3) pH 변화에 대한 완충제, (4) 삼투압 조절제와 같은 여러가지 기능을 갖는다. 알부민의 또 다른 중요한 역할은 아마도 단백질 분해 효소의 기질로 작용함으로써 인자 VIII과 같은 변성하기 쉬운 단백질을 단백질 분해로부터 보호하는 것이다.
또한, 알부민 제조시 존재하는 불순물은 알부민의 안정화 효과에 기여를 할수도 있다. 리포 단백질과 같은 인자 (Chan, 1996)는 무-혈청 조건하에서 재조합 인자 VIII의 제조를 위한 인간 혈청 알부민을 대체할 수 있는 것으로 알려져 있다.
인간 혈장에서 유래된 알부민이 없는 생산 배지를 개발하기 위한 본 발명자들의 시도에 의해 본 발명, 즉, 재조합 인자 VIII 제조를 위한 단백질-무함유 기초 배지가 개발되었다. 재조합 인슐린 (Nucellin, Eli Lilly사 제품) 10 μg/mol 및 FeSO4·EDTA (50 μM)가 보충된 개질된 Dulbecco's Minimal Essential 배지 및 Ham's F-12 배지 (50:50, 중량비)로 이루어진 배지가 바람직하다. 인자 VIII의 제조를 제외하고, 처리된 BHK 세포는 본 발명의 단백질-무함유 기초 배지에서 잘 자란다.
놀랍게도, 플루로닉 F-68과 같은 폴리올의 첨가는 성장에 아무런 영향이 없었지만, 인자 VIII을 위한 BHK 세포의 특이한 생산성을 향상시켰다. 뜻하지 않은 발견으로, 황산구리의 첨가는 또한 인자 VIII의 생산을 더 향상시킨다. 또한, 망간, 몰리브덴, 규소, 리튬 및 크롬과 같은 미량 금속염을 함유시키면 인자 VIII 생산을 더 증가시킨다. 이어서, 인간 혈장 유래의 단백질-무함유 조건하에서 인자 VIII을 생산하기 위한 연속법을 개발하였다. 플루로닉 폴리올의 사용에 관한 추가의 정보는 Papoutsakis (1991) 및 Schmolka (1977)의 문헌에서 찾을 수 있다.
교반되는 배양물에서 발생하는 거품 형성을 막고, 살포된 배양물에서의 전단 응력 및 기포 손상으로부터 세포를 보호하기 위해 폴리글리콜인 플루로닉 F-68 (바스프 (BASF)사 제품)이 통상 사용된다. 플루로닉 F-68은 중심에 폴리(옥시프로필렌) (20 중량%) 블록과 양 말단에 폴리(옥시에틸렌) 블록으로 구성되는, 평균 분자량 8400의 비이온성 블록 공중합체이다. 플루로닉 F-68의 역할에 대하여 예의 연구한 결과가, 플루로닉 F-68은 계면 활성제로 작용하여, 교반 또는 살포 중에 생물 반응기에서 형성되는 거품을 세포로부터 배출시킴으로써 세포의 손상을 막는 것으로 나타났다. 그러나, 몇몇 연구자들은 전단력이 최소인 배양 조건하에서 플루로닉 F-68은 성장에 이로운 효과가 있음을 알아내었다 (Mizrahi, 1975; Murhammer 및 Goochee, 1990). 생성물을 정제하는 동안 플루로닉 F-68과 함께 지질의 동시정제는 플로로닉 중합체가 계면 활성제로서 알부민을 대체할 수 있을 뿐만 아니라, 지질의 운반체로도 작용할 수 있다는 일화같은 증거를 제공한다. 또한, 플루로닉 F-68은 아마도 막으로의 직접적인 삽입에 의해 수복할 수 있기 전에 막 손상에 대해 세포가 죽는 것을 방지할 수 있다. 금속 이온 완충제로서 작용하는 플루로닉 F-68의 역할은 완전히 알려지지 않는다.
배지 중의 플로로닉 F-68이 부피 생산성을 증가시킨다는 보고가 있지만, 작용 메카니즘은 세포의 생존 능력을 유지하는 것처럼 보인다 (Schneider, 1989; Qi, 1996). 확실히, 플루로닉 F-68이 특정 단백질 생성물의 특이 생산을 증가시키는 것을 보여준 것은 본 발명이 처음이다. 본 발명자들의 플루로닉 F-68 함유 시스템 및 함유하지 않는 시스템에서 생존 능력 및 성장 속도가 비슷하기 때문에, 세포 생존 능력의 유지가 본 발명자들의 시스템에서 플루오닉 F-68의 작용 메카니즘이 될 수는 없다. 그러나, 플루로닉 F-68 첨가 효과는 메카니즘이 어떻든 간에 즉각적이고 극적이다.
일련의 다른 폴리올들이 비슷한 효과를 가질 것이라고 예상할 수 있다. 이러한 다른 폴리올로서는 약 1000 내지 약 16,000 범위의 분자량을 갖는 폴리(옥시에틸렌) 및 폴리(옥시프로필렌)의 비이온성 블록 공중합체를 포함한다.
본 발명의 방법은 쉐이크 플라스크, 스피너 플라스크 및 롤러 보틀 배양과 같은 통상적인 현탁 배양 기술에 덧붙여서, 관류 및 뱃치식 생물 반응기의 사용에도 적당하다. 숙주 세포의 배양에 이어, 한외 여과 또는 원심 분리와 같은 표준 방법에 의해 사용된 배지로부터 인자 VIII을 회수할 수 있다. 필요하다면, 회수한 인자 VIII을 예를 들어, 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피, 면역-친화성 또는 금속 킬레이트 크로마토그래피 등과 같은 방법으로 정제할 수 있다.
본 발명에서 사용된 인간 또는 동물 단백질-무함유 배지란 인간 또는 동물 공급원으로부터 유래된 단백질을 전혀 함유하지 않는 세포 배양 배지이다. 인간 또는 동물 공급원으로부터 분리된 단백질은 본래 바이러스성 오염을 일으키는 위험을 지닌다. 따라서, 인간 또는 동물 단백질-무함유 배지의 목표는 바이러스성 전염을 제거하거나 적어도 크게 감소시키는 것이다.
실시예 1
인자 VIII 발현을 조작할 수 있는 유전자로 트랜스펙션된 어린 햄스터 신장 (BHK-21) 세포를 미국 캘리포니아주 샌 프란치스코 남부에 있는 제넨테크사(Genentech, Inc.,)로부터 입수하였다. 세포주는 Wood 등 (1984)에 의해 상세하게 기재된 대로 제조해서 아메리칸 타입 컬처 콜렉션에 기탁하여 수탁 번호 ATCC CRL-8544를 받았다. 또한, 이 세포주의 클론 변이체도 제넨테크사에서 입수하였으며, 모든 실시예에서 사용하였다.
Ham's F-12 배지 및 Dulbecco's Minimal Essential 배지 (50:50, 중량비), 뉴셀린 (재조합 인슐린, 5-10 μg/ml), FeSO4·EDTA (50 μM) 및 MgCl2(15 mM)을 포함하는 혈청-무함유 기초 배지를 사용하여 쉐이크 플라스크에서 현탁 배양액으로 인자 VIII을 암호화하는 유전자를 함유하는 BHK-21 세포를 배양하였다. 세포들을 48 시간 간격으로 유지 및 통과시켰다. 5분 동안 800 x g로 세포들을 회전시키고, 계수하고, ml당 1×106개의 세포 밀도로 재접종시켰다. 각각의 플라스크는 새로운 배지 50-100 ml를 포함한다. 쉐이크 플라스크를 회전기에 놓고, 37 ℃에서 배양시켜서, 90 내지 110 r.p.m으로 부드럽게 회전시킴으로써 현탁 배양액으로 유지시켰다.
인자 VIII의 생산에 미치는 플루로닉 F-68 (0.1 %) (하기 표에서는 F-68로 나타냄)와 같은 폴리올 및 황산구리 (50 nM)의 영향을 쉐이크 플라스크에서 시험했다. 인자 VIII은 발색 분석기 (chromogenic assay)로 정량하였다. 이 분석기는 Coatest VIII:C/4로 알려진 시험 키트로서 시판 중이고, 박스터 헬스케어 프러덕츠 (Baxter HealthCare Products)사로부터 구입할 수 있다. 세포는 24 일 동안 상기 과정에 따라 유지시켰다. 각 배지의 인자 VIII 활성을 Coatest VIII:C/4 키트로 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.
조건 역가 (U/ml) 비(比)생산성(μU/세포/일) 기초 배지에 대한 증가%
기초 배지 0.15 ± 0.07* 0.026 ± 0.013 0
기초 배지+F-68(0.1%)** 0.24 ± 0.04 0.052 ± 0.013 200
기초 배지+F-68 (0.1%) +Cu (50 nM)** 0.42 ± 0.09 0.091 ± 0.013 350
*36개 샘플의 평균±표준 편차. 상기한 바와 같이 24 일의 기간에 걸쳐 인자 VIII 제조에 대해 세포를 모니터하였다.**적정 실험 결과, 0.1 %가 플루로닉 F-68의 최적량인 것으로 나타났다. 0.3 %까지의 농도 증가는 인자 VIII 제조에 전혀 영향을 주지 않았다. 투입량-반응 실험 결과, 황산구리 50-800 nM이 인자 VIII의 제조에 최적 투여인 것으로 나타났다.
표 1에서 나타낸 바와 같이, 플루로닉 F-68만의 첨가 또는 바람직하게는 황산구리와의 조합이 단백질-무함유 조건하에서 인자 VIII을 암호화하는 유전자를 함유하는 BHK 세포의 역가 및 비(比)생산성을 크게 향상시켰다.
실시예 2
단백질-무함유 조건하에서 인자 VIII의 생산 조건을 더 최적화하기 위하여, 미량 금속을 단백질-무함유 생산 배지에 첨가하였다. 이어서, 실시예 1에 기재된 바와 같이 16일 동안 연속 쉐이크 플라스크 배양 시스템에 의해 인자 VIII의 생산을 평가하였다. 데이터를 하기 표 2에 나타낸다. 황산구리가 없을 때, 미량 금속은 인자 VIII의 생산성에 전혀 영향을 주지 않았다. 표 2 참조.
조건 역가 (U/ml) 비(比)생산성(μU/세포/일) 기초 배지+F-68에 대한 증가%
기초 배지+F-68 0.46 ± 0.11 0.065± 0.013 0
기초 배지+F-68+Cu 0.53 ± 0.15 0.078 ± 0.026 120
기초 배지+F-68+Cu+금속* 0.73 ± 0.16 0.104 ± 0.026 160
*금속으로서는 CuSO4·5H2O (50 nM), MnSO4(3 nM), Na2SiO3·9H2O (1.5 μM), [NH4]6Mo7O24·4H2O (3 nM), CrK(SO4)2·4H2O (1.5 nM) 및 LiCl (236 nM)을 함유한다.
실시예 3
인자 VIII의 생산 제조에 미치는 미량 금속 및 구리의 효과가 관류식 발효기에서 추가로 평가하였다. 두 개의 1.5 리터 발효기에 표 1에 기재된 기초 배지를 사용하여 2×106개 세포/ml의 밀도로 BHK 클론 변이체를 접종하였다. 발효기는 0.5 리터/일의 양으로 관류시켰다. 하나의 발효기는 대조군으로 유지하였고, 다른 발효기는 표 2에 기재된 구리 및 미량 금속을 첨가하였다. 발효기들을 평균 세포 밀도 ∼2 내지 3×106개 세포/ml로 15 일 동안 유지하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 플루로닉 F-68, 구리 및 미량 금속의 첨가가 연속적인 관류 조건의 단백질-무함유 조건하에서 인자 VIII을 암호화하는 유전자를 갖는 BHK 세포의 비(比)생산성을 크게 향상시켰다. 이 생산법은 침전기와 같은 세포 보유 장치가 장착된 보다 대용량의 발효기 (200 내지 500 리터)에 쉽게 적용시킬 수 있다.
일 비(比)생산성 (μU/세포/일)
기초 배지 Cu+금속
1 0.02 0.04
2 0.02 0.05
3 0.02 0.045
4 0.018 0.05
5 0.02 0.05
6 0.035 0.060
7 0.025 0.055
8 0.02 0.04
9 0.025 0.06
10 0.02 0.065
11 0.025 0.070
12 0.025 0.065
13 0.02 0.060
14 0.03 0.06
15 0.02 0.05
상기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되서는 아니되며, 본 발명은 단지 특허 청구 범위로 한정된다.
본 발명에 따르면, 가장 이상적인 조건인 인간 및 동물의 혈청 단백질이 전혀 존재하지 않는 신규한 세포 배양 배지를 사용하여 재조합 인자 VIII을 비교적 다량으로 연속 생산할 수 있다. 따라서, 혈청에 의존할 필요가 없으며, 바이러스 감염에 대한 어떠한 위험도 감소시켰다.
참고 문헌
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Qi, Y-M., 외, Cytotechnology 21: 95-109 (1996)
Schmolka, I.R., J. Am. Oil Chemists' Soc. 54: 110-116
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Wood, W., 외, Nature 312: 330-337 (1984)
Xu, D., 외, China J. Biotech. 11: 101-107 (1995)
Zhang, J., 외, Biotechnol. 33: 249-258 (1994)

Claims (15)

  1. 폴리올이 추가된 인간 또는 동물 단백질-무함유 배지에서 재조합 인자 VIII의 유전자를 포함하는 포유 동물 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 재조합 인자 VIII의 유전자를 포함하는 포유 동물 세포로부터의 재조합 인자 VIII의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 배지가 구리 이온을 함유하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 폴리올이 플루로닉 F-68이고, 약 0.025 내지 약 0.2 중량%의 농도 범위로 배지에 존재하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 배지가 약 50 내지 약 800 nM 범위의 양으로 황산구리를 함유하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 망간 이온이 약 1.5 내지 약 4.5 nM 범위의 양으로 존재하는 방법.
  6. 제2항에 있어서, 몰리브덴 함유 이온이 약 1.5 내지 약 4.5 nM 범위의 양으로 존재하는 방법.
  7. 제2항에 있어서, 규소 함유 이온이 약 75 내지 약 300 nM 범위의 양으로 존재하는 방법.
  8. 제2항에 있어서, 크롬 이온이 약 1.0 내지 약 4.0 nM 범위의 양으로 존재하는 방법.
  9. 제2항에 있어서, 리튬 이온이 약 120 내지 약 480 nM 범위의 양으로 존재하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 포유 동물 숙주 세포가 어린 햄스터 신장 세포, 인간의 태아 신장 세포 및 차이니즈 햄스터 난소 세포로 구성된 군 중에서 선택되는 방법.
  11. 인간 또는 동물 단백질이 없는, 제1항의 방법에 따라 제조된 재조합 인자 VIII 생성물.
  12. 폴리올을 함유하는 기초 배지로 이루어진, 재조합 인자 VIII을 생산하기 위한 인간 또는 동물 단백질-무함유 세포 배양 배지.
  13. 제12항에 있어서, 구리 이온을 함유하는 배지.
  14. 제13항에 있어서, 망간, 몰리브덴, 규소, 크롬 및 리튬으로 구성된 군 중에서 선택된 1종 이상의 미량 금속을 함유하는 배지.
  15. 제14항에 있어서, 인슐린을 함유하는 배지.
KR10-1998-0013934A 1997-04-18 1998-04-18 단백질을 함유하지 않는 배지에서의 재조합 인자ⅷ의 제조방법 KR100496111B1 (ko)

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