NO333527B1 - Fremgangsmate ved fremstilling av virus eller viralproteiner til anvendelse i vaksiner. - Google Patents

Fremgangsmate ved fremstilling av virus eller viralproteiner til anvendelse i vaksiner. Download PDF

Info

Publication number
NO333527B1
NO333527B1 NO20022500A NO20022500A NO333527B1 NO 333527 B1 NO333527 B1 NO 333527B1 NO 20022500 A NO20022500 A NO 20022500A NO 20022500 A NO20022500 A NO 20022500A NO 333527 B1 NO333527 B1 NO 333527B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
virus
cell
cells
per
influenza
Prior art date
Application number
NO20022500A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20022500D0 (no
NO20022500L (no
Inventor
Govert Johan Schouten
Alphonsus Gerardus Cornelis Maria Uytdehaag
Maria Grazia Pau
Original Assignee
Crucell Holland Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8240914&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO333527(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Crucell Holland Bv filed Critical Crucell Holland Bv
Publication of NO20022500D0 publication Critical patent/NO20022500D0/no
Publication of NO20022500L publication Critical patent/NO20022500L/no
Publication of NO333527B1 publication Critical patent/NO333527B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/503—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16651—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12351—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16251—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36211—Rubivirus, e.g. rubella virus
    • C12N2770/36251—Methods of production or purification of viral material
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Det tilveiebringes nye anordninger og fremgangsmåter for produksjon av pattedyrvirus, omfattende å infisere en kul- tur av udødeliggjorte humane celler med viruset, inkubere kulturen som er blitt infisert med virus, for å formere viruset under betingelser som tillater vekst av viruset, og å danne et virusholdig medium, og fjerne det virusholdlge medium. Virusene kan samles og brukes til fremstilling av vaksiner. Fordeler: de beskrevne humane celler kan dyrkes under definerte serumfrie betingelser, og cellene oppviser en forbedret evne til å formere virus. Nærmere bestemt til- veiebringes fremgangsmåter for fremstilling av influensa- virus og vaksiner avledet derav, i dyrkede humane celler. Denne fremgangsmåte fjerner behovet for anvendelse av hele kyllingembryoer for fremstilling av influensavaksiner. Fremgangsmåten tilveiebringer også en kontinuerlig eller batchvis fjerning av kulturmedium. Som sådann tillater fremgangsmåten en kontinuerlig produksjon av virus i høy titer og stor skala.

Description

OMRÅDE FOR OPPFINNELSEN
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et virus og/eller virale proteiner som er forskjellige fra adenovirus eller adenovirale proteiner for anvendelse i vaksiner som angitt i krav 1. Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen fremstilling av slike virale proteiner og/eller virus, under anvendelse av en pattedyrcelle, fortrinnsvis en human celle, for fremstilling av virus som vokser i eukaryotiske celler, fortrinnsvis pattedyrceller og spesielt humane celler. Oppfinnelsen er spesielt nyttig for fremstilling av vaksiner for å fremme en beskyttelse mot virale patogener for virveldyr, spesielt pattedyr og helt spesielt mennesker.
Heri beskrives fremgangsmåter for fremstilling av et virus og/eller et viralt protein i en (human) celle, fortrinnsvis ved bruk av et definert syntetisk medium, og for å rense viruset og/eller bestanddelene derav fra cellen og/eller kulturmediet.
BAKGRUNN
Vaksinasjon er den viktigste rute for å bekjempe virale infeksjoner. Selv om det er tilgjengelig et antall antivirale midler, har disse midler vanligvis en begrenset virkning. Administrasjon av antistoffer mot et virus kan være en god måte å bekjempe virale infeksjoner når et individ vel er blitt infisert (passiv immunisering), og vanligvis virker humane eller humaniserte antistoffer lovende for å bekjempe et antall virale infeksjoner, men den mest virksomme og sikre måte å bekjempe virusinfeksjoner er, og vil sannsynligvis forbli, forebyggelse ved aktiv immunisering. Aktiv immunisering benevnes som regel vaksinasjon, og vaksiner omfatter minst én antigendeterminant av vanligvis et virus, fortrinnsvis et antall forskjellige antigendeterminanter av minst ett virus eller et annet patogen, f.eks. ved innlemmelse i vaksinen av minst ett (viralt) polypeptid eller protein avledet fra et virus (delenhetsvaksiner). Vanligvis omfatter de hittil nevnte formater adjuvanser for å forsterke immunresponsen. Det er også mulig for vaksiner å baseres på helt virus (patogen), f.eks. i inaktivert form. En ytterligere mulighet er anvendelse av levende, men svekkede, former for det patogene virus. En ytterligere mulighet er anvendelse av villtypevirus, f.eks. i tilfeller hvor voksne individer ikke står i fare ved smitte, men hvor barn beskyttes og kan beskyttes via moder-antistoffer og lignende. Produksjonen av vaksiner er ikke alltid en enkel prosedyre. I noen tilfeller utføres produksjonen av viralt materiale på egg, hvilket gjør det vanskelig å rense materialet og nødvendiggjør omfattende sikkerhetstiltak mot forurensning osv. Også produksjon på bakterier eller gjærceller, som iblant, men ikke alltid, er et alternativ til eggene, krever mange rense- og sikkerhetstrinn. Produksjon på pattedyrceller ville være et alternativ, men de pattedyrceller som er blitt brukt hittil, krever f.eks. nærvær av serum og/eller klebing til en fast bærer for å kunne vokse. I det første tilfelle er igjen rensingen og sikkerheten og f.eks. behovet for protease for å støtte replikasjonen av noen virus, et tema. I det andre tilfelle blir høye utbytter og enkel produksjon et ytterligere tema. Foreliggende oppfinnelse overvinner i det minste et antall av problemene som forefinnes ved produksjonssystemer for fremstilling av virus og/eller virale proteiner for vaksineformål, i dagens systemer.
Det er tidligere kjent fremgangsmåter for fremstilling av virus. Således beskriver Neumann G. et al «Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs» Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1999, Aug. 3;96(16):9345-50. PMID: 10430945 en metode for å produsere influenza A virus fra 293 celler ved å utstyre disse cellene med forskjellige plasmider som til sammen koder for hele viruset.
Fra Fallaux FJ et al. «New helper cells and matched early region 1-deleted adenovirus vectors prevent generation of replication-competent adenoviruses». Hum Gene Ther. 1998 Sep 1;9(13):1909-17 er det kjent PER cellelinjer (som inneholder adenovirale EIA- og EIB-kodende sekvenser) som hjelper cellelinjer og samsvarende ikke-homologe adenovirale vektorer til bruk i genterapi.
Fra Fallaux FJ. «Using defined adenoviral genes and primary human cells for the generation of immortalized cell substrates». I: Workshop: «Evolving scientific and regulatory perspectives on cell substrates for vaccine development». U.S. Dep of Health and Human Services, 1999.09.10, Rockville, s. 259, er det foreslått en protokoll som angår tilsvarende teknikk som nevnt ovenfor, men setter denne teknikken i kontekst med tanke på vaksineutvikling.
DETALJERT BESKRIVELSE
Foreliggende oppfinnelse beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av virus hvor det anvendes en ny human udødeliggjort cellelinje for å formere og innsamle virus, for produksjon av viruset. PER.C6-celler (WO 97/00326) ble generert ved å transfisere primære humane embryoniske netthinneceller ved bruk av et plasmid som inneholdt Ad-serotype 5 (Ad5)-E1A- og EIB-kodende sekvenser (Ad5- nukleotider 459-3510) under styring av human fosfoglyceratkinase (PGK)-promoter.
De følgende trekk gjør PER.C6 eller derivater derav spesielt nyttige som vert for fremstilling av virus: den er en fullstendigkarakteriserthuman cellelinje, den ble utviklet i samsvar med GLP, den kan dyrkes som suspensjonskulturer i definert serumfritt medium som er fritt for humane eller animalske serumproteiner; dens vekst er kompatibel med rullekolber, rystekolber, spinnekolber og bioreaktorer, hvor fordoblingstiden er ca. 35 timer.
Influensaepidemioloqi
Influensavirus, dvs. medlemmer av familien Orthomyxoviridae, er de forårsakende midler av årlige epidemier med akutt respiratorisk sykdom. Alene i USA får hvert år 50 millioner amerikanere influensa. Det anslåtte dødstall verden over (1972-1992) er 60.000 (CDC-statistikk). Det har funnet sted 3 alvorlige tilfeller av pandemiutbrudd av influensa, nemlig i 1918 (spansk influensa, beregnet 40 millioner dødsfall), i 1957 (asiatisk influensa, beregnet 1 million dødsfall) og i 1968 (Hong-Kong-influensa, beregnet 700.000 dødsfall). Smitte med influensavirus er forbundet med et bredt spektrum av sykdommer og komplikasjoner som fører til et vesentlig morbiditets- og mortalitetstall verden over, spesielt i eldre mennesker og pasienter med kroniske sykdommer. Vaksinasjon mot influensa er meget virksomt ved forebyggelse av de ofte dødelige komplikasjoner forbundet med denne infeksjon (Murphy, B.R. og R.G. Webster 1996). Produksjon av influensavirus på den diploide humane cellelinje MRC-5 er beskrevet (Herrero-Euribe L. et al. 1983). Imidlertid var titrene av influensavirus uoverkommelig lave.
Stammer av influensavirus
Dagens influensavaksiner inneholder renset hemagglutinin og neuraminidase av influensavirus A og B. De 3 virus som representerer epidemiologisk viktige stammer, er influensa A (H1N1), influensa A (H3N2) og influensa B. Oppdelingen i A- og B-type baserer seg på antigene forskjeller i deres nukleoprotein (NP)- og matriks (M)-proteinantigen. Influensa A-virus er ytterligere delt opp i undertyper på grunnlag av den antigene sammensetning (sekvens) av hemagglutinin (H1-H15)-og neuraminidase (Nl-N9)-molekyler. Representanter for hver av disse undertyper er blitt isolert fra sjøfugler, som sannsynligvis er urbeholdningen av alle influensavirus for fugle- og pattedyrarter. Overføring er blitt påvist mellom svin og mennesker, og nylig (H5N1) mellom fugler og mennesker.
Influensavaksiner
Tre typer inaktiverte influensavaksiner er for tiden i bruk i verden: helvirus-, delvirus- og overflateantigen- eller delenhetsvaksiner. Alle disse vaksiner inneholder overflateglykoproteinene, nemlig hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA), av de influensavirusstammer som antas å sirkulere i den humane populasjon i den kommende sesong. Disse stammer, som innlemmes i vaksinen, dyrkes i embryonerte hønseegg, og de virale partikler renses deretter før viderebehandling. Behovet for en årlig justering av influensavaksinene skyldes antigenvariasjonen som forårsakes av prosesser som er kjent som "antigenic drift" (heri benevnt antigenvandring) og "antigenic shift" (heri benevnt antigenforskyvning).
"Antigenvandring" finner sted ved opphopning av en rekke punktmutasjoner i enten H- eller N-proteinene av et virus, som fører til aminosyresubstitusjoner. Disse substitusjoner forebygger bindingen av nøytraliserende antistoffer som ble indusert av en tidligere smitte, og den nye variant kan smitte verten.
"Antigenforskyvning" er opptreden av en ny undertype ved en genetisk nysammensetning av dyre- og humant influensa A-virus. De pandemiske stammer av 1957 (H2N2) og 1968 (H3N2) er eksempler på nysammensatte virus hvor fugle-H- og/eller N-gener ble innført i sirkulerende humane virus, som deretter kunne spre seg i den humane befolkning.
På grunnlag av de epidemiologiske undersøkelser av over ett hundre nasjonale influensasentre verden over, anbefaler verdens helseorganisasjon (World Health Organization, WHO) årlig en sammensetning av influensavaksinen, vanligvis i februar for den nordre halvkule og i september for den sørlige halvkule. Denne praksis begrenser tidsrommet som er tilgjengelig for fremstilling og standardisering av vaksinen, til maksimalt 9 måneder. I tilfeller med et presserende behov for mange doser med vaksine, f.eks. hvis det oppstår en ny undertype av influensa A-virus ved antigenvandring eller antigenforskyvning, kan en begrenset til-gjengelighet på egg forhindre en rask produksjon av vaksinen. Ytterligere ulemper med dette produksjonssystem er mangelen på fleksibilitet, faren for at det foreligger toksiner, og farene med tilfeldige virus, spesielt retrovirus, og betenkeligheter vedrørende steriliteten. Dette utgjør et alvorlig problem i dagens praksis ved fremstilling av influensavaksiner på embryonerte hønseegg.
Derfor ville anvendelsen av et cellekultursystem for fremstilling av influensavaksiner være et attraktivt alternativ. Influensavirus kan dyrkes på et antall primære celler, bl.a. apenyre, kalvenyre, hamsternyre og kyllingnyre. Alli-kevel er det ikke praktikabelt å benytte seg derav for fremstilling av vaksiner på grunn av behovet for å opprette nye kulturer fra disse primære celler for hver fremstilling av en vaksine. Derfor er anvendelsen av kontinuerlige udødeliggjorte cellelinjer for fremstilling av influensavaksiner et attraktivt alternativ.
Anvendelse av kultursystemer ble forenklet ved at man fikk innsikt i at det er nødvendig med en proteolytisk spaltning av HA til sine to delenheter (HAI og HA2) for at influensavirus skal kunne smitte, og at dette kan oppnås ved tilsetning av trypsin. Innlemmelsen av trypsin muliggjør en replikasjon og plakkdannelse i Madin-Darby-hundenyre (MDCK)-celler (Tobita et al. 1975).
MDCK-cellelinjen viste seg nylig å støtte veksten av influensavirus for fremstilling av vaksiner (Brand et al. 1996 og 1997, Palache et al. 1997). Anvendelse av trypsin nødvendiggjør en dyrkning av MDCK-cellene i serumfritt vevkulturmedium (MDCK-SF1). Imidlertid er MDCK-celler for tiden ikke godkjent som substrat for fremstilling av influensavirus.
Det er viktig at hvilket som helst ikke-humant system for fremstilling av influensavaksiner har iboende ulemper, kjent som "adaptasjon". Både humant influensa A-virus og B-virus bærer mutasjoner i HA som skyldes adaptasjonen til embryonerte hønseegg. Disse mutasjoner fører til en endret antigenisitet (Newman et al. 1993, Williams og Robertson 1993, Robertson et al. 1994, Gubareva et al.
1994, Schild et al. 1993, Robertson et al. 1987, Kodihalli et al. 1995). I mennesker induserer en immunisering med vaksiner som inneholder et HA som bærer en egge-adaptasjonsmutasjon, et mindre nøytraliserende antistoff mot virus som inneholder et ikke-egge-adaptatert HA (Newman et al. 1993).
Humane influensavirus som formerer seg i hundeceller såsom MDCK-celler, oppviser også adaptasjon, om enn i mindre utstrekning. Slike virus ligner de opprinnelige humane isolater mer enn de egge-avledede virus gjør (Robertson et al. 1990).
Videre finnes det tegn på at vert-spesifikke endringer i NA og vert-spesifikke fosforylasjonsmønstre av NA kan påvirke replikasjonen av influensavirus (Schulman og Palese 1977; Sugiara og Ueda 1980; Kistnereta/. 1976).
Det ville derfor klart være fordelaktig å unngå adaptasjon eller andre vert-induserte endringer av influensavirus. Dette kan føre til en mer homogen populasjon av virus og gjøre den endelige vaksine mer virksom.
Det er derfor et formål for foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe humane celler som substrat for fremstilling av høye titere av influensavirus som er egnet for utvikling av vaksiner.
Rotavirus og rotavaksiner
Rotavirus er den viktigste årsak til alvorlig dehydrerende gastroenteritt i små barn verden over. I utviklingsland fører smitte med rotavirus til over 800.000 dødsfall per år. I USA overskrider de beregnede kostnader for helsepleie som skyldes rotavirussmitte, 1 milliard US-dollar per år.
Rotavirus, som er medlemmer av familien Reoviridae, er dobbeltkjedede RNA-virus som består av 11 RN A-segmenter, som hver koder for et strukturelt eller ikke-strukturelt viralt protein (VP). Denne indre kjerne av viruset omfatter fire VP'er: VP1, 2, 3 og 6. VP bestemmer de tre hovedsaklige antigene egenskaper av HRV-gruppen, undergruppen og serotypen. Syv antigent adskilte grupper (A-G) er blitt identifisert som kodes for av VP6. Smitte med humant rotavirus (HRV) forårsakes hovedsaklig av gruppe A-rotavirus, hvor serotypene 1-4 er skyld i 95% av de kliniske sykdommer. Naturlig sykdomsbeskyttelse er serotype-spesifikk. Gruppe A deles ytterligere opp i delgruppe I og II.
Det dobbeltsjiktede ytre skall som utgjør det virale kapsid, består av to virale proteiner, nemlig VP4 og VP7, som er nøytralisasjonsantigenene omfattet i beskyttende immunitet og som bestemmer serotypen, selv om VP4 spiller en mindre rolle ved serotypebestemmelse. Under koinfeksjon med forskjellige serotyper gjennomgår de segmenterte genomer lett en genetisk nysammensetning, en egenskap som er blitt brukt til å lage vaksiner (Marsha et al. 1999).
I betraktning av den verdensomfattende utbredning av rotavirus-forbundet barne-morbiditet og mortalitet, anses en vaksinasjon mot rotavirus i stor skala å være den mest virksomme måte å bekjempe dette virus. Målet med vaksinasjonen ville ikke være å forebygge sykdommen, men å nedsette alvoret og komplikasjonene, spesielt under de første leveår.
Den eneste virksomme vaksine som for tiden er tilgjengelig, er en levende, svekket, oralt levert vaksine basert på nysammensetningen av RNA-segmenter av humane rotavirus som koder for VP7'ene av serotypene 1, 2 og 4 i et Rhesus-rotavirus som tilveiebringer den svekkede bakgrunn sammen med VP7 av serotype 3. Selv om en vaksinasjon med denne humane rhesus-nysammensatte tetravalente vaksine (RRV-TV) er meget virksom ved forebygging av alvorlig gastroenteritt, er dette forbundet med intussuscepsjon, som er en tarmobstruksjonssykdom. Av denne grunn er denne vaksine ikke lenger i bruk.
BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av et virus og/eller virale proteiner, annet enn adenovirus eller adenovirale proteiner, for anvendelse som en vaksine, som omfatter å tilveiebringe en celle som er avledet fra en human embryonisk retinoblast og som har blitt udødeliggjort for å vokse i kultur, med minst en sekvens som koder for minst ett genprodukt av El-gen eller et funksjonelt derivat derav av et adenovirus, å infisere nevnte celle med et virus som er forskjellig fra adenovirus, å dyrke denne cellen i et egnet medium og tillate en formering av viruset eller en ekspresjon av de virale proteiner, og samle viruset og/eller de virale proteiner fra mediet og/eller cellen, som angitt i krav 1.
Før foreliggende oppfinnelse ble gjort, fantes det få, om noen, (humane) celler som har vist seg å være egnet til å fremstille virus og/eller virale proteiner for anvendelse som vaksiner på reproduserbar og skalerbar måte og/eller i tilstrekkelig høyt utbytte og/eller lett rensbart. Vi har nå funnet at celler som omfatter adenovirale El-sekvenser, fortrinnsvis i sitt genom, har evnen til å opprettholde en formering av virus i betydelige mengder.
Den foretrukne celle ifølge oppfinnelsen er avledet fra en human primær celle, fortrinnsvis en celle som er udødeliggjort med et genprodukt av El-genet. For å kunne dyrke en primær celle, må denne såklart udødeliggjøres. Et godt eksempel på en slik celle er en celle avledet fra en human embryonisk retinoblast.
I celler ifølge oppfinnelsen, slike som er angitt i krav 23, er det viktig at El-gensekvensene ikke går tapt under cellesyklusen. Det foretrekkes derfor at sekvensen som koder for minst ett genprodukt av El-genet, foreligger i genomet av cellen (den humane celle). Av sikkerhetsgrunner er det best å være nøyaktig med å unngå unødige adenovirale sekvenser i cellene ifølge oppfinnelsen. Det er dermed et annet trekk av oppfinnelsen å tilveiebringe celler som ikke produserer adenovirale strukturelle proteiner. For å oppnå (kontinuerlig) virusproduksjon i stor skala via cellekulturen, foretrekkes det imidlertid å ha celler som har evnen til å vokse uten at de trenger forankring. Cellene ifølge foreliggende oppfinnelse har denne evne. For å oppnå et rent og sikkert produksjonssystem fra hvilket det er lett å isolere, og om ønsket, rense viruset, foretrekkes det å ha en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen, hvor den humane celle ikke omfatter andre adenovirale sekvenser. Den mest foretrukne celle for fremgangsmåtene og anvendelsene ifølge oppfinnelsen er PER.C6, som ble deponert med ECACC-nr 96022940, eller et derivat derav.
Dermed tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte ved anvendelse av en celle ifølge oppfinnelsen, hvor cellen ytterligere omfatter en sekvens som koder for E2A eller et funksjonelt derivat eller en analog eller et fragment derav, fortrinnsvis en celle hvor sekvensen som koder for E2A eller et funksjonelt derivat eller en analog eller et fragment derav, foreligger i genomet av den humane celle, og mest foretrukket en celle hvor de E2A-kodende sekvenser koder for en temperaturfølsom E2A-mutant.
Videre tilveiebringer oppfinnelsen, som sagt, også en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen hvor cellen (den humane celle) har evnen til å vokse i suspensjon.
Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte hvor den humane celle kan dyrkes i fravær av serum. Cellene ifølge oppfinnelsen, spesielt PER.C6, har den ytterligere fordel at den kan dyrkes i fravær av serum eller serum bestanddeler. Dermed er isolasjonen enkel, sikkerheten er forbedret, og systemets pålitelighet er god (syntetiske medier er best reproduserbare). De humane celler ifølge oppfinnelsen, og spesielt de som baserer seg på primære celler, og helt spesielt de som baserer seg på HER-celler, har evnen til normale post- og peritranslasjonelle modifikasjoner og sammensetning. Dette betyr at de er meget godt egnet for fremstilling av virale proteiner og virus for bruk i vaksiner.
Dermed tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen, hvor viruset og/eller de virale proteiner omfatter et protein som gjennomgår posttranslasjonell og/eller peritranslasjonell modifikasjon, spesielt hvor modifikasjonene omfatter glykosylasjon. Et godt eksempel på en viral vaksine som har vært vanskelig å fremstille på pålitelig måte, er influensavaksine. Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen hvor de virale proteiner omfatter minst ett element valgt fra gruppen influensavirusneuraminidase og/eller hemagglutinin. Andre virale proteiner (delenheter) og virus (villtype som skal inaktiveres) eller svekkede virus som kan fremstilles i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen, omfatter enterovirus, såsom rhinovirus, aftovirus eller poliomyelittvirus, herpesvirus, såsom herpes simpleks-virus, pseudorabiesvirus eller bovint herpesvirus, orthomyxovirus, såsom influensavirus, et paramyxovirus, såsom newcastlesykdomvirus, respiratorisk syncitiovirus, kusmavirus eller meslingevirus, retrovirus, såsom humant immunsviktvirus eller et parvovirus eller et papovavirus, rotavirus eller koronavirus, såsom overførbart gastroenterittvirus eller et flavivirus, såsom flått-båren encefalittvirus eller gulfebervirus, et togavirus, såsom rubellavirus eller østlig, vestlig eller venezuelsk hesteencefalomyelittvirus, et hepatitt-forårsakende virus, såsom hepatitt A- eller hepatitt B-virus, et pestivirus, såsom svinekoleravirus eller rhabdovirus, såsom rabiesvirus, et Bunyaviridae- v'\ rus, såsom Hantavirus.
I én utførelse er en celle ifølge oppfinnelsen nyttig ved generering av en influensavirusstamme som ikke vokser spesielt godt på embryonale egg.
Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte under anvendelse av en human celle som har en sekvens som koder for minst ett El-protein av et adenovirus eller et funksjonelt derivat, en homolog eller et fragment derav i sitt genom, hvilken celle ikke produserer strukturelle adenovirale proteiner, for produksjon av et virus eller minst ett viralt protein for anvendelse i en vaksine. Cellene som foretrekkes i fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse, foretrekkes såklart også for en slik anvendelse. Oppfinnelsen tilveiebringer også produktene som resulterer av fremgangsmåtene og anvendelsene ifølge oppfinnelsen, spesielt virale proteiner og virus som kan erholdes ifølge disse anvendelser og/eller fremgangsmåter, spesielt når de bringes i en farmasøytisk sammensetning omfattende egnede eksipienser og i noen formater (inaktiverte virus, delenheter) også hjelpestoffer. Doseringen og administrasjonsmåten kan bestemmes ved normal klinisk testing i det omfang de ikke allerede er kjent fra de allerede registrerte vaksiner.
Oppfinnelsen tilveiebringer dessuten en human celle som har en sekvens som koder for minst ett El-protein av et adenovirus eller et funksjonelt derivat, en homolog eller et fragment derav i sitt genom, hvilken celle ikke produserer strukturelle adenovirale proteiner og som er infisert av et ikke-adenoviralt virus, hvor nevnte humane celle er avledet fra en human embryonisk retinoblast. Denne celle kan brukes i en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen.
I en foretrukken utførelse tilveiebringer oppfinnelsen influensavirus som kan erholdes med en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen. I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen influensavaksiner som kan erholdes ved en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen.
I et annet trekk tilveiebringer oppfinnelsen et sett for å bestemme aktiviteten av en protease i en prøve som omfatter minst ett viralt protein eller virus som kan erholdes ved en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen, hvor viruset eller det virale protein er fritt for ikke-humant pattedyr-proteinmateriale. Dette trekk av oppfinnelsen er nyttig spesielt for å bestemme proteaseaktiviteten i et kulturmedium. Kulturmedium er kjent for å være et vanskelig miljø for å bestemme aktiviteten av en protease. Ved bruk av et viralt protein eller et virus ifølge oppfinnelsen som mål for proteasen, er det imidlertid mulig å nøyaktig bestemme aktiviteten av proteasen også i kulturmedium. I en foretrukken utførelse måles derfor proteaseaktiviteten i en prøve som omfatter kulturmedium. I en foretrukken utførelse omfatter proteasen trypsin. I en foretrukken utførelse omfatter det virale protein HAO.
I enda et annet trekk tilveiebringer oppfinnelsen muligheter for å konsentrere influensavirus under betingelser som i det minste delvis kan bevare virusets smitteevne. Dette gjøres ved å tilveiebringe en celle-frigjort supernatant omfattende viruset fra en cellekultur, og å ultrafiltrere supernatanten under lavskjær-betingelser. Influensaviruspreparater samlet fra embryonale egg trenger vanligvis å renses for å fremstille en vaksine. Rensingen omfatter vanligvis minst ett konsentrasjonstrinn av viruset. Dagens teknologi for konsentrasjon av influensavirus fra slike relativt ubehandlede preparater av influensavirus er møy-sommelige. Ved bruk av en fremgangsmåte for konsentrasjon er det mulig å konsentrere influensaviruspreparater under betingelser som bevarer i det minste en del av virusets smitteevne. Fortrinnsvis konsentreres virus som er, eller kan gjøres, smittedyktig. Med "kan gjøres smittedyktig" menes i det minste en generering av smittedyktig virus ved spaltning av HAO. I en foretrukken utførelse utføres konsentrasjonen ved bruk av en hul fiber. En hul fiber er spesielt godt egnet til å konsentrere under lavskjær-betingelser. I en foretrukken utførelse omfatter dyrkningen av celler in wfro-dyrkede celler. Spesielt godt egnet for konsentrasjon er supernatant fra in wtro-dyrkede celler. Spesielt når supernatanten omfatter serumfritt kulturmedium. I en foretrukken utførelse utføres ultrafiltreringen med filter som gjør det mulig for enkelte proteiner å passere, mens virus holdes tilbake. Fortrinnsvis omfatter filtret en avsperring ved 500 kD. Mer foretrukket omfatter filtret en avsperring ved 750 kD. I en spesielt foretrukken utførelse omfatter konsentrasjonen ytterligere i det minste en delvis fjerning av proteiner som har en molekylvekt under 500 kD og mer foretrukket under 750 kD. Fortrinnsvis oppnås rensningen ved bruk av et nevnt filter.
I enda et annet trekk tilveiebringer oppfinnelsen smittedyktig influensavirus eller derivater derav. Et derivat av et smittedyktig influensavirus ifølge oppfinnelsen er vanligvis et virus, en viruspartikkel eller et viralt protein eller en del derav som kan brukes for immuniseringsformål. Vanligvis medfører dette et virusinfektivitets-inaktiveringstrinn.
EKSEMPLER
For å illustrere oppfinnelsen tilveiebringes de følgende eksempler.
Eksempel 1
Materialer og metoder
PER. C6- oo MDCK- cellekultur
Madin-Darby-hundenyre (MDCK)-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM, Life Technologies, Breda, Nederland) som inneholdt 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum og lx L-glutamin (Gibco-BRL), ved 37°C og 10% C02. Suspensjonskulturer av PER.C6 ble dyrket i ExCell 525 (JRH Biosciences) supplementert med lx L-glutamin, ved 37°C og 10% C02, i stasjonære kulturer i 6-brønners skåler (Greiner) eller i 490 cm<2>vevkultur-rullekolber (Corning Costar Corporation) under kontinuerlig rotasjon med 1 rpm.
Immunofluorescens- test
Direkte immunofluorescensassayer for påvisning av influensavirussmitte ble utført ved bruk av "IMAGEN" influensavirus A- og B-sett (Dako) i henhold til produsentens standardprotokoll. Prøvene ble betraktet med mikroskop ved bruk av epifluorescens-belysning. Smittede celler var kjennetegnet av en lysende eplegrønn fluorescens.
Propidiumiodid- flekkinq
Cellepelleter ble resuspendert i 300^1 kald PBS/0,5% BSA + 5^1 propidiumjodid (konsentrasjon 50 ug/ml) i PBS/FCS/azid-oppløsning som er kjent for fagmannen. Levedyktige og døde celler ble deretter påvist ved strømningscytometrisk analyse.
Hemaqqlutinasionsassav
Generelt ble hemagglutinasjonsassayer for influensavirustitere utført i henhold til metoder som er kjent for fagmannen. Her ble 50 |i.l to ganger fortynnet virusoppløsning i PBS tilsatt til 25^1 PBS og 25 ^1 1% suspensjon av kalkun-erytrocytter (Biotrading Benelux B.V.) i PBS, og inkubert i 96-brønners mikrotiterplater ved 4°C i 1 time. Hemagglutinasjonsmønstret ble undersøkt og bedømt, og uttrykt som hemagglutinerende enheter (HAU'er). Antallet HAU'er tilsvarte den resiproke verdi av den høyeste virusfortynning som oppviste fullstendig hemagglutinasjon.
Western blot- analvse av influensa- HA- protein
Generelt ble de erholdte influensavirus sprengt i en Laemmli-buffer i henhold til fremgangsmåter som er kjent for fagmannen, og forskjellige volumer av erholdte proteinblandinger ble adskilt ved bruk av 10% SDS/PAGE-geler. Kort sagt ble blottene blokkert i 30 minutter ved romtemperatur med blokkeringsoppløsning (5% tørr-skummetmelkpulver (Biorad) i TBST supplementert med 1% kaninserum (Rockland)), fulgt av 3 vaskinger med TBST. Deretter ble blottene inkubert med anti A/Sydney/5/97-HA-antiserum (98/768 NIBSC) fortynnet 1/500 i 1% BSA/TBST med 5% kaninserum (Rockland) O/N ved romtemperatur. Igjen ble blottene vasket 8 ganger med TBST. Til slutt ble blottene inkubert med kanin-anti-saue-antiserum (HRP-merket, Rockland) 1/6000 fortynnet i blokkeringsoppløsning i 1 time ved romtemperatur. Etter 8 vaskinger med TBST, ble protein/konjugat-komplekset visualisert med ECL (Amersham Pharmacia Biotech), og filmer (Hyperfilm, Amersham Life Science) ble eksponert. Antiseraene ble ervervet fra NIBSC (UK) og anvendt i de fortynninger som anbefales av NIBSC.
Enkelt radial immunodiffusions ( SRID)- assav
Konsentrasjonen av hemagglutinin i supernatanter, avledet fra influensavirus-infiserte PER.C6-celler, ble bestemt ved enkelt radial immunodiffusjons (SRID)-testen slik det er blitt beskrevet tidligere (Wood et al. 1977). Assayet ble utført ved bruk av standard NIBSC (UK)-antigener og antisera-reagensmidler.
Plakk- assav
Tilsammen 1 ml 10 ganger serielt fortynnede virale supernatanter ble podet på MDCK-celler som var blitt dyrket til 95% sammenløp i 6-brønners plater. Etter 1 time ved 35°C ble cellene vasket to ganger med PBS og overladet med 3 ml agaroseblanding (1,2 ml 2,5% agarose, 1,5 ml 2x MEM, 30 |xl 200 mM L-glutamin, 24 ul trypsin-EDTA, 250 ul PBS). Cellene ble deretter innpodet i en fuktig, 10% C02-atmosfære ved 35°C i ca. 3 dager, og antallet virale plakk ble bedømt visuelt.
Virusinfektivitetsassav ( TCID^)
Titrering av smittelig virus ble utført på MDCK-celler. Kort sagt ble celler podet i 96-brønners plater i en tetthet på 4 x 104 celler/brønn i DMEM som var supplementert med 2 mM L-glutamin. 24 timer senere ble cellene smittet med 100 |i.l ti ganger serielt fortynnede kultursupernatanter, in quatro, i medium som inneholdt trypsin-EDTA i konsentrasjonen 4 ug/ml. To timer etter infeksjonen, ble celle-monosjiktene vasket to ganger i PBS og inkubert i medium som inneholdt trypsin, i 7 dager ved 35°C. Supernatantene fra disse kulturer ble deretter testet i et HA-assay. TCID50-titrene ble beregnet i henhold til fremgangsmåten til Karber (1931).
Influensavirus- inaktiverinq med B- propiolakton
For inaktivering av virusene for å erholde hel-inaktivert virus for generering av vaksiner avledet fra PER.C6, utførte man en mutasjonsprotokoll som er kjent for fagmannen, ved bruk av p-propiolakton. p-Propiolakton er et meget virksomt middel som finner bred anvendelse ved inaktivering av virus og som er velkjent innen faget for sine muterende virkninger. Det modifiserer nukleinsyrebaser av det virale genom og vertens cellegenom, og blokkerer deretter replikasjonen. Idet man fulgte en etablert protokoll som brukes til å fremstille inaktivert hel-influensavirusvaksine fremstilt på embryonerte egg, ble den mengde virus som tilsvarte ca. 400 |xg HA per stamme, inaktivert og brukt for formulering av den endelige vaksine. Kort sagt ble én volumdel 0,3 M natriumfosfatbuffer tilsatt til 9 volumdeler influensaviruspreparat. Inaktivering av virusene ble utført ved å tilsette én volumdel 10% p-propiolakton (Newall Design, UK) til 100 volumdeler fosfatbufret viruspreparat, og det hele ble inkubert ved 20°C i 24 timer. Inaktiveringen av virusene ble kontrollert ved plakk-assayet, og ingen plakk ble påvist for noen av de inaktiverte batcher (data ikke vist).
Eksempel 2A
PER. C6- cellelaqrinq og forkultur
Cellelinjen PER.C6 (deponert under nr. 96022940 ved European Collection of Animal Cell Cultures ved Centre for Applied Microbiology and Research) eller derivater derav ble brukt (beskrevet i WO 97/00326). Cellelinjene ble lagret med et tosjikts cellelagringssystem. Den valgte cellelinje ble lagret i et forsknings-originalcellelager (rMCB) som ble lagret på forskjellige steder. Fra denne rMCB ble forsknings-arbeidscellebanker (rWCB) fremstilt som følger: en ampull av rMCB ble tint, og cellene ble formert inntil det forelå tilstrekkelig mange celler til å fryse cellene ved bruk av tørris. Opptil 500 ampuller som inneholdt 1 ml (1-2 x IO<6>celler/ml) rWCB ble lagret i gassfasen av en flytende N2-fryser. Én ampull som inneholdt 5 x IO<6>PER.C6-celler av WCB, ble tint i et vannbad ved 37°C. Cellene ble raskt overført til et 50 ml-rør og gjensuspendert ved tilsetning av 9 ml av suspensjonsmediet ExCell 525 (JRH Biosciences) supplementert med 1 x L-glutamin. Etter 3 minutters sentrifugering ved 1000 rpm i en bordsentrifuge, ble cellene resuspendert i den endelige konsentrasjon 3 x IO<5>celler/ml og dyrket i en T80-vevkulturkolbe ved 37°C, 10% C02. To til tre dager senere, ble cellene podet inn i 490 cm<2>vevkultur-rullekolber (Corning Costar Corporation) i tettheten 3 x IO<5>per ml, og dyrket under kontinuerlig rotasjon med 1 rpm.
Eksempel 2B
PER. C6- celler som mottakelig cellelinje for influensa A- virus
PER.C6 som human celle var ikke kjent for sin evne til å tillate influensavirussmitte og -replikasjon. Det ble derfor verifisert om PER.C6-celler er mottakelige for influensavirussmitte sammenlignet med hundecellelinjen Madin-Darby hundenyre (MDCK), som tjente som positivkontroll.
Pa dagen før smitten, ble 2 x IO<5>MDCK-celler per brønn podet i 6-brønners plater. 24 timer senere, ble 4 x IO<5>podede PER.C6-celler og MDCK-celler per brønn smittet med HINl-stammen A/Puerto Rico/8/34 (titer 3,6 x IO<7>pfu/ml) (erholdt fra Dr. E. Claas, Leiden University Medical Center, Nederland). Smitten ble utført ved forskjellige smittemultiplisiteter (moi'er) fra 0,1 til 10 pfu/celle. Etter ca. 2 timers inkubasjon ved 37°C, ble podestoffet fjernet og erstattet med ferskt kulturmedium. Et direkte immunofluorescensassay for påvisning av influensavirussmitten ble utført 24 og 48 timer etter smitten. Eksperimentet oppviste en mottakelighet av PER.C6 for influensasmitte, hvor prosentdelen positive celler var moi-avhengig og sammenlignbar med MDCK (fig. 1).
Eksempel 3
PER. C6 brukt for influensa A- virusformerinq
Det ble verifisert om replikasjon og formering av influensavirus kunne opprettholdes av PER.C6. På dagen for smitten, ble PER.C6-celler podet i 490 cm<2>vevkultur-rullekolber, med tettheten 2 x IO<5>celler/ml, i det endelige volum 40 ml, i nærvær av 5 ug/ml trypsin-EDTA (Gibco-BRL). Cellene ble enten jukse-innpodet eller infisert med H3N2-stammen A/Shenzhen/227/95 (titer 1,5 x IO<6>pfu/ml)
(erholdt fra Dr. E. Claas, Leiden University Medical Centre, Nederland). Infeksjonene ble utført med moi-verdiene 10"<4>og IO"<3>pfu/celle. Etter 1 times inkubasjon ved 37°C, ble podestoffet fjernet ved sentrifugering av cellene med 1500 rpm og resuspensjon av cellene i ferskt kulturmedium + 5 ug/ml trypsin-EDTA. Innsamling av 1,3 ml cellesuspensjon ble utført hver dag, fra dag 1 til dag 6 etter infeksjonen. Supernatantene ble lagret ved -80°C og brukt for hemagglutinasjonsassayer. Cellepelleter ble brukt for direkte immunofluorescensassayer og for propidiumjodidflekking.
Eksempel 4
Toleransen av PER. C6 for forskjellige influensastammer
For å nærmere undersøke toleransen av PER.C6 for formeringen av forskjellige
influensavirusstammer, utførte man en smitte ved bruk av HINl-vaksinestammene A/Beijing/262/95 og dets nysammensatte type X-127, erholdt fra National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC, UK). På dagen for smitten ble PER.C6-
celler podet i 490 cm<2>vevkultur-rullekolber, med tettheten ca. 1 x IO<6>celler per ml, i det endelige volum 50 ml. Cellene ble podet med 5 |xl (10"<4>fortynning) og 50n\ (10"<3>fortynning) virus i nærvær av 5^g/ml trypsin-EDTA. For å bestemme om trypsin faktisk var nødvendig, utførte man én infeksjon til ved å innpode 5 |xl av stamme A/Beijing/262/95 i fravær av proteaset. Etter ca. 1 times inkubasjon ved 37°C, ble podestoffet fjernet ved å sentrifugere cellene ved 1500 rpm og resuspendere dem i ferskt kulturmedium ± 5^g/ml trypsin-EDTA. På dag 2 og dag 4 etter infeksjonen ble mer trypsin tilsatt til prøvene. Innsamling av 1,3 ml cellesuspensjon ble utført fra dag 1 til dag 6 etter infeksjonen. Supernatantene ble lagret ved -80°C og brukt for hemagglutinasjonsassayer og ytterligere infeksjoner; cellepelleter ble brukt for direkte immunofluorescensassayer. Resultatene som ble erholdt i de ovennevnte immunofluorescens- og hemagglutinasjonsassayer, vises på henholdsvis flg. 4 og 5, som illustrerer en effektiv replikasjon og frigivning av virusene.
Eksempel 5
Smitteevne av virus som er blitt formert på PER. C6
Det ble verifisert om virusene som ble dyrket i PER.C6, var smittelige, og om adaptasjon til cellelinjen kunne heve virusutbyttet. Man brukte virussupernatanter avledet fra PER.C6 som var blitt smittet med stammene A/Beijing/262/95 og dens nysammensatte type X-127 (dil. 10-3) og innsamlet på dag 6 etter infeksjonen. På dagen for infeksjonen ble PER.C6 podet i 490 cm<2>vevkultur-rullekolber, i tettheten ca. 1 x IO<6>celler per ml i det endelige volum 50 ml. Cellene ble innpodet med 100 ixl og 1 ml virussupernatant i nærvær av 5 ug/ml trypsin-EDTA. For å bestemme om trypsinet fortsatt var nødvendig, utførte man én smitte til ved å pode 100 ul av stammen A/Beijing/262/95 i fravær av proteaset. Etter ca. 1 times inkubasjon ved 37°C, ble podestoffet fjernet ved sentrifugering av cellene ved 1500 rpm og gjen-suspensjon derav i ferskt kulturmedium ± 5 mg/ml trypsin-EDTA. På dag 2 og 4 etter infeksjonen ble det tilsatt mer trypsin til prøvene. Innsamling av 1,3 ml cellesuspensjon ble utført fra dag 1 til dag 6 etter infeksjonen. Supernatantene ble lagret ved -80°C og brukt for hemagglutinasjonsassayer og ytterligere infeksjoner; cellepelleter ble brukt for direkte immunofluorescensassayer. Resultatene som ble erholdt i de ovennevnte immunofluorescens- og hemagglutinasjonsassayer, vises på fig. 6 og 7. Data erholdt med det foreliggende eksperiment, viste en smitteevne av virusene som ble dyrket i PER.C6, samt et hevet virusutbytte.
Eksempel 6
Nærvær av celleflatereceptorer for influensavirus på PER. C6
Formeringen av humane influensa A- og B-stammer i embryonerte kyllingegg fører alltid til et utvalg av receptorbindingsvarianter som inneholder aminosyresubstitusjoner i det distale parti av HA-globulært hode i de utsatte og funksjonelt viktige regioner av molekylet. På grunn av disse mutasjoner kan de egge-adapterte stammer skille seg fra de opprinnelige humane virus i sin antigene og immunogene aktivitet, samt sin virulens. Humane influensavirus isolert fra MDCK-celler presenterer vanligvis et HA-protein som er identisk med HA-proteinet som foreligger på viruset av den opprinnelige kliniske prøve. En nylig undersøkelse (Govorkova 1999) klargjorde det molekylære grunnlag for utvalg av varianter i kyllingegg og fraværet av dette variantutvalgsfenomen i MDCK-celler. Alle humane influensa A- og B-stammer som ble isolert fra MDCK-cellene, viste seg å bindes med høy affinitet og spesifisitet for alfa-2,6-sialsyre-galaktose-bindinger som forelå i oligosakkarider som forelå i celleflatereceptorer, mens deres egge-dyrkede mot-parter oppviste en hevet affinitet for alfa-2,3-sialsyre-galaktose-bindinger i celleflatereceptorer som bar oligosakkarider (Sia2-3Gal). Ved bruk av spesifikke lektiner ble det demonstrert at det kun forelå Sia2-3Gal-holdige receptorer på overflaten av kylling-embryoniske egg, mens MDCK-celler uttrykte både Sia2-6Gal og Sia2-3Gal. Ekspresjonen av Sia2-3Gal- og Sia2-6Gal-enheter på overflaten av PER.C6-celler ble undersøkt ved FACS-analyse ved bruk av to forskjellige digoksigenin (DIG)-merkede lektiner, nemlig Sambuca n/gra-agglutinin (SNA), som spesifikt gjenkjenner Sia2-6Gal-bindinger, og Maackia amurens/s-agglutinin (MAA), som spesifikt gjenkjenner Sia2-3Gal-bindinger. Fig. 8A viser gjenkjenningen av SNA- og MAA-lektiner og deres binding til glykosylasjonssetene. Videre viser fig. 8A den skjematiske vekselvirkning mellom FITC-merket anti-DIG-antistoff og det DIG-merkede lektin som gjenkjenner den spesifikke sialylbinding i glykosylasjons-grunnstrukturen av receptoren som foreligger på celleflaten. Begge lektiner ble tatt fra glykan-differensieringssettet (Boehringer-La Roche).
Eksperimentet ble utført på PER.C6-celler i suspensjon og adherente MDCK- og CHO-celler. MDCK- og CHO-celler ble frigjort fra den faste bærer ved bruk av trypsin-EDTA (Gibco-BRL). Cellesuspensjonene ble deretter vasket én gang med Mem-5% PBS og inkubert i dette medium i 1 time ved 37°C. Etter vasking med PBS (Gibco-BRL), ble cellene gjensuspendert til en konsentrasjon på ca. IO<6>celler/ml i bindingsmedium (Tris-bufret salin, pH 7,5, 0,5% BSA, og 1 mM hver av MgCI2, MnCI2og CaCI2). Cellealikvoter ble inkubert i 1 time ved romtemperatur med de DIG-merkede lektiner SNA og MAA. Etter 1 time, ble lektin-behandlede celler vasket med PBS og inkubert i en ytterligere time ved romtemperatur med FITC-merket anti-DIG-antistoff (Boehringer-Mannheim). Til slutt ble cellene vasket med PBS og analysert ved fluorescens-aktivert cellesortering ved bruk av et FAC-sorte-ringsapparat (Becton Dickinson). Resultatene som vises på fig. 8B, demonstrerer at PER.C6-celler ble flekket med begge lektiner, hvilket viser et nærvær av Sia2-6Gal-samt Sia2-3Gal-receptorer.
I det samme eksperiment ble MDCK-celler brukt som positivkontroll for begge de sialylerte receptorer, mens CHO-celler, grunnet fraværet av alfa-2,6-sialyltransferase-glykosylasjonsenzym i disse hamsterceller, representerte en nega-tivkontroll for Sia2-6Gal-enheten. De øvre ruter viser resultatene med SNA-lektinet, og de nedre ruter viser resultatene med MAA-lektinet. Fra disse resultater kan man konkludere med at PER.C6 uttrykker celleflateproteiner som har både Sia2-3Gal- og Sia2-6Gal-bindinger i sine oligosakkaridkjeder.
Eksempel 7
Virkning av forskjellige konsentrasjoner av trypsin- EDTA på levedyktigheten av PER. C6- celler. på influensavirus- produksjonen i PER. C6- celler og på HA- proteinet avledet derav
Grunnet det absolutte krav til trypsin for formeringen av influensavirus i cellekulturer, undersøkte man virkningene av forskjellige konsentrasjoner av trypsin-EDTA på PER.C6-cellers levedyktighet og virusreplikasjonen i PER.C6-celler, etter infeksjon ved bruk av forskjellige influensa-stammer.
Infeksjon med influensavirusstamme A/ Svdnev/ 5/ 97 i nærvær av lave konsentrasjoner av trypsin
På dagen for infeksjonen ble PER.C6-celler podet i 490 cm<2>vevkultur-rullekolber, i en tetthet på 1 x IO<6>celler per ml, i nærvær av trypsin-EDTA i de endelige konsentrasjoner 0,5, 1, 2, 3 og 5 ug/ml.
Disse trypsinkonsentrasjoner forstyrret ikke vekstkarakteristikken av cellene eller deres levedyktighet (data ikke vist). Cellene ble enten jukse-infisert eller infisert med PER.C6-dyrket influensavirus A/Sydney/5/97 ved en moi-verdi på IO"<4>pfu/celle. Den virale produksjon ble overvåket ved direkte immunofluorescens (data ikke vist), hemagglutinasjonsassayer, enkelt radial immunodiffusjon (SRID) beskre vet ovenfor og plakk-assayer, alle som beskrevet ovenfor. Resultatene fra dette eksperiment avbildes på fig. 9, og viser at HA-innholdet ifølge målinger ved SRID, samt den biologiske aktivitet av viruset, uttrykt i HAU, var høyest når man brukte en trypsinkonsentrasjon på 1^g/ml. Fig. 9 viser også at ved bruk av et plakk-assay, observerte man det høyeste antall plakkdannende enheter (pfu) per ml i prøven som tilsvarte celler som ble dyrket i medium som inneholdt 2 ug/ml trypsin.
Infeksjon med influensavirusstamme B/ Harbin/ 7/ 94
På dagen for infeksjonen ble PER.C6-celler podet i 490 cm<2>vevkultur-rullekolber i en tetthet på 1 x io<6>celler/ml, i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av trypsin-EDTA som varierte fra 1 til 5 ug/ml. Cellene ble infisert med PER.C6-dyrket virus B/Harbin/7/94 ved en moi-verdi på IO"<3>pfu/celle. Produksjonen av virus ble overvåket ved direkte immunofluorescens-, hemagglutinasjons- og plakkassayer slik det fremgår fra fig. 10. Smitteevnen av PER.C6 på dag 2 økte med konsentrasjonen av trypsin. På dag 3 observerte man imidlertid ingen signifikant forskjell mellom prosentdelen smittede celler når det forelå 1, 2,5 eller 5 |i.g/ml trypsin. I fravær av trypsin (0 ug/ml) påviste man ingen smitte med influensavirus. På dagen for den siste innsamling (dag 4 etter infeksjonen), var det ingen signifikant forskjell i den biologiske aktivitet av viruset ifølge målinger med hemagglutinasjonsassayet. Det er interessant å notere seg at infektivitetsassayet utført i prøver som ble tatt på dag 3 og 4 etter infeksjonen, viste en forskjellig produksjon av viruset. De høyeste titere ble oppnådd på dag 3 og dag 4 når man brukte en trypsinkonsentrasjon på 2,5 til 5 (dag 3) eller 1^g/ml (dag 4).
Infeksjon med influensavirus- nvsammensetninastvpe X- 127
På dagen for infeksjonen ble PER.C6-celler podet i T25-vevkulturkolber, i en tetthet på 1 x IO<6>celler/ml, i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av trypsin-EDTA som varierte fra 0 til 7,5 \ ig/ m\. Cellene ble infisert med PER.C6-dyrket virus X-127 (egge-nysammensetningstype for stammen A/Beijing/262/95) ved en moi-verdi på IO"4 og 10"<3>pfu/celle. Den virale vekst ble overvåket ved direkte immunofluorescens-, hemagglutinasjons- og plakk-assayer. Slik det fremgår fra fig. 11 og fig. 12, var HAU-titrene identiske prøvene imellom, uavhengig av hvilken trypsinkonsentrasjon og opprinnelig moi-verdi som ble brukt. Videre observerte man ingen signifikante forskjeller i infektivitetstitrene ifølge målinger med plakk-assayet.
Infeksjon av PER. C6 med influensavirusstamme A/ Svdnev/ 5/ 97 i nærvær av høve konsentrasjoner av trypsin
For å teste virkningen av å heve konsentrasjonen av trypsin på levelevedyktigheten av cellene og virusreplikasjonen, ble PER.C6-celler podet i rullekolber i en tetthet på 1 x IO<6>celler/ml i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av trypsin-EDTA som varierte fra 0 til 12,5 ug/ml. Cellene ble enten jukseinfisert eller infisert med PER.C6-dyrket virus A/Sydney/5/97 ved en moi-verdi på 4 x IO"<5>pfu/celle. 1-IAU'er som forelå i de erholdte batcher, ble bestemt slik det ble beskrevet ovenfor. Det er viktig å notere seg at dataen som er avbildet på fig. 13, tydelig viser at trypsinkonsentrasjoner opptil 10^g/ml ikke forstyrrer cellenes levedyktighet. Videre var den biologiske aktivitet av viruset som ble oppnådd på dag 4 etter infeksjonen og målt ved HAU, høyere når man brukte en trypsinkonsentrasjon fra 2,5 til 5 ug/ml. Videre ble TCID50målt (fig. 14A), og plakkassayer ble utført (data ikke vist). Man fant ingen relevante forskjeller i disse plakkassayer, i infektivitetstitrene (TCID50), i HA-spaltningen og mengden (ca. 10 ug/ml) ifølge bestemmelser med western blot-analyse, slik det fremgår fra fig. 14B.
Eksempel 8
Influensavirusproduksjon på PER. C6- celler i et hulfiberperfusjons- bioreaktorsvstem
Skalerbarheten av influensavirusproduksjonen i suspensjonsdyrkede PER.C6-celler ble undersøkt ved bruk av 3 liters (samlet volum) bioreaktorer som inneholdt et 2 liters cellesuspensjonsvolum i serumfritt medium som også var fritt for dyre- eller menneskeavledede proteiner (ExCell 525, JRH Biosciences).
Influensainfeksjonen ble utført ved en celletetthet på ca. 3 x IO6 celler/ml. Cellene ble podet med PER.C6-dyrket A/Sydney/5/97-vi rus ved en moi-verdi på 10"<4>pfu/celle. Prøver av 5 til 10 ml cellesuspensjon ble tatt hver dag for å utføre generelle celletellinger, for å bestemme levedyktigheten av cellene, for måling av glukosekonsentrasjonen, for direkte immunofluorescens-, hemagglutinasjons- og infektivitetsassayer. Resultatene av disse eksperimenter vises på fig. 15.
For å undersøke nærværet og statusen av HA-protein, utførte man western blot-analyser ved bruk av to forskjellige anti-HA-antistoffer som var ervervet fra NIBSC. SRID-assayer som beskrevet ovenfor, ble også utført. Resultatene som er avbildet på de to western blots på fig. 16, viser at influensavirus-batchen som ble produsert i denne bioreaktor, gav et HA-innhold med en beregnet konsentrasjon på 15^g/ml, hvilket ble bekreftet ved SRID-assayer. Det produserte HA er sammenlignbart med referanse-NIBSC-HA hva angår delenhetenes sammensetning og immunreaktiviteten med de referanse-undertype-spesifikke antisera.
Eksempel 9
Infeksjon av PER. C6 med A/ Svdnev/ 5/ 97 i en 15 liters bioreaktor.fulgt av en spesifikk nedstrømsprosess ( DSP)
Suspensjonsdyrkede PER.C6-celler ble inkubert ved 37°C i en 15 liters bioreaktor med hulfiberperfusjonssystem, med et cellesuspensjonsvolum på 10 liter i serumfritt ExCell 525-medium (JRH Biosciences). Influensainfeksjon ble utført ved 35°C ved en celletetthet på ca. 3,3 x IO<6>celler/ml i medium som inneholdt 5 |i.g/ml trypsin-EDTA (Life Technologies). Cellene ble podet med PER.C6-dyrket A/Sydney/5/97-virus (passasjetall 3) ved en moi-verdi på 10"<4>pfu/celle. Perfusjon med serumfritt ExCell 525-medium som inneholdt trypsin-EDTA, ble fortsatt under de første 24 timer etter infeksjonen. To dager etter infeksjonen ble cellene foret med en for-batch-oppløsning som inneholdt glukose, essensielle aminosyrer og ekstra glutamin: 82 ml per liter suspensjon som inneholdt 50 m/vol% glukose (NPBI, Nederland), 50x essensielle aminosyrer uten Gin (Gibco-BRL-Life Technologies) og 200 mM glutamin (Gibco-BRL-Life Technologies). Cellesuspensjonsprøver på 10 ml ble tatt hver dag for å utføre standard celletelling (resultatene vises på fig. 17, venstre graf), måling av glukosekonsentrasjonen (resultatene vises på fig. 17, høyre graf);direkte immunofluorescens (fig. 18), hemagglutinasjons- (fig. 19) og infektivitetsassayer (data ikke vist). Videre ble HA-protein undersøkt ved western blot-analyse og sammenlignet med en standard HA-kontroll fra NIBSC (fig. 20). På dagen for den endelige innsamling av hele cellesuspensjonen (92 timer etter infeksjonen), utførte man en celleavfallklarning i en kontinuerlig strøm ved 20.000 g ved bruk av "Powerfuge"-separasjonssystemet (Carr, JM Separations) i henhold til produsentens protokoller. Klarnet supernatant ble deretter konsentrert 20 ganger ved bruk av en hulfibermembran-patron med avsperring ved 500 kD (A/G Technology, JM Separations). Resultatene som vises på fig. 21, viser at den kvantitative isolasjon av levende influensavirus etter konsentrasjon ved hulfiber ifølge målinger med hemagglutinasjons- og infektivitetsassayer, er meget betydelig.
Eksempel 10
Immunoqenisiteten av PER. C6- dvrkede influensavirus og vaksiner avledet derfra
For å bestemme immunogenisiteten av PER.C6-dyrkede influensavirus, utformet man en in wVo-undersøkelses- og smittemodell i fretter. To batcher av treverdig inaktivert hel-influensa-vaksine (satt sammen av A/Sydney/5/97, A/Beijing/262/95 og B/Harbin/7/94) som inneholdt 15^g HA fra hver av de tre stammer, ble brukt. Den første batch ble erholdt fra befruktede hønseegg, og den andre ble erholdt fra PER.C6-celler. Produksjonen, rensingen, inaktiveringen og formuleringen av de treverdige inaktiverte PER.C6-avledede hel-influensa-vaksiner ble utført slik det skal beskrives i det følgende.
Dyrking av A/ Svdnev/ 5/ 97-. A/ Beiiinq/ 262/ 95- og B/ Harbin/ 7/ 94- influensastammer på PER. C6
Produksjon av alle tre influensavirusbatcher ble utført i tre adskilte 3 liters hulfiber batch-forede-bioreaktorsystemer med cellesuspensjonsvolumer på 2 liter. Batch-foringen ble utført ved tilsetning av den følgende oppløsning: et samlet volum på 96 ml som inneholdt 50 m/vol% glukose (NPBI), 50x essensielle aminosyrer uten Gin (Gibco-BRL-Life Technologies), 200 mM glutamin (Gibco-BRL-Life Technologies) og 7,5 m/vol% NaHC03(Merck) ble tilsatt én gang. Influensainfeksjoner ble utført ved celletettheter fra 1,8 x IO<6>til 2,6 x IO<6>levedyktige celler per ml, i ExCell 525 serumfritt medium som inneholdt 5^g/ml trypsin-EDTA. PER.C6-celler ble podet med PER.C6-dyrkede A/Syd ney/5/97-, A/Beijing/262/95- og B/Harbin/7/94-virusbatcher ved forskjellige moi-verdier: 10"<4>(A/Sydney/5/97) eller IO"<3>(A/Beijing/262/95 og B/Harbin/7/94) pfu/celle. Under produksjonsperioden for viruset, tok man prøver på 10 ml hver dag for å utføre standard celle- og levedyktighetstellinger, måling av glukosekonsentrasjonen, direkte immunofluorescens- og hemagglutinasjonsassayer. Fig. 22 (resultater fra de A/Sydney/5/97-infiserte PER.C6-celler) viser resultatene av tellingen av det samlede celletall og levedyktige celler etter infeksjon med viruset (øvre venstre rute), glukoseforbruket (øvre høyre rute), prosentdelen positive celler i den direkte immunofluorescenspåvisning (nedre venstre rute) og HAU-verdiene (nedre høyre rute). Fig. 23 (resultater for de A/Beijing/262/95-infiserte PER.C6-celler) viser resultatene av tellingen av det samlede celletall og levedyktige celler etter infeksjon med viruset (øvre venstre rute), glukoseforbruket (øvre høyre rute), prosentdelen positive celler i den direkte immunofluorescenspåvisning (nedre venstre rute) og HAU-verdiene (nedre høyre rute). Fig. 24 (resultater for de B/Harbin/7/94-infiserte PER.C6-celler) viser resultatene av tellingen av det samlede celletall og levedyktige celler etter infeksjon med viruset (øvre venstre rute), glukoseforbruket (øvre høyre rute), prosentdelen positive celler i den direkte immunofluorescenspåvisning (nedre venstre rute) og HAU-verdiene (nedre høyre rute). Virusholdige konsentrater ble
lagret ved -80°C frem til DSP.
I alle tre tilfeller var glukoseforbruket, levedyktigheten og det samlede celleantall av PER.C6-celler sammenlignbare. Dessuten var produksjonsnivået av de tre virus, målt ved direkte immunofluorescens, lignende. Selv om HAU-verdien og infektivitetstitrene var forskjellig stammene imellom, opprettholdt PER.C6 replikasjonen av alle influensavirus som ble testet her.
På dagen for innsamling av hele batchen (enten på dag 3 eller dag 4 etter infeksjonen), ble de virale supernatanter klarnet ved sentrifugering med 2.000 rpm i en bordsentrifuge og konsentrert ti ganger ved ultrafiltrering ved bruk av en hulfibermembran-patron med avsperring ved 750 kD (A/G Technology, JM Separations) i henhold til produsentens protokoller. Influensavirus ble renset fra de konsentrerte supernatanter via to påfølgende tetthetssentrifugeringstrinn: en 25-70% blokkerings-sakkarosegradient (1,5 timer ved 27 K) fulgt av en kontinuerlig 25-70% sakkarosegradient (4 timer ved 23 K). De virale bånd ble fortynnet i ca. 50 ml fosfatbuffer og til slutt pelletert ved 24.000 rpm i en ultrasentrifuge. De virale pelleter ble løst opp i 1,5 til 2,3 ml fosfatbuffer, alikvotert og frosset ved -80°C. Formuleringen av inaktiverte influensavaksiner baserer seg på mengden (i ug) av "immunologisk aktivt" HA-protein ifølge målinger med SRID-assayet (Wood et al. 1977). Testen ble utført for å karakterisere HA-innholdet i batchene. Samtidig ble den samlede mengde proteiner målt ved bruk av det Lowry-baserte DC-protein-assaysett (Biorad) ifølge prosedyrene som foreslås av produsenten. Man fant at HA utgjør ca. 20-30% av det samlede proteininnhold i viruspreparatet.
Eksempel 11
In wVo- immunoqenisitet av inaktiverte vaksiner fremstilt i egg og på PER. C6
lidere og mus representerer to vel-etablerte dyremodeller for undersøkelse av influensainfeksjon, og er blitt brukt til å bestemme effekten og immunogenisiteten av influensavaksiner. Ved bruk av musemodell-testsystemet, sammenlignet man immunogenisiteten som tilveiebringes av de PER.C6- og egge-avledede treverdige vaksiner som inneholder A/Syd ney/5/97, A/Beijing/262/95 og B/Harbin/7/94, ved å analysere serum av vaksinerte dyr ved hemagglutinasjonsinhiberingsassay. Ved
bruk av ilder-infeksjonsmodellen, følges immuniseringen av en smitte med A/Sydney/5/97. Virusisolasjonen på MDCK-celler og hemagglutinasjonsinhiberingsassay utført på sera, brukes til å sammenligne immunogenisiteten og effekten av de to vaksiner.
In wVo-undersøkelse i mus
90 Balb/C-mus av hunnkjønn deles opp i ni grupper på hver 10 mus. På dag 0 samles opptil 100 ul blod. Serumet adskilles og lagres ved -20°C. Hver mus vaksineres deretter med den aktuelle vaksine i henhold til ordningen i tabell I. På dag 28 tas ytterligere 100^1 blod. Serumet lagres ved -20°C. Hver mus vaksineres igjen i henhold til ordningen i tabell I. På dag 42 tas en 100 \ i\ blodprøve, og alle musene avlives. Serumet adskilles og fryses ved -20°C. Hemaggluti-nasjonsinhiberings (Hl)-assayer utføres på serumprøver fra dag 0, 28 og 42. Alle disse assayer utføres parallelt for hver dag både for egge- og celle-dyrkede virus.
In wVo-undersøkelse i fretter
18 voksne ildere av hunnkjønn (albino eller ilder) ble delt opp i tre grupper med hver seks dyr, som følger: gruppe 1 fikk den egge-avledede testvaksine
intramuskulært (i.m.), dyrene ble infisert med A/Sydney/5/97. Gruppe 2 fikk den PER.C6-avledede testvaksine i.m., dyrene ble infisert med A/Syd ney/5/97. Gruppe 3 fikk kun testvaksine-tynneren og ble infisert med A/Sydney/5/97. På dagene 0 og 28 ble testvaksinene administrert. På dag 56 ble alle ilderne infisert intranasalt med 0,5 ml A/Sydney/5/97-smittevirus ved TCID50-verdien IO<3.>Nasale vaskinger ble utført, og tellinger av inflammatoriske celler, temperaturen og vekten av ilderne ble overvåket én gang daglig fra dag 57 til 63. Alle dyrene ble avlivet på dag 63. Serum ble separert og lagret ved -20°C. Prøvene fra de nasale vaskinger ble lagret på is, og nasalvaskingsisolasjons-celletellinger ble utført ved bruk av et Trypan blue-eksklusjonsassay.
Titeren av virus som ble erholdt fra prøvene fra de nasale vaskinger, ble bestemt ved å måle virusisolasjonen på MDCK-celler. Spearman-Karber-beregning (1931) ble utført for å beregne TCID50-verdiene. Hemagglutinasjonsinhiberingsanalyser ble utført på serumprøver tatt på dag 0, 28, 56 og 63. Fra dette eksperiment konkluderte man med at den PER.C6-avledede testvaksine var virksom.
Eksempel 12
Karakterisering av HA- protein avledet fra influensavirus produsert på PER. C6
For å undersøke glykosylasjonen av HA i PER.C6-celler, genererte man en batch med uspaltet HA (HAO). PER.C6-celler ble infisert med viruset A/Sydney/5/97 (passasjetall 5 på PER.C6) ved moi-verdiene 1, 0,1 og 0,01 pfu/celle i ExCell 525-medium som inneholdt trypsin-EDTA i den endelige konsentrasjon 5 |i.g/ml. Etter 1 times inkubasjon ved 35°C, ble cellene vasket to ganger med PBS for å fjerne trypsinet, og inkubert over natten ved 35°C og 10% C02, i fravær av trypsin. Den påfølgende dag ble cellesuspensjoner samlet og sentrifugert (500 g), og cellepelletene ble vasket to ganger med medium. De virale supernatanter ble frosset ved -80°C, og prøver derav ble brukt i western blot-assayer som beskrevet, for å undersøke nærværet eller fraværet av uspaltet HA-protein.
Uspaltet HA-protein (HAO) består av de to delenheter: HAI og HA2, som er forbundet via en disulfidbinding. Ettersom denne disulfidbinding kan åpnes ved reduksjon med DTT, kan HAI og HA2 separeres og visualiseres på en reduserende gel fulgt av western blots ved bruk av antisera som gjenkjenner delenhetene. Hvis HA-proteinet består utelukkende av HAO, vil ett bånd bli synlig som migrerer langsommere gjennom en SDS/PAGE-gel enn HAl-delenheten og den raskest migrerende HA2-delenhet. Resultatene som vises på fig. 25, tyder på et nærvær av hovedsaklig uspaltet HAO fra PER.C6-infeksjoner, sammenlignet med den egge-avledede positivkontroll som ble erholdt fra HIBSC (UK). For å bekrefte at det påviste bånd faktisk var uspaltet hemagglutinin, ble en HAO-prøve spaltet med forskjellige konsentrasjoner av trypsin som varierte fra 2,5 til 10 ug/ml i medium over natten ved 37°C. De spaltede proteiner ble deretter ladet under reduserende betingelser på en SDS/PAGE-gel, fulgt av western blot-analyse ved bruk av det samme antiserum som ble beskrevet for fig. 14. Slik det fremgår fra fig. 26A, opp-nådde man en spaltning av HAO, hvilket bekreftet genereringen av uspaltet HA-protein på PER.C6. På grunnlag av disse resultater utviklet man et assay for å bestemme trypsinaktiviteten i kulturmedium ved bruk av influensa-HAO som substrat.
Trypsin- aktivitetsassav
For å bestemme om trypsin som foreligger i kulturmediet av en influensa-produksjonsøkt, fortsatt er aktivt, har man utviklet et trypsin-aktivitetsassay. Dette assay baserer seg på målingen av trypsinets enzymatiske aktivitet til å spalte substratet som er mest relevant for fremstilling av influensavaksine, nemlig HAO.
Det ble bestemt om trypsinet i en kultur av PER.C6 podet med influensa B/Harbin/7/94 (moi 10"<3>/10"<4>pfu/celle) holdt seg aktivt over hele produksjonsløpet. Med denne hensikt ble 10 ul supernatant som ble tatt på dag 1, 2 og 3 etter infeksjonen, brukt til å spalte 68 ng substrat som bestod av HAO fra influensa A Sydney/5/97-virus, over natten ved 37°C. Etter spaltningen ble proteaseinhibitorer tilsatt i den endelige konsentrasjon lx (fullstendig proteaseinhibitorblanding, Boehringer Mannheim) i 3x Laemli-buffer med 150 mM DTT (Fluka). Prøvene ble ladet på en 10% Tris-HCI-SDS/PAGE-gel (Biorad) og fikk flyte. Western blot ble ut-ført som beskrevet. Resultatene vises på fig. 26B, og demonstrerer at i kulturer av PER.C6 som er podet med influensa B/Harpin-virus, holdt seg trypsinet aktivt under hele produksjonsløpet, idet kultursupernatantene hadde evnen til å spalte HAO fullstendig.
Eksempel 13
Spaltning av HAO med N- qlvkosidase F
Influensavirus-HA-protein er et glykoprotein som inneholder 3 til 9 N-bundne glykosylasjons-oligosakkarid-seter. Antallet seter er avhengig av virusstammen. Plasseringen av disse seter bestemmes ved nukleotidsekvensen i HA-gen, og ettersom det virale genom av influensa replikeres av en feil-tilbøyelig RNA-polymerase, opptrer det hyppig mutasjoner som genererer en tilføyelse eller fjerning av glykosylasjonsseter. Sammensetningen og strukturen av oligosakka-ridkjedene som foreligger på HA, bestemmes deretter ved linjestilling av biosyntetiske og beskjærende glykosylasjonsenzymer som tilveiebringes av vertcellen. Ettersom en glykosylasjon av HA spiller en viktig rolle i virulensen og vaksiners virkning, undersøkte man egenskapene av HA som ble produsert på influensa-infiserte PER.C6. En spaltning av uspaltet HAO-protein fra A/Sydney/5/97 med N-glykosydase-F-enzym ble utført ved bruk av produsentens protokoller, for å fjerne de syv oligosakkarider som man forventet at ville foreligge på A/Sydney/5/97-HA-polypeptid. Influensaen A/Sydney/5/97 ble spaltet med 1% Triton X-100 (Merck). Proteaseinhibitor ble tilsatt til en alikvot av dette spaltede virus som tilsvarte 68 ng HA, til den endelige konsentrasjon lx (fullstendig proteaseinhibitorblanding, Boehringer Mannheim). Denne prøve ble inkubert i nærvær av 100 mM NaP04pH 7, 10 mM EDTA (J.T. Baker), 1% SDS (J.T. Baker) og 1% B-merkaptoetanol (Merck). Dette ble inkubert i 10 minutter ved romtemperatur. Prøven ble fortynnet 5 ganger i mM NaP04pH 7, 10 mM EDTA (J.T. Baker), 0,625% NP-40 og 1% B-merkaptoetanol (Merck). Av dette ble 40 ul brukt for glyko-F-spaltning. For dette tilsatte man 2 ul IU/jxl glyko-F (N-glykosidase F, Boehringer), og det hele ble inkubert i minst 16 timer ved 37°C. Deretter tilsatte man 3x Laemli-buffer med 150 mM DTT (Fluka) til den endelige konsentrasjon lx. Prøvene ble kjørt på en 7,5% SDS/PAGE-gel. SDS/PAGE og western blot ble utført som følger. Kort sagt ble blotten blokkert i 30 minutter ved romtemperatur med blokkeringsoppløsning (5% tørr-skummetmelkpulver, Biorad) i TBST supplementert med 1% kaninserum (Rockland), fulgt av 3 vaskinger med TBST. Deretter ble blotten inkubert med anti-A/Sydney/5/97-HA-antiserum (98/768 NIBSC) fortynnet 1/500 i 1% BSA/TBST med 5% kaninserum (Rockland) over natten ved romtemperatur. Igjen ble blotten vasket 8 ganger med TBST. Til slutt ble blotten inkubert med kanin-anti-saue-antiserum HRP-merket (Rockland) 1/6000 fortynnet i blokkeringsoppløsning, i 1 time ved romtemperatur. Etter 8 vaskinger med TBST ble protein/konjugat-komplekset visualisert med ECL (Amersham Pharmacia Biotech), og filmer (Hyperfilm, Amersham Life Science) ble eksponert. Slik det fremgår fra fig. 27, reduserte en behandling med glykosidase-F-enzym klart størrelsen av proteinet med ca. 28-30 kD, hvilket omtrent tilsvarer det forutsagte tap på ca. 4 kD per oligosakkarid. Proteinbåndet som er avbildet med en stjerne
(<*>), er de-glykosylert HAO, som migrerer på lignende måte som HA1-delenhetsproduktet som ble erholdt etter spaltning av HAO til HAI- og HA2-delenhetene (høyre baner).
Eksempel 14
Spaltning av HAO med " accutase"
Muligheten for å erstatte pattedyr-avledet trypsin-EDTA med ikke-pattedy r- eller rekombinante proteiner, ble undersøkt. Nylig ble en blanding av proteolytiske og kollagenolytiske enzymer ("Accutase", PAA) fra virvelløse arter tilgjengelig for rutinemessig cellekultur. Grunnet sin ikke-pattedyr-kilde er "Accutase" fritt for prioner, parvovirus og andre bestanddeler som potensielt kunne forurense trypsin-EDTA-oppløsninger. Til dato kunne man ikke erholde noen informasjon om typen av proteaser som foreligger i "Accutase". Spaltningen av HAO ble undersøkt ved bruk av western blot-analyse. En konstant mengde HAO-protein, erholdt fra PER.C6 som var blitt infisert med A/Sydney/5/97 med en moi-verdi på 1 pfu/celle uten trypsin, ble spaltet med serielle fortynninger av "Accutase", over natten ved 37°C. Som positivkontroll brukte man den samme mengde HAO som var blitt spaltet med 100 ng trypsin-EDTA. De spaltede proteiner ble deretter ladet på en 10% SDS/PAGE-gel under reduserende betingelser, for western blot-analyse. Slik det fremgår fra flg. 28, førte en spaltning med 2 jxl "Accutase"-behandling til en fullstendig spaltning av HAO; en delvis spaltning ble observert ved bruk av 0,2 jxl.
Disse resultater tyder på at en behandling med "Accutase" under influensa-replikering og -produksjon kan erstatte trypsin-EDTA under influensa-infeksjoner på PER.C6.
Eksempel 15
Elektronmikroskopisk analyse av influensavirus på PER. C6- celler
Transmisjons-elektronmikroskopi-undersøkelser ble utført på PER.C6-celler som var infisert med influensastammen A/Sydney/5/97, samt på viralholdige supernatanter og sakkarose-renset materiale, for å bestemme fenotypen av dette influensavirus som var blitt produsert på PER.C6. Alle metoder som ble brukt, er velkjent for fagmannen. Fig. 29 viser at de siste stadier av virusets levesyklus representeres ved en knopping og frigivelse av innhyllede virioner fra den cytoplasmatiske membran. Torner som tilsvarer HA- og NA-virale proteiner ble påvist, som pryder periferien av virionpartiklene. Figuren viser også den karakteristiske pleiomorfisme av influensavirus.
Eksempel 16
Infeksjon av PER. C6 med et bredt utvalg av influensa A- og B- virusstammer
For å kunne bruke PER.C6 som plattformteknologi for produksjon av influensavaksine, er det nødvendig at PER.C6 støtter veksten av et bredt utvalg av stammer av forskjellige influensa-undertyper.
Statiske suspensjonskulturer av PER.C6-celler som var blitt dyrket i T25-kolber og/eller på 6-brønners plater i ExCell 525-medium, ble infisert med en celletetthet på IO<6>celler per ml, med 16 forskjellige stammer av influensavirus som vises på fig. 30A. Disse stammer omfattet flere H3N2-, H1N1-, B-type og fugle-avledede stammer. Infeksjoner ble utført i nærvær av 5 ug/ml trypsin. Virusene ble erholdt fra NIBSC (UK) som egge-passerte villtype- eller nysammensatte stammer, og er angitt i. Infeksjonen ble utført med en virusfortynneise som anbefales av NIBSC i produktarkene som ble levert med de forskjellige stammer. Alle de testede virus hadde evnen til å formere seg på PER.C6, slik det visualiseres ved immunofluorescens (data ikke vist) og titrasjon av supernatantvæsker i pfu-assay (fig. 30B).
Disse resultater viser at selv influensavirusstammer (merket med stjerne) såsom A/Johannesburg/33/94, B/Beijing/184/93 og A/Duck/Singapore-Q/F119-3/97, som normalt er meget vanskelige å produsere på embryonerte egg, kan formere seg og produseres på de humane PER.C6-celler.
Eksempel 17
Generering av herpes simpleks type 1 ( HSV- lVvirus. herpes simpleks type 2 ( HSV- 2)- virus og meslingevirus på PER. C6
Man testet om andre virus enn influensavirus og adenovirus, såsom herpes simpleks-virus type 1 og 2 og meslingevirus, også kunne formere seg på PER.C6. Vaksiner avledet fra disse PER.C6-dyrkede virus og som induserer nøytraliserende virkninger i mennesker for beskyttelse mot villtype-infeksjoner, genereres fra de PER.C6-dyrkede virusbatcher. Stammene som ble erholdt fra ATCC og som ble brukt for infeksjon av PER.C6-celler, oppgis i tabell II.
For å teste om HSV-1-, HSV-2- og meslingevirus erholdt fra ATCC kunne formere seg og produseres på PER.C6, ble celler med passasjetall 46 podet i labtek-kammere, bestrøket med poly-L-lysin ved bruk av fremgangsmåter som er kjent for fagmannen, med IO<5>celler/brønn. Ape-avledede Vero-celler (erholdt fra ATCC) med passasjetall 137 ble dyrket og brukt som positivkontroller, og podet i tettheten 2,5 x IO<4>celler/brønn. På dag 0, når brønner med PER.C6-cellene var 60% og Vero-cellene var 80% sammenløpende, ble cellene infisert med forskjellige moi-verdier (IO"<3>,10"<2>,10"<1>og 1 TCID50per celle). I daglige intervaller etter infeksjonen ble celler fiksert og testet i immunofluorescens ved bruk av FITC-konjugerte typespesifikke monoklonale antistoffer ved bruk av et sett (Imagen Herpes Simplex Virus (HSV) Type 1 og 2 (Dako)) og FITC-konjugerte antistoffer mot HA- og matriksprotein av meslingevirus (meslinger-IFA-sett, Light diagnostics), idet man fulgte prosedyrene som foreslås av produsenten. Antiseraene er rettet mot henholdsvis HSV-1- og -2- og meslinge-virusantigener.
Resultatene som oppsummeres i fig. 31, viser at PER.C6 tolererer HSV-1- (fig. 31D), HSV-2- (fig. 31E) og meslingevirus (fig. 31A)-infeksjoner. Videre tyder kinetikken på at disse virus formerer seg på PER.C6 på moi-avhengig måte.
Dernest undersøkte man om HSV-1, HSV-2 og meslingevirus kunne formere seg på PER.C6. Med dette formål ble celler infisert med moi-verdiene 0,01, 0,1 og 1 TCIDso/celle for HSV-1 (fig. 32C) og HSV-2 (flg. 32A), og moi-verdien 0,001 TCID5o/celle for meslingevirus (fig. 32B) (passasjetall 1). Ved forekomst av nærmest fullstendig cpe, ble cellene og supernatantene samlet, raskt frosset i flytende N2og tint. Deretter ble klarnede supernatanter passert blindt ved bruk av ca. 100 ul, til PER.C6 (dette er passasjetall 2). Etter igjen å ha oppnådd nærmest fullstendig cpe, ble en tredje passasje (passasjetall 3) utført på lignende måte. moi-Verdien for passasjetall 2 og 3 ble bestemt i etterkant ved TCID50-assayer.
Resultatene av disse eksperimenter viser at herpes simpleks-virus type 1 og 2 og meslinge-virus kan formere seg på PER.C6, og at replikasjon og formering kan finne sted selv ved såpass lave moi-verdier som IO"<7>.
Eksempel 18
Testing av rotavirus for replikasjon på PER. C6
For å teste om PER.C6 også kan støtte en replikasjon av et rotavirus, ble PER.C6-celler infisert med et Rhesus-rotavirus (MMU 18006; ATCC-nr VR-954; stamme S:USA:79:2; batch nr. 2181153). PER.C6-celler (passasjetall 41) ble dyrket i tettheten 1 x IO<5>per ml, og ape-avledede Vero-celler (erholdt fra ATCC, passasjetall 139) ble dyrket i tettheten 2,5 x io<4>per ml, og deretter podet i Labtek-kammere som var blitt forhåndsbestrøket med poly-L-lysin ved bruk av fremgangsmåter som er kjent for fagmannen. Cellene ble infisert med en moi-verdi på 1 TCID50per celle Rhesus-rotavirus i nærvær og fravær av 2 ug/ml trypsin-EDTA. Etter 90 minutters infeksjon, ble cellene vasket med ExCell 525-medium og ytterligere inkubert ved 37°C ved 10% C02i en befuktet atmosfære. På 5 suksessive dager etter infeksjonen, ble prøver av supernatantene samlet, klarnet for celler og celleavfall ved sentrifugering med 2.000 rpm i en bordsentrifuge og analysert i et ELISA som var spesifikt for rotavirus (IDEIA Rotavirus, Dako). Resultatene som vises på fig. 33, viser tydelig at Rhesus-rotavirus replikeres på PER.C6.
TEKST TIL FIGURENE
Fig. 1. Prosentdel infiserte celler (positive celler), betraktet mikroskopisk etter immunofluorescensassay, sammenlignet med prosentdel døde celler, målt ved FACS etter propidiumjodidflekking, ved moi-verdiene IO"<3>og 10"<4>. Dårlig levedyktighet av cellene fra prøver avledet fra infeksjon med moi-verdien IO"<3>gav ikke opphav til pålitelig data. Fig. 2. Prosentdel infiserte celler, betraktet mikroskopisk etter immunofluorescensassay. Prøver avledet fra infeksjon ved moi-verdien 10 og 1, 48 timer etter infeksjonen, vises ikke grunnet fullstendig CPE. Fig. 3. Kinetikk av virusformeringen målt i hemagglutinerende enheter (HAU) fra dag 1 til dag 6 etter infeksjonen. Fig. 4. Prosentdel infiserte celler (positive celler), betraktet mikroskopisk etter immunofluorescensassay. Fig. 5. Kinetikk av virusformering, målt i hemagglutinerende enheter (HAU) fra dag 1 til 6 etter infeksjonen. Fig. 6. Prosentdel infiserte celler (positive celler), betraktet mikroskopisk etter immunofluorescensassay. Fig. 7. Kinetikk av virusformeringen, målt i hemagglutinerende enheter (HAU) fra dag 2 til 6 etter infeksjonen. Fig. 8. Ekspresjon av Sia2-3Gal- og Sia2-6Gal-bindinger på celleflatereceptorer som foreligger på kinesisk hamster-ovarie (CHO)-celler, PER.C6-celler og MDCK-celler. (A) Skjematisk representasjon av vekselvirkningen av Sambuca n/gra-agglutinin (SNA)-lektin, som spesifikt gjenkjenner Sia2-6Gal-bindinger, og Maackia amurens/s-agglutinin (MAA)-lektin, som spesifikt gjenkjenner Sia2-3Gal-bindinger. Den skjematiske vekselvirkning med FITC-merket anti-DIG-antistoff som gjenkjenner det DIG-merkede lektin bundet til oligosakkaridkjeden på celleflateproteinet, vises også. (B) FACS-analyse av celler inkubert med DIG-merkede lektiner. Lektiner bundet til cellene ble påvist med FITC-merket anti-DIG-antistoff ved bruk av fremgangsmåter som er kjent for fagmannen. Celletall-tellinger er plottet mot fluorescens-intensiteten av lektin-flekkede celler (grå) sammenlignet med celler som ble inkubert kun med FITC-anti-DIG-antistoff (hvit). De øvre ruter viser forskyvningen i FACS-analysen som oppnås ved bruk av SNA-lektin, og de nedre ruter viser forskyvningen i FACS-analysen som oppnås ved bruk av MAA-lektin. Fig. 9. Infeksjon med A/Sydney/5/97 på PER.C6. (A) Virkning av trypsin-EDTA på HAU-titrene. (B) HA-konsentrasjon i ug/ml, og (C) Virusinfektivitetstitre i pfu/ml, målt i ubehandlede virale supernatanter, 96 timer etter infeksjonen. Fig. 10. Infeksjon med B/Harbin/7/94 på PER.C6. (A) Virkning av forskjellige konsentrasjoner av trypsin-EDTA som forelå under og etter virusinfeksjonen, på vekst-kinetikken. (B) HAU-titre per 50 ul, og (C) Virusinfektivitetstitre i pfu/ml. Fig. 11. Infeksjon med X-127 ved bruk av en moi-verdi på IO"<3>, på PER.C6. (A) Virkning av trypsin-EDTA på HAU, oppgitt i HAU/50 ul, og (B) Virusinfektivitetstitre i pfu/ml under 5 dager etter infeksjonen. Fig. 12. Infeksjon med X-127 ved bruk av en moi-verdi på 10"<4>, på PER.C6. (A) Virkning av trypsin-EDTA på HAU, oppgitt i HAU/50 ul, og (B) Virusinfektivitetstitre i pfu/ml under 5 dager etter infeksjonen. Fig. 13. Virkning av trypsin-EDTA på (A) PER.C6-cellers levedyktighet, og (B) den biologiske aktivitet av viruset. Cellelevedyktigheten ble målt etter Trypan blue-flekking. HAU-titrene ble målt som beskrevet, og angis per 50 fil. Fig. 14. Virkning av trypsin-EDTA på virusinfektivitetstitrene og HA-protein-innholdet etter influensainfeksjon av PER.C6-celler med A/Sydney/5/97. (A) Infektivitetsassayet ble utført ved innpoding, in quatro, av MDCK-celler med tilsammen 100 |il 10 ganger serielt fortynnede virus-holdige supernatanter, i serumfritt medium med trypsin-EDTA (4 jig/ml). Etter syv dager ble supernatanter fra disse kulturer testet for sin HA-aktivitet. De smittelige virustitre ble beregnet i henhold til metoden til Spearman-Karber (1931). (B) Western blot-analyse av A/Syd ney/5/97-HA-protein. Innsamlingen av virale proteiner ble utført ved sprengning og denaturering av proteiner ved bruk av en SDS-holdig lysisbuffer. Den elektroforetiske gjennomgang ble utført på en 10% SDS/PAGE-gel under reduserende betingelser. De adskilte proteiner ble probet med de spesifikke anti-A/Sydney-HA-antisera. Stigende mengder av kontroll-A/Sydney-HA-antigener (venstre 4 baner) og 10 ul PER.C6-cellesupernatanter av de angitte trypsin-inkuberte prøver (høyre 5 baner) ble ladet. Fig. 15. PER.C6-cellers levedyktighet, glukosekonsentrasjonen og vekst-kinetikken av A/Sydney/5/97 i et hulfiber-perfusjonssystem. Fig. 16. Karakterisering og kvantifisering av influensavirus A/Sydney/5/97 som fikk formere seg på PER.C6 i et hulfiber-perfusjonssystem. SDS/PAGE og western blots ble utført slik det ble beskrevet i teksten til fig. 14 for saue-anti-A/Sydney-HA-antistoffet. Det monoklonale antistoff anti-HA-tag (HA-probe (F7), muse- monoklonalt (Santa Cruz)) ble brukt i l:1000-fortynning. Som et andre antistoff brukte man et geite-anti-muse-HRP-konjugert antistoff (Biorad) i 1:7500-fortynning. Fig. 17. PER.C6-cellers levedyktighet (venstre rute) og glukosekonsentrasjonen (høyre rute) i en 12-liters bioreaktor opptil 92 timer etter viral infeksjon, ved bruk av A/Sydney/5/97-virus. Fig. 18. Infeksjon av PER.C6 med A/Sydney/5/97 i en 10-liters cellesuspensjon i en 12-liters bioreaktor. Kinetikken av virusets replikasjon ifølge målinger med immunofluorescensassay, oppgis i prosentdelen positivt flekkede celler. Fig. 19. Infeksjon av PER.C6-celler med A/Sydney/5/97 i en 10-liters cellesuspensjon i en 12-liters bioreaktor. Kinetikken av virusets replikasjon ifølge målinger med hemagglutinasjonsassay oppgis i HAU'er under flere dager etter den virale infeksjon. Stolpen som er merket med stjerne, er antallet 1-IAU'er som ble oppnådd etter "Powerfuge"-klarning slik det beskrives i teksten. Fig. 20. Western blot etter infeksjon av PER.C6 med A/Sydney/5/97-virus, i en 10-liters cellesuspensjon i en 12-liters bioreaktor. Vist er karakteriseringen og kvanti-fiseringen av influensavirus A/Sydney/5/97-HA-polypeptid. SDS/PAGE og western blot ble utført som beskrevet i teksten til fig. 14. De forskjellige delenheter (HAI og HA2) og de ikke-spaltede HAO-proteiner vises med pilspisser. HA erholdt fra NIBSC tjente som positivkontroll. Fig. 21. Bestemmelse av HAU-verdiene og pfu/ml etter infeksjon av PER.C6 med A/Sydney/5/97 i en 10-liters cellesuspensjon i en 12-liters bioreaktor. Infeksjonen ble etterfulgt av nedstrømsprosessering (Down Stream Processing, DSP). Isolasjonen av virale utbytter etter hulfiber-ultrafiltrering (20 gangers konsentrasjon) vises også. Fig. 22. Infeksjon av PER.C6 med A/Sydney/5/97 i en 2-liters cellesuspensjon i en 3-liters bioreaktor. PER.C6-cellers levedyktighet (øvre venstre rute), glukosekonsentrasjonen (øvre høyre rute) og vekstkinetikken av viruset i prosentdelen positivt flekkede celler (nedre venstre rute) og HAU-verdiene (nedre høyre rute) oppgis. Fig. 23. Infeksjon av PER.C6 med A/Beijing/262/95 i en 2-liters cellesuspensjon i en 3-liters bioreaktor. PER.C6-cellers levedyktighet (øvre venstre rute), glukosekonsentrasjonen (øvre høyre rute) og vekstkinetikken av viruset i prosentdelen positivt flekkede celler (nedre venstre rute) og HAU-verdiene (nedre høyre rute) oppgis. Fig. 24. Infeksjon av PER.C6 med B/Harbin/7/94 i en 2-liters cellesuspensjon i en 3-liters bioreaktor. PER.C6-cellers levedyktighet (øvre venstre rute), glukosekonsentrasjonen (øvre høyre rute) og vekstkinetikken av viruset i prosentdelen positivt flekkede celler (nedre venstre rute) og HAU-verdiene (nedre høyre rute) oppgis. Fig. 25. Western blot-analyse av uspaltet A/Sydney/5/97-HA0-protein. Positivt flekkede proteiner påvises etter inkubasjon med de spesifikke anti-A/Sydney-antisera som ble ervervet fra NIBSC og som ble beskrevet i teksten til fig. 14 og i teksten. Fig. 26. (A) Western blot-analyse av A/Sydney/5/97-avledet HAO-protein spaltet med trypsin. Proteinene påvises etter inkubasjon med de spesifikke anti-A/Sydney-antisera. Til venstre vises et standard spaltet A/Sydney-HA, til høyre HAO som var blitt behandlet med stigende mengder trypsin. (B) Bestemmelse av trypsinaktiviteten i kultursupernatanten av et influensa-B/Harbin-produksjonsløp, ved bruk av HAO fra influensa A/Sydney/5/97 som substrat. Western blot-analyse av HAO-spaltningsproduktene HAI og HA2 ble visualisert med de anti-influensa-A/Sydney/5/97-HA-spesifikke antisera som ble nevnt i teksten til fig. 14. Fig. 27. Western blot-analyse av A/Sydney-HAO som var blitt spaltet med N-glykosidase F. Proteinene påvises etter inkubasjon med de spesifikke anti-A/Sydney-antisera. Proteinbåndet som er merket med en stjerne, er det de-glykosylerte produkt. Fig. 28. Western blot-analyse av A/Sydney/5/97-HA etter "Accutase"-spaltning. Proteinene påvises etter inkubasjon med de spesifikke polyklonale anti-A/Sydney-HA-antisera. Til venstre vises HAO før og etter trypsin-behandlingen, til høyre vises HAO som er blitt spaltet med synkende mengder "Accutase". Fig. 29. Elektronmikrografer av influensa A/Sydney/5/97. (A) PER.C6-celler 72 timer etter infeksjonen. (B) og (C) Negativ flekking på virus avledet fra infisert PER.C6. (D) og (E) Negativ flekking av sakkarose-renset materiale. Fig. 30. (A) Alle de forskjellige influensa A- og B-stammer som ble testet på PER.C6-celler. (B) Infektivitetstitre av tre avbildede A- og B-type influensavirus avledet fra infiserte PER.C6-celler. Fig. 31. Immunofluorescens av PER.C6 og Vero-celler som var blitt infisert med andre virus enn influensavirus. (A) Positivt flekkede celler etter infeksjon med meslingevirus. (B) Positivt flekkede celler etter infeksjon av Vero-celler med HSV-1-virus. (C) Positivt flekkede celler etter infeksjon av Vero-celler med HSV-2-virus. (D) Positivt flekkede celler etter smitte av PER.C6-celler med HSV-l-virus. (E) Positivt flekkede celler etter infeksjon av PER.C6-celler med HSV-2-virus. Fig. 32. Infektivitetstitre bestemt etter formering av meslingevirus (midtre rute), HSV-1 (nedre rute) og HSV-2 (øvre rute) på PER.C6-celler. Fig. 33. Replikasjon av rotavirus etter infeksjon av PER.C6-celler (øvre rute) og Vero-celler (nedre rute) med forskjellige moi-verdier, målt ved ELISA i ubehandlede supernatanter.

Claims (26)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et virus og/eller virale proteiner som er forskjellige fra adenovirus eller adenovirale proteiner for anvendelse i en vaksine, og som omfatter: (a) å utstyre en celle som er avledet fra en human embryonisk retinoblast og som har blitt udødeliggjort for å vokse i kultur, med minst en sekvens som koder for minst et genprodukt av El-genet eller et funksjonelt derivat derav av et adenovirus, (b) å infisere nevnte celle med et virus som er forskjellig fra adenovirus, (c) dyrke nevnte celle i et egnet medium for å mangfoldiggjøre nevnte virus, og (d) høste inn nevnt virus og/eller virale proteiner fra nevnte medium og/eller nevnte celle.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor nevnte sekvens som koder for minst et genprodukt av El-genet, er til stede i genomet av nevnte humane celle.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, hvor nevnte celle ikke danner adenovirale strukturelle proteiner.
4. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, hvor nevnte celle ytterligere omfatter en sekvens som koder for E2A eller et funksjonelt derivat eller analog eller fragment derav.
5. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, hvor nevnte sekvens som koder for E2A eller et funksjonelt derivat eller analog eller fragment derav, er til stede i genomet av nevnte humane celle.
6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 4 eller 5, hvor nevnte E2A-kodende sekvenskoder for en temperatursensitiv E2A-mutant.
7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, hvorved nevnte humane celle ikke omfatter noen andre adenovirale sekvenser.
8. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, hvor nevnte humane celle er i stand til å vokse i suspensjon.
9. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, hvor nevnte humane celle dyrkes ved fravær av serum.
10. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, hvor nevnte humane celle er en celle som er deponert under ECACC nr. 96022940 eller et derivat derav.
11. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 - 10, hvor nevnte virus omfatter et protein som undergår post-translatoriske og/eller peritranslatoriske modifikasjoner.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, hvor nevnte modifikasjoner omfatter glykosylering.
13. Fremgangsmåte ifølge krav 11 eller 12, hvor nevnte virale protein omfatter minst et av et influensavirus neuraminidase og/eller et hemagglutinin.
14. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 - 12, hvor nevnte virus er et enterovirus så som rhinovirus, aphtovirus eller polyomyelittvirus.
15. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 - 12, hvor nevnte virus er et herpesvirus så som herpes simplex-virus, pseudorabies-virus eller bovint herpesvirus.
16. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 - 12, hvor nevnte virus er et ortomyxovirus så som et influensavirus, et paramyxovirus så som Newcastle sykdoms-virus, respiratorisk syncitio-virus, kusmavirus eller meslingvirus.
17. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 - 12, hvor nevnte virus er et retrovirus så som humant immunsviktvirus eller hvor nevnte virus er et parvovirus eller papovavirus.
18. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 - 12, hvor nevnte virus er et rotavirus eller et coronavirus så som overførbart gastroenteritisvirus eller et flavivirus så som flått-båret encephalittvirus eller gulfebervirus.
19. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 - 12, hvor nevnte virus er et togavirus så som rubella-virus eller eastern-, western- eller venezuelansk heste-encephalomyelittvirus.
20. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 - 12, hvor nevnte virus er et hepatitt-forårsakende virus så som hepatitt A- eller hepatitt B-virus.
21. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 - 12, hvor nevnte virus er et pestivirus så som svinekoleravirus eller et rhabdovirus så som rabiesvirus.
22. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 - 12, hvor nevnte virus er Bunyaviridae-virus så som Hantavirus.
23. Human celle som har en sekvens som koder for minst et El-protein av et adenovirus eller et funksjonelt derivat, homolog eller fragment derav i sitt genom, hvilken celle ikke danner strukturelle adenovirale proteiner og som er infisert av et ikke-adenoviralt virus, hvor nevnte humane celle er avledet fra en human embryonisk retinoblast.
24. Human celle ifølge krav 23, hvilken er avledet fra en celle som deponert under ECACC nr. 96022940.
25. Human celle ifølge krav 23 - 24, hvilken ytterligere omfatter en sekvens som koder for E2A eller et funksjonelt derivat eller analog eller fragment derav i sitt genom.
26. Human celle ifølge krav 25, hvor nevnte E2A er temperatursensitiv.
NO20022500A 1999-11-26 2002-05-27 Fremgangsmate ved fremstilling av virus eller viralproteiner til anvendelse i vaksiner. NO333527B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99203983A EP1103610A1 (en) 1999-11-26 1999-11-26 Production of vaccines from immortalised mammalian cell lines
PCT/NL2000/000862 WO2001038362A2 (en) 1999-11-26 2000-11-24 Production of vaccines

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO20022500D0 NO20022500D0 (no) 2002-05-27
NO20022500L NO20022500L (no) 2002-07-26
NO333527B1 true NO333527B1 (no) 2013-07-01

Family

ID=8240914

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20022500A NO333527B1 (no) 1999-11-26 2002-05-27 Fremgangsmate ved fremstilling av virus eller viralproteiner til anvendelse i vaksiner.

Country Status (21)

Country Link
EP (3) EP1103610A1 (no)
JP (1) JP4331432B2 (no)
KR (2) KR100683374B1 (no)
CN (1) CN1306033C (no)
AT (1) ATE286537T1 (no)
AU (2) AU775966B2 (no)
BR (1) BR0015846A (no)
CA (1) CA2392653C (no)
DE (1) DE60017234T3 (no)
DK (1) DK1108787T4 (no)
EA (1) EA006136B1 (no)
ES (1) ES2235770T5 (no)
HK (1) HK1057236A1 (no)
IL (2) IL149788A0 (no)
MX (1) MXPA02005237A (no)
NO (1) NO333527B1 (no)
NZ (1) NZ527942A (no)
PT (1) PT1108787E (no)
SI (1) SI1108787T2 (no)
WO (1) WO2001038362A2 (no)
ZA (1) ZA200204078B (no)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0833934T4 (da) 1995-06-15 2012-11-19 Crucell Holland Bv Pakningssystemer til human rekombinant adenovirus til anvendelse ved genterapi
WO2003048348A2 (en) 2001-12-07 2003-06-12 Crucell Holland B.V. Production of viruses, viral isolates and vaccines
US7297680B2 (en) 1999-04-15 2007-11-20 Crucell Holland B.V. Compositions of erythropoietin isoforms comprising Lewis-X structures and high sialic acid content
US7604960B2 (en) 1999-04-15 2009-10-20 Crucell Holland B.V. Transient protein expression methods
WO2003048197A1 (en) * 2001-12-07 2003-06-12 Crucell Holland B.V. Production and of viruses, viral isolates and vaccines
US8236561B2 (en) 1999-04-15 2012-08-07 Crucell Holland B.V. Efficient production of IgA in recombinant mammalian cells
US6855544B1 (en) 1999-04-15 2005-02-15 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell
US7192759B1 (en) 1999-11-26 2007-03-20 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
US7425437B2 (en) 1999-11-26 2008-09-16 Crucell Holland B.V. Vaccines against West Nile Virus
US7527961B2 (en) 1999-11-26 2009-05-05 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
US7521220B2 (en) 1999-11-26 2009-04-21 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
US8715922B2 (en) 2001-01-19 2014-05-06 ViroNovative Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
CA2435180C (en) 2001-01-19 2019-04-09 Vironovative B.V. A virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
EP1256803A1 (en) 2001-05-07 2002-11-13 Crucell Holland B.V. Methods for the identification of antiviral compounds
DE60226896D1 (de) 2001-12-17 2008-07-10 Crucell Holland Bv Herstellung von f(ab')2 fragmenten in saügetierzelle
EP1485468A4 (en) 2002-02-21 2007-01-03 Medimmune Vaccines Inc EXPRESSION SYSTEMS OF RECOMBINANT PARAINFLUENZA VIRUSES AND VACCINES COMPRISING HETEROLOGOUS ANTIGENS DERIVED FROM METAPNEUMOVIRUS
AU2003271738C1 (en) 2002-04-25 2008-04-17 Crucell Holland B.V. Stable adenoviral vectors and methods for propagation thereof
ATE453708T1 (de) * 2002-11-08 2010-01-15 Crucell Holland Bv Impfstoff gegen west nile virus
WO2004056979A2 (en) * 2002-12-20 2004-07-08 Crucell Holland B.V. Recombinant virus production for the manufacturing of vaccines
AU2004273776B2 (en) * 2003-04-25 2010-07-08 Medimmune, Llc Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines comprising heterologous antigens derived from metapneumovirus
EA008670B1 (ru) * 2003-05-09 2007-06-29 Круселл Холланд Б.В. Культуры e1-иммортализованных клеток и способы их культивирования с целью повышения выхода их продукции
JP4749334B2 (ja) 2003-10-02 2011-08-17 クルセル ホランド ベー ヴェー 組換えアデノウイルス用パッケージング細胞
EP1718738A2 (en) 2004-02-23 2006-11-08 Crucell Holland B.V. Virus purification methods
EP2308958A3 (en) * 2004-03-05 2011-08-10 DSM IP Assets B.V. Process for cell culturing by continuous perfusion and alternating tangential flow
DE202005022108U1 (de) 2004-03-09 2013-11-12 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Influenza-Virus-Impfstoffe
WO2006078294A2 (en) 2004-05-21 2006-07-27 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Alphavirus vectors for respiratory pathogen vaccines
RS51721B (en) * 2004-09-09 2011-10-31 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh. Reduction of potential iatrogenic risks associated with influenza vaccines
JP2006090864A (ja) * 2004-09-24 2006-04-06 Denka Seiken Co Ltd ワクチン中の特定成分の含量を求める方法
WO2006063053A2 (en) 2004-12-08 2006-06-15 Medimmune Vaccines, Inc. Methods of producing influenza vaccine compositions
AU2005318171B2 (en) 2004-12-20 2011-09-29 Crucell Holland B.V. Binding molecules capable of neutralizing West Nile virus and uses thereof
ATE412737T1 (de) 2005-04-11 2008-11-15 Crucell Holland Bv Virusreinigung mit ultrafiltration
CA2608058C (en) 2005-05-12 2013-09-10 Crucell Holland B.V. Host cell specific binding molecules capable of neutralizing viruses and uses thereof
US7888102B2 (en) 2005-07-22 2011-02-15 Crucell Holland B.V. Cell line for producing coronaviruses
AU2006310171B2 (en) 2005-11-01 2011-02-17 Seqirus UK Limited Cell-derived viral vaccines with low levels of residual cell DNA by beta-propiolactone treatment
MX340242B (es) 2006-07-14 2016-07-01 Dpx Holdings Bv Proceso mejorado para el cultivo de celulas.
CN101688182A (zh) * 2007-07-03 2010-03-31 特兰斯吉恩股份有限公司 永生化禽细胞系
ES2450998T3 (es) * 2007-12-13 2014-03-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Nuevas variantes de proteína de cubierta E1 de rubéola y su utilización en la detección de anticuerpos anti-rubéola
EP2268309B1 (en) 2008-03-18 2015-01-21 Novartis AG Improvements in preparation of influenza virus vaccine antigens
US8163523B2 (en) 2008-06-11 2012-04-24 Flugen, Inc. Cell-based systems for producing influenza vaccines
JP5684122B2 (ja) * 2008-07-15 2015-03-11 クルセル ホランド ベー ヴェー Ｐｅｒ．ｃ６細胞の培養およびそれからの生成物の生産のための拡張可能なプロセス
EP2168987A1 (en) * 2008-09-22 2010-03-31 Mucosis B.V. Multifunctional linker protein containing an antibody against hemagglutinin, a conserved influenza antigen and an immunostimulating carrier binding domain
WO2010046335A1 (en) * 2008-10-21 2010-04-29 Crucell Holland B.V. Production of influenza virus by reverse genetics in per.c6 cells under serum free conditions
JP2012507272A (ja) 2008-11-05 2012-03-29 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 新規な方法
MY183385A (en) 2009-07-16 2021-02-18 Janssen Vaccines & Prevention Bv Production of polio virus at high titers for vaccine production
WO2011139717A1 (en) 2010-04-26 2011-11-10 Novartis Ag Improved production of virus replicon particles in packaging cells
TR201903651T4 (tr) 2010-10-11 2019-04-22 Glaxosmithkline Biologicals Sa Antijen uygulama platformları.
TR201908715T4 (tr) 2011-01-26 2019-07-22 Glaxosmithkline Biologicals Sa Rsv immünizasyon rejimi.
MX2014004214A (es) 2011-10-11 2014-05-07 Novartis Ag Moleculas de acido ribonucleico policistronicas auto-replicantes recombinantes.
EP2766385A2 (en) 2011-10-12 2014-08-20 Novartis AG Cmv antigens and uses thereof
CN102526720B (zh) * 2012-01-11 2013-12-11 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种流感病毒疫苗的制备方法
CN104159608A (zh) 2012-03-06 2014-11-19 克鲁塞尔荷兰公司 针对流感的改善的疫苗接种
CN102631673A (zh) * 2012-04-17 2012-08-15 金宇保灵生物药品有限公司 口蹄疫疫苗浓缩纯化方法
SG10201707554WA (en) 2013-03-15 2017-11-29 Genzyme Corp High-density cell banking methods
CN117958251A (zh) 2014-09-18 2024-05-03 建新公司 超高密度细胞建库方法
AR102548A1 (es) 2014-11-07 2017-03-08 Takeda Vaccines Inc Vacunas contra la enfermedad de manos, pies y boca y métodos de fabricación y uso
AR102547A1 (es) 2014-11-07 2017-03-08 Takeda Vaccines Inc Vacunas contra la enfermedad de manos, pies y boca y métodos de fabricación y su uso
KR102526616B1 (ko) 2014-12-17 2023-04-27 푼다시온 파라 라 인베스티가시온 메디카 아플리카다 윌슨병 및 기타 병태의 치료에 사용되기 위한 핵산 구조물 및 유전자 치료용 벡터
WO2016097218A1 (en) 2014-12-17 2016-06-23 Fundación Para La Investigación Mèdica Aplicada Nucleic acid constructs and gene therapy vectors for use in the treatment of wilson's disease and other conditions
HUE051783T2 (hu) * 2015-07-07 2021-03-29 Seqirus Uk Ltd Eljárás immunogén hemagglutinin mennyiségi meghatározására
ES2642723B1 (es) 2016-05-12 2018-10-22 Servizo Galego De Saúde (Sergas) Uso de los niveles de anticuerpos anti-CD26 como biomarcadores de enfermedades autoinmunes y/o inflamatorias.
CN111511395B (zh) 2017-11-03 2024-10-15 武田疫苗股份有限公司 用于将寨卡病毒灭活和用于确定灭活完全性的方法
MA50942A (fr) 2017-12-01 2020-10-07 Encoded Therapeutics Inc Protéines de liaison à l'adn modifiées
KR20200015323A (ko) 2018-08-03 2020-02-12 에릭스바이오(주) 바이러스 치료 장치 또는 백신 제조 장치
JP2022508724A (ja) 2018-10-12 2022-01-19 ヴィヴェ テラピューティクス 進行性家族性肝内胆汁鬱滞タイプ３（ｐｆｉｃ３）の治療のためのコドン最適化導入遺伝子
TW202039854A (zh) 2018-11-16 2020-11-01 美商編碼製藥公司 治療威爾遜氏病的組合物和方法
WO2020226831A1 (en) 2019-05-08 2020-11-12 Takeda Vaccines, Inc. Inactivated virus compositions and zika vaccine formulations
TW202214864A (zh) 2020-08-06 2022-04-16 應用醫學研究基金會 用於藉基因療法治療諸如阿茲海默症之Ｔａｕ蛋白病變的病毒顆粒
US20230265456A1 (en) 2020-08-10 2023-08-24 Fundacion Para La Investigacion Medica Aplicada Gene therapy vector expressing cyp27a1 for the treatment of cerebrotendinous xanthomatosis
MX2023003994A (es) 2020-10-09 2023-04-24 UCB Biopharma SRL Construcciones de acido nucleico, vectores virales y particulas virales.
KR20240099360A (ko) 2021-10-28 2024-06-28 유씨비 바이오파마 에스알엘 핵산 구축물, 바이러스 벡터 및 바이러스 입자
WO2023154043A1 (en) 2022-02-09 2023-08-17 Takeda Vaccines, Inc. Zika vaccines and immunogenic compositions, and methods of using the same
WO2024059507A1 (en) 2022-09-12 2024-03-21 Akero Therapeutics, Inc. Fgf21 mutant polypeptides

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3547779A (en) * 1968-12-18 1970-12-15 Merck & Co Inc Process for producing purified concentrated influenza virus
US5192539A (en) * 1988-07-21 1993-03-09 Akzo N.V. Infectious bursal disease virus production in continuous cell lines
FR2723740B1 (fr) * 1994-08-16 1996-11-08 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de preparation d'antigenes du virus grippal, antigenes obtenus et leurs applications
US5989805A (en) * 1995-10-27 1999-11-23 Board Of Trustees Operating Michigan State University Immortal avian cell line to grow avian and animal viruses to produce vaccines

Also Published As

Publication number Publication date
AU2557201A (en) 2001-06-04
DK1108787T3 (da) 2005-04-04
WO2001038362A3 (en) 2002-02-14
KR20020064910A (ko) 2002-08-10
JP4331432B2 (ja) 2009-09-16
IL149788A0 (en) 2002-11-10
SI1108787T1 (en) 2005-06-30
EP1108787A2 (en) 2001-06-20
KR20060107868A (ko) 2006-10-16
AU2004203642A1 (en) 2004-09-02
NO20022500D0 (no) 2002-05-27
AU775966B2 (en) 2004-08-19
EP1108787B2 (en) 2008-12-10
CN1433472A (zh) 2003-07-30
CA2392653A1 (en) 2001-05-31
BR0015846A (pt) 2002-07-16
CN1306033C (zh) 2007-03-21
DK1108787T4 (da) 2009-04-14
EP1108787B1 (en) 2005-01-05
IL149788A (en) 2010-12-30
DE60017234D1 (de) 2005-02-10
WO2001038362A2 (en) 2001-05-31
EA006136B1 (ru) 2005-10-27
BRPI0015846B8 (no) 2021-05-25
EP1103610A1 (en) 2001-05-30
JP2003516733A (ja) 2003-05-20
HK1057236A1 (en) 2004-03-19
ZA200204078B (en) 2003-08-22
ES2235770T5 (es) 2009-05-01
MXPA02005237A (es) 2003-09-22
EA200200604A1 (ru) 2002-12-26
KR100683374B1 (ko) 2007-02-15
DE60017234T2 (de) 2005-12-08
EP1514937A1 (en) 2005-03-16
BRPI0015846B1 (pt) 2001-05-31
SI1108787T2 (sl) 2009-06-30
ES2235770T3 (es) 2005-07-16
NZ527942A (en) 2004-07-30
ATE286537T1 (de) 2005-01-15
PT1108787E (pt) 2005-04-29
NO20022500L (no) 2002-07-26
CA2392653C (en) 2011-03-29
DE60017234T3 (de) 2009-07-09
EP1108787A3 (en) 2001-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO333527B1 (no) Fremgangsmate ved fremstilling av virus eller viralproteiner til anvendelse i vaksiner.
US7964198B2 (en) Production of vaccines
US7550284B2 (en) Production of vaccines
US7527961B2 (en) Production of vaccines
AU2002351444B2 (en) Production of viruses, viral isolates and vaccines
US8716016B2 (en) Immortal avian cell line and methods of use
Nelson Characterization of Sialic Acid Receptors on MDCK Cells Maintained Under Different Media Conditions by Flow Cytometric Analysis and Implications for Detection of Influenza A Virus.

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired