ES2235770T5 - Produccion de vacunas. - Google Patents

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Abstract

Un método para producir un virus y/o proteínas virales distintas a adenovirus o proteínas adenovirales para su uso como vacuna, que consiste en proporcionar a una célula que ha sido provista con al menos una secuencia que codifica al menos un producto genético del gen E1 o un derivado funcional del mismo de un adenovirus, un ácido nucleico que codifica dicho virus y/o dichas proteínas virales, cultivar dicha célula en un medio adecuado y dar paso a la expresión de dicho virus y/o dichas proteínas virales y recoger dicho virus y/o proteínas virales desde dicho medio y/o dicha célula, inmortalizándose dicha célula con el fin de desarrollarla en cultivo.

Description

Producción de vacunas.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al desarrollo y fabricación de vacunas. En particular, la invención se encuadra dentro del campo de la producción de proteínas virales y/o virus, más en particular, se refiere al uso de células derivadas de un retinoblasto embrionario humano para la producción de virus que crecen en células eucarióticas, preferiblemente células de mamífero, y en particular humanas. La invención es particularmente útil para la producción de vacunas para ayudar a proteger contra patógenos virales para vertebrados, en particular mamíferos y especialmente seres humanos. Así, la invención describe las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.
Se describen aquí medios y métodos para producir un virus y/o proteína viral en una célula (humana), preferiblemente mediante el uso de un medio sintético definido, y para la purificación de los virus y/o componentes de los mismos desde el medio de cultivo y/o células. Se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen virus o sus componentes y los métodos para su fabricación y recuperación y/o purificación.
Antecedentes
La vacunación es la ruta más importante para tratar las infecciones virales. Si bien se dispone de una serie de agentes antivirales, típicamente, dichos agentes tienen una eficacia limitada. La administración de anticuerpos contra un virus puede ser un buen modo de tratamiento de infecciones virales una vez que el individuo está infectado (inmunización pasiva) y, típicamente los anticuerpos humanos o humanizados parecen prometedores para el tratamiento de una serie de infecciones virales, si bien la manera más eficaz y segura para tratar una infección de virus es, y probablemente será, la profilaxis a través de inmunizaciones activas. La inmunización activa es lo que llamamos generalmente vacunación y las vacunas comprenden al menos un determinante antigénico típicamente de un virus, preferiblemente una serie de determinantes antigénicos diferentes de al menos un virus u otro patógeno, v.g., incorporando en la vacuna al menos un polipéptido o proteína (viral) derivada de un virus (vacunas de subunidad). Típicamente, los formatos mencionados hasta ahora incluyen adyuvantes con el fin de potenciar una respuesta inmune. Esto también es posible para vacunas a base de virus entero (patógeno), v.g., en un formato inactivado. Otra posibilidad más es el uso de formas vivas, pero atenuadas, de los virus patógenos. Otra posibilidad más es el uso de virus de tipo silvestre, v.g. en casos en los que individuos adultos no están en peligro de infección, pero los bebés han y pueden ser protegidos a través de anticuerpos maternos y similares. La producción de vacunas no siempre es un procedimiento sencillo. En algunos casos la producción de material viral se encuentra en los huevos, lo que lleva a la dificultad de purificar el material y adoptar medidas de seguridad extensivas contra la contaminación, etc. Asimismo, la producción en bacterias y o levaduras, que a veces, pero no siempre es una alternativa de los huevos, requiere muchas etapas de purificación y seguridad. La producción en células de mamífero sería una alternativa, pero las células de mamífero que se han utilizado hasta ahora requieren, por ejemplo, la presencia de suero y/o la adherencia a un soporte sólido para desarrollarse. En el primer caso, otra vez más, la purificación y seguridad y, v.g, el requisito de proteasa como soporte de la replicación de algunos virus, han de resolverse. En el segundo caso, los altos rendimientos y facilidad de producción también han de resolverse. La presente invención supera al menos una serie de los problemas con los que se topa con los sistemas de producción de virus y/o proteínas virales para propósitos de vacuna de los sistemas de la técnica
anterior.
Descripción detallada
La presente invención describe una línea celular inmortalizada humana nueva para el propósito de propagar y recoger virus, para la producción de dichos virus. Se generaron células PER.C6 (WO 97/00326) por transfección de células retinales embriónicas humanas primarias, utilizando un plasmidio que contenía secuencias que codifican E1A y E1B de serotipo 5 Ad (Ad5) (nucleótidos Ad5 459-3510) bajo el control de promotor de fosfoglicerato cinasa humano (PGK).
Las características que se indican a continuación hacen de PER.C6 o derivados de las mismas particularmente útiles como huésped para producción de virus: es una línea celular humana totalmente caracterizada, fue desarrollada en correspondencia con GLP, se puede desarrollar como cultivos en suspensión en un medio sin suero definido, está desprovista de proteínas de suero humano o animal; su crecimiento es compatible con botellas de rotación, matraces de agitación, matraces de centrifugado y biorreactores, con tiempos de duplicación de aproximadamente 35 h.
Epidemiología de la gripe
Los virus de la gripe, miembros de la familia Orthomyxoviridae, son los agentes causantes de epidemias anuales de enfermedad respiratoria aguda. Tan sólo en los EE.UU. 50 millones de norteamericanos contraen la gripe cada año. Las muertes estimadas en todo el mundo (1972-1992) son 60.000 (CDC statistics). Ha habido tres casos principales de brotes pandémicos de gripe, en concreto en 1918 (Gripe española, est. 40 millones de muertes), en 1957 (gripe asiática, est. 1 millón de muertes) y en 1968 (gripe de Hong-Kong 700.000 muertes). Las infecciones con virus de la gripe están asociadas con un amplio espectro de enfermedades y complicaciones que resultan en una morbilidad y mortalidad a nivel mundial sustancial, especialmente entre las personas ancianas y los pacientes con enfermedades crónicas. La vacunación contra la gripe es sobre todo eficaz para prevenir las complicaciones a menudo fatales asociadas con esta infección (Murphy, B.R. y R.G. Webster 1996). Se ha descrito la producción de virus de la gripe en la línea celular diploide humana MCR-5 (Herrero-Euribe L y cols. 1983). Sin embargo, las valoraciones de virus de la gripe son prohibitivamente bajas.
Cepas de virus de la gripe
Hoy en día, las vacunas de la gripe contienen Hemaglutinina y neuraminidasa de virus de la gripe A y B purificados. Los 3 virus que representan cepas epidemiológicamente importantes son virus de la gripe A (H1N1) y virus de la gripe A (H3H2) y virus de la gripe B. La división entre los tipos A y B se basa en las diferencias antigénicas entre sus antígenos de nucleoproteína (NP) y de proteína matriz (M). El virus de la gripe A se subdivide a su vez en subtipos en función de la composición antigénica (secuencia) de las moléculas de hemoglutinina (H1-H15) y neuraminidasa (N1-N9). Los representantes de cada uno de estos subtipos han sido aislados desde aves acuáticas, que probablemente sean la reserva primordial de todos los virus de la gripe para especies avícolas y mamíferos. Se ha demostrado la transmisión entre cerdos y humanos y recientemente (H5N1) entre aves y seres humanos.
Vacunas de la gripe
Actualmente se utilizan tres tipos de vacunas de la gripe inactivadas en el mundo: de virus entero, de productos fraccionados y antígeno de superficie o vacunas de subunidad. Estas vacunas contienen todas ellas glucoproteínas de superficie, hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA), de las cepas del virus de la gripe que se prevé que van a circular en la población humana en la temporada venidera. Estas cepas que se incorporan en la vacuna se desarrollan en huevos de gallina embrionados, y se purifican posteriormente las partículas virales antes de su posterior tratamiento. La necesidad del ajuste anual de las vacunas de la gripe se debe a la variación de antígeno causada por procesos conocidos como "variación antigénica" y "cambio antigénico".
La "variación antigénica" se da en virtud de la acumulación de una serie de mutaciones puntuales en la proteína H o N de un virus con el resultado de sustituciones de aminoácido. Dichas sustituciones impiden la unión de anticuerpos neutralizantes, inducidos por infección previa, y la nueva variante puede infectar al huésped.
El "cambio antigénico" es la aparición de un nuevo subtipo de rearreglo (reassortment) genético entre los virus de la gripe A humanos y animales. Las cepas pandémicas de 1957 (H2N2) y 1968 (H3N2) son ejemplos de virus reasortados a través de los cuales se introdujeron genes H y o N aviares en los virus humanos circulantes, que pudieron extenderse posteriormente entre la población humana.
En función de las encuestas epidemiológicas realizadas en 100 Centros de la Gripe Nacionales de todo el mundo, la Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda anualmente la composición de la vacuna de la gripe, normalmente en febrero para el hemisferio norte, y en septiembre para el hemisferio sur. Esta práctica limita el tiempo de maniobra para la producción y normalización de la vacuna a un máximo de 9 meses. En el caso de una demanda urgente de muchas dosis de vacuna, por ejemplo, cuando surge un nuevo subtipo de virus de la gripe A por cambio antigénico o variación antigénica, la disponibilidad limitada de huevos puede entorpecer la rápida producción de vacunas. Otras desventajas de este sistema de producción son las que vienen dadas por la falta de flexibilidad, el riesgo de la presencia de toxinas y los riesgos de virus adventicios, en particular retrovirus, así como cuestiones preocupantes como la esterilidad. Esto presenta un grave problema en la práctica de hoy de la producción de la vacuna de la gripe en huevos de gallina embrionados.
Por consiguiente, el uso de un sistema de cultivo celular para la producción de la vacuna de la gripe sería una atractiva alternativa. Los virus de la gripe pueden desarrollarse en una serie de células primarias incluyendo riñón de mono, riñón de becerro, riñón de hámster y riñón de pollo. Con todo, su uso para la producción de la vacuna no es práctico, ya que existe la necesidad de reestablecer cultivos a partir de estas células primarias para cada preparación de la vacuna. Por lo tanto, el uso de líneas celulares inmortalizadas continuas para la producción de la vacuna de la gripe es una atractiva alternativa.
El uso de sistemas de cultivo fue facilitado al advertir que de la segmentación proteolítica de HA en sus dos subunidades (HA1 y HA2) es necesaria para la infectividad de virus de la gripe, y se puede obtener por adición de tripsina. La inclusión de tripsina permite la replicación y la formación de placa en células de riñón canino Madin -Darby (MDCK) (Tobita y cols. 1975).
Recientemente, se ha demostrado que la línea celular MDCK soporta el desarrollo del virus de la gripe para la producción de vacunas (Brand y cols., 1996 y 1997, Palache y cols., 1997). El uso de tripsina requiere el desarrollo de células MDCK en medio de cultivo de tejido sin suero (MDCK-SF1). Sin embargo, las células MDCK no están aprobadas actualmente como sustrato para la producción de virus de la gripe.
Como dato importante, cualquier sistema no humano para la producción de vacunas de la gripe presenta un inconveniente inherente, conocido como "adaptación". Los virus de la gripe A y B humanos llevan ambos mutaciones en la HA, debido a la adaptación en huevos de gallina embrionados. Estas mutaciones tienen como resultado una antigenicidad alterada (Newman y cols., 1993, Williams and Robertson 1993, Robertson y cols. 1994, Gubareva y cols., 1994, Schild y cols. 1993, Robertson y cols., 1987, Kodihalli y cols. 1955). En los seres humanos, la inmunización con vacunas que contienen HA que lleva una mutación de adaptación al huevo induce a menos anticuerpos neutralizantes para el virus que contiene un HA no adaptado al huevo (Newman y cols., 1993).
Los virus de la gripe humana propagados en células caninas, como por ejemplo células MDCK, también presentan adaptación, si bien en un menor grado. Dichos virus se parecen a aislados humanos originales más cercanamente que los virus derivados de huevo (Roberton y cols. 1990).
Asimismo, existe evidencia de que los cambios específicos de huésped en NA y en modelos de fosforilación específicos de huésped de NA pueden afectar a la replicación de virus de la gripe (Schulman y Palese 1977; Sugiara y Ueda 1980; Kistner y cols. 1976).
Por lo tanto, sería claramente ventajoso evitar la adaptación u otros cambios inducidos por el huésped del virus de la gripe. Ello puede resultar en una población más homogénea de virus y hacer que la vacuna sea finalmente más eficaz.
Por tanto, uno de los objetos de la presente invención consiste en proporcionar células humanas como sustrato para la producción de altas valoraciones de virus de la gripe, adecuadas para desarrollar vacunas.
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Rotavirus y rotavacunas
Los rotavirus son la causa más importante de gastroenteritis deshidratante severa en los niños pequeños de todo el mundo. En los países en vías de desarrollo las infecciones con rotavirus llevan a más de 800.000 muertes al año. En los Estados Unidos se estiman los costes de la atención sanitaria como consecuencia de las infecciones por rotavirus en más de mil millones de dólares al año.
Los rotavirus, miembros de la familia de los Reoviridae, son virus de ARN de doble hebra que consisten en 11 segmentos de ARN, que codifican cada uno de ellos una proteína viral estructural o no estructural (VP). Este núcleo interior del virus comprende cuatro VPs: VP1, 2, 3 y 6. La VP determina las tres propiedades antigénicas principales de grupo HRV, subgrupo y serotipo. Se han identificado siete grupos antigénicamente distintos (A-G), que están codificados por VP6. La infección con rotavirus humano (HRV) es causada predominantemente por rotavirus del grupo A, abarcando los serotipos 1-4 un 95% de las enfermedades clínicas. La protección de la enfermedad natural es específica de serotipo. El grupo A se clasifica a su vez en los subgrupos I y II.
La envolutura exterior de doble capa que forma el cápside viral consiste en dos proteínas virales, VP4 y VP7, que son los antígenos de neutralización relacionados con la inmunidad protectora y que determinan el serotipo, si bien VP4 desempeña una función menor en la determinación de serotipo. Durante la co-infección con diferentes serotipos, los genomas segmentados experimentan enseguida rearreglo genético, una propiedad que se ha utilizado para crear la vacuna (Marsha y cols., 1999).
Dada la prevalencia a nivel mundial del rotavirus asociado con morbilidad y mortalidad infantil, la vacunación a gran escala contra el rotavirus se considera la manera más eficaz para combatir este virus. El objetivo de la vacunación no sería prevenir la enfermedad sino reducir su severidad y complicaciones, sobre todo durante los primeros años de vida.
La única vacuna eficaz de la que se dispone en el momento actual es una vacuna de administración oral atenuada viva basada en el rearreglo de segmentos de ARN de rotavirus humanos, que codifican las VP7s de serotipos 1, 2 y 4 en un rotavirus Rhesus que suministra el terreno atenuado junto con la VP7 de serotipo 3. La vacunación con esta vacuna tetravalente reasortante de rhesus humano (RRV-TV), aunque es altamente eficaz para prevenir la gastroenteritis severa, está asociada con la intusucepción, una enfermedad de obstrucción intestinal. Por esta razón, esta vacuna ya no está en uso.
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Descripción de la invención
La invención proporciona un método para producir un virus y/o proteínas virales distintas a adenovirus o proteínas adenovirales para su uso como una vacuna que consiste en proporcionar a una célula al menos una secuencia que codifica al menos un producto genético del gen E1 o un derivado funcional del mismo de un adenovirus, proporcionar a dicha célula un ácido nucleico que codifica dicho virus, cultivar dicha célula en un medio adecuado y permitir la propagación de dicho virus y recoger dichos virus y/o proteínas virales desde dicho medio y/o dicha célula, donde dicha célula es derivada de un retinoblasto embrionario humano.
Hasta la presente invención eran pocas, si es que había, las células (humanas) que se consideraban como adecuadas para producir virus y/o proteínas virales para su uso como vacunas de una manera reproducible y graduable y/o en rendimientos suficientemente altos y/o fácilmente purificables. Los autores de la presente invención han descubierto que las células derivadas de un retinoblasto embrionario humano, que comprenden secuencias adenovirales E1, preferiblemente en su genoma, son capaces de sostener la propagación de virus en cantidades significativas.
La célula según la invención se deriva de una célula primaria humana, preferiblemente una célula que está inmortalizada mediante un producto genético de dicho gen E1. Para poder desarrollar una célula primaria, naturalmente, es necesario que esté inmortalizada. La célula es el de una célula derivada de un retinoblasto embrionario humano.
En las células según la invención, es importante que las secuencias de gen E1 no se pierdan durante el ciclo celular. Es por lo tanto preferible que dicha secuencia que codifica al menos un producto genético del gen E1 esté presente en el genoma de dicha célula (humana). Por razones de seguridad, se presta el mayor cuidado a evitar secuencias adenovirales innecesarias en las células de acuerdo con la invención. Así pues, otro modo de realización de la invención consiste en proporcionar células que no producen proteínas estructurales adenovirales. No obstante, para conseguir una producción de virus (continua) a gran escala a través del cultivo celular, es preferible contar con células capaces de desarrollarse sin necesidad de anclaje. Las células de la presente invención tienen dicha capacidad. Para tener un sistema de producción limpio y seguro a partir del cual sea fácil recuperar y, si es deseable, purificar el virus, es preferible contar con un método según la invención en virtud del cual dicha célula humana no comprenda ninguna otra secuencia adenoviral. La célula que se prefiere sobre todo para los métodos y usos de la invención es PER.C6 tal como está depositado bajo el Nº ECACC 96022940, o un derivado de la misma.
Así pues, la invención proporciona un método en el que se usa una célula según la invención, comprendiendo dicha célula además una secuencia que codifica E2A o un derivado funcional o análogo o fragmento de la misma, preferiblemente una célula en la que dicha secuencia que codifica E2A o un derivado funcional o análogo o fragmento de la misma está presente en el genoma de dicha célula humana, siendo sobre todo preferible una célula en la que dicha secuencia que codifica E2A codifica un mutante E2A sensible a la temperatura.
Asimismo, tal como se ha señalado, la invención proporciona también un método según la invención en el que dicha célula (humana) es capaz de desarrollarse en suspensión.
La invención proporciona además un método en el que dicha célula humana se puede cultivar en ausencia de suero. Las células según la invención, en particular PER.C6, presenten la ventaja adicional de que se pueden cultivar en ausencia de suero o componentes de suero. Así pues, el aislamiento es fácil, se favorece la seguridad y la fiabilidad del sistema es buena (los medios sintéticos son los mejores en reproducibilidad). Las células humanas de la invención, son capaces de modificaciones de post- y peri-traducción y ensamblaje. Esto significa que son muy adecuadas para la preparación de virus y proteínas virales para su uso en vacunas.
Según esto, la invención proporciona un método según la invención en el que dicho virus y/o proteínas virales comprenden una proteína que experimenta modificación de post-traducción y/o peri-traducción, sobre todo cuando dichas modificaciones incluyen glucosilación. Un buen ejemplo de vacuna viral que ha resultado complicada de producir de una forma fiable es la vacuna de la gripe. La invención proporciona un método en el que dichas proteínas virales comprenden al menos uno entre neuraminidasa y/o hemaglutinina de virus de la gripe. Otras proteínas virales (subunidades) y virus (tipo silvestre para ser inactivados) o virus atenuados que se pueden producir en los métodos de la invención incluyen enterovirus, como rhinovirus, aftovirus o virus de la poliomielitis, herpesvirus, como virus de herpes simplex, virus de la pseudorrabia o virus de herpes bovino, orthomyxovirus, como el virus de la gripe, un paramyxovirus, como virus de la enfermedad de newcastle, virus de sincintio respiratorio, virus de las paperas o virus de la rubéola, retrovirus, como virus de inmunodeficiencia humana o parvovirus o un papovavirus, rotavirus o un coronavirus, como virus de la gastroenteritis transmisible o un flavivirus, como virus de la encefalitis por picadura de garrapata o virus de la fiebre amarilla, un togavirus, como el virus rubella o virus de encefalomielitis equina del Este, Del Oeste o de Venezuela, un virus causante de la heptatitis, como virus de la hepatitis A o hepatitis B, un pestivirus, como virus de la peste porcina o un rhabdovirus, como el virus de la rabia, un virus Bunyaviridae, como Hantavirus.
En uno de los modos de realización, una célula de la invención es útil para la generación de una cepa de virus de la gripe que no crece muy eficazmente en huevos embrionarios.
La invención también proporciona el uso de una célula humana que tiene una secuencia que codifica al menos una proteína E1 de un adenovirus o un derivado funcional, homólogo o fragmento de la misma en su genoma, no produciendo dicha célula proteínas adenovirales estructurales para la producción de virus no-adenovirales, para su uso en una vacuna, donde dicha célula humana es derivada de un retinoblasto embrionario humano. Naturalmente para dicho uso, las células preferibles en los métodos según la invención son también las preferibles. La invención también proporciona los productos que resultan de los métodos y uso de la invención, sobre todo proteínas virales y virus que se pueden obtener de acuerdo con los usos y/o métodos, sobre todo cuando se introducen en una composición farmacéutica que comprende excipientes adecuados y en ciertos formatos (subnidades de virus inactivados), adyuvantes. Las dosis y modos de administración se pueden seleccionar a través de las pruebas clínicas normales ya que no están disponibles aún a través de vacunas ya registradas.
Por lo tanto, la presente invención proporciona también un virus o una proteína viral para su uso en una vacuna que se puede obtener a través del método o a través del uso según la presente invención, estando dicho virus o proteína viral libre de material proteináceo de mamífero no humano y una formulación farmacéutica que comprende dicho virus y/o proteína viral.
La invención proporciona asimismo una célula humana que tiene una secuencia que codifica al menos una proteína E1 de un adenovirus o un derivado funcional, homólogo o fragmento de la misma en su genoma, no produciendo dicha célula proteínas adenovirales estructurales y teniendo un ácido nucleico que codifica un virus no-adenoviral. Dicha célula es derivada de un retinoblasto embrionario humano y se puede utilizar en un método según la invención.
En un modo de realización preferible, la invención proporciona virus de la gripe que se puede obtener a través del método según la invención o a través del uso según la invención. En otro modo de realización, la invención proporciona vacunas de la gripe que se pueden obtener a través del método según la invención o el uso según la invención.
Las preparaciones de virus de la gripe recogidas de huevos embrionarios típicamente han de ser purificadas para la preparación de una vacuna. La purificación implica típicamente al menos una etapa de concentración del virus. Las tecnologías actuales para la concentración del virus de la gripe a partir de dichas preparaciones relativamente en bruto de virus de la gripe son complicadas.
Un derivado de un virus de la gripe infeccioso de la invención es típicamente un virus, una partícula de virus o una proteína viral o parte de la misma que se pueda utilizar para fines de inmunización. Típicamente esto implica una etapa de inactivación de la infectividad del virus.
Ejemplos
Para ilustrar la invención, se ofrecen los siguientes ejemplos, no pretendiéndose en absoluto limitar con ello el marco de la invención.
Ejemplo 1 Materiales y métodos Cultivo de células PER.C6 y MDCK
Se cultivaron células de riñón canino Madin Darby (MDCK) en medio de Eagle modificado con Dulvecco (DMEM; Life Tecnhologies Breda, Países Bajos) que contenía un 10% de suero bovino fetal inactivado por calor y 1x de L-glutamina (Gibco-BRL), a 37ºC y un 10% de CO_{2}. Se cultivaron cultivos en suspensión de PER.C6 en ExCell 525 (JRH Biosciences) suplementado con 1x L-Glutamina, a 37ºC y 10% de CO_{2}, en cultivos estacionarios en placas de 6 pocillos (Greiner) o en botellas de rotación de cultivo de tejido de 490 cm^{2} (Corning Costar Corporation) durante la rotación continua a 1 rpm.
Ensayo de inmunofluorescencia
Se llevaron a cabo ensayos de inmunofluorescencia directa para la detección de infección de virus de la gripe utilizando un equipo de virus de la gripe A y B IMAGEN^{TM} (Dako) con arreglo al protocolo normal del proveedor. Se observaron por microscopio las muestras utilizando iluminación de epifluorescencia. Las células infectadas se caracterizaron por una fluorescencia verde manzana brillante.
Manchado con yoduro de propidio
Se suspendieron pelets de células en 300 \mul de PBS frío/0,5% de BSA + 5 \mul de yoduro de propidio (concentración 50 \mug/ml) en PBS/FCS/solución de azida conocido entre las personas especializadas en este campo. A continuación, se detectaron las células viables y muertas a través de un análisis citofluorométrico de flujo.
Ensayo de hemaglutinación
En general, se llevaron a cabo los ensayos de hemaglutinación para valoraciones de virus de la gripe de con arreglo a los métodos conocidos entre las personas especializadas en este campo. En este caso, se añadieron 50 \mul de una solución de virus diluida dos veces en PBS a 25 \mul de PBS y 25 \mul de una suspensión al 1% de eritrocitos de pavo (Biotrading Benelux B.V) en PBS y se incubó en placas de microvaloración de 96 pocillos a 4ºC durante 1 hora. Se examinó el modelo de hemaglutinación y se puntuó, y se expresó como unidades de hemaglutinación (HAUs). El número de HAUs se correspondió con el valor recíproco de la dilución de virus más alta que presentó hemaglutinación completa.
Análisis de mancha de Western de proteína HA de virus de la gripe
En general, se interrumpieron los virus de la gripe obtenidos en tampón de Laemmli con arreglo a los métodos conocidos entre las personas especializadas en este campo y se separaron diferentes volúmenes de las mezclas de proteína obtenidas utilizando geles 10% SDS/PAGE. Brevemente, se bloquearon manchas durante 30 minutos a temperatura ambiente con solución de bloqueo (5% de leche en polvo deshidratada sin grasa (Biorad) en TBST suplementado con 1% de suero de conejo (Rockland)), seguido de 3 lavados con TBST. A continuación, se incubaron las manchas con los antisueros HA anti A/Sydney/5/97 (98/768 NIBSC) diluido 1/500 en 1% BSA/TBST con suero de conejo al 5% (Rockland) O/N a temperatura ambiente. De nuevo se lavaron las manchas 8 veces con TBST. Finalmente, se incubaron las manchas con el anti suero anti oveja de conejo (etiquetado con HRP, Rockland) diluido 1/6000 en solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Al cabo de 8 lavados con TBST, se visualizó el complejo proteína-conjugado con ECL (Amersham Pharmacia Biotech), y se expusieron las películas (Hyperfilm, Amersham Life Science). Se obtuvieron los antisueros de NIBSC (RU) y se aplicaron en las diluciones recomendadas por los NIBSC.
Ensayo de inmunodifusión radial simple (SRID)
Se determinó la concentración de hemaglutinina en sobrenadantes derivados de células PER.C6 infectadas con virus de la gripe, a través de un ensayo de inmunodifusión radial simple (SRID) tal como se ha descrito anteriormente (Wood y cols., 1977). Se llevó a cabo el ensayo utilizando antígenos NIBSC normales (RU) y reactivos de antisuero.
Ensayo de placa
Se inoculó un total de 1 ml de sobrenadantes virales diluidos en serie 10 veces en células MDCK que habían sido desarrolladas hasta una confluencia de un 95% en placas de 6 pocillos. Al cabo de 1 hora a 35ºC, se lavaron las células dos veces con PBS y se sobrecargaron con 3 ml de mezcla de agasosa (1,2 ml de agarosa al 2,5%, 1,5 ml de 2 x MEM, 30 \mul de L-glutamina 200 mM, 24 \mul de tripsina-EDTA, 250 \mul de PBS). A continuación, se incubaron las células en una atmósfera húmeda de CO_{2} al 10% a 35ºC durante aproximadamente 3 días y se puntuaron a simple vista las placas virales.
Ensayo de infectividad del virus (TCID_{50})
Se llevó a cabo la valoración de virus infeccioso sobre células MDCK. Brevemente, se sembraron células en placas de 96 pocillos a una densidad de 4 x 10^{4} células/pocillo en DMEM suplementado con L-glutamina 2 mM. Al cabo de 24 horas, se infectaron éstas células con 100 \mul de sobrenadantes de cultivo diluidos en serie diez veces, por cuadruplicado, en medio que contenía tripsina-EDTA a una concentración de 4 \mug/ml. Dos horas después de la infección, se lavaron monocapas de células dos veces en PBS y se incubaron en medio que contenía tripsina durante 7 días, a 35ºC. A continuación, se sometieron a ensayo los sobrenadantes de estos cultivos en un ensayo de HA. Se calcularon las valoraciones TCID_{50} con arreglo al método de Karber (1931).
Inactivación de virus de la gripe con \beta-propiolactona
Para inactivar los virus para obtener virus totalmente intactivado entero para generar vacunas derivadas de PER.C6, se llevó a cabo un protocolo de mutación conocido entre las personas especializadas en este campo utilizando \beta-propiolactona. \beta-propiolactona es un agente muy eficaz cuyo uso está muy extendido para la inactivación de virus y es muy conocido en la técnica por sus efectos mutantes. Modifica bases de ácido nucleico del genoma viral y el genoma de la célula huésped y después bloquea la replicación. Siguiendo un protocolo establecido utilizado para preparar la vacuna de la gripe inactivada entera preparada sobre huevos embrionados, se inactivó la cantidad de virus que correspondía aproximadamente a 400 \mug de HA por cepa y se utilizó para la formulación de vacuna final. Brevemente, se añadió un volumen de tampón fosfato sódico 0,3 M a 9 volúmenes de preparación de virus de la gripe. Se llevó a cabo la inactivación de los virus añadiendo un volumen de 10% de \beta-propiolactona (Newall Design, RU) a 100 volúmenes de preparación de virus tamponada con fosfato y se incubó a 20ºC durante 24 horas. Se comprobó la inactivación de los virus por ensayo de placa y no se detectó ninguna placa para los cultivos dicontinuos inactivados (no se muestran los datos).
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Ejemplo 2A
Formación de banco de Células PER.C6 y precultivo
Se utilizó línea celular PER.C6 (depositada bajo el Nº 96022940 en el European Collection of Animal Cell Cultures en el Centre for Applied Microbiology and Research), o derivados de las mismas (descritas en WO 97/00326). Se formaron bancos de las líneas celulares a través de un sistema de banco celular en dos niveles. Se colocó en un banco la línea celular seleccionada en un banco celular maestro de investigación (rMCD) que fue almacenado en diferentes localizaciones. A partir de este rMCB, se prepararon bancos celulares de trabajo de investigación (rWCB) del siguiente modo: se descongeló una ampolla de rMCB y se propagaron las células hasta que estuvieron presentes suficientes células para congelar las células utilizando hielo seco. Se almacenaron hasta 500 ampollas que contenían 1 ml (1-2 x 10^{6} células/ml) de rWCB en la fase vapor de un congelador de N_{2} líquido. Se descongeló una ampolla que contenía 5 x 10^{6} células PER.C6 del WCB en un baño de agua a 37ºC. Se transfirieron rápidamente las células en un tubo de 50 ml y se volvieron a suspender añadiendo 9 ml del medio de suspensión ExCell 525 (JRH Biosciences) suplementado con 1 x L-Glutamina. Al cabo de 3 minutos de centrifugado a 1000 rpm en una centrífuga de mesa, se resuspendieron las células a una concentración final de 3 x 10^{5} células/ml y se cultivaron en un matraz de cultivo de tejido T80, a 37ºC, CO_{2} al 10%. De dos a tres días después, se sembraron las células en botellas de rotación de cultivo de tejido de 490 cm^{2} (Corning Costar Corporation), con una densidad de 3 x 10^{5} por ml y se cultivaron en rotación continua a 1 rpm.
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Ejemplo 2B
Células PER.C6 como línea celular permisiva para virus de la gripe A
No se conocían PER.C6 como célula humana por su capacidad de sostener infección de virus de la gripe y replicación. Por tanto, se verificó si las células PER.C6 eran permisivas para la infección de virus de la gripe en comparación con la línea celular de perro de las células caninas de riñón Madin Darby (MDCK), que sirvieron como control positivo.
El día antes de la infección, se sembraron 2 x 10^{5} células MDCK por pocillo en placas de 6 pocillos. Veinticuatro horas después, se sembraron 4 x 10^{5} células PER.C6 y se infectaron las células MDCK de cada pocillo con la cepa H1N1 A/Puerto Rico/8/34 (valoración 3,6 x 10^{7} pfu/ml), (obtenida del Dr. E. Claas, Leiden University Medical Center, Países Bajos). Se llevó a cabo la infección a varias multiplicidades de infección (moi) que oscilaron entre 0,1 y 10 pfu/célula. Al cabo de aproximadamente 2 horas de incubación a 37ºC, se extrajo el inóculo y se sustituyó por medio de cultivo nuevo. Se llevó a cabo un ensayo de inmunofluorescencia directa para la detección de infección de virus de la gripe 24 y 28 horas después de la infección. El experimento presentó permisivilidad de PER.C6 para infección de la gripe, con porcentajes de células positivas dependientes de moi y comparables con MDCK (figura 1).
Ejemplo 3 PER.C6 utilizada para propagación del virus de la gripe A
Se verificó si la replicación y propagación del virus de la gripe podían ser soportadas por PER.C6. El día de la infección, se sembraron células PER.C6 en botellas de rotación de cultivo de tejido de 490 cm^{2}, con una densidad de 2 x 10^{5} células/ml en un volumen final de 40 ml, en presencia de 5 \mug/ml de tripsina-EDTA (Gibco-BRL). Se inocularon las células falsamente (mock) o se infectaron con cepa H3N2 A/Shenzhen/227/95 (valoración 1,5 x 10^{6} pfu/ml) (obtenida de Dr. E. Claas, Leiden University Medical Centre, Países Bajos). Se llevaron a cabo infecciones a una moi de 10^{-4} y 10^{-3} pfu/célula. Al cabo de 1 hora de incubación a 37ºC, se eliminó el inóculo por centrifugado corriente abajo de las células a 1500 rpm y se resuspendieron las células en el medio de cultivo nuevo + 5 \mug/ml de tripsina-EDTA. Se llevó a cabo la recogida de 1,3 ml de suspensión celular todos los días desde el día 1 hasta el día 6 después de la infección. Se almacenaron los sobrenadantes a -80ºC y se utilizaron para ensayos de hemaglutinación. Se utilizaron los pelets celulares para ensayos de inmunofluorescencia directa y manchado de yodo propidio.
Ejemplo 4 Permisivilidad de PER.C6 para diferentes cepas de la gripe
Para investigar mejor la permisivilidad de PER.C6 para la propagación de diversas cepas de virus de la gripe, se llevó a cabo una infección utilizando cepas de vacuna H1N1 A/Beijing/262/95 y su reasortante X-127, obtenidas del National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC, RU). El día de la infección, se sembraron células PER.C6 en botellas de rotación de cultivo de tejido de 490 cm^{2}, con la densidad de aproximadamente 1 x 10^{6} células/ml en un volumen final de 50 ml. Se inocularon en las células 5 \mul (dilución 10^{-4}) y 50 \mul (dilución 10^{3}) de virus en presencia de 5 \mug/ml de tripsina-EDTA.
Con el fin de establecer si se necesitaba realmente tripsina, se llevó a cabo una infección más inoculando 5 \mul de la cepa A/Beiging/262/95 en ausencia de la proteasa. Al cabo de aproximadamente 1 hora de incubación a 37ºC, se eliminó el inóculo por centrifugado corriente abajo de las células a 1500 rpm y se volvieron a suspender en medio de cultivo nuevo \pm 5 \mug/ml de tripsina-EDTA. Los días 2 y 4 después de la infección se añadió más tripsina a las muestras. Se llevó a cabo la recogida de 1,3 ml de suspensión celular desde el día 1 al día 6 tras la infección. Se almacenaron los sobrenadantes a -80ºC y se utilizaron para ensayos de hemaglutinación y posteriores infecciones; se utilizaron los pellets celulares para ensayos de inmunofluorescencia directa. Los resultados obtenidos con la inmunofluorescencia mencionada y los ensayos de hemaglutinación se muestran en las figuras 4 y 5, respectivamente, en las que se ilustra la replicación y liberación de los virus eficaz.
Ejemplo 5 Infectividad de virus propagado sobre PER.C6
Se verificó si los virus desarrollados en PER.C6 eran infecciosos y si la adaptación a la línea celular podía aumentar los rendimientos de virus. Se utilizaron sobrenadantes de virus derivados de PER.C6 infectadas con las cepas A/Beiging/262/95 y su reasortante X-127 (dil-10-3) y recogidas el día 6 después de la infección. El día de la infección, se sembraron PER.C6 en botellas de rotación de cultivo de tejido de 490 cm^{2}, con la densidad de aproximadamente 1 x 10 células/ml en un volumen final de 50 ml. Se inocularon en las células 100 \mul y 1 ml de sobrenadante de virus en presencia de 5 \mug/ml de tripsina-EDTA. Para establecer si se seguía requiriendo tripsina, se llevó a cabo una infección más inoculando 100 \mul de la cepa A/Beijing/262/95 en ausencia de la proteasa. Al cabo de aproximadamente 1 hora de incubación a 37ºC, se eliminó el inóculo por centrifugado corriente abajo de las células a 1500 rpm y se volvieron a suspender en un medio de cultivo nuevo \pm5 \mug/ml de tripsina-EDTA. El día 2 y el día 4 después de la infección, se añadió más tripsina a las muestras. Se llevó a cabo la recogida de 1,3 ml de suspensión celular desde el día 1 hasta el día 6 después de la infección. Se almacenaron los sobrenadantes a -80ºC y se utilizaron para ensayos de hemaglutinación y posteriores infecciones; se utilizaron los pelets celulares para ensayos de inmunofluorescencia directa. Los resultados obtenidos con la inmunofluorescencia mencionada y los ensayos de hemaglutinación se muestran en las figuras 6 y 7. Los datos obtenidos con este experimento demostraron la infectividad de los virus desarrollados en PER.C6 así como un aumento de los rendimientos de virus.
Ejemplo 6 Presencia de receptores de superficie célular para virus de la gripe sobre PER.C6
La propagación de cepas A y B de virus de la gripe humana en huevos de pollo embrionados siempre lleva a una selección de las variantes de unión a receptor que hospedan sustituciones de aminoácido en la porción distal de la cabeza globular de HA en las regiones expuestas y funcionalmente importantes de la molécula. Dadas estas mutaciones, las cepas adaptadas a huevo pueden diferir de los virus humanos originales en sus actividad antigénica e inmunogénica, así como su virulencia. Los virus de la gripe humana aislados de células MDCK presentan normalmente una proteían HA que es idéntica a la proteína HA presente en el virus de la muestra clínica original. En un estudio reciente (Govorkova 1999) se clarificaba la base molecular para la selección de variantes de huevos de pollo y la ausencia de este fenómeno de selección variante en células MDCK. Se observó que todas las cepas A y B de la gripe humana aisladas de MDCK se unían con alta afinidad y específicamente a sitios de unión ácido alfa-2,6 siálico-galactosa presentes en oligosacáridos presentes en receptores de superficie de célula, mientras que sus contrapartidas desarrollados en huevo presentaron una mayor afinidad para los sitios de unión ácido alfa-2,3-siálico-galactosa en los receptores de superficie celular que llevaban oligosacáridos (Sia2-3Gal). Utilizando lecitinas específicas se demostró que los receptores q ue contenían sólo Sia2-3Gal estaban presentes en la superficie de células embriónicas de pollo, mientras que las células MDCK expresaban tanto Sia2-6Gal como Sia2-3Gal. La expresión de las fracciones Sia2-3Gal y Sia2-6Gal en la superficie de células PER.C6 fue estudiada por análisis FACS, utilizando dos lecitinas etiquetadas con digoxigenina (DIG) diferentes: aglutinina Sambuca nigra (SNA) que reconoce específicamente sitios de unión Sia2-6GA1 y aglutinina Maackia amurensis (MAA), que reconoce específicamente sitios de unión Sia2-3Gal. La figura 8A muestra el reconocimiento de lecitinas SNA y MAA y su unión a los sitios de glucosilación. Asimismo, la figura 8A muestra la interacción esquemática entre el anticuerpo anti-DIG etiquetado con FITC y la lecitina etiquetada con DIG que reconoce la unión sialilo específica en la estructura principal de glucosilación del receptor presente en la superficie celular. Se tomaron ambas lecitinas del equipo de diferenciación de glucano (Boehringer-La Roche).
Se llevó a cabo el experimento en células PER.C6 en suspensión y MDCK adherente y células CHO. Se liberaron las células MDCK y CHO del soporte sólido utilizando tripsina-EDTA (Gibco-BRL). A continuación, se lavaron las suspensiones celulares una vez con Mem-FBS al 5% y se incubaron en este medio durante 1 hora a 37ºC. Después del lavado en PBS (Bigco-BRL), se resuspendieron las células a una concentración de aproximadamente 10^{6} células/ml en medio de unión/(Tris-salina tamponada, pH 7,5, 0,5% de BSA y 1 mM de cada uno de los siguientes: MgCl_{2}, MnCl_{2} y CaCl_{2}). Se incubaron partes alícuotas de células durante 1 hora a temperatura ambiente con las lecitinas etiquetadas con DIB SNA y MAA. Al cabo de 1 hora, se lavaron las células tratadas con lecitina con PBS y se incubaron durante una hora más a temperatura ambiente con anticuerpo anti DIG etiquetado con FITC (Boehringer-Mannheim). Finalmente, se lavaron las células con PBS y se analizaron por separación celular (sorting) activada por fluorescencia utilizando un aparato de separación celular activada por fluorescencia (Becton Dickinson). Los resultados que se muestran en la figura 8B demuestran que las células PER.C6 fueron manchadas con ambas lecitinas lo que demuestra la presencia de Sia2-6Gal así como receptores Sia2-3Gal.
En el mismo experimento, se utilizaron células MDCK como control positivo para ambos receptores sialilados, mientras que las células CHO, debido a la ausencia de enzima de glucosilación alfa 2-6 sialiltransferasa en estas células de hámster, representaron el control negativo para la fracción Sia2-6Gal. El panel superior muestra los resultados con la lecitina SNA y los paneles inferiores muestran los resultados con la lecitina MAA. Se puede concluir de estos resultados que PER.C6 expresa proteínas de superficie celular que tienen sitios de unión tanto Sia2-3Gal como Sia2-6Gal en sus cadenas de oligosacárido.
Ejemplo 7 Efecto de diferentes concentraciones de tripsina-EDTA en la viabilidad de células PER.C6, en la producción de virus de la gripe en células PER.C6 y en proteína HA derivada de las mismas
Debido a la necesidad absoluta de tripsina para la propagación de virus de la gripe en cultivos celulares, se investigaron los efectos de diferentes concentraciones de tripsina-EDTA sobre la viabilidad de células PER.C6 y la replicación de virus en células PER.C6 tras la infección utilizando varias cepas de la gripe.
Infección con cepa de virus de la gripe A/Sydney/5/97 en presencia de bajas concentraciones de tripsina
El día de la infección, se sembraron células PER.C6 en botellas de rotación de cultivo de tejido de 490 cm^{2}, a una densidad de 1 x 10^{6} células/ml, en presencia de tripsina-EDTA a concentraciones finales de 0,5, 1, 2, 3 y 5 \mug/ml. Las concentraciones de tripsina no interfirieron con las características de crecimiento de las células ni su viabilidad (no se muestran los datos). Se infectaron las células o bien falsamente (mock) o bien se infectaron con virus de la gripe A/Sydney/5/97 desarrollado en PER.C6 a una moi de 10^{-4} pfu/célula. Se llevó un seguimiento de la producción viral por inmunofluorescencia directa (no se muestran los datos), ensayos de hemaglutinación, inmunodifusión radial simple (RSID) y ensayos de placa, todos ellos descritos anteriormente. Los resultados de este experimento se representan en la figura 9, donde se muestra que el contenido de HA, según se midió por SRID, así como la actividad biológica del virus, expresado en HAU, fueron más altos cuando se utilizó una concentración de tripsina de 1 \mug/ml. En la figura 9 se muestra también que al utilizar un ensayo de placa el número más alto de unidades que forman placa (pfu) por ml fue observado en la muestra que correspondía a células desarrolladas en medio que contenía 2 \mug/ml de tripsina.
Infección con cepa de virus de la gripe B/Harbin/7/94
En el día de la infección se sembraron células PER.C6 en botellas de rotación de cultivo de tejido de 490 cm^{2} a una densidad de 1 x 10^{6} células/ml, en presencia de diferentes concentraciones de tripsina-EDTA, que oscilaron entre 1 a 5 \mug/ml. Se infectaron las células con virus B/Harbin/7/94 desarrollado en PER.C6 a una moi de 10^{-3} pfu/célula. Se llevó un seguimiento de la producción de virus por inmunofluorescencia directa, hemaglutinación y ensayos de placa, tal como se muestra en la figura 10. La infectabilidad de PER.C6 el día 2 aumentó con la concentración de tripsina. En el día 3 sin embargo, no se observó ninguna diferencia significativa en el porcentaje de células infectadas cuando estuvo presente 1, 2,5 ó 5 \mug/ml de tripsina. En ausencia de tripsina (0 \mug/ml) no se detectó ninguna infección de virus de la gripe. En el día de la última recogida (día 4 después de la infección), la actividad biológica del virus, tal como se midió según el ensayo de hemaglutinación, no difirió significativamente. Es interesante que el ensayo de infectividad realizado en muestras que fueron tomadas el día 3 y el día 4 después de la infección, presentaron una diferencia en la producción del virus. Las valoraciones más altas fueron obtenidas el día 3 y el día 4 cuando se utilizó una concentración de tripsina de 2,5 a 5 (día 3) y 1 \mug/ml (día 4).
Infección con reasortante de virus de la gripe X-127
El día de la infección, se sembraron células PER.C6 en matraces de cultivo de tejido T25, a una densidad de 1 x 10^{6} células/ml, en presencia de diferentes concentraciones de tripsina-EDTA que oscilaron entre 0 y 7,5 \mug/ml. Se infectaron las células con virus X-127 (reasortant de huevo para cepa A/Beijing/262/95) desarrollado en PER.C6 a una moi de 10^{-4} y 10^{-3} pfu/célula. Se llevó un seguimiento del desarrollo viral por inmunofluorescencia directa, hemaglutinación y ensayos de placa. Tal como se muestra en la figura 11 y la figura 12, las valoraciones HAU fueron idénticas entre las muestras, independientemente de la concentración de tripsina y de la moi inicial que se utilizó. Asimismo, no se observaron diferencias significativas en las valoraciones de infectividad, tal como se midió por ensayo de placa.
Infección de PER.C6 con cepa de virus de la gripe A/Sidney/5/97 en presencia de altas concentraciones de tripsina
Para ensayar el efecto de ir aumentando las concentraciones de tripsina en la viabilidad de las células y replicación de virus, se sembraron células PER.C6 en botellas de rotación a una densidad de 1 x 10^{6} células /ml en presencia de varias concentraciones de tripsina-EDTA que oscilaron entre 0 y 12,5 \mug/ml. Se infectaron las células o bien falsamente o bien se infectaron con virus A/Sidney/5/97 desarrollado en PER.C6 a una moi de 4 x 10^{-5} pfu/célula. Se determinaron las HAU presentes en las tandas obtenidas. Es importante destacar que los datos representados en la figura 13 claramente muestran que las concentraciones de tripsina de hasta 10 \mug/ml no interfieren con la viabilidad celular. Asimismo, la actividad biológica del virus obtenido el día 4 después de la infección según se midió por las HAU fue superior cuando se utilizó una concentración de tripsina de 2,5 a 5 \mug/ml. Por otra parte, se midió TCID_{50} (Figura 14A) y se llevaron a cabo ensayos de placa (no se muestran los datos). No se encontraron diferencias relevantes en dichos ensayos de placa, en valoraciones de infectividad (TCID_{50}), en la segmentación de HA y la cantidad
(aproximadamente 10 \mug/ml) según se determinó por análisis de mancha de western que se muestra en la figura 14B.
Ejemplo 8 Producción de virus de la gripe sobre células PER.C6 en un sistema de biorreactor de perfusión de fibra hueca
Se estudió la graduabilidad de la producción de virus de la gripe en células PER.C6 en desarrollo en suspensión utilizando biorreactores de 3 litros (volumen total) que contenían un volumen en suspensión celular de 2 litros de células en medio sin suero, que también estaba desprovisto de proteínas derivadas de animal o ser humano (ExCell 525, JRH, Biosciences).
Se llevó a cabo la infección de virus de la gripe a una densidad celular de aproximadamente 3 x 10^{6} células/ml. Se inocularon las células con virus A/Sidney/5/97 desarrollado en PER.C6, a una moi de 10^{-4} pfu/célula. Se tomaron muestras de 5 a 10 ml de suspensiones celulares todos los días para llevar a cabo recuentos celulares generales, para determinar la viabilidad de las células, para tomar medidas de la concentración de glucosa, y para realizar ensayos de inmunofluorescencia directa, hemaglutinación y ensayos de infectividad. En la figura 15 se muestran los resultados de estos experimentos.
Para investigar la presencia y el estado de la proteína HA se utilizaron manchas de western utilizando dos anticuerpos anti-HA diferentes obtenidos del NIBSC. Se llevaron a cabo ensayos SRID tal como se ha descrito antes. Los resultados representados en las dos manchas de western de la figura 16 muestran que el cultivo discontinuo (batch) de virus de la gripe producida en este biorreactor produjo un contenido de HA de una concentración estimada de 15 \mug/ml que se confirmó según los ensayos SRID. La HA producida es comparable a la HA del NIBSC de referencia en lo que se refiere a la composición de subunidad y la reactividad inmune con el antisuero específico de subtipo de referencia.
Ejemplo 9 Infección de células PER.C6 con A/Sidney/5/97 en un biorreactor de 15 litros seguido de un proceso de corriente abajo específico (DSP)
Se incubó una suspensión de células PER.C6 en desarrollo a 37ºC en un sistema de perfusión de fibra hueca de biorreactor de 15 litros, con un volumen de suspensión celular de 10 litros en medio ExCell 525 sin suero (JRH Biosciences). Se llevó a cabo la infección de virus de la gripe a 35ºC a una densidad celular de aproximadamente 3,3 x 10^{6} células/ml en un medio que contenía 5 \mug/ml de tripsina-EDTA (Life Techonologies). Se inocularon las células con virus A/Sidney/5/97 desarrollado en PER.C6 (pase número 3) a una moi de 10^{-4} pfu/célula. Se continuó la perfusión con medio ExCell 525 sin suero que contenía tripsina EDTA durante las primeras 24 horas tras la infección. Dos días después de la infección se alimentaron las células con una solución de cultivo continuo (fed-batch) que contenía glucosa, aminoácidos esenciales y glutamina extra: 82 ml por litro de suspensión que contenía 50% m/v de glucosa (NPBI-Países Bajos), 50 x aminoácidos esenciales sin Gln (Gibco-BRL-Life Technologíes) y 200 mM de glutamina (Gibco-BRL-Life Technologies). Se tomaron muestras en suspensión celular de 10 ml todos los días con el fin de llevar a cabo recuentos celulares normales (los resultados se muestran en la figura 17, gráfico de la izquierda), medidas de la concentración de glucosa (los resultados se muestran en la figura 17, gráfico de la derecha), inmunofluorescencia directa (figura 18), hemaglutinación (figura 19) y ensayos de infectividad (no se muestran los datos). Asimismo, se investigó la proteína HA por análisis de mancha de western y se comparó con el control HA normal del NIBSC (figura 20). El día de la recogida final de toda la suspensión celular (92 horas después de la infección), se llevó a cabo la clarificación de residuos celulares en un flujo continuo da 20.000 g utilizando un sistema de separación Powerfuge^{TM} (Carr, JM Separations) con arreglo a los protocolos proporcionados por el fabricante. A continuación, se concentró el sobrenadante clarificado veinte veces utilizando un cartucho de membrana de fibra hueca de 500 kD de calibre (A/G Tecnhology, JM Separations). Los resultados representados en la figura 21 muestran que la recuperación cuantitativa del virus de la gripe vivo tras la concentración con fibra hueca según se midió por hemaglutinación y ensayos de infectividad es muy significativa.
Ejemplo 10 Inmunogenicidad de virus de la gripe desarrollados en PER.C6 y vacunas derivadas de los mismos
Para determinar la inmunogenicidad de virus de la gripe desarrollados en PER.C6 se designó un estudio in vivo y un modelo de contaminación intencionada (challenging) en hurones. Se utilizaron dos cultivos discontinuos de vacuna de virus la gripe inactivada entera trivalente (compuesta de A/Sidney/5/97; A/Beijing/262/95 y B/Harbin/7/94), que contenía 15 \mug de HA de cada una de las tres cepas. El primer cultivo discontinuo se obtuvo de huevos de gallinas fértiles y el segundo de células PER.C6. Se llevaron a cabo la producción, purificación, inactivación y formulación de las vacunas de virus de la gripe derivadas de PER.C6 inactivadas enteras trivalentes del siguiente modo.
Crecimiento de cepas de virus de la gripe A/Sidney/5/97, A/Beijing/262/95 y B/Harbin/7/94 sobre PER.C6
Se llevó a cabo la producción de los tres cultivos discontinuos virales de virus de la gripe en tres sistemas de biorreactor de cultivo continuo de fibra hueca de 3 litros distintos con volúmenes de suspensión celular de 2 litros. Se llevó a cabo el cultivo continuo con la adición de la siguiente solución: un volumen total de 96 ml que contenía 50% m/v de glucosa (NPBI), 50 x aminoácidos esenciales sin Gln (Gibco-BRL-Life Technologies), 200 mM de glutamina (Gibco-BRL-Life Technologies) y 7,5% m/v de NaHCO_{3} (Merck) de una vez. Se llevaron a cabo infecciones de la gripe a densidades celulares que oscilaron entre 1,8 x 10^{6} y 2,6 x 10^{6} células viables/ml, en medio sin suero ExCell 525 que contenía 5 \mug/ml de tripsina-EDTA. Se inocularon células PER.C6 con las cultivos discontinuos de virus A/Sidney/5/97, A/Beijing/262/95 y B/Harbin/7/94 desarrollados en PER.C6 a diferentes moi: 10^{-4} (A/Sidney/5/97) o 10^{-3} (A/Beiging/262/95 y B/Harbin/7/94) pfu/célula. Durante el período de producción de virus, se tomaron muestras 10 ml todos los días para llevar a cabo recuentos normales de viabilidad y de células, tomar medidas de la concentración de glucosa, realizar ensayos de inmunofluorescencia directa y hemaglutinación. En la figura 22 (resultados de las células PER.C6 infectadas con A/Sidney/5/97) se muestran los recuentos del total de células y la viabilidad tras la infección con el virus (panel de la izquierda superior), el consumo de glucosa (panel de la derecha superior), el porcentaje de células positivas en la detección de inmunofluorescencia directa (panel de la izquierda inferior) y las HAU (panel de la derecha inferior). En la figura 23 (resultados de las células PER.C6 infectadas con A/Beijing/262/95) se muestran los recuentos del total de células y la viabilidad tras la infección con el virus (panel izquierda superior), el consumo de glucosa (panel de la derecha superior), el porcentaje de células positivas en la detección de inmunofluorescencia directa (panel de la izquierda inferior) y las HAU (panel de la derecha inferior). La figura 24 (resultados de células PER.C6 infectadas con B/Harbin/7/97) se muestran los recuentos del total de células y de viabilidad tras la infección con el virus (panel izquierda superior), el consumo de glucosa (panel de la derecha superior), el porcentaje de células positivas en la detección de inmunofluorescencia directa (panel de la izquierda inferior) y las HAU (panel de la derecha inferior). Se almacenaron los concentrados que contenían virus a -80ºC hasta DSP.
En los tres casos, el consumo de glucosa y los recuentos de total de células y de viabilidad de células PER.C6 fueron comparables. También los niveles de producción de los tres virus, según se midió por inmunofluorescencia directa fueron similares. Aunque las valoraciones de HAU y de infectividad difirieron entre las tres cepas, PER.C6 tenía una replicación sostenida de todos los virus de la gripe que se ensayaron aquí.
El día de la recogida de todo el cultivo (o bien el día 3 o bien el día 4 tras la infección), se clarificaron los sobrenadantes virales por centrifugado a 2000 rpm en una centrífuga de mesa y se concentró diez veces por ultra filtrado utilizando un cartucho de membrana de fibra hueca de 750 kD de calibre (A/G Technology, JM Separations), siguiendo los protocolos proporcionados por el fabricante. Se purificaron los virus de la gripe de los sobrenadantes concentrados a través de dos etapas de centrifugado de densidad sucesivos: un gradiente de sacarosa de bloqueo de 25-70% (1,5 horas a 27K) seguido de un gradiente de sacarosa al 25-70% continuo (4 horas a 23 K). Se diluyeron las bandas virales en aproximadamente 50 ml de tampón fosfato y finalmente se aglomeraron a 24.000 rpm en una ultracentrífuga. Se disolvieron los aglomerados virales en 1,5 a 2,3 ml de tampón fosfato, se dividieron en partes alícuotas y se congelaron a -80ºC.
La formulación de las vacunas de la gripe inactivadas se basa en la cantidad (en microgramos) de proteína HA "inmunológicamente activa" tal como se mide según el ensayo SRID (Wood y cols., 1977). Se llevó a cabo el ensayo para caracterizar el contenido de HA de los cultivos. Al mismo tiempo, se midió la cantidad total de proteínas utilizando un equipo de ensayo DC-proteína basado en Lowry (Biorad) siguiendo los procedimientos sugeridos por el fabricante. Se observó que HA constituye aproximadamente 20 a 30% del contenido en proteína total de la preparación de virus.
Ejemplo 11 Inmunogenicidad in vivo de vacunas inactivadas producidas en huevos y en PER.C6
Hurones y ratones representan dos modelos animales perfectamente establecidos para estudiar la infección de virus de la gripe y se han utilizado para determinar la eficacia e inmunogenicidad de vacunas de la gripe. Utilizando el sistema de ensayo de modelo de ratón, se compara la inmunogenicidad producida por vacunas trivalentes derivadas de PER.C6 y huevos que contienen A/Sidney/5/97, A/Beijing/262/95 y B/Harbin/7/94 analizando sueros de animales vacunados por ensayo de inhibición de hemaglutinación. Utilizando el modelo de infección de hurón, la inmunización va seguida de contaminación intencionada con A/Sidney/5/97. La recuperación de virus en células MDCK y el ensayo de inhibición de hemaglutinación realizado en los sueros se utilizan para comparar la inmuinogenicidad y eficacia de las dos vacunas.
Estudio in vivo en ratones
Se dividen noventa ratones Balb/C hembra en nueve grupos de diez ratones. El día 0, se recoge hasta 100 \mul de sangre. Se separa el suero y se almacena a -20ºC. A continuación, se vacuna a cada uno de los ratones con la vacuna apropiada con arreglo al esquema de la tabla I. El día 28, se extraen 100 \mul más de sangre. Se almacena el suero a -20ºC. Se vuelve a vacunar a cada uno de los ratones con arreglo al esquema de la tabla I. El día 42 se extrae una muestra de 100 \mul de sangre y se sacrifica a todos los ratones. Se separa el suero y se congela a -20ºC. Se llevan a cabo los ensayos de inhibición de hemaglutinación (HI) en las muestras de suero desde el día 0, 28, y 42. Se llevan a cabo todos estos ensayos en paralelo todos los días tanto para virus desarrollados en célula como huevo.
TABLA I Ensayo de inmunogenicidad en ratones
1
Estudio in vivo en hurones
Se dividieron dieciocho hurones hembra adultos (albino o polecat) en tres grupos de seis del siguiente modo: grupo 1 recibió una vacuna de ensayo derivada de huevo intramuscular (IM), se contaminó (challenging) a los animales con A/Sidney/5/97. El grupo 2 recibió la vacuna de ensayo derivada de PER.C6 IM, se contaminó intencionadamente a los animales con A/Sidney/5/97. El grupo 3 recibió diluyente de vacuna de ensayo solamente y fue contaminado intencionadamente con A/Sidney/5/97. En los días 0 y 28, se administraron las vacunas de ensayo. El día 56, se infectó a todos los hurones intranasalmente con 0,5 ml del virus de contaminación intencionada A/Sydney/5/97 a una TCID_{50} 10^{3}. Se llevaron a cabo lavados nasales y recuentos de células inflamatorias, se llevó un seguimiento de la temperatura y los pesos de los hurones una vez al día del día 57 al 63. Se sacrificó a los animales el día 63. Se separó el suero y se almacenó a -20ºC. Se almacenaron las muestras de lavado nasal sobre hielo y se llevó a cabo el recuento celular de recuperación de lavado nasal utilizando ensayo de exclusión con azul de tripano.
La valoración de los virus obtenida de las muestras de lavado nasal fue determinada midiendo la recuperación de virus en células MDCK. Se usó el cálculo de Spearman y Karber (1931) para calcular valores TCID_{50}. Se llevaron a cabo los análisis de inhibición de hemaglutinación sobre muestras de suero tomadas el día 0, 28, 56 y 63. Se concluyó a partir de este experimento que la vacuna de ensayo derivada de PER.C6 era eficaz.
Ejemplo 12 Caracterización de proteína HA derivada de virus de la gripe producido sobre PER.C6
Para estudiar la glucosilación de HA en células PER.C6, se generó un cultivo discontinuo de HA sin segmentar (HA0). Se infectaron células PER.C6 con virus A/Sidney/5/97 (pase número 5 sobre PER.C6) a unas moi de 1, 0,1 y 0,01 pfu/cell en medio ExCell 525 que contenía tripsina-EDTA a la concentración final de 5 \mug/ml. Al cabo de 1 hora de incubación a 35ºC, se lavaron las células dos veces con PBS para eliminar la tripsina y se incubaron O/N a 35ºC y 10% de CO_{2}, en ausencia de tripsina. Un día después, se recogieron las suspensiones celulares y se centrifugaron (500 g) y se lavaron los pelets celulares dos veces con medio. Se congelaron los sobrenadantes virales a -80ºC y se utilizaron sus muestras en los ensayos de mancha de western tal como se ha descrito para investigar la presencia o ausencia de proteína HA sin segmentar.
La proteína HA sin segmentar (HA0) consiste en dos subunidades: HA1 y HA2, que están conectadas a través de un enlace disulfuro. Dado que este enlace disulfuro se puede interrumpir por reducción con DTT, HA1 y HA2 pueden separarse y visualizarse en un gel de reducción después de las manchas de western utilizando antisueros que reconocen las subunidades. Si la proteína HA consiste solamente en HA0, será visible una banda que se desplaza más lentamente a través de un gel SDS/PAGE en comparación con la subunidad HAI y la subunidad HA2 de desplazamiento más rápido. Los resultados que se muestran en la figura 25 sugieren la presencia de HA0 sin segmentar principalmente a partir de infecciones de PER.C6 en comparación con el control positivo derivado de huevo que se obtuvo de NIBSC (RU). Para confirmar que la banda detectada era realmente hemaglutinina sin segmentar, se digirió una muestra de HA0 digerida con diferentes concentraciones de tripsina comprendidas entre 2,5 y 10 \mug/ml en medio O/N a 37ºC. A continuación, se cargaron las proteínas digeridas en condiciones de reducción sobre gel SDS/PAGE seguido de análisis de mancha de western utilizando los mismos antisueros que se han descrito para la figura 14. Tal como se muestra en la figura 26, se pudo conseguir la segmentación de HA0, lo que confirma la generación de proteína HA sin segmentar sobre PER.C6.
Ejemplo 13 Digestión de HA0 con N-glucosidasa F
La proteína HA del virus de la gripe es una glucoproteína que contiene de 3 a 9 sitios de oligosacárido de glucosilación unidos en N. El número de sitios depende de la cepa del virus. La localización de estos sitios se determina por la secuencia de nucleótido del gen HA, y dado que el genoma viral de virus de la gripe se replica por polimerizasa ARN tendente a error, las mutaciones que generan la adición o eliminación de sitios de glucosilación se produce a alta frecuencia. La composición y estructura de las cadenas de oligosacárido presentes en la HA se determina entonces por la disposición de enzimas de glucosilación de ordenamiento y biosintéticas provistas por la célula huésped. Dado que la glucosilación de HA desempeña un importante papel en la virulencia y eficacia de vacuna, se investigaron las propiedades HA producidas en células PER.C6 infectadas con virus de la gripe. Se llevó a cabo una digestión de proteína HA0 sin segmentar de A/Sidney/5/97 con la enzima N-glucosidasa utilizando los protocolos proporcionados por el fabricante para eliminar los siete oligosacáridos que se preveía estaban presentes en el polipéptido HA de A/Sidney/5/97. Se sometió a lisis el virus de la gripe A/Sidney/5/97 con 1% de Triton X-100 (Merck). Se añadió inhibidor de proteasa a una parte alícuota de este virus lisado que correspondía a 68 ng de HA, hasta una concentración final de 1 x(cóctel de inhibidor de proteasa completo Boehringer Mannheim). Se incubó esta mezcla en presencia de 100 mM de NaPO_{4} pH 7, 10 mM EDTA (J.T. Baker), 1% de SDS (J.T. Baker) y 1% de B-mercapto etanol (Merck). Se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se diluyó la muestra 5 veces en NaPO_{4} mM pH 7, 10 mM de EDTA (J.T. Baker), 0,625% NP-40 y 1% B-mercaptoetanol (Merck). De esto, se utilizaron 40 \mul para la digestión de glico-F. Para ello se añadieron 2 \mul 1U/\mul de gluco-F (N-glucosidasa F, Boehringer) y se incubó durante un período mínimo de 16 horas a 37ºC. A continuación, se añadieron 3 x tampón Laemli con 150 mM de DTT (Fluka) hasta una concentración final de 1x. Se hicieron correr las muestras sobre un gel SDS/PAGE al 7,5%. Se llevaron a cabo los ensayos SDS-PAGE y mancha de western del siguiente modo. Brevemente, se bloqueó la mancha durante 30 minutos a temperatura ambiente con solución de bloqueo (5% de leche en polvo sin grasa deshidratada, Biorad en TBST suplementado con 1% de suero de conejo (Rockland), seguido de tres lavados con TBST. A continuación, se incubó la mancha con el antisuero HA anti A/Sidney/5/97 (98/768 NIBSC) diluido 1/500 en 1% de BSA/TBST con 5% de suero de conejo (Rockland) durante toda la noche a temperatura ambiente. Se volvió a lavar la mancha 8 veces con TBST. Finalmente, se incubó la mancha con antisuero-HRP anti-oveja de conejo (Rockland) 1/6000 diluido en solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Al cabo de 8 lavados con TBST se visualizó el complejo conjugado con proteína con ECL (Amersham Pharmacia Biotech) y se expusieron películas (Hyperfilm, Amersham Life Science). Tal como se muestra en la figura 27, el tratamiento con enzima glucosidasa-F claramente redujo el tamaño de la proteína con aproximadamente 28-30 kD, siendo aproximadamente la pérdida predicha de aproximadamente 4 kD por oligosacárido. La banda de proteína representada con un asterisco (*) es la HA0 desglucosilada, que se desplaza de manera similar al producto de subunidad HA1 obtenido tras la segmentación de HA0 en las subunidades HA1 y HA2 (líneas de la derecha).
Ejemplo 14 Segmentación de HAO con Accutase
Se investigó la posibilidad de reemplazar la tripsina-EDTA derivada de mamífero por proteínas recombinantes o no de mamífero. Recientemente, se ha conseguido disponer de una mezcla de enzimas proteolíticas y colagenolíticas (Accutase^{TM}, PAA) de especies de invertebrados para cultivo celular de rutina. Dado su origen no mamífero, Accutase está libre de priones, parvovirus y otros componentes que pueden contaminar potencialmente las soluciones de tripsina-EDTA. No se ha podido obtener hasta la fecha ninguna información relacionada con el tipo de proteasas presentes en Accutase. Se estudió la sementación de HA0 utilizando análisis de mancha de western. Se digerió una cantidad constante de proteína HA0 obtenida por PER.C6 infectada con A/Sidney/5/97 a una moi de 1 pfu por célula sin tripsina con diluciones en serie de Accutase, O/N a 37ºC. Como control positivo se utilizó la misma cantidad de HA0 digerida con 100 ng de tripsina-EDTA. A continuación, se cargaron las proteínas digeridas en un gel SDS-PAGE al 10%, en condiciones de reducción, para análisis de mancha de western. Tal como se muestra en la figura 28 la digestión con tratamiento con 2 \mul de Accutase tuvo como resultado una segmentación completa de HA0; se observó una segmentación parcial utilizando 0,2 \mul.
Estos resultados sugieren que el tratamiento con Accutase durante la replicación y producción del virus de la gripe puede sustituir tripsina-EDTA durante las infecciones con virus de la gripe en PER.C6.
Ejemplo 15 Análisis con microscopio electrónico de virus de la gripe en células PER.C6
Se llevaron a cabo estudios con microscopio electrónico de transmisión en células PER.C6 que fueron infectadas con la cepa del virus de la gripe A/Sidney/5/97 así como en sobrenadantes que contenían virus y material purificado de sacarosa para determinar el fenotipo de este virus de la gripe producido en PER.C6. Todos los métodos que se utilizaron son muy conocidos entre las personas especializadas en este campo. En la figura 29 se muestra que las últimas etapas del ciclo vital del virus están representadas por yemación y liberación de viriones envueltos desde la membrana citoplasmática. Se detectaron las espículas que correspondían a las proteínas virales HA y NA, que ornamentaban la periferia de las partículas de virion. En la figura se muestran también las características de pleiomorfismo de virus de la gripe.
Ejemplo 16 Infección de PER.C6 con una gran variedad de cepas de virus de la gripe A y B
El uso de PER.C6 como tecnología de plataforma para la producción de vacuna de la gripe requiere PER.C6 para soportar el crecimiento de una amplia gama de cepas de diferentes subtipos de virus de la gripe.
Se infectaron cultivos en suspensión estáticos de células PER.C6 desarrollados en matraces T25 y/o en placas de 6 pocillos en medio ExCell 525, a una densidad celular de 10^{6} células/ml con 16 cepas diferentes de los virus de la gripe tal como se muestra en la figura 30A. Dichas células comprendían varias cepas H3N2, N1N1, tipo B y aviar. Se llevaron a cabo infecciones en presencia de 5 \mug/ml de tripsina. Se obtuvieron los virus de NIBSC (RU) como cepas de tipo silvestre de pase por huevo o cepas reasortantes. Se llevó a cabo la infección con una dilución de virus recomendada por NIBSC en las hojas de producto que se entregaron con las diferentes cepas. Todos los virus sometidos a ensayo fueron capaces de propagarse en PER.C6 tal como se visualizó por inmunofluorescencia (no se muestran los datos) y por la valoración de los fluidos sobrenadantes en ensayo en pfu (figura 30B).
Estos resultados muestran que incluso cepas del virus del la gripe (representado por un asterisco), como A/
Johannesburg/33/94, B/Beijing/184/93 y A/Pato/Singapur-Q/F119-3/97, que normalmente son difíciles de producir en huevos embrionados se pueden replicar y producir en las células PER.C6 humanas.
Ejemplo 17 Generación de virus Herpes Simplex tipo 1 (HSV-1), virus Herpes Simplex tipo 2 (HSV-2) y virus de la rubéola en PER.C6.
Se sometió a ensayo si otros virus distintos al virus de la gripe y Adenovirus, como virus herpex simplex tipo 1 y 2 y virus de la rubéola se podían replicar también en PER.C6. Las vacunas que se derivan de estos virus desarrollados en PER.C6 y que inducen efectos neutralizantes en seres humanos para la protección contra infecciones de tipo silvestre se generan a partir de cultivos discontinuos de virus desarrolladas en PER.C6. Las cepas que se obtuvieron de ATCC y se utilizaron para infección de células PER.C6 se representan en la tabla II.
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TABLA II Cepas de virus herpes simplex y rubéola que se obtuvieron de ATCC y que se utilizaron para la infección de células PER.C6
2
Para determinar si los virus HVS-1 y HSV-2 y de la rubéola obtenidos de ATCC podían replicarse y producirse en PER.C6, se sembraron células pase número 46 en cámaras de labtek, recubiertas con Poly-L-Lysina utilizando métodos conocidos entre las personas especializadas en la técnica, a 10^{5} células/pocillo. Se cultivaron células vero derivadas de mono (obtenidas de ATCC) a pase número 137 y se utilizaron como controles positivos y se sembraron a una densidad de 2,5 x 10^{4} células/pocillo. El día 0, cuando los pocillos con células PER.C6 fueron el 60% y células Vero, 80% confluyentes, se infectaron las células con diferentes mois (10^{-3}, 10^{-2}, 10^{-1} y 1 TCID_{50} por célula). A intervalos diarios tras la infección, se fijaron las células y se ensayaron por inmunofluorescencia utilizando anticuerpos monoclonales específicos de tipo conjugado con FITC utilizando un equipo (Imagen Herpes Simplex Virus (HSV) tipo 1 y 2, (Dako) y anticuerpos conjugados con FITC contra la proteína HA y de matriz de virus de la rubéola (equipo IFA paperas, Light diagnostics), seguido de los procedimientos sugeridos por el fabricante. Los antisueros se dirigen contra HSV-1 y 2 y antígenos de virus de la rubéola.
Los resultados que se resumen en la figura 31 demuestran que PER.C6 es permisivo para infecciones por HSV-1 (fig. 31D), HSV-2 (Fig.31E) y virus de la rubéola (Fig.31A). Por otra parte, la cinética sugirió que estos virus se replicaban en PER.C6 en una manera dependiente de la moi.
A continuación, se investigó si los virus HSV-1, -2 y de la rubéola podían propagarse en PER.C6. Para este fin, se infectaron células con una moi de 0,02, 0,1 y 1 TCID_{50}/célula para HSV-1 (figura 32.C) y HSV-2 (figura 32A) y una moi de 0,001 TCID_{50}/célula para virus de la rubéola (figura 32B) (pase número 1). Cuando tuvo lugar el cpe (efecto citopático) casi completó, se recogieron las células y los sobrenadantes, se congelaron rápidamente en N_{2} líquido, y se descongelaron. A continuación, se pasaron los sobrenadantes clarificados en ciego utilizando aproximadamente 100 \mul, a PER.C6 (es el pase número 2). Después de alcanzar un cpe casi completo de nuevo, se realizó un tercer pase (pase número 3) de manera similar. Las mois del pase número 2 y 3 fueron determinados en retrospectiva mediante ensayos TCID_{50}.
Los resultados de estos experimentos demuestran que el virus Herpes simplex tipo 1 y -2 y los virus de la rubéola se pueden replicar en PER.C6 y que la replicación y propagación puede tener lugar incluso cuando se utilizan mois tan bajos como 10^{-7}.
Ejemplo 18 Detección selectiva de rotavirus para replicación en PER.C6
Para determinar si PER.C6 podía también soportar la replicación de un rotavirus, se infectaron células PER.C6 con un rotavirus Rhesus (MMU 18006; ATCC#VR-954; cepa S: EE.UU. 79:2; lote# 2181153). Se cultivaron células PER.C6 (número de pase 41) a una densidad de 1 x 10^{5} por ml y se cultivaron células vero derivadas de mono (obtenidas de ATCC, pase número 139) a una densidad de 2,5 x 10^{4} por ml, y después se sembraron en cámaras labtek, que habían sido recubiertas previamente con poli-L-lisina utilizando los métodos conocidos entre los especialistas en este campo. Se infectaron las células con una moi de 1 TCID_{50}/célula de rotavirus Rhesus en presencia y ausencia de 2 \mug/ml de tripsina-EDTA. Al cabo de 90 minutos de infecciones, se lavaron las células con medio ExCell 525 y después se incubaron a 37ºC a 10% de CO_{2} en una atmósfera humidificada. Tras 5 días consecutivos de la infección, se recogieron las muestras de sobrenadantes, se clarificaron de células y residuos celulares por centrifugado a 2000 rpm y en una centrífuga de mesa y se analizaron en un ensayo ELISA específico para rotavirus (IDEIA Rotavirus, Dako). En la figura 33 se representan los resultados donde claramente se muestra que el rotavirus Rhesus se replica en PER.C6.
Leyendas para las figuras
Fig. 1. Porcentaje de células infectadas (células positivas) vistas por microscopio tras en el ensayo de inmunofluorescencia frente al porcentaje de células muertas medidas por FACS tras el manchado con yoduro de propidio, a mois de 10^{-3} y 10^{-4}. Una escasa viabilidad de las células de las muestras derivadas de infección a una moi de 10^{-3} no dio lugar a unos datos fiables.
Figura 2. Porcentaje de células infectadas vistas por microscopio después del ensayo de inmunofluorescencia. Las muestras derivadas de infección a una moi de 10 y 1, 48 horas después de la infección no se muestran debido a un efecto citopático (CPE) completo.
Figura 3. Cinética de propagación de virus medido en unidades de hemaglutinación (HAU) del día 1 al día 6 tras la infección.
Figura 4. Porcentaje de células infectadas (células positivas) vistas por el microscopio después del ensayo de inmunofluorescencia.
Figura 5. Cinética de propagación de virus medido en unidades de hemaglutinina (HAU) desde el día 1 al 6 después de la infección.
Figura 6. Porcentaje de células infectadas (células positivas) vistas por microscopio tras el ensayo de inmunofluorescencia.
Figura 7. Cinética de propagación de virus medido en unidades de hemaglutinación (HAU) desde el día 2 a 6 después de la infección.
Figura 8. Expresión de sitios de unión Sia2-3Gal y Sia2-6Gal en receptores de superficie de célula presentes en células de ovario de hámster chino (CHO), células PER.C6 y células MDCK. (A) Representación esquemática de la interacción de lecitina aglutinina de Sambuca nigra (SNA)que reconoce específicamente sitios de unión Sia2-6Gal y lecitina de aglutinina de Maakia amurensis (MAA) que reconoce específicamente sitios de unión Sia2-3Gal. La interacción esquemática con el anticuerpo anti-DIG etiquetado con FITC que reconoce la lecitina etiquetada con DIG unida a la cadena de oligosacárido en la proteína de superficie celular también está representa. (B) análisis FACS de células incubadas en lecitinas etiquetadas con DIG. Las lecitinas unidas a las células fueron detectadas con anticuerpo anti-DIG etiquetado con FITC utilizando procedimientos conocidos entre las personas especializadas en este campo. Se trazan en gráfico los recuentos del número de células frente a la intensidad de fluorescencia de células manchadas con lecitina (en gris) en comparación con células que fueron incubadas solamente con anticuerpo anti-DIG FITC (en blanco). Los paneles superiores muestran el desplazamiento en el análisis de FACS obtenido mediante el uso de lecitina SNA y los paneles inferiores muestran el desplazamiento del análisis de FACS obtenido mediante el uso de lecitina MAA.
Figura 9. Infección con A/Sidney/5/97 en PER.C6. (A) Efecto de la tripsina-EDTA en las valoraciones de HAU. (B) concentración de HA en \mug/ml y (C) valoraciones de infectividad de virus en pfu/ml según se midió en sobrenadantes virales en bruto, 96 horas después de la infección.
Fig. 10. Infección con B/Harbin/7/94 en PER.C6. (A) Efecto de diferentes concentraciones de tripsina-EDTA presentes durante y después e la infección con virus en la cinética de crecimiento. (3) valoraciones HAU por 50 \mul y (C) valoraciones de infectividad de virus en pfu/ml.
Fig. 11. Infección con X-127 utilizando una moi de 10^{-3} en PER.C6. (A) Efecto de tripsina-EDTA en HAU dado en HAU/50 \mul y (B) valoraciones de infectividad de virus en pfu/ml durante 5 días tras la infección.
Fig. 12. Infección con X-127 utilizando una moi de 10^{-4} en PER.C6. (A) Efecto de tripsina-EDTA sobre HAU dado en HAU/50 \mul y (B) valoraciones de infectividad de virus en pfu/ml durante 5 días tras la infección.
Fig. 13. Efecto de tripsina-EDTA en (A) viabilidad de células PER.C6 y (B) actividad biológica del virus. Se midió la viabilidad celular después de el manchado con azul de tripano. Se midieron las valoraciones HAU tal como se ha descrito y se dieron por 50 \mul.
Fig. 14. Efecto de tripsina-EDTA sobre las valoraciones de infectividad de virus y el contenido en proteína HA tras la infección con virus de la gripe de células PER.C6 con A/Sidney/5/97. (A) Se llevó a cabo el ensayo de infectividad inoculando, por cuadriplicado, en células MDCK un total de 100 \mul de sobrenadantes que contenían virus diluidos en serie 10 veces, en medio sin suero con tripsina-EDTA (4 \mug/ml). Al cabo de siete días, se ensayó el sobrenadante de estos cultivos para determinar la actividad HA. Se calcularon las valoraciones de virus infeccioso con arreglo al método de Spearman-Karber (1931). (B) Análisis de mancha de western de la proteína HA de A/Sidney/5/97. Se llevó a cabo la recogida de proteínas virales por interrupción y desnaturalización de proteínas utilizando un tampón de lisis que contenía SDS. Se llevó el ciclo electroforético en un gel SDS/PAGE al 10% en condiciones de reducción. Se sondearon las proteínas separadas con antisueros anti-A/Sidney-HA específicos. Se cargaron cantidades en aumento del antígeno HA A/Sidney de control positivo (4 bandas a la izquierda) y 10 \mul de sobrenadantes de células PER.C6 de las muestras incubadas en tripsina indicadas (5 bandas a la derecha).
Fig. 15. Viabilidad de células PER.C6, concentración de glucosa y cinética de crecimiento de A/Sidney/5/97 en un sistema de perfusión de fibra hueca.
Fig. 16. Caracterización y cuantificación de virus de la gripe A/Sidney/5/97 propagado en células PER.C6 en un sistema de perfusión de fibra hueca. Se realizaron manchas Western y SDS-PAGE tal como se ha descrito en la leyenda de la figura 14 para anticuerpo anti-A-/Sidney-HA de oveja. Se utilizó anticuerpo monoclonal anti HA-Tag (sonda HA (F7),monoclonal de ratón (Santa Cruz), en una dilución 1:1000. Como segundo anticuerpo, se utilizó un anticuerpo conjugado con HRP anti-ratón de cabra (Biorad) en una dilución 1:7500.
Fig. 17. Viabilidad de células PER.C6 (panel de la izquierda) y concentración de glucosa (panel de la derecha) en un biorreactor de 12 litros hasta 92 horas después de la infección viral utilizando virus A/Sidney/5/97.
Fig. 18. Infección de células PER.C6 con A/Sidney/5/97 en una suspensión celular de 10 litros en un biorreactor de 12 litros. La cinética de replicación de virus según se mide por ensayo de hemaglutinación se dan en porcentajes de células manchadas positivamente.
Fig. 19. Infección de células PER.C6 con A/Sidney/5/97 en una suspensión celular de 10 litros en un biorreactor de 12 litros. La cinética de replicación de virus, tal como se midió por ensayo de hemaglutinación se dan en HAUS durante varios días después de la infección viral. La barra representada con un asterisco en el número de HAUs obtenidas después de la clarificación por separación Powerfuge^{TM} se describen en el texto.
Fig. 20. Mancha de western después de una infección de PER.C6 con virus A/Sidney/5/97 en una suspensión celular de 10 litros en un biorreactor de 12 litros. Se muestra la caracterización y cuantificación del polipéptido HA de virus de la gripe A/Sidney/5/97. Se realizaron mancha de western y SDS/PAGE tal como se describe en la leyenda para la figura 14. Las diferentes subunidades (HA1 y HA2) y las proteínas HA0 no segmentadas se representan por puntas de flecha. La HA obtenida de NIBSC sirvió como control positivo.
Fig. 21. Determinación de HAUs y pfu/ml después de la infección de PER.C6 con A/Sidney/5/97 en una suspensión celular de 10 litros en un biorreactor de 2 litros. La infección fue seguida de tratamiento corriente abajo (DSP). La recuperación de rendimientos virales después de ultrafiltración de fibra hueca (concentración 20 veces) también se muestra.
Fig. 22. Infección de PER.C6 con A/Sidney/5/97 en una suspensión celular de 2 litros en un biorreactor de 3 litros. Se dan la viabilidad de células PER.C6 (izquierda superior), la concentración de glucosa (derecha superior) y cinética de crecimiento del virus en el porcentaje de células de manchado positivamente (izquierda inferior) y HAU (derecha inferior).
Fig. 23. Infección de PER.C6 con A/Beijing/262/95 en una suspensión celular de 2 litros en un biorreactor de 3 litros. Se dan la viabilidad de células PER.C6 (izquierda superior), la concentración de glucosa (derecha superior) y cinética de crecimiento del virus en el porcentaje de células manchadas positivamente (izquierda inferior) y HAU (derecha inferior).
Fig. 24. Infección de PER.C6 con B/Harbin/7/94 en una suspensión celular de 2 litros en un biorreactor de 3 litros. Se dan la viabilidad de células PER.C6 (izquierda superior), la concentración de glucosa (derecha superior) y la cinética de crecimiento del virus en el porcentaje de células de manchado positivamente (izquierda inferior) y HAUs (derecha inferior).
Fig. 25. Análisis de mancha de western de proteína HA0 de A/Sidney/5/97 sin segmentar. Se detectaron proteínas de manchado positivo después de la incubación con antisuero anti-A/Sidney específico obtenido de NIBSC y descrito en la leyenda de la figura 14 y en el texto.
Fig. 26. Análisis de mancha de western de A/Sidney/5/97 derivado de proteína HA0 digerida con tripsina. Se detectaron proteínas después de la incubación con los antisueros anti-A/Sidney específicos. En la izquierda A/Sidney HA segmentado normal, en la derecha HAO tratado con una cantidad en aumento de tripsina.
Fig. 27. Análisis de mancha de western de A/Sidney HA0 digerido con N-glucosidasa F. Se detectan proteínas tras la incubación con los antisueros anti-A/Sidney específicos. La banda de proteína representada con un asterisco es el producto de desglucosilado.
Fig. 28. Análisis de mancha de western de A/Sidney/5/97 tras la digestión con Accutase. Se detectan proteínas tras la incubación con los antisueros anti-A/Sidney-HA policlonales específicos. A la derecha, HA0 antes y después del tratamiento con tripsina, en la derecha HA0 digerido con una cantidad en disminución de Accutase.
Fig. 29. Micrografías electrónicas de virus de la gripe A/Sidney 5/97. (A). células PER.C6 72 horas después de la infección. (B y C) manchado negativo en virus derivado de PER.C6 infectado. (D y E) manchado negativo de material purificado con sacarosa.
Fig. 30. (A) todas las cepas A y B de virus de la gripe diferentes ensayadas en células PER.C6. (B)valoraciones de infectividad de tres virus de la gripe tipo A y B- representados derivados de células PER.C6 infectadas.
Fig. 31. Inmunofluorescencia de PER.C6 y células vero infectadas con virus distintos a virus de la gripe. (A) células de manchado positivamente tras la infección con virus de la rubéola. (B) células de manchado positivamente tras la infección de células Vero con virus HSV-1. (C) células de manchado positivamente tras la infección de células vero con virus HSV-2. (D) células de manchado positivamente tras la infección de células PER.C6 con virus HSV-1. (E) células de manchado positivamente tras la infección de células PER.C6 con virus HSV-2.
Fig. 32. Valoraciones de infectividad determinadas tras la propagación de virus de la rubéola (panel del centro), virus HSV-1 (panel de abajo) y HSV-2 (panel superior) en células PER.C6.
Fig. 33. Replicación de rotavirus tras la infección de PER.C6 (panel superior) y células vero (panel inferior) con diferentes mois medidos por ELISA en supernadantes en bruto.
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Referencias
Bachmayer H. Selective solubilisation of haemaglutinin and neuraminidase from Influenza virus. Interviorology 1975; 5:260-272.
Brands R. Palache AM, van Scharrenburg GJM. Madin Darby Canine Kidney (MDCK)-Cells for the production of inactivated influenza subunit vaccine. Safety Characteristics and clinical results in the elderly. In: Brown LE, Hampson EW, Webster RG, editors. Option for the control of Influenza III. Amsterdam Elsevier, 1996, P. 683-693.
Brands R, Palache AM, van Scharrenburg GJM. Development of Influenza subunit vaccine produced using mammalian cell culture technology. In Carrondo JMT, Griffths B. Moreira JLP, editors. Animal cell technology: from vaccines to genetic medicine. Dordrecht: Kuwer Academic Publishers, 1997: 165-167.
Gubareva LV, Wood JM, Meyer WJ, Katz JM, Robertson JS, Major D, Webster RG. Codominant mixtures of viruses in strains of Influenza virus due to host cell variation. Virol. 1994; 199: 89-97.
Govorkova EA, Matrosovich MN, Tuzikov AB, Bovin NV, Gerdil C, Fanget B, Webster RG. Selection of receptor-binding variants of human Influenza A and B viruses in baby hamster kidney cells. Virology 1999 15; 262(1):31-8
Herrero-Euribe L y cols. Replication of Influenza A and B viruses in human diploid cells. J. Gen. Virol. 1983; 64; 471-475.
Karber G. Beitrag zur kollektiven behandlung pharmakologischer reihenversuche. Exp. Pathol. Pharmakol. 1931; 162, 480-483.
Kodihalli S, Justewicz DM, Gubareva LV, Webster RG. Selection of a single amino acid substitution in the haemagglutinin molecule by chicken eggs can render Influenza A virus (H3) candidate vaccine ineffective. J. Virol. 1995; 69: 4888-4897.
Kirstner O. Muller K. Scholtissek C. Differential phosphorylatian of the nucleoproteín of Influenza A viruses. J. Gen. Virol. 1989; 70: 2421-2431.
Marsha A. y cols. Parmacotherapy 19 (11): 1270-1295, 1999: Rotavirus disease and its prevention in infants and children.
Murphy BR and Webster R.G. Orthomyxoviruses, In: Fields Virology, capítulo 46, 1397. Eds. B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howley, y cols., Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, 1996.
Newman RW. Jenning R. Major DL, Robertson JS, Jenkins R, Potter CW, Burnett I, Jewes L, Anders M, Jackson D, Oxford JS. Inmune response of human volunteers as animals to vaccination with egg grown Influenza A (H1N1) virus is influenced by three amino acid substitutions in the haemagglutinin molecule. Vaccine 1993; 11:400-406.
Palache AM, Brands R, van Scharrenburg GJM. Immunogenicity and reactogenecity of Influenza subunit vaccines produced in MDCK cells or fertilizad chicken eggs, J. Infect. Dis. 1977; 176:S20-S23.
Robertson JS, Cook P, Nicolson C. Newman R. Wood JM. Mixed populations in Influenza vaccine strains. Vaccine 1994; 12:1317-1320.
Robertson JS, Bootman JS, Nicolson C, Mjor D, Robertson EW, Wood JM. The haemagglutinin of Influenza B virus present in clinical material is a single species identical to that of mammalian cell grown-virus. Virol. 1990; 179:35-40.
Robertson JS, Bootman JS, Newman R, Oxford JS, Daniels RS, Webster RG, Schild GC. Structural changes in the haemagglutinin which acompany egg adaptation of an Influenza A (H1N1) virus. Virol. 1987; 160:31-37.
Schild GC, Oxford JS, de Jong JC, Webster RG: Evidence for host-cell selection of Influenza virus antigenic variants. Nature 1983; 303: 706-709.
Schulman JL, Palese P. Virulence factors of Influenza A viruses: WSN virus neuraminidase required for plaque production in MDBK cells. J. Virol. 1977; 24:170-176.
Sugiara A, Ueda M. Neurovirulence of Influenza virus in mice. I. Neurovirulence of recombinants between virulent and avirulent virus strains. Virol 1980; 101:440-449, 495, 271).
Tobita K, Sugiura A, Enomoto C, Furuyama M. Plaque assay and primary isolation of Influenza A viruses in an established line of canine Kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin. Med. Microbiol. Immunol. 1975; 162: 9-14.
Williams SP, Robertson JS. Analysis of restriction to the growth of non-egg-adapted human Influenza in eggs. Virol. 1993; 196:660665.
Wood JM, Schild GC, Newman RW, Seagroatt V. Application of and improved single-radial-immunodiffusion technique for the assay of haemagglutinin antigen content of whole virus and subunit Influenza vaccines. Dev. Biol. Stand. 1977 1-3; 39:193-20.

Claims (30)

1. Un método para producir un virus y/o proteínas virales distintas a adenovirus o proteínas adenovirales para su uso como vacuna, que consiste en proporcionar a una célula que ha sido provista con al menos una secuencia que codifica al menos un producto genético del gen E1 o un derivado funcional del mismo de un adenovirus, con un ácido nucleico que codifica dicho virus, cultivar dicha célula en un medio adecuado y dar paso a la expresión de dicho virus y recoger dicho virus y/o proteínas virales desde dicho medio y/o dicha célula, inmortalizándose dicha célula con el fin de desarrollarla en cultivo y donde dicha célula humana se deriva de un retinoblasto embrionario
humano.
2. Un método según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia que codifica al menos un producto genético del gen E1 está presente en el genoma de dicha célula humana.
3. Un método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha célula no produce proteínas estructurales adenovirales.
4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha célula comprende además una secuencia que codifica E2A o un derivado funcional o análogo o fragmento del mismo.
5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que dicha secuencia que codifica E2A o un derivado funcional o análogo o fragmento del mismo está presente en el genoma de dicha célula humana.
6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, en el que dicha secuencia que codifica E2E codifica un mutante E2A sensible a la temperatura.
7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, según el cual dicha célula humana no comprende ninguna otra secuencia adenoviral.
8. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que dicha célula humana puede desarrollarse en suspensión.
9. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que dicha célula se cultiva en ausencia de suero.
10. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha célula humana es una célula depositada bajo el número ECACC 96022940 o un derivado del mismo.
11. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho virus comprende una proteína que experimenta modificaciones post-traduccionales y/o peritraduccionales.
12. Un método según la reivindicación 11, en el que dichas modificaciones comprenden glucosilación.
13. Un método según las reivindicaciones 11 ó 12, en el que dichas proteínas virales comprenden al menos una entre neuraminidasa y/o una hemaglutinina de virus de la gripe.
14. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en el que dicho virus es un enterovirus, como por ejemplo rhinovirus, aftovirus, o virus de la poliomelitis.
15. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho virus es un herpesvirus como por ejemplo virus del herpes simplex, virus de la pseudorrabia o virus de herpes bovino.
16. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho virus es un orthomyxovirus, como por ejemplo virus de la gripe, un paramyxovirus, como por ejemplo virus de enfermedad de newcastle, virus sinctio respiratorio, virus de las paperas y virus la rubéola.
17. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en el que dicho virus es un retrovirus, como por ejemplo un virus de inmunodeficiencia humana o en el que dicho virus es un parvovirus o un papovirus.
18. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho virus es un rotavirus o un coronavirus, como por ejemplo un virus de la gastroenteritis de transmisión o un flavivirus, como por ejemplo virus de encefalitis por picadura de garrapata o virus de la fiebre amarilla.
19. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en el que dicho virus es un togavirus, como por ejemplo virus de la ruebeola o virus de encefalomielitis equina del Este, del Oeste o de Venezuela.
20. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho virus es un virus causante de hepatitis, como virus de hepatitis A o hepatitis B.
21. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho virus es un pestivirus, como por ejemplo virus de la peste porcina o un rhabdovirus, como virus de la rabia.
22. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho virus es un virus Bunyaviridae, como Hantavirus.
23. Uso de una célula humana inmortailizada que tiene una secuencia que codifica al menos una proteína E1 de un adenovirus o un derivado funcional, homólogo o fragmento del mismo en su genoma, no produciendo dicha célula proteínas adenovirales estructurales para la producción de un virus no adenoviral para su uso en una vacuna, donde dicha célula humana se deriva de un retinoblasto embrionario humano.
24.Uso según la reivindicación 23 en el que dicha célula humana es una célula tal como está depositada bajo el Nº ECACC 96022940 o un derivado del mismo.
25. Uso según la reivindicación 23 - 24, en el que dicha célula humana comprende además una secuencia que codifica E2A o un derivado funcional o análogo o fragmento del mismo en su genoma.
26. Uso según la reivindicación 25 en el que dicha E2A es sensible a la temperatura.
27. Una célula humana que tiene una secuencia que codifica al menos una proteína E1 de un adenovirus o un derivado funcional, homólogo o fragmento del mismo en su genoma, no produciendo dicha célula proteínas adenovirales estructurales y teniendo un ácido nucleico que codifica un virus no adenoviral, donde dicha célula humana se deriva de un retinoblasto embrionario humano.
28. Una célula humana según la reivindicación 27 que se deriva de una célula tal como se deposita bajo el Nº ECACC 96022940.
29. Una célula humana según la reivindicación 27-28 que comprende además una secuencia que codifica E2A o un derivado o análogo o fragmento funcional del mismo en su genoma.
30. Una célula humana según la reivindicación 29, en la que dicha E2A es sensible a la temperatura.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE278794T1 (de) 1995-06-15 2004-10-15 Crucell Holland Bv Verpackungssysteme für humane, menschliche adenoviren, zur verwendung in die gentherapie
US6855544B1 (en) 1999-04-15 2005-02-15 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell
US7297680B2 (en) 1999-04-15 2007-11-20 Crucell Holland B.V. Compositions of erythropoietin isoforms comprising Lewis-X structures and high sialic acid content
US8236561B2 (en) 1999-04-15 2012-08-07 Crucell Holland B.V. Efficient production of IgA in recombinant mammalian cells
WO2003048197A1 (en) * 2001-12-07 2003-06-12 Crucell Holland B.V. Production and of viruses, viral isolates and vaccines
US7604960B2 (en) 1999-04-15 2009-10-20 Crucell Holland B.V. Transient protein expression methods
US7521220B2 (en) * 1999-11-26 2009-04-21 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
US7527961B2 (en) 1999-11-26 2009-05-05 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
US7425437B2 (en) 1999-11-26 2008-09-16 Crucell Holland B.V. Vaccines against West Nile Virus
US7192759B1 (en) 1999-11-26 2007-03-20 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
US8715922B2 (en) 2001-01-19 2014-05-06 ViroNovative Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
PL213926B1 (pl) 2001-01-19 2013-05-31 Vironovative Bv Wyizolowany ssaczy metapneumowirus o ujemnej pojedynczej nici RNA (MPV), kompozycja immunogenna, wyizolowane kwasy nukleinowe, sposoby wykrywania ssaczego metapneumowirusa, wektor, komórka gospodarza, wyizolowane bialko, przeciwcialo, sposób wirologicznego diagnozowania infekcji MPV, sposób serologicznego diagnozowania infekcji MPV, kompozycja farmaceutyczna, zestaw diagnostyczny oraz zastosowanie kompozycji farmaceutycznej
EP1256803A1 (en) 2001-05-07 2002-11-13 Crucell Holland B.V. Methods for the identification of antiviral compounds
EP1465987B1 (en) 2001-12-07 2008-01-23 Crucell Holland B.V. Production of viruses, viral isolates and vaccines
SI1456238T1 (sl) 2001-12-17 2008-08-31 Crucell Holland Bv Proizvodnja f(ab)2 fragmentov v sesalskih celicah
CN101098958A (zh) 2002-02-21 2008-01-02 免疫医疗疫苗公司 间质肺病毒株及其在疫苗制剂中以及用作抗原性序列表达载体的用途
KR101006594B1 (ko) 2002-04-25 2011-01-07 크루셀 홀란드 비.브이. 안정한 아데노바이러스 벡터 및 그 증식 방법
ATE453708T1 (de) * 2002-11-08 2010-01-15 Crucell Holland Bv Impfstoff gegen west nile virus
AU2003299244A1 (en) * 2002-12-20 2004-07-14 Crucell Holland B.V. Recombinant virus production for the manufacturing of vaccines
KR101187955B1 (ko) * 2003-04-25 2012-10-08 비로노바티브 비브이 메타뉴모바이러스 유래 이종 항원을 포함하는 재조합파라인플루엔자 바이러스 발현 시스템 및 백신
BRPI0409895B8 (pt) 2003-05-09 2021-05-25 Crucell Holland Bv método de cultura de células derivadas de células per.c6 capazes de crescer em suspensão para aumentar o rendimento de produto das referidas células
DK1670925T3 (da) 2003-10-02 2013-07-08 Crucell Holland Bv Pakningsceller til rekombinat adenovirus
EP1718738A2 (en) 2004-02-23 2006-11-08 Crucell Holland B.V. Virus purification methods
AU2005229359C1 (en) * 2004-03-05 2011-07-28 Patheon Holdings I B.V. Process for cell culturing by continuous perfusion and alternating tangential flow
US20080254065A1 (en) 2004-03-09 2008-10-16 Chiron Corporation Influenza Virus Vaccines
EP2848692B1 (en) 2004-05-21 2017-08-16 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Alphavirus vectors for influenza virus vaccines
PL2179744T3 (pl) 2004-09-09 2011-09-30 Novartis Ag Zmniejszanie potencjału zagrożeń działaniami jatrogennymi związanymi ze szczepionkami przeciwko grypie
JP2006090864A (ja) * 2004-09-24 2006-04-06 Denka Seiken Co Ltd ワクチン中の特定成分の含量を求める方法
CN101128598B (zh) 2004-12-08 2013-04-24 米迪缪尼有限公司 生产流感疫苗组合物的方法
AU2005318171B2 (en) 2004-12-20 2011-09-29 Crucell Holland B.V. Binding molecules capable of neutralizing West Nile virus and uses thereof
DK1869171T4 (en) 2005-04-11 2016-01-18 Crucell Holland Bv Virus cleaning using ultrafiltration
AU2006245734C1 (en) 2005-05-12 2012-05-24 Crucell Holland B.V. Host cell specific binding molecules capable of neutralizing viruses and uses thereof
CA2616221C (en) 2005-07-22 2011-07-05 Crucell Holland B.V. Cell line for producing coronaviruses
WO2007052163A2 (en) 2005-11-01 2007-05-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co Kg Cell-derived viral vaccines with low levels of residual cell dna by beta-propiolactone treatment
ES2579957T3 (es) 2006-07-14 2016-08-17 Dpx Holdings B.V. Procedimiento mejorado para el cultivo de células
ES2618490T3 (es) * 2007-07-03 2017-06-21 Transgene Sa Estirpes celulares aviares inmortalizadas
ES2450998T3 (es) * 2007-12-13 2014-03-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Nuevas variantes de proteína de cubierta E1 de rubéola y su utilización en la detección de anticuerpos anti-rubéola
EP2889042A3 (en) * 2008-03-18 2015-10-14 Novartis AG Improvements in preparation of influenza virus vaccine antigens
US8163523B2 (en) 2008-06-11 2012-04-24 Flugen, Inc. Cell-based systems for producing influenza vaccines
JP5684122B2 (ja) * 2008-07-15 2015-03-11 クルセル ホランド ベー ヴェー Ｐｅｒ．ｃ６細胞の培養およびそれからの生成物の生産のための拡張可能なプロセス
EP2168987A1 (en) * 2008-09-22 2010-03-31 Mucosis B.V. Multifunctional linker protein containing an antibody against hemagglutinin, a conserved influenza antigen and an immunostimulating carrier binding domain
WO2010046335A1 (en) * 2008-10-21 2010-04-29 Crucell Holland B.V. Production of influenza virus by reverse genetics in per.c6 cells under serum free conditions
US20110217330A1 (en) 2008-11-05 2011-09-08 Bruno Rene Andre Novel method
EA020563B1 (ru) 2009-07-16 2014-12-30 Круселл Холланд Б.В. Получение полиовируса с высокими титрами для получения вакцины
WO2011139717A1 (en) 2010-04-26 2011-11-10 Novartis Ag Improved production of virus replicon particles in packaging cells
US20140030292A1 (en) 2010-10-11 2014-01-30 Novartis Ag Antigen delivery platforms
US10342862B2 (en) 2011-01-26 2019-07-09 Glaxosmithkline Biologicals, Sa RSV immunization regimen
RU2014118727A (ru) 2011-10-11 2015-11-20 Новартис Аг Рекомбинантные самореплицирующиеся полицистронные молекулы рнк
WO2013054199A2 (en) 2011-10-12 2013-04-18 Novartis Ag Cmv antigens and uses thereof
CN102526720B (zh) * 2012-01-11 2013-12-11 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种流感病毒疫苗的制备方法
CN104159608A (zh) 2012-03-06 2014-11-19 克鲁塞尔荷兰公司 针对流感的改善的疫苗接种
CN102631673A (zh) * 2012-04-17 2012-08-15 金宇保灵生物药品有限公司 口蹄疫疫苗浓缩纯化方法
JP6742902B2 (ja) 2013-03-15 2020-08-19 ジェンザイム・コーポレーション 高密度細胞バンキングの方法
EP3193594B1 (en) 2014-09-18 2021-07-07 Genzyme Corporation Ultra-high density cell banking methods
AU2015252119A1 (en) 2014-11-07 2016-05-26 Takeda Vaccines, Inc. Hand, foot, and mouth vaccines and methods of manufacture and use thereof
MA40920A (fr) 2014-11-07 2017-09-12 Takeda Vaccines Inc Vaccins de la main, du pied et de la bouche, et procédés de fabrication et d'utilisation de ceux-ci
MX2017007965A (es) 2014-12-17 2018-01-18 Fundacion Para La Investig Medica Aplicada Construcciones de acido nucleico y vectores de terapia de genes para uso en el tratamiento de enfermedad de wilson.
DK3233129T3 (da) 2014-12-17 2020-04-06 Fundacion Para La Investig Medica Aplicada Nukleinsyrekonstrukter og genterapivektorer til anvendelse i behandlingen af wilsons sygdom og andre lidelser
KR20230132628A (ko) * 2015-07-07 2023-09-15 세퀴러스 유케이 리미티드 인플루엔자 효능 검정
ES2642723B1 (es) 2016-05-12 2018-10-22 Servizo Galego De Saúde (Sergas) Uso de los niveles de anticuerpos anti-CD26 como biomarcadores de enfermedades autoinmunes y/o inflamatorias.
EP3703741A1 (en) 2017-11-03 2020-09-09 Takeda Vaccines, Inc. Zika vaccines and immunogenic compositions, and methods of using the same
KR20200015323A (ko) 2018-08-03 2020-02-12 에릭스바이오(주) 바이러스 치료 장치 또는 백신 제조 장치
CA3116098A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 Vivet Therapeutics Codon-optimized transgene for the treatment of progressive familiar intrahepatic cholestasis type 3 (pfic3)
US20210369870A1 (en) 2018-11-16 2021-12-02 Encoded Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating wilson's disease
AU2020269164B2 (en) 2019-05-08 2024-04-04 Takeda Vaccines, Inc. Inactivated virus compositions and Zika vaccine formulations
TW202214864A (zh) 2020-08-06 2022-04-16 應用醫學研究基金會 用於藉基因療法治療諸如阿茲海默症之Ｔａｕ蛋白病變的病毒顆粒
US20230265456A1 (en) 2020-08-10 2023-08-24 Fundacion Para La Investigacion Medica Aplicada Gene therapy vector expressing cyp27a1 for the treatment of cerebrotendinous xanthomatosis
AU2021358413A1 (en) 2020-10-09 2023-05-25 UCB Biopharma SRL Nucleic acid constructs, viral vectors and viral particles
AU2022378524A1 (en) 2021-10-28 2024-05-02 UCB Biopharma SRL Nucleic acid constructs, viral vectors and viral particles
WO2023154043A1 (en) 2022-02-09 2023-08-17 Takeda Vaccines, Inc. Zika vaccines and immunogenic compositions, and methods of using the same
WO2024059507A1 (en) 2022-09-12 2024-03-21 Akero Therapeutics, Inc. Fgf21 mutant polypeptides

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3547779A (en) * 1968-12-18 1970-12-15 Merck & Co Inc Process for producing purified concentrated influenza virus
US5192539A (en) * 1988-07-21 1993-03-09 Akzo N.V. Infectious bursal disease virus production in continuous cell lines
FR2723740B1 (fr) * 1994-08-16 1996-11-08 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de preparation d'antigenes du virus grippal, antigenes obtenus et leurs applications
US5989805A (en) * 1995-10-27 1999-11-23 Board Of Trustees Operating Michigan State University Immortal avian cell line to grow avian and animal viruses to produce vaccines

Also Published As

Publication number Publication date
JP4331432B2 (ja) 2009-09-16
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NZ527942A (en) 2004-07-30

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