PT872487E - Preparação de factor viii recombinante num meio sem proteína - Google Patents

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Description

ΡΕ0872487 1 DESCRIÇÃO "PREPARAÇÃO DE FACTOR VIII RECOMBINANTE NUM MEIO SEM PROTEÍNA"
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Campo: Esta revelação refere-se, de um modo geral, ao fabrico de Factor VIII recombinante num meio sem soro ou proteína. Técnica Anterior: A hemofilia A é um distúrbio genético recessivo ligado ao X gue se deve a um defeito ou deficiência da molécula de Factor VIII, resultando numa tendência hemorrágica. Historicamente, o Factor VIII foi isolado a partir de plasma de sangue humano. Todavia, a terapia com Factor VIII derivado de plasma foi associado à transmissão de vários vírus humanos, tais como os vírus da hepatite e da imunodeficiência humana.
Com o surgimento da tecnologia do DNA recombinante, a estrutura do Factor VIII humano e do seu gene foi elucidada. 0 produto de transcrição do gene, que deriva de 26 exões, é uma molécula de RNA mensageiro de -9000 bases de comprimento, codificando para uma proteína grande, de 2351 aminoácidos. Estudos estruturais do Factor VIII indicam que é uma glicoproteína contendo um número significativo de resíduos de hidratos de carbono. 2 ΡΕ0872487 0 cDNA que codifica para o Factor VIII foi clonado e expresso de forma estável em células de rim de hamster bebé (BHK-21) e de ovário de hamster chinês (CHO) . Foram desenvolvidos processos comerciais para produzir Factor VIII recombinante para o tratamento de hemofilia A. 0 Factor VIII recombinante é actualmente produzido por células de mamífero sujeitas a engenharia genética, evitando assim a dependência de plasma e minimizando qualquer possível risco de transmissão de vírus. A amplificação genética tem sido o método de escolha para derivar linhas celulares de elevada produção para proteínas terapêuticas. A estratégia de amplificação envolve a ligação de uma unidade de transcrição codificando a proteína desejada a um marcador amplificável, tal como redutase de di-hidrofolato. São então aplicadas técnicas de transfecção par transferir o vector de DNA para células recipientes. São seleccionadas populações de células para aumentar a resistência ao fármaco de escolha, tal como metotrexato. 0 estabelecimento de um clone celular estável é conseguido por clonagem de diluição limitante. Estes clones celulares são então adaptados a um meio de produção sem soro e monitorizados para a produção da proteína desejada. A EP 0534383 descreve um processo para preparar o complexo de proteína de factor VIII de coagulação humana. Esta citação não refere nada em relação às características da presente invenção, como delineado nas reivindicações. 3 ΡΕ0872487
Para proteínas lábeis, tais como o Factor VIII, foi adicionada albumina humana como um estabilizador durante os processos de preparação e purificação. Embora a albumina seja sujeita a um passo de inactivação virai através de pasteurização, seria ideal se o Factor VIII recombinante pudesse ser preparado na ausência total de proteínas do sangue humano e animal. Verificou-se agora que isto é possível utilizando um meio de cultura de células novo. Os detalhes são descritos abaixo.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO 0 método para a produção contínua de quantidades relativamente grandes de Factor VIII recombinante (rFVIII) de células de mamíferos na ausência de quaisquer proteínas do plasma derivado de humano ou animal compreende cultivar as células hospedeiras de mamífero num meio sem proteína suplementado com um polímero poliol, tal como Pluronic F-68. 0 meio preferido inclui sulfato de cobre, complexo sulfato ferroso/EDTA e os sais de metais vestigiais, tais como manganês, molibdénio, silício, lítio e crómio.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Avanços recentes na tecnologia de expressão de proteína recombinante tornaram possível a produção de proteína em grandes quantidades em células de mamíferos. Células hospedeiras adequadas para a produção de Factor 4 ΡΕ0872487 VIII incluem linhas celulares, tais como células de rim de hamster bebé (BHK), células de ovário de hamster chinês (CHO) e células de rim embrionário humano (HEK) . São particularmente preferidas células de rim de hamster bebé, especificamente as transfectadas com um gene capaz de dirigir a expressão do Factor VIII como descrito em Wood et al. (1984) (incluindo derivados, tais como variantes clonais e sua progénie). Uma tal linha celular foi depositada na American Type Culture Collection e foi-lhe atribuído o número de acesso ATCC CRL-8544. A linha celular hospedeira desejada comportando o gene do Factor VIII está tipicamente adaptada ao crescimento como culturas em suspensão num meio de produção sem proteína, que é suplementado com lipoproteína. 0 meio basal escolhido para cultivar a linha celular hospedeira não é crítica para a presente invenção e pode ser uma qualquer, ou combinação daquelas que são conhecidas da técnica que são adequadas para cultivar células de mamíferos. Estão comercialmente disponíveis meios como Meio de Eagle Modificado por Dulbecco, Meio de Ham F-12, Meio Mínimo Essencial de Eagle e Meio RPMI-1640, e semelhantes. A adição de factores de crescimento tais como insulina recombinante é convencional na técnica.
Devido à natureza lábil do factor VIII, a produtividade das células hospedeiras modificadas é severamente reduzida em condições de ausência de proteína. É normalmente utilizada albumina de soro humano como uma cultura 5 ΡΕ0872487 sem soro suplementada para a produção de proteínas recom-binantes. A albumina de soro humano serve muitas funções incluindo: (1) como um transportador de ácidos gordos, colesterol e vitaminas lipofílicas, hormonas esteróides e factores de crescimento; (2) como um agente protector contra lesões devidas a forças de tracção; (3) como um tampão para alterações de pH; e (4) como um regulador de pressão osmótica. Outro papel crítico da albumina é talvez proteger as proteínas lábeis, tais como o Factor VIII, de proteólise, servindo como um substrato para as proteases.
As impurezas presentes nas preparações de albumina também podem contribuir para o efeito estabilizador da albumina. Foram identificados factores, tais como lipoproteína (Chan, 2996), como um substituinte da albumina de soro humano para a produção de Factor VIII recombinante em condições de ausência de soro. A tentativa dos autores para desenvolver um meio de produção sem albumina derivada de plasma humano conduziu à invenção desta revelação, um meio sem proteína basal para a produção de Factor VIII recombinante. 0 meio preferido consiste em Meio Mínimo Essencial de Dulbecco e Meio F-12 de Ham (50:50, em peso) suplementado com insulina recombinante (Nucellinm Eli Lilly) a 10 pg/mL e FeSCg-EDTA (50 μΜ). Com a excepção da produção de Factor VIII, as células BHK modificadas crescem bem neste meio basal sem proteína.
Surpreendentemente, a adiçao de um poliol, tal 6 ΡΕ0872487 como Pluronic F-68 não teve efeito no crescimento, mas aumentou a produtividade especifica das células BHK para o factor VIII. Foi observado de um modo perfeitamente casual que a adição de sulfato de cobre aumenta a produção de Factor VIII. Também a inclusão de um painel de metais vestigiais, tais como manganês, molibdénio, silício, lítio e crómio conduz a um aumentou na produção de Factor VIII. Foi então desenvolvido um processo contínuo para a produção de Factor VIII em condições de ausência de proteína derivada de plasma. Pode ser encontrada informação adicional a respeito da utilização de polióis Pluronic em Papoutsakis (1991) e Schmolka (1977).
Pluronic F-68, um poliglicol, (BASF, Wyandot) é normalmente utilizado para prevenir a formação de espuma que ocorre em culturas sob agitação e para proteger células de stress de tracção e lesão de bolhas em culturas disseminadas. 0 Pluronic F-68 é um copolímero de bloco não iónico com um peso molecular médio de 8400, consistindo num bloco central de poli(oxipropileno) 20% em peso) e blocos de poli(oxietileno) em ambas as extremidades. Investigação extensa sobre o papel de Pluronic F-68 indica que o Pluronic F-68 actua como um tensioactivo e previne a lesão das células permitindo a drenagem das células para longe das bolhas formadas nos biorreactores durante a agitação ou disseminação. Todavia, vários investigadores noticiaram efeitos benéficos do Pluronic F-68 no crescimento em condições de cultura no qual a tracção é mínima (Mizrahi, 1975; Murhammer e Goochee, 1990). A co-purificação de 7 ΡΕ0872487 lípidos com Pluronic F-68 durante a purificação do produto proporciona evidência história de que o polímero Pluronic pode substituir albumina não apenas como tensioactivo, mas pode também actuar como um veículo para lípidos. 0 Pluronic F-68 pode também evitar que a lesão da membrana mate as células antes de a reparação poder ser realizada, possivelmente por intercalação directa na membrana. 0 papel do Pluronic F-68 actuando como um tampão de iões metálicos é completamente desconhecido.
Embora existam relatórios de que o Pluronic nos meios pode aumente a produtividade volumétrica, o mecanismo de acção parece ser a manutenção da viabilidade celular (Schneider, 1989; Qi, 1996). Que exista conhecimento, esta é a primeira vez que se observou que o Pluronic F-68 aumenta a produção específica de um produto proteico particular. Uma vez que as variabilidades e as taxas de crescimento são comparáveis neste sistema com e sem Pluronic F-68, a manutenção da viabilidade celular não pode ser o mecanismo de acção de Pluronic F-68 no presente sistema. Todavia, o efeito da adição de Pluronic F-68 é imediata e dramática, qualquer que seja o mecanismo.
Antecipa-se que uma variedade de outros polióis teriam efeitos semelhantes. Esses outros polióis incluem copolímeros de bloco não iónicos de poli(oxietileno) e poli(oxipropileno) possuindo pesos moleculares que variam desde cerca de 1000 até cerca de 16000. ΡΕ0872487
Para além das técnicas de cultura em suspensão convencionais, tais como frascos de agitação, frascos de rotor, e frascos rolantes, o método da presente invenção também é aplicável para utilização com biorreactores de perfusão e descontínuos. Após a cultura de células hospedeiras, o Factor VIII pode ser recuperado do meio gasto através de metodologias convencionais, tais como ultrafiltração ou centrifugação. Se desejável, o Factor VIII recuperado pode ser purificado através de, por exemplo, cromatografia de permuta iónica ou de exclusão de tamanho, cromatografia de imunoafinidade ou quelante metálico e semelhantes.
Como aqui utilizado, um "meio isento de proteína humana ou animal" é um meio de cultura de células que é isento de qualquer proteína que tenha sido derivada de uma fonte humana ou de uma fonte animal. As proteínas que são isoladas a partir de fontes humana ou animal comportam inerentemente o risco de introduzir contaminação virai. 0 objectivo de um meio sem proteína humana ou animal é, deste modo, eliminar, ou pelo menos reduzir gradualmente o risco de transmissão virai.
Exemplo 1: Células de rim de hamster bebé (BHK-21) transfectadas com um gene capaz de dirigir a expressão do Factor VIII foram obtidas de Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, E.U.A. A linha celular foi preparada como descrito em detalhe em Wood et al. (1984) e foi depositada na American Type Culture Collection e com o 9 ΡΕ0872487 número de acesso ATCC CRL-8544. Uma variante clonal desta linha celular foi também obtida de Genentech, Inc e utilizada em todos os exemplos.
As células BHK-21 contendo o gene que codifica o Factor VIII foram cultivadas como culturas em suspensão em frascos de agitação utilizando um meio basal sem soro contendo o seguinte: Meio F-12 de Ham e Meio Minimo Essencial de Dulbecco (50:50, em peso), Nuceilina (insulina recombinante, 5-10 pg/mL), FeS04-EDTA (50 μΜ) e MgCl2 (15 mM) . As células foram mantidas e passadas a intervalos de 48 horas. As células foram centrifugadas a 800 x g durante 5 minutos, contadas e re-semeadas a uma densidade de 1 x 106 células por mL. Cada frasco contém 50-100 mL de meio fresco. Os frascos de agitação foram colocados numa plataforma de rotação, incubados a 37 °C e mantidos como cultura de suspensão por rotação suave entre 90 - 110 r.p.m. O efeito de um poliol, tal como o Pluronic F-68 (0,1%), apresentado como F-68 abaixo e sulfato de cobre (a 50 nM) na produção de Factor VIII foi examinado em frascos de agitação. O Factor VIII foi quantificado por um ensaio cromogénico. O ensaio é vendido comercialmente como um kit de teste conhecido como Coatest VIII:C/4 e está disponível a partir de Baxter HeathCare Products. As células foram mantidas por este processo durante 24 dias. A actividade do Factor VIII em cada meio, como determinada com o kit Coatest VIII:C/4 é apresentada na Tabela 1. ΡΕ0872487 10 TABELA 1
Condições Titulo Produtividade % Aumento em (U/mL) Específica relação ao (pU/célula/dia) basal Meio Basal 0,15 ± 0,07* 0,026 ± 0,013 0 Basal + F-68 (0,1%)** 0,24 ± 0,04 0,052 ± 0,013 200 Basal + F-68 (0,1%) 0,42 ± 0,09 0,091 ± 0,013 350 + Cu (50 nM**) Média de 36 amostras ± desvios padrão. As células foram monitorizadas para a produção de Factor VIII durante um período de 24 dias, como descrito acima.
Experiências de titulação demonstraram que 0,1% é a dose óptima para Pluronic F-68. O aumento da concentração para 0,3% não teve um impacto significativo na produção de Factor VIII. As experiências de dose-resposta revelaram que 50 - 800 nM de sulfato de cobre é óptimo para a produção de Factor VIII.
Como apresentado na Tabela 1, a adição de Pluronic F-68 isoladamente ou, preferencialmente, em combinação com sulfato de cobre, aumentou significativamente o título e a produtividade específica de células BHK contendo o gene que codifica o Factor VIII em condições de ausência de proteína.
Exemplo 2: Para optimizar ainda mais a produção de Factor VIIII em condições de ausência de proteína, foram adicionados metais vestigiais ao meio de produção sem proteína. A produção de Facto VIII foi então avaliada pelo sistema de cultura contínua em frasco de agitação, como 11 ΡΕ0872487 descrito no exemplo 1, durante 16 dias. Os resultados são apresentados na Tabela 2. Na ausência de sulfato de cobre, os metais vestigiais não tiveram efeito na produtividade de Factor VIII. Ver Tabela 2. TABELA 2
Condições Titulo (U/mL) Produtividade Específica (pU/célula/dia) % Aumento em relação ao basal + F-68 Basal + F-68 0,46 ± 0,11 0,065 ± 0,013 0 Basal + F-68 + Cu 0,53 ± 0,15 0,078 ± 0,026 120 Basal + F-68 + Cu + metais* 0,73 ± 0,16 0,104 ± 0,026 160 *0s metais incluem CuS04-5H20 (50 nM) , MnS04 (3 nM) , Na2Si03-9H20 (1,5 μΜ), [NH4] 6Μο7024 · 4H20 (3 nM) , CrK (S04) 2· 4H20 (1,5 nM) , e LiCl (236 nM).
Exemplo 3: 0 efeito dos metais vestigiais e do cobre na produção de factor VIII foi ainda avaliada num fermentador de perfusão. Foram semeados fermentadores de 1-5 litros com a variante clonal de BHK, a uma densidade de 2 x 106 células/mL, utilizando o meio basal descrito na Tabela 1. 0 fermentador foi perfundido a uma taxa de 0,5 litro/dia. Um fermentador foi mantido como um controlo e o outro fermentador foi suplementado com cobre e metais vestigiais, como descrito na Tabela 2. Os fermentadores foram mantidos durante 15 dias com uma densidade celular média de ~2 - 3 x 106 células/mL. Como apresentado na Tabela 3, a adição de Pluronic F-68, cobre e metais vestigiais 12 ΡΕ0872487 aumentaram significativamente a produtividade especifica de células BHK contendo o gene que codifica o Factor VIII em condições sem proteína, em condições de perfusão continua. Este método de produção pode ser facilmente adaptado a fer-mentadores maiores (200 a 500 litros) equipado com dispositivos de retenção de células, tais como sedimentadores. TABELA 3
Dias Produtividade Especifica (pU/célula/dia) Meio Basal Cu + metais 1 0,02 0, 04 2 0,02 0,05 3 0,02 0, 045 4 0,018 0, 05 5 0,02 0, 05 6 0, 035 0, 060 7 0, 025 0, 055 8 0, 02 0, 04 9 0, 025 0,06 10 0, 02 0,065 11 0,025 0,070 12 0,025 0,065 13 0,02 0,060 14 0,03 0,06 15 0, 02 0, 05
Os exemplos acima são proporcionados como um meio 13 ΡΕ0872487 de ilustração da presente invenção e não pretendem ser encarados como limitantes da invenção, que é apenas definida pelas reivindicações.
Referências:
Bihoreau, N., et al., Eur. J. Biochem. 222: 41-48 (1994) Chan, S.Y., U.S. Pat. No. 5,576,194 (1996)
Eis-Hubinger, A.M., et al., Thromb. Haemost. 76: 1120 (1996) Mizrahi, A., J. Clin. Microbiol. 11-13 (1975)
Murhammer, D.W., et al., Biotechnol. Prog. 6: 142-148 (1990) Papoutsakis, E.T., Trends in Biotechnology (Tibtech) 9:316-324 (1991)
Qi, Y-M. et al., Cytotechnology 21: 95-109 (1996)
Schmolka, I.R., J. Am. 011 Chemlsts' Soc. 54: 110-116 Schneider, Y-J., J. Immunol. Meth. 116: 65-77 (1989)
Wood, W., et al., Nature 312: 330-337 (1984)
Xu, D., et al., China J. Biotech. 11: 101-107 (1995)
Zhang, J. et al., Biotechnol. 33: 249-256 (1994)
Lisboa, 28 de Novembro de 2006

Claims (15)

  1. ΡΕ0872487 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para a produção de Factor VIII recom-binante de células de hospedeiro de mamífero, comportando o gene para este Factor VIII, compreendendo cultivar as referidas células hospedeiras de mamíferos em meio isento de proteína derivada de plasma e suplementado com polióis e iões de cobre.
  2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o poliol é Pluronic F-68 e está presente no meio a uma concentração variando desde cerca de 0,025 até cerca de 0,2% em peso.
  3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o meio inclui sulfato de cobre numa quantidade que varia desde cerca de 50 até cerca de 800 nM.
  4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os iões de manganês estão presentes numa quantidade que varia desde cerca de 1,5 até cerca de 4,5 nM.
  5. 5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os iões contendo molibdénio estão presentes numa quantidade que varia desde cerca de 1,5 até cerca de 4,5 nM.
  6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os iões que contêm silício estão presentes numa quantidade que varia desde cerca de 75 até cerca de 300 nM. 2 ΡΕ0872487
  7. 7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os iões de crómio estão presentes numa quantidade que varia desde cerca de 1,0 até cerca de 4,0 nM.
  8. 8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os iões de lítio estão presentes numa quantidade que varia desde cerca de 120 até cerca de 480 nM.
  9. 9. Método de acordo com as reivindicações 1 a 8, em que a referida célula hospedeira de mamifero é selec-cionada a partir do grupo consistindo em células de rim de hamster bebé, células de rim embrionário humano e células de ovário de hamster chinês.
  10. 10. Meio de cultura celular para a produção de Factor VIII recombinante compreendendo: (a) um meio basal; (b) um poliol; e (c) iões cobre, em que o meio de cultura de células é isento de proteína derivada de plasma.
  11. 11. Meio de acordo com a reivindicação 10, compreendendo ainda pelo menos um metal vestigial seleccionado a partir do grupo consistindo em manganês, molibdénio, silício, crómio e lítio. 3 ΡΕ0872487
  12. 12. Meio de acordo com a reivindicação 10, em que os iões cobre estão presentes numa quantidade que varia desde cerca de 50 até cerca de 800 nM.
  13. 13. Meio de acordo com a reivindicação 12, compreendendo ainda iões de molibdénio numa quantidade que varia desde cerca de 1,5 até cerca de 4,5 nM.
  14. 14. Meio de acordo com a reivindicação 12, compreendendo ainda iões de litio presentes numa quantidade que varia desde cerca de 120 até cerca de 480 nM.
  15. 15. Meio de acordo com qualquer das reivindicações 10-14, compreendendo ainda insulina produzida de forma recombinante. Lisboa, 28 de Novembro de 2006
PT98106133T 1997-04-18 1998-04-03 Preparação de factor viii recombinante num meio sem proteína PT872487E (pt)

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