DE69836164T2 - Herstellung des rekombinanten Faktors VIII in einem proteinfreiem Nährmedium - Google Patents

Herstellung des rekombinanten Faktors VIII in einem proteinfreiem Nährmedium Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Technisches Gebiet: Diese Offenbarung befasst sich allgemein mit der Herstellung von rekombinantem Faktor VIII und speziell mit der Herstellung von rekombinantem Faktor VIII in einem Medium, das frei von Serum oder Protein ist.
  • Stand der Technik: Hämophilie A ist ein X-chromosomal-rezessiver Gendefekt, der auf ein defektes oder mangelhaftes Faktor-VIII-Molekül zurückzuführen ist und zu einer Blutungsneigung führt. Um Blutungsepisoden zu kontrollieren, werden Bluter mit Faktor VIII behandelt. Ursprünglich ist Faktor VIII aus dem menschlichen Blut isoliert worden. Die Therapie mit aus dem Plasma stammendem Faktor VIII ist mit der Übertragung verschiedener menschlicher Viren, wie z.B. Hepatitisviren und menschlichen Immunschwächeviren in Verbindung gebracht worden.
  • Mit dem Aufkommen der DNA-Rekombinationstechnologie ist die Struktur des menschlichen Faktors VIII und seines Gens aufgeklärt worden. Das Transkriptionsprodukt des Gens, das von 26 Exons abgeleitet wird, ist ein Messenger-RNA-Molekül mit einer Länge von 9000 Basen, das für ein großes Protein aus 2351 Aminosäuren kodiert. Studien der Struktur von Faktor VIII zeigen, dass dieser ein Glykoprotein ist, das eine signifikante Anzahl an Kohlenhydratresten enthält.
  • Die für Faktor VIII kodierende cDNA wurde kloniert und in Babyhamster-Nieren-(BHK-21-) Zellen und Chinahamster-Ovarialzellen stabil exprimiert. Es sind kommerzielle Verfahren entwickelt worden, um rekombinanten Faktor VIII zur Behandlung von Hämophilie A zu produzieren. Derzeit wird rekombinanten Faktor VIII mittels gentechnisch veränderter Säugetierzellen hergestellt, wodurch eine Abhängigkeit von Plasma verhindert wird und mögliche Risiken einer Virusübertragung minimiert werden.
  • Genamplifikation ist bisher das Verfahren der Wahl gewesen, um für therapeutische Proteine hochproduktive Zelllinien abzuleiten. Die Strategie der Amplifikation umfasst die Verbindung einer Transkriptionseinheit, die für das gewünschte Protein kodiert, mit einem amplifizierbaren Marker, wie z.B. Dihydrofolat-Reductase. Dann werden Transfektionsverfahren eingesetzt, um die Vektor-DNA in die Rezipientenzellen zu übertragen. Zellpopulationen werden anhand von erhöhter Resistenz gegen das Arzneimittel der Wahl, wie z.B. Methotrexat, selektiert. Die Schaffung eines stabilen Zellklons wird mittels Grenzverdünnungsklonierung erreicht. Diese Zellklone werden dann an ein serumfreies Produktionsmedium angepasst und bezüglich der Produktion des gewünschten Proteins überwacht.
  • EP 0.534.383 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung des menschlichen Gerinnungsfaktor-VIII-Proteinkomplexes. Dieses Literaturzitat befasst sich nicht mit den in den Ansprüchen dargelegten Merkmalen der vorliegenden Erfindung.
  • Bei labilen Proteinen, wie z.B. Faktor VIII, ist menschliches Albumin in den Herstellungs- und Reinigungsverfahren als Stabilisator hinzugefügt worden. Obwohl das Albumin durch Pasteurisierung einem Vireninaktivierungsschritt unterzogen wird, wäre es ideal, wenn rekombinanter Faktor VIII bei vollständiger Abwesenheit von menschlichen und tierischen Blutproteinen hergestellt werden könnte. Der Erfinder hat festgestellt, dass dies unter Verwendung eines neuen Zellkulturmediums möglich ist. Details werden nachstehend beschrieben.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Das Verfahren zur kontinuierlichen Produktion relativ großer Mengen an rekombinantem Faktor VIII (rFVIII) aus Säugetierzellen in Abwesenheit jeglicher von Menschen oder Tieren stammender Plasmaproteine umfasst das Kultivieren von Säugetierwirtszellen in einem proteinfreien Medium, das mit einem Polyolpolymer, wie z.B. Pluronic F-68, ergänzt ist. Das bevorzugte Medium umfasst Kupfersulfat, einen Eisensulfat/EDTA-Komplex und die Salze von Spurenmetallen, wie z.B. Mangan, Molybdän, Silicium, Lithium und Chrom.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Jüngste Fortschritte in der Technologie der rekombinanten Proteinexpression haben die Produktion von Proteinen in Säugetierzellen in großen Mengen möglich gemacht. Wirtszellen, die für die Produktion von Faktor VIII geeignet sind, umfassen Zelllinien wie etwa Babyhamsternierenzellen (BHK-Zellen, „baby hamster kidney cells"), Chinahamster-Ovarialzellen (CHO-Zellen, „china hamster ovary cells") und menschliche embryonale Nierenzellen (HEK-Zellen, „human embryonic kidney cells"). Besonders bevorzugt sind Babyhamsternierenzellen, speziell jene, die mit einem Gen transfiziert sind, das die Expression von Faktor VIII lenken kann, wie von Wood et al. (1984) beschrieben (einschließlich Derivate, wie z.B. Klonierungsvarianten und deren Nachkommenschaft). Eine solche Zelllinie wurde bei der American Type Culture Collection unter der Zugriffsnummer ATCC CRL-8544 hinterlegt.
  • Die gewünschte Wirtszelllinie, die das Faktor VIII-Gen trägt, ist typischerweise so angepasst, dass sie sich in Suspensionskultur in einem proteinfreien Produktionsmedium vermehrt, das mit Lipoprotein ergänzt wurde. Das zur Kultivierung der Wirtszelllinie gewählte Grundmedium ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend, und es kann jedes beliebige fachbekannter, für die Züchtung von Säugetierzellen geeigneter Medien oder eine Kombination davon sein. Medien, wie z.B. Dulbecco's Modified Eagle Medium, Ham's Medium F-12, Eagle's Minimal Essential Medium und RPMI-1640 Medium und dergleichen, sind im Handel erhältlich. Die Hinzufügung von Wachstumsfaktoren, wie z.B. rekombinantem Insulin, ist auf dem Gebiet üblich.
  • Aufgrund der Labilität von Faktor VIII ist die Produktivität der gentechnisch veränderten Wirtszellen unter proteinfreien Bedingungen stark verringert. Menschliches Serumalbumin wird üblicherweise als serumfreie Ergänzung der Kultur zur Produktion von rekombinanten Proteinen eingesetzt. Menschliches Serumalbumin erfüllt zahlreiche Aufgaben, einschließlich (1) als Träger für Fettsäuren, Cholesterin und lipophile Vitamine, Steroidhormone und Wachstumsfaktoren; (2) als Schutzmittel gegen Schäden aufgrund von Scherkräften; (3) als Puffer für pH-Änderungen und (4) als Regler des osmotischen Drucks. Eine andere entscheidende Rolle von Albumin ist es vielleicht, labile Proteine wie Faktor VIII vor Proteolyse zu schützen, indem es als Substrat für Proteasen dient.
  • Die Verunreinigungen in Albuminformulierungen können auch zur stabilisierenden Wirkung von Albumin beitragen. Faktoren, wie z.B. Lipoprotein [Chan (1996)], sind als Ersatz für menschliches Serumalbumin zur Produktion von rekombinantem Faktor VIII unter serumfreien Bedingungen identifiziert worden.
  • Der Versuch der Erfinder, ein Produktionsmedium zu entwickeln, das frei von von menschlichem Plasma stammenden Albumin ist, führte zu der hierin offenbarten Erfindung, einem proteinfreien Grundmedium zur Produktion von rekombinantem Faktor VIII. Das bevorzugte Medium besteht aus modifiziertem Dulbecco's Minimum Essential Medium und Ham's F-12 Medium (50:50 nach Gewicht), ergänzt mit 10 μg/ml rekombinantem Insulin (Nucellin, Eli Lilly) und FeSO4·EDTA (50 μM). Mit Ausnahme von Faktor-VIII-Produktion vermehren sich gentechnisch veränderte BHK-Zellen in diesem proteinfreien Grundmedium gut.
  • Überraschenderweise zeigte der Zusatz eines Polyols, wie z.B. Pluronic F-68, keine Wirkung auf das Wachstum, erhöhte aber die spezifische Faktor-VIII-Produktivität der BHK-Zellen. Glücklicherweise erhöht der Zusatz von Kupfersulfat die Produktion von Faktor VIII weiter. Auch die Aufnahme einer Reihe von Spurenmetallen, wie z.B. Mangan, Molybdän, Silizium, Lithium und Chrom, führt zu einer weiteren Zunahme der Faktor-VIII-Produktion. Für die Faktor-III-Produktion wurde dann ein kontinuierliches Verfahren unter den Bedingungen der Freiheit von von menschlichem Plasma stammendem Protein entwickelt. Weitere Informationen bezüglich des Einsatzes von Pluronic-Polyolen sind bei Papoutsakis (1991) und Schmolka (1977) zu finden.
  • Pluronic F-68, ein Polyglykol, (BASF, Wyandot) wird üblicherweise verwendet, um Schäumen zu vermeiden, das bei Rührkulturen auftritt, und Zellen in Anschwänzkulturen vor Scherbelastung und Blasenschäden zu schützen. Pluronic F-68 ist ein nichtionisches Block-Copolymer mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 8400, bestehend aus einem Mittelblock aus Poly(oxypropylen) (20 Gew.-%) und Blö cken aus Poly(oxyethylen) an beiden Enden. Die umfassende Forschungsarbeit über die Rolle von Pluronic F-68 zeigt, dass Pluronic F-68 als oberflächenaktive Substanz wirkt und Zellschäden vorbeugt, indem ein Ableiten der Zellen von Blasen, die während des Rührens oder Anschwänzens in den Bioreaktoren gebildet werden, ermöglicht wird. Allerdings haben einige Wissenschafter unter Kulturbedingungen, bei denen die Scherbelastung minimal ist, positive Wirkungen von Pluronic F-68 auf das Wachstum festgestellt (Mizrahi, 1971, Murhammer und Goochee, 1990). Die Co-Reinigung von Lipiden mit Pluronic F-68 während der Reinigung des Produkts stellt einen Einzelbeweis dar, dass das Pluronic-Polymer das Albumin nicht nur als oberflächenaktive Substanz ersetzen kann, sondern auch als Lipidträger wirken kann. Pluronic F-68 kann verhindern, dass Membranschäden die Zellen töten, bevor eine Reparatur erfolgen kann – möglicherweise durch direkte Interkalation in die Membran. Die Rolle von Pluronic F-68 als Metallionenpuffer ist gänzlich unbekannt.
  • Obwohl es Berichte darüber gibt, dass Pluronic F-68 im Medium die volumetrische Produktivität erhöhen kann, scheint der Wirkmechanismus die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Zelle zu sein [Schneider (1989); Qui (1996)]. Nach dem Wissensstand der Erfinder ist dies das erste Mal, dass eine Erhöhung der spezifischen Produktion eines speziellen Proteinprodukts durch Pluronic F-68 beobachtet wurde. Da die Lebensfähigkeiten und Wachstumsraten im System der Erfinder mit und ohne Pluronic F-68 vergleichbar sind, kann im System der Erfinder die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen nicht der Wirkmechanismus von Pluronic F-68 sein. Allerdings gibt es, unabhängig vom Mechanismus, unmittelbare und dramatische Auswirkungen des Zusatzes von F-68.
  • Es wird davon ausgegangen, dass eine Reihe anderer Polyole ähnliche Wirkung zeigen würde. Diese anderen Polyole umfassen nichtionische Block-Copolymere aus Poly(oxyethylen) und Poly(oxypropylen) mit Molekulargewichten im Bereich von 1.000 bis 16.000.
  • Zusätzlich zu herkömmlichen Suspensionskultivierungsverfahren, wie z.B. Schüttelkolben, Spinnerflaschen und Rollflaschen ist das Verfahren der vorliegenden Erfin dung auch auf den Einsatz mit Bioreaktoren im Chargenbetrieb anwendbar. Nach der Kultivierung der Wirtszellen kann der Faktor VIII nach Standardverfahren wie Ultrafiltration oder Zentrifugation aus dem verbrauchten Medium gewonnen werden. Falls gewünscht kann der gewonnene Faktor VIII beispielsweise mittels Ionenaustauschchromatographie oder Größenausschlusschromatographie, Immunaffinitätschromatographie oder Metallchelatchromatographie und dergleichen gereinigt werden.
  • Wie hierin verwendet ist ein „von menschlichem oder tierischem Protein freies Medium" ein Zellkulturmedium, das frei von jeglichem Protein aus menschlicher oder tierischer Quelle ist. Proteine, die aus menschlichen oder tierischen Quellen isoliert werden, bringen von Natur aus das Risiko einer Virenkontamination mit sich. Das Ziel eines von menschlichem oder tierischem Protein freien Mediums ist es daher, das Risiko einer Virenübertragung zu eliminieren oder zumindest stark einzuschränken.
  • Beispiel 1: Babyhamsternieren-(BHK-21) Zellen, die mit einem Gen transfiziert sind, das die Expression von Faktor VIII lenken kann, wurden von Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornien, USA erhalten. Die Zelllinie wurde wie von Wood et al. (1984) detailliert beschrieben präpariert und bei der American Type Culture Collection unter der Zugriffsnummer ATCC CRL-8544 hinterlegt. Von Genentech, Inc. wurde auch eine Klonierungsvariante dieser Zelllinie erhalten und in allen Beispielen verwendet.
  • Die BHK-21-Zellen, die das für Faktor VIII kodierende Gen enthielten, wurden als Suspensionskulturen in Schüttelkolben unter Einsatz eines serumfreien Grundmediums, das Folgendes enthielt, kultiviert: Ham's F-12-Medium und Dulbecco's Minimal Essential Medium (50:50 nach Gewicht); Nucellin (rekombinantes Insulin, 5-10 μg/ml), FeSO4·EDTA (50 μM) und MgCl2 (15 mM). Die Zellen wurden versorgt und in 48-Stunden-Intervallen passagiert. Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei 800 × g zentrifugiert, gezählt und in einer Dichte von 1 × 106 Zellen pro ml erneut überimpft. Jeder Kolben enthielt 50-100 ml frisches Medium. Die Schüttelkolben wurden auf einen Rotator platziert, bei 37 °C inkubiert und mittels leichtem Schütteln zwischen 90-110 U/min als Suspensionskultur gehalten. In Schüttelkolben wurde die Wirkung eines Polyols, wie z.B. Pluronic F-68 (0,1%), unten als F-68 angeführt, und von Kupfersulfats (50 nM) auf die Produktion von Faktor VIII untersucht. Faktor VIII wurde mithilfe eines chromogenen Tests quantifiziert. Der Test wird kommerziell als Set vertrieben, das als Coatest VIII:C/4 bekannt ist und von Baxter HealthCare Products zu beziehen ist. Die Zellen wurden mithilfe dieses Verfahrens 24 Tage lang versorgt. Die mit dem Coatest VIII:C/4-Set bestimmte Aktivität von Faktor VIII in jedem Medium ist in Tabelle 1 angeführt. TABELLE 1
    Figure 00070001
    • * Mittelwert von 36 Proben ± Standardabweichungen. Die Zellen wurden wie oben beschrieben über einen Zeitraum von 24 Tagen auf Faktor-VIII-Produktion überwacht.
    • ** Titrationsversuche zeigten, dass 0,1 % die optimale Dosis für Pluronic F-68 ist. Eine Erhöhung der Konzentration auf 0,3 % zeigte keine signifikante Wirkung auf die Faktor-VIII-Produktion. Dosis-Wirkung-Versuche zeigten, dass 50-800 nM Kupfersulfat für die Faktor-VIII-Produktion optimal sind.
  • Wie in Tabelle 1 angeführt erhöhte der Zusatz von Pluronic F-68 alleine oder vorzugsweise in Kombination mit Kupfersulfat den Titer und die spezifische Produktivität der BHK-Zellen, die das für Faktor VIII kodierende Gen enthielten, unter proteinfreien Bedingungen signifikant.
  • Beispiel 2: Um die Produktion von Faktor VIII unter proteinfreien Bedingungen weiter zu optimieren, wurden dem proteinfreien Produktionsmedium Spurenmetalle zugesetzt. Die Faktor-VIII-Produktion wurde dann mithilfe des kontinuierlichen Schüttelkolbenkultursystems wie in Beispiel 1 beschrieben 16 Tage lang bewertet. Die Daten sind in Tabelle 2 angeführt. In Abwesenheit von Kupfersulfat zeigten die Spurenmetalle keine Wirkung auf die Faktor-VIII-Produktivität. Siehe Tabelle 2. TABELLE 2
    Figure 00080001
    • * die Metalle umfassen CuSO4·5H2O (50 nM), MnSO4 (3 nM), Na2SiO3·9H2O (1,5 μM), [NH4]6Mo7O24·4H2O (3 nM), CrK(SO4)2·4H2O (1,5 nM) und LiCl (236 nM).
  • Beispiel 3: Die Auswirkung von Spurenmetallen und Kupfer auf die Produktion von Faktor VIII wurde in einem Perfusionsfermenter weiter bewertet. Zwei 1,5-Liter-Fermenter wurden unter Einsatz des in Tabelle 1 beschriebenen Grundmediums in einer Dichte von 2 × 106 Zellen/ml mit der BHK-Klonierungsvariante beimpft. Der Fermenter wurde mit einer Rate von 0,5 Liter/Tag perfundiert. Ein Fermenter wurde als Kontrolle behalten und der andere mit Kupfer und Spurenelementen wie in Tabelle 2 beschrieben ergänzt. Die Fermenter wurden 15 Tage lang bei einer durchschnittlichen Zelldichte von etwa 2-3 × 106 Zellen/ml gehalten. Wie in Tabelle 3 angeführt erhöhte der Zusatz von Pluronic F-68, Kupfer und Spurenelementen die spezifische Produktivität von BHK-Zellen, die das für Faktor VIII kodierende Gen enthalten, unter proteinfreien Bedingungen und kontinuierlicher Perfusion signifikant. Dieses Produktionsverfahren kann leicht an größere Fermenter (200 bis 500 Liter) angepasst werden, die mit Zellretentionsvorrichtungen, wie z.B. Absetzbehältern, ausgerüstet sind.
  • TABELLE 3
    Figure 00090001
  • Die oben angeführten Beispiele werden zur Illustration der vorliegenden Erfindung bereitgestellt und sind nicht als Einschränkung der Erfindung auszulegen, die ausschließlich durch die Ansprüche definiert ist.
  • Literaturverweise:
    • Bihoreau, N., et al., Eur. J. Biochem. 222, 41-48 (1994).
    • Chan, S. Y., U.S. Pat. Nr. 5.576.194 (1996).
    • Eis-Hubinger, A.M., et al. Thromb. Haemost. 76, 1120 (1996).
    • Mizrahi, A., J. Clin. Microbiol. 11-13 (1975).
    • Murhammer, D.W., et al., Biotechnol. Prog. 6. 142-148 (1990).
    • Papoutsakis, E.T., Trends in Biotechnology (Tibtech) 9, 316-324 (1991).
    • Qi, Y-M., et al., Cytotechnology 21, 95-109 (1996).
    • Schmolka, I. R., J. Am. Oil Chemists' Soc. 54, 110-116.
    • Schneider Y-J., J. Immunol. Meth. 116; 65-77 (1989).
    • Wood, W., et al., Nature 312, 330-337 (1984).
    • Xu, D., et al., China J. Biotech. 11, 101-107 (1995).
    • Zhang, J., et al., Biotechnol. 33, 249-258 (1994).

Claims (15)

  1. Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Faktor VIII aus Säugetierwirtszellen, die das Gen dafür aufweisen, umfassend das Kultivieren der Säugetierwirtszellen in einem Medium, das frei von Proteinen ist, die von Plasma stammen, und mit Polyolen und Kupferionen ergänzt ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Polyol Pluronic F-68 ist und im Medium in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,025 bis etwa 0,2 Gew.-% vorhanden ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Medium Kupfersulfat in einer Menge im Bereich von etwa 50 bis etwa 800 nM umfasst.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, worin Manganionen in einer Menge im Bereich von etwa 1,5 bis etwa 4,5 nM vorhanden sind.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, worin Ionen, die Molybdän enthalten, in einer Menge im Bereich von etwa 1,5 bis etwa 4,5 nM vorhanden sind.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, worin Ionen, die Silicium enthalten, in einer Menge im Bereich von etwa 75 bis etwa 300 nM vorhanden sind.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, worin Chromionen in einer Menge im Bereich von etwa 1,0 bis etwa 4,0 nM vorhanden sind,
  8. Verfahren nach Anspruch 1, worin Lithiumionen in einer Menge im Bereich von etwa 120 bis etwa 480 nM vorhanden sind.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Säugetierwirtszelle aus der aus Babyhamster-Nierenzellen, menschlichen embryonalen Nierenzellen und Chinahamster-Ovarialzellen ausgewählt ist.
  10. Zellkulturmedium zur Herstellung von rekombinantem Faktor VIII, umfassend: (a) ein Grundmedium; (b) ein Polyol; und (c) Kupferionen, worin das Zellkulturmedium frei von Proteinen ist, die von Plasma stammen.
  11. Medium nach Anspruch 10, das weiters zumindest ein Spurenmetall umfasst, das aus der aus Mangan, Molybdän, Silicium, Chrom und Lithium bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  12. Medium nach Anspruch 10, worin die Kupferionen in einer Menge im Bereich von etwa 50 bis etwa 800 nM vorhanden sind.
  13. Medium nach Anspruch 12, das weiters Molybdänionen in einer Menge im Bereich von etwa 1,5 bis etwa 4,5 nM umfasst.
  14. Medium nach Anspruch 12, das weiters Lithiumionen in einer Menge im Bereich von etwa 120 bis etwa 480 nM umfasst.
  15. Medium nach einem der Ansprüche 10 bis 14, das weiters rekombinant produziertes Insulin umfasst.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9501040D0 (en) * 1995-01-19 1995-03-08 Quadrant Holdings Cambridge Dried composition
US8183344B2 (en) * 1996-04-24 2012-05-22 University Of Michigan Inactivation resistant factor VIII
US6475725B1 (en) * 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
US6528286B1 (en) * 1998-05-29 2003-03-04 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process for producing glycoproteins
AUPP521298A0 (en) * 1998-08-12 1998-09-03 Life Therapeutics Limited Purification of fibrinogen
US6358703B1 (en) 1998-12-10 2002-03-19 Bayer Corporation Expression system for factor VIII
AUPP790698A0 (en) 1998-12-23 1999-01-28 Life Therapeutics Limited Separation of microorganisms
AUPP790898A0 (en) 1998-12-23 1999-01-28 Life Therapeutics Limited Renal dialysis
US20050224355A1 (en) * 1999-12-23 2005-10-13 Brendon Conlan Removal of biological contaminants
AUPP971399A0 (en) 1999-04-12 1999-05-06 Life Therapeutics Limited Separation of plasma components
AT409379B (de) 1999-06-02 2002-07-25 Baxter Ag Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen
JP4674021B2 (ja) * 1999-07-13 2011-04-20 ビオヴィトルム・アクチボラゲット（プブリクト） 安定第ｖｉｉｉ因子組成物
US6767741B1 (en) * 1999-08-27 2004-07-27 Invitrogen Corporation Metal binding compounds and their use in cell culture medium compositions
DE60041573D1 (de) 1999-08-31 2009-04-02 Sony Computer Entertainment Inc Unterhaltungssystem, aufzeichnungsmdeium und programm
US7077942B1 (en) * 1999-12-23 2006-07-18 Gradipore Limited Removal of biological contaminants
AUPQ691400A0 (en) 2000-04-14 2000-05-11 Life Therapeutics Limited Separation of micromolecules
AUPQ697300A0 (en) * 2000-04-18 2000-05-11 Life Therapeutics Limited Separation apparatus
ATE449200T1 (de) 2000-04-18 2009-12-15 Gradipore Ltd Trennung und behandlung von proben durch elektrophorese
US6923896B2 (en) * 2000-09-22 2005-08-02 The Texas A&M University System Electrophoresis apparatus and method
CN1235667C (zh) * 2000-10-06 2006-01-11 格拉迪普有限公司 多口分离装置及方法
AUPR222300A0 (en) * 2000-12-21 2001-01-25 Life Therapeutics Limited Electrophoresis device and method
US7220718B2 (en) 2001-08-03 2007-05-22 United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Oral treatment of hemophilia
EP2298354B1 (de) 2001-10-10 2014-03-19 ratiopharm GmbH Neumodulierung und Glykokonjugation von Interferon-beta
KR20040065278A (ko) * 2001-12-21 2004-07-21 노보 노르디스크 에이/에스 변경된 인자 ⅶ 폴리펩티드의 액체 조성물
BR0215216A (pt) 2001-12-21 2004-11-16 Novo Nordisk Healthcare Ag Composição aquosa lìquida, método para preparar uma composição aquosa lìquida de um polipeptìdeo de fator vii, uso de uma composição aquosa lìquida, e, método para o tratamento de uma sìndrome de resposta ao fator vii
US20040009918A1 (en) * 2002-05-03 2004-01-15 Hanne Nedergaard Stabilised solid compositions of modified factor VII
KR101212025B1 (ko) 2002-06-21 2013-01-09 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 인자 ⅶ 폴리펩티드의 안정화된 고체 조성물
AU2003249990B2 (en) 2002-07-09 2007-06-28 Takeda Pharmaceutical Company Limited Animal protein free media for cultivation of cells
EP2572732A1 (de) 2003-02-26 2013-03-27 Nektar Therapeutics Konjugate mit Polymer-Faktor-VIII-Anteil
CA2518327A1 (en) * 2003-03-18 2004-09-30 Novo Nordisk Health Care Ag Liquid, aqueous, pharmaceutical compositions of factor vii polypeptides
US7897734B2 (en) * 2003-03-26 2011-03-01 Novo Nordisk Healthcare Ag Method for the production of proteins
AU2004241698A1 (en) * 2003-05-23 2004-12-02 Novo Nordisk Health Care Ag Protein stabilization in solution
ES2382157T3 (es) * 2003-06-25 2012-06-05 Novo Nordisk Health Care Ag Composición líquida de polipépttidos del factor VII
ATE446768T1 (de) * 2003-07-01 2009-11-15 Novo Nordisk Healthcare Ag Flüssige wässrige pharmazeutische zusammnesetzung von factor vii polypeptiden
EP1656158B1 (de) * 2003-08-14 2016-03-09 Novo Nordisk Health Care AG Flüssige, wässrige pharmazeutische zusammensetzung von faktor-vii-polypeptiden
MXPA06006886A (es) * 2003-12-19 2006-09-04 Novo Nordisk Healthcare Ag Composiciones estabilizadas de polipeptidos del factor vii.
GB0414825D0 (en) 2004-07-02 2004-08-04 Biostatus Ltd Gel formulations and uses thereof
US7422875B2 (en) * 2004-07-20 2008-09-09 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Compositions and methods for increasing protein production
US20060094104A1 (en) 2004-10-29 2006-05-04 Leopold Grillberger Animal protein-free media for cultivation of cells
WO2006050050A2 (en) * 2004-10-29 2006-05-11 Centocor, Inc. Chemically defined media compositions
CA2594580C (en) * 2005-01-25 2013-09-24 Wyeth Research Ireland Limited Method for diafiltration
EP1707634A1 (de) * 2005-03-29 2006-10-04 Octapharma AG Verfahren zur Isolierung von rekombinant hergestellten Proteinen
US20070212770A1 (en) * 2006-01-04 2007-09-13 Baxter International Inc. Oligopeptide-free cell culture media
US20090203077A1 (en) * 2006-06-30 2009-08-13 The Regents Of The University Of Michigan Method of producing factor viii proteins by recombinant methods
WO2008005847A2 (en) * 2006-06-30 2008-01-10 The Regents Of The University Of Michigan Method of producing factor viii proteins by recombinant methods
DK2126106T3 (en) 2007-02-23 2017-12-04 Sk Chemicals Co Ltd Process for the preparation and purification of Factor VIII and its derivatives
RU2469739C2 (ru) * 2007-04-26 2012-12-20 БАЙЕР ХЕЛСКЕА ЛЛСи Стабилизация жидких растворов рекомбинантного белка для хранения в замороженном состоянии
BRPI0818913A2 (pt) * 2007-11-01 2015-05-12 Univ Rochester Fator viii recombinante tendo elevada estabilidade
SG10201503304RA (en) * 2007-12-27 2015-06-29 Baxter Int Cell culture processes
DE102008051574A1 (de) 2008-10-14 2010-04-15 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren zur Herstellung von Interferon-beta und deren Varianten
JP5719301B2 (ja) * 2008-11-12 2015-05-13 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ 血清不含インスリン不含で第ｖｉｉ因子を産生する方法
KR101574056B1 (ko) 2009-07-31 2015-12-02 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 Ａｄａｍｔｓ 단백질 발현을 위한 세포 배양 배지
ES2865250T3 (es) 2009-09-21 2021-10-15 Takeda Pharmaceuticals Co Formulaciones de ADAMTS13 líquidas y liofilizadas estabilizadas
CN102648212B (zh) 2009-11-13 2014-12-03 基立福疗法公司 包含冯维勒布兰德因子(vWF)的制剂及其相关制备方法、试剂盒和用途
MX2012012526A (es) 2010-04-26 2012-11-23 Novartis Ag Medio de cultivo celular mejorado.
BR112013000512A2 (pt) 2010-07-08 2016-05-17 Baxter Healthcare Sa método para produzir uma composição de adamts 13 (ra13) recombinante, sobrenadante de cultura de célula, e , composição adamts13 recombinante (ra13)'
GB201014121D0 (en) * 2010-08-24 2010-10-06 Univ Gent Particulate biologic drug delivery system
EP2702077A2 (de) 2011-04-27 2014-03-05 AbbVie Inc. Verfahren zur steuerung des galactosylierungsprofil von rekombinant exprimierten proteinen
RU2592680C2 (ru) * 2011-04-29 2016-07-27 Биокон Рисерч Лимитед Способ снижения накопления лактата при культивировании и способ получения антитела
DK3626737T3 (da) 2011-05-13 2024-02-05 Octapharma Ag Fremgangsmåde til at forøge produktiviteten af eukaryote celler i produktionen af rekombinant fviii
AU2012324020A1 (en) 2011-12-30 2013-07-18 Grifols, S.A. Method for purifying Factor VIII
WO2013158279A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Protein purification methods to reduce acidic species
WO2013158273A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
SG11201507230PA (en) 2013-03-12 2015-10-29 Abbvie Inc Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same
US9677105B2 (en) 2013-03-14 2017-06-13 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
US9217168B2 (en) 2013-03-14 2015-12-22 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
US8956830B2 (en) 2013-03-14 2015-02-17 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
US20140271622A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
WO2014151878A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides
EP3052640A2 (de) 2013-10-04 2016-08-10 AbbVie Inc. Verwendung von metallionen zur modulation von proteinglykosylierungsprofilen rekombinanter proteine
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
WO2015073884A2 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
CA2942770A1 (en) * 2014-03-23 2015-10-01 Advantech Bioscience Farmaceutica Ltda. Enhancement of recombinant protein expression with copper
KR102352250B1 (ko) 2014-03-25 2022-01-17 제넨테크, 인크. 세포 배양 배지에 사용하기 위한 폴록사머를 제조하는 방법
MX2016012870A (es) 2014-04-01 2017-05-12 Advantech Bioscience Farmacêutica Ltda Formulaciones de factor viii estables con bajo tenor de azucar - glicina.
US9855319B2 (en) 2014-04-01 2018-01-02 Advantech Bioscience Farmacêutica Ltda Stabilization of factor VIII without calcium as an excipient
JP6917984B2 (ja) * 2016-05-09 2021-08-11 協和発酵バイオ株式会社 培地、アルブミン非含有培地用添加剤および多能性幹細胞の培養方法
EP3625329A1 (de) * 2017-05-17 2020-03-25 Octapharma AG Verfahren zur herstellung eines rekombinanten zielproteins
PL3781943T3 (pl) 2018-04-20 2022-08-01 Janssen Biotech, Inc Kwalifikacja kolumny chromatograficznej w sposobach produkcji w celu wytwarzania kompozycji przeciwciał anty-il12/il23
MA54248A (fr) 2018-11-13 2021-09-22 Janssen Biotech Inc Régulation de métaux traces pendant la production d'anticorps anti-cd38
CN113825765A (zh) 2019-03-14 2021-12-21 詹森生物科技公司 用于制备抗il12/il23抗体组合物的制造方法
US20220153830A1 (en) 2019-03-14 2022-05-19 Janssen Biotech, Inc. Manufacturing Methods for Producing Anti-TNF Antibody Compositions
MY193349A (en) 2019-12-06 2022-10-06 Regeneron Pharma Anti-vegf protein compositions and methods for producing the same
BR112022019817A2 (pt) 2020-04-02 2022-12-06 Takeda Pharmaceuticals Co Variante de adamts13, composições e usos das mesmas
WO2023281463A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Janssen Biotech, Inc. Manufacturing methods for producing anti-tnf antibody compositions
IL309987A (en) 2021-07-09 2024-03-01 Janssen Biotech Inc Production methods for the production of anti-IL12/IL23 antibody compositions
US20230332084A1 (en) 2022-03-02 2023-10-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bioreactor for antibody production

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4440679A (en) * 1980-03-05 1984-04-03 Cutter Laboratories, Inc. Pasteurized therapeutically active protein compositions
US4767704A (en) * 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
NO162160C (no) * 1987-01-09 1989-11-15 Medi Cult As Serumfritt vekstmedium, samt anvendelse derav.
US5024947A (en) * 1987-07-24 1991-06-18 Cetus Corporation Serum free media for the growth on insect cells and expression of products thereby
JPH0387173A (ja) * 1987-09-10 1991-04-11 Teijin Ltd ヒト活性化天然型ファクター８ｃの製造方法及びそれに用いる形質転換体
US5378612A (en) * 1990-05-11 1995-01-03 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Culture medium for production of recombinant protein
CA2078721A1 (en) * 1991-09-24 1993-03-25 Hiroshi Yonemura Process for preparing human coagulation factor viii protein complex
ATE399855T1 (de) * 1996-10-10 2008-07-15 Invitrogen Corp Tierzellkulturmedium mit pflanzlichen nährstoffen

Also Published As

Publication number Publication date
HU224306B1 (hu) 2005-07-28
KR19980081531A (ko) 1998-11-25
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CA2234215A1 (en) 1998-10-18
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HUP9800901A2 (hu) 1999-05-28
US6171825B1 (en) 2001-01-09
PL325862A1 (en) 1998-10-26
CZ295049B6 (cs) 2005-05-18
US5804420A (en) 1998-09-08
TW490469B (en) 2002-06-11
ZA983234B (en) 1998-10-22
AR012451A1 (es) 2000-10-18
PL192072B1 (pl) 2006-08-31
CZ115698A3 (cs) 1998-11-11
EP0872487B1 (de) 2006-10-18
IL124123A (en) 2006-07-05
CO4790112A1 (es) 1999-05-31
BRPI9801092A (pt) 2000-01-11
SK49798A3 (en) 1998-12-02
DK0872487T3 (da) 2007-02-05
ATE342921T1 (de) 2006-11-15
NZ330183A (en) 1999-08-30
AU748731B2 (en) 2002-06-13
CA2234215C (en) 2008-06-17
HU9800901D0 (en) 1998-07-28
HK1018797A1 (en) 2000-01-07
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BRPI9801092B1 (pt) 2013-04-02
ID20193A (id) 1998-10-22
EP0872487A3 (de) 1999-10-27
JP4257685B2 (ja) 2009-04-22
UA66340C2 (uk) 2004-05-17
SK285684B6 (sk) 2007-06-07
RU2222547C2 (ru) 2004-01-27
EP0872487A2 (de) 1998-10-21
PT872487E (pt) 2007-01-31
ES2273380T3 (es) 2007-05-01
DE69836164D1 (de) 2006-11-30
JPH10295397A (ja) 1998-11-10
MY115583A (en) 2003-07-31

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