KR100683374B1 - 백신의 제조 - Google Patents

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Abstract

포유류 바이러스의 생산을 위한 위한 신규 수단 및 방법이 제공되며, 상기 방법은 불멸화된 인간세포의 배양을 바이러스로 감염시키고, 바이러스의 성장을 허용하는 조건하에서 바이러스를 증식시키고, 바이러스 함유 배지을 형성하기 위해 바이러스로 감염된 배지를 배양시키고, 바이러스 함유 배지을 제거하는 것으로 이루어진다. 바이러스들이 수확되고 백신제조를 위해 사용될 수 있다. 장점-본 발명의 인간세포는 무혈청 조건에서 배양될 수 있고, 상기 세포는 바이러스 증식에 향상된 능력을 나타낸다. 특히, 배양된 인간 세포에서 인플루엔자 바이러스와 그것으로부터 유도된 백신을 생성하는 방법을 제공한다. 본 방법은 배양된 배지을 연속 또는 배치식으로 제거하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 고적정농도로 바이러스의 대량 연속 생성을 허용한다.

Description

백신의 제조{PRODUCTION OF VACCINES}
본 발명은 백신의 개발 및 제조에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 바이러스성 단백질 및/또는 바이러스 생산 분야에 관한 것이며, 더욱 특별히는 성숙핵, 바람직하기는 포유류 및 특히 인간 세포에서 성장하는 바이러스를 생산하기 위한 포유류 세포, 바람직하기는 인간세포의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 척추동물, 특히 포유동물과, 특별히는 인간에서의 바이러스 병원체로부터의 방어를 돕는 백신의 생산에 특히 유용하다. 본 명세서에는 (인간)세포에서 바이러스 및/또는 바이러스 단백질을 생산하고, 바람직하기는 한정된 합성 배지을 이용하며, 및 세포 및/또는 배양 배지로부터 바이러스 및/또는 그것의 성분을 정제하는 수단 및 방법들이 기재되어 있다. 바이러스 또는 그것의 성분을 함유하는 제약학적 조성물 및 그것의 제조 및 복구 및/또는 정제 방법이 제공된다.
접종은 바이러스성 감염을 다루는 가장 중요한 경로이다. 비록 많은 항바이러스성 약제가 이용가능하지만, 통상적으로 이들 약제들은 제한된 효능을 갖는다. 일단 개체가 감염되면 바이러스에 대한 항체의 투여가 바이러스성 감염을 다루는 양호한 방법일 수 있고, 통상적으로 인간 또는 인간화된 항체는 다수의 바이러스 감염을 다룰 수 있지만, 바이러스성 감염을 다루는 가장 효과적이고 안정한 방법은 활성 면역을 통한 예방이며 아마도 그럴 것이다. 활성 면역은 일반적으로 접종이라 불리우며 백신은 통상적으로 하나의 바이러스의 적어도 하나의 항원 결정인자, 바람직하기는 적어도 하나의 바이러스 또는 기타 병원체의 다수의 다른 항원 결정인자들로 이루어지며, 예를 들면, 바이러스(서브유니트 백신)로부터 유도된 적어도 하나의 (바이러스성) 폴리펩티드 또는 단백질에 백신을 병합한다. 통상적으로 지금까지 언급한 포멧들은 면역 반응을 강화하기 위해 보조약을 포함한다. 또한, 전체 바이러스(병원체)를 기초로한 백신, 예를 들면 불활성 백신이 가능하다. 또 다른 가능성은 살아있는, 그러나 약독형(attenuated form) 병원성 바이러스를 사용하는 것이다. 또 다른 가능성은 예를 들면, 성인 개체는 감염의 위험이 없지만, 유아는 모성항체 등에 의해 감염되거나 또는 감염될 수 있는 있는 경우에, 야생형 바이러스를 사용하는 것이다. 백신의 생산이 언제나 쉬운 공정은 아니다. 몇몇 경우에, 바이러스 재료는 알에서 생산되며, 이것은 재료의 정제 및 오염등에 대한 광범위한 안정성 측정을 어렵게 한다. 또한, 항상은 아니지만, 가끔 알을 대체하는 박테리아 또는 효모에서의 생산은 여러 정제 및 안정화 단계를 요구한다. 포유류 세포에서의 생산은 대체적일 수 있으나 지금까지 이용된 포유류 세포들 모두는, 예를 들면 혈청의 존재 및/또는 성장을 위한 고형 지지체에 접착을 필요로 한다. 첫번째 경우에는, 정제 및 안정성 및 예를 들면 몇몇 바이러스의 복제를 지지하기 위한 프로테아제의 요건이 중요해진다. 두번째 경우에는, 높은 수득률과 용이한 생산이 추가로 중요해진다. 본 발명은 선행 기술의 시스템의 백신용 바이러스 및/또는 바이러스성 단백질의 생산을 위한 생산 시스템과 관련된 많은 문제점들을 극복한다.
본 발명은 상기 바이러스를 생산하기 위한, 바이러스를 증식 및 수확할 수 있는 신규의 인간 불멸화 세포계를 기재한다. PER.C6세포(WO97/00326)은, 인간 포스포글리세레이트 키나제(PGK)프로모터의 조절하에 Ad 혈청형 5(Ad5) E1A-와 E1B-코드화 서열(Ad5 뉴클레오티드 459-3510)을 함유하는 플라즈미드를 이용하여, 1차 인간 배아 망막 세포의 트란스펙션에 의해 발생되었다.
다음의 특성들은 PER.C6 또는 유도체를 특히 바이러스 생산을 위한 숙주로서 유용하게 만든다: 이것은 완전히 특징된 인간 세포계이며, 이것은 GLP에 따라 개발되었고, 어느 인간 또는 동물 혈청 단백질이 없는, 한정된 무혈청 배지에서 현탁 배양으로 성장할 수 있으며; 그의 성장은 롤러병, 쉐이커 플라스크, 스피너 플라스크와 생물반응기에서 35 h에 두배로 일어날 수 있다.
인플루엔자 역학(疫學)
오르소믹소바이러스과의 일부인 인플루엔자 바이러스들은 급성 호흡 질환의 연례 유행의 원인 제제이다. 미국에서만 해마다 5천만명이 독감에 걸린다. 세계적으로 추정되는 사망자 수는 (1972~1992) 60,000명이다(CDC 통계). 인플루엔자의 발생이 세계적으로 유행했던 3번의 중요한 경우가 있었는데, 1918년(스페인 독감, 4천만명 사망 추정), 1957년 (아시아 독감 백만명 사망 추정), 및 1968년(홍콩 독감, 700,00 사망 추정)이다. 인플루엔자 바이러스에 관한 감염은 광범위한 병의 증세와 합병증을 수반하며, 그 결과 전세계적으로 특히 노인과 만성질환자들의 상당한 사망률과 치사율을 낳는다. 인플루엔자에 대한 접종은 이 감염과 관련된 치명적 합병증을 예방하는데 가장 효과적이다(Murphy, B.R and R.G. Webster, 1996). 이배체 인간 세포계 MRC-5에서의 인플루엔자 바이러스의 생산이 보고되어 있다(Herrero-Euribe L et al 1983). 그러나, 인플루엔자 바이러스의 적정농도는 매우 낮다.
인플루엔자 바이러스 균주
현재 독감 백신은 정제된 적혈구응집소와 인플루엔자 바이러스 A와 B의 뉴라미니다제(neuraminidase)를 함유한다. 역학적으로 중요한 균주를 대표하는 3 바이러스들은 인플루엔자 A(H1N1), 인플루엔자 A(H3N2)와 인플루엔자 B이다. A와 B 타입의 분리는 그것의 핵단백질(NP)과 매트릭스(M) 단백질 항원간의 항원성 차이를 기준으로 한다. 인플루엔자 A 바이러스는 추가로 헤마글루티닌(H1~ H15)과 뉴라미니다제(N1 ~ N9) 분자들의 항원 조성(서열)을 기준으로 아형으로 재분리된다. 이들 각각의 아형들의 대표자는 수생조류로부터 분리되며, 이것은 아마 조류 및 포유류 종에 대한 모든 인플루엔자 바이러스의 최초 저장기이다. 전파는 돼지와 인간사이에 나타났으며, 최근(H5N1) 조류와 인간사이에 나타났다.
인플루엔자 백신
현재, 3가지 타입의 불활성화된 인플루엔자 백신이 세계적으로 사용된다: 전체 바이러스, 분할 생성물과 표면 항원 또는 서브유니트 백신. 이들 백신들 모두는 다가올 시기에 인간 개체군에 유행될 것으로 예상되는 인플루엔자 바이러스 균주들의 표면 당단백질, 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다제(NA)를 포함한다. 백신에 병합되는 이들 균주들은 부화계란에서 성장되며, 바이러스성 입자들은 그 후 추가 처리되기 전에 정제된다. 인플루엔자 백신을 해마다 조정해야 하는 필요는 "항원 변동 (antigenic drift)" 또는 "항원 이동 (antigenic shift)"으로 알려진 과정에 의한 항원 변이체 때문이다.
"항원 변동"은 아미노산의 치환을 일으키는 바이러스의 H 또는 N 단백질에서의 일련의 점(point) 돌연변이의 축적에 의해 일어난다. 이들 치환은 이전 감염으로 유도된 중화항체의 결합을 막고, 새로운 변이체이 숙주를 감염시킨다.
"항원 이동"은 동물과 인간 인플루엔자 A 바이러스 사이의 유전적 재분류 (reassortment)에 의한 새로운 아형의 출현이다. 1957년(H2N2)과 1968년(H3N2)의 전세계적으로 유행한 균주들은 재분류된 바이러스들의 예이며, 재분류에 의해 조류 H 및/또는 N 유전자가 인간 바이러스의 순환에 도입되었고, 이후 인간 개체군에 전파되었다.
백개 이상의 세계적인 내셔널 인플루엔자 센터에 의한 역학적 조사를 기초로, 세계 보건기구(WHO)는 해마다 북반구에 대해서는 2월에, 남반구에 대해서는 9월에 인플루엔자 백신의 조성물을 제안한다. 이런 관행은 백신 제조 및 표준화에 대한 시간창을 최대 9개월로 제한한다. 많은 백신 투여량이 긴급히 요구되는 경우, 예를 들면, 인플루엔자 A 바이러스의 새로운 아종이 항원 변동 또는 항원 이동에 의해 발생되는 경우, 알의 한정된 이용가능성은 백신의 신속한 생산을 방해할 수 있다. 추가로 상기 생산 시스템의 단점은 융통성 부족, 독소 존재의 부족 및 후천성 바이러스, 특히 레트로바이러스의 부족이며, 불임증에 관한 염려이다. 이것은 현재의 부화계란에서의 인플루엔자 백신 생산 실시에 일련의 문제점을 제공한다.
그러므로, 인플루엔자 백신 생산을 위한 세포배양 시스템의 이용은 매력적인 대안이다. 인플루엔자 바이러스는 원숭이 신장, 송아지 신장, 햄스터 신장 및 닭 신장을 포함하여 여러가지 1차 세포에서 성장할 수 있다. 이들을 백신제조에 사용하는 것은, 백신 각각의 제조를 위해 이들 1차 세포들로부터 배양을 재-수립시켜야하는 필요성 때문에 아직 실용적이지 않다. 그러므로, 인플루엔자 백신 생산에 연속 불멸화된 세포계의 사용은 매력적인 대안이다.
배양 시스템의 이용은, 인플루엔자 바이러스 감염성에 HA의 2 서브유니트(HA1 및 HA2)에서 HA의 단백질분해성 절단이 요구되며, 이것은 트립신 첨가에 의해 얻어질 수 있다는 것을 인식함으로써 촉진되었다. 트립신의 함유는 Madin-Darb canine kidney(MDCK) 세포(Tobita et al 1975)에서 복제 및 플라그 (plaque) 형성을 허용한다.
최근, MDCK 세포계가 백신제조에 대해 인플루엔자 바이러스의 성장을 지지한다는 것이 알려졌다(Brand et al 1996 및 1997, Palache et al 1997). 트립신의 이용은 무혈청 조직 배양배지(MDCK-SF-1)에서 MDCK 세포의 성장을 요구한다. 그러나, MDCK 세포는 최근 인플루엔자 바이러스의 생산용 기질로 승인되지 않았다.
중요하게는, 인플루엔자 백신의 생산을 위한 어느 비-인간 시스템은 '적응(adaptation)'으로 알려진 고유의 장애를 갖는다. 인간 인플루엔자 A와 B 바이러스 모두는 부화계란에서의 적응에 기인하는 HA에서의 돌연변이를 겪는다. 이들 돌연변이로 항원성이 변화된다(Newman et al 1993, Williams and Robertson 1993, Robertson et al 1994, Gubareva et al 1994, Schild et al 1993, Robertson et al 1987, Kodihalli et al 1995). 인간에게 알-적응 돌연변이를 겪은 HA를 함유하는 백신으로 면역화하는 것은 비-계란 적응 HA를 함유하는 바이러스에 대해 덜 중화된 항체를 유도한다.
MDCK 세포와 같은 개 세포에서 증식된 인간 인플루엔자 바이러스 역시, 비록 정도는 덜하지만, 적응을 나타낸다. 이와 같은 바이러스는 바이러스를 유도한 알보다 조(crude) 인간 단리물과 더 가깝게 닮는다(Robertson et al 1990).
그 밖에, NA에서의 숙주-선택적 변화와 NA의 숙주-선택적 인산화 패턴은 인플루엔자 바이러스의 복제에 영향을 미칠 수 있다는 증거가 있다(Schulman and Palese 1997; Sugiara and Ueda 1980; Kistner et al 1976).
그러므로, 인플루엔자 바이러스의 적응 또는 다른 숙주-유도 변화를 피하는 것이 유리함이 명백하다. 이것은 바이러스 개체군의 동질성을 더욱 가져오며 최종 백신이 더욱 효과적이게 한다.
따라서, 본 발명의 목적은, 고적정 농도의 인플루엔자 바이러스를 생산하기 위한, 백신 개발에 적합한 기질로서, 인간 세포를 제공하는 것이다.
로타바이러스와 로타 백신
로타 바이러스는 전세계 어린이에게 심한 탈수 위장염의 가장 중요한 원인이다. 개발도상국에서 로타바이러스로 인한 감염은 해마다 800,000명 이상의 사망을 일으킨다. 미국에서, 로타바이러스 감염으로 인한 건강관리의 예산비용은 해마다 10억불을 넘는다.
레오바이러스과 이들 구성원인 로타바이러스는 11 RNA 분절(segments)로 이루어진 이중가닥 RNA 바이러스로, 각각 구조 또는 비구조 바이러스성 단백질(VP)을 코드화한다. 상기 바이러스의 내핵은 4개의 VP's로 이루어진다:VP1, 2, 3, 와 6. VP는 HRV-군, 아군 및 혈청형의 3개의 중요한 항원 특성을 결정한다. 항원적으로 독특한 7개의 군들(A-G)이 확인되었고, 이들은 VP6로 코드화되었다. 인간 로타바이러스(HRV)에 의한 감염은, 임상질환의 95%를 설명하는 혈청형 1-4를 갖는 A군 로타바이러스에 의해 주로 일어난다. 자연적 질병 방어는 혈청형 선택적이다. A군은 추가로 아군 I과 II로 분류된다.
바이러스성 캡시드를 형성하는 이중층 외피는 2개의 바이러스 단백질, VP4와 VP7으로 이루어지며, 이들은 보호 면역에 참여하는 중화 항원이며, 비록 VP4는 혈청형 결정에 중요한 역할을 하지 않지만, 혈청형을 결정한다. 다른 혈청형에 의한 공-감염(co-infection) 동안, 분절된 게놈은 즉시 유전적으로 재분류되며, 그 속성은 백신 생성에 사용된다(Marsha et al 1999).
유아 사망율과 치사율에 관련된 로타 바이러스가 세계적으로 유행일 때, 로타바이러스에 대한 대규모 접종은 상기 바이어스를 격퇴하는 가장 효과적인 방법이다. 접종 목적은 질병을 예방하는 것이 아니라, 특히 생후 초기 몇년동안, 고통과 합병증을 감소시키는 것이다.
현재 이용가능한 유일한 효과적인 백신은 혈청형 3의 VP7과 함께 약독된 배경을 공급하는 레서스(Rhesus) 로타바이러스에서 혈청형 1, 2와 4의 VP7's을 코드화하는 인간 로타바이러스의 RNA 분절의 재분류를 기초로 한 경구투여되는 생약독(live attenuated) 백신이다. 상기 인간 레서스 재집합체(reassortant) 3가 백신(RRV-TV)은, 비록 심한 위장염의 예방에는 매우 효과적이지만, 장중적증(intussuception), 장폐색 질병과 관련된다. 이와 같은 이유로 상기 백신은 더 이상 사용되지 않는다.
도 1은 감염 다중도 10-3 내지 10-4에서, 프로피듐 아이오다이드 염색 후 FACS를 통해 측정된 사멸세포의 백분율에 대한 면역형광분석 조사 후 현미경으로 본 감염세포(양성 세포)의 백분율을 나타낸다. 감염 다중도 10-3 에서 감염으로부터 유도된 샘플로부터의 세포의 불량한 생육성은 믿을만한 자료를 제공하지 않았다.
도 2는 면역형광분석 후 현미경으로 본 감염세포의 백분률이다. 감염 다중도 10과 1 및 감염 후 48시간에서, 감염으로부터 유도된 샘플은 완전 CPE 때문에 나타내지 않았다.
도 3은 감염 후 day 1 내지 day 6에 적혈구응집반응 단위(HAU)로 측정된 바이러스 증식 반응속도(kinetics)이다.
도 4는 면역형광분석 조사 후 현미경으로 관찰된 감염세포(양성 세포)의 백분률이다.
도 5는 감염 후 day 1 내지 day 6에 적혈구응집반응 단위(HAU)로 측정된 바이러스 증식 반응속도이다.
도 6은 면역형광분석 조사 후 현미경으로 관찰된 감염세포(양성 세포)의 백분률이다.
도 7는 감염 후 day 2 내지 day 6에서 적혈구응집반응 단위(HAU)로 측정된 바이러스 증식 반응속도이다.
도 8은 차이나 햄스터 오바리(CHO) 세포, PER.C6 세포 및 MDCK 세포에 존재하는 세포 표면 수용체 위에 Sia2-3Gal과 Sia2-6Gal 결합의 발현이다. (A)Sia2-6Gal 연결을 특이적으로 인식하는 샘부카 니그라 아글루티닌(SNA)과 Sia2-3Gal 연결을 특이적으로 인식하는 마키아아무렌시스 아글루티닌(MAA) 렉틴의 상호작용을 개략적으로 나타내었다. 또한, 세포 표면 단백질 위의 과당류 사슬에 결합된 DIG 라벨된 렉틴을 인식하는 FITC 라벨된 항-DIG 항체와의 개략적 상호작용을 나타내었다. (B)DIG-라벨된 렉틴으로 배양된 세포의 FACS 분석. 세포에 연결된 렉틴은 당업자들에게 알려진 과정을 이용하여 FITC-라벨된 항-DIG 항체로 검출하였다. 세포수 계수를 오직 FITC-항-DIG 항체(open)만으로 배양한 세포와 비교하여 렉틴-염색된 세포(gray)의 형광 강도에 대해 플롯하였다. 상부 패널은 SNA 렉틴을 이용하여 얻은 FACS 분석에서의 이동을 나타내며, 하부 패널은 MAA 렉틴을 이용하여 얻은 FACS 분석에서의 이동을 나타낸다.
도 9는 PER.C6상의 A/시드니/5/97 감염을 나타낸다. (A) HAU 적정농도에 대한 트립신-EDTA의 효과. (B)㎍/ml 단위의 HA 농도. (C)감염 96 시간 후, 조 바이러스 상징액에서 측정된 pfu's/ml의 바이러스 감염성 적정농도.
도 10은 PER.C6상의 B/하빈/7/94 감염을 나타낸다. (A) 성장 반응속도에 대한 바이러스 감염 동안 및 감염 후 존재하는 트립신-EDTA의 다양한 농도효과. (B)50 ㎕에 대한 HAU 적정농도 및 (C) pfu/ml의 바이러스 감염성 적정농도.
도 11은 PER.C6상의 감염 다중도 10-3을 이용한 X-127 감염을 나타낸다. (A)HAU/50 ㎕로 제공되는 HAU에 대한 트립신-EDTA의 효과 및(B) 감염 후 5일 동안 의 pfu/ml 단위의 바이러스 감염성 적정농도.
도 12는 PER.C6상의 감염 다중도 10-4의 X-127 감염. (A)HAU/50 ㎕로 제공되는 HAU에 대한 트립신-EDTA의 효과 및(B) 감염 후 5일 동안의 pfu/ml 단위의 바이러스 감염성 적정농도.
도 13은 (A)PER.C.세포 생육성 및 (B) 바이러스의 생물학적 활성에 대한 트립신-EDTA의 효과이다. 세포 생육성은 트립신-블루 염색 후 측정되었다. HAU 적정농도는 기재와 같이 측정되었고 50 ㎕당 주어졌다.
도 14는 PER.C6 세포상의 A/시드니/5/97 인플루엔자 감염후, 바이러스 감염성 적정농도와 HA 단백질 함량에 대한 트립신-EDTA의 효과. (A)감염성 조사는 트립신-EDTA(4 ㎍/ml)를 갖는 무혈청 배지에서 상징액 함유 10배 연속 희석된 바이러스 총 100 ㎕로 접종된, 4벌의 MDCK세포로 실시되었다. 7일 후, 이들 배양물의 상징액을 HA 활성에 대해 시험하였다. 감염성 바이러스 적정농도를 Spearman Karber(1931)법에 따라 산출하였다. (B)A/시드니/5/97 HA 단백질의 웨스턴 블롯 분석. 바이러스성 단백질의 수확은 용해 완충액을 함유하는 SDS를 이용한 단백질 파괴 및 변성에 의해 실시되었다. 환원조건하에서 10 %SDS/PAGE 겔에서 전기영동을 실시하였다. 분리된 단백질들은 특이 항-A/시드니-HA-항혈청으로 증명되었다. 양성 대조 A/시드니 HA 항원(좌측 4 래인)의 증가량과 나타낸 트립신 배양된 샘플(우측 5 래인)의 PER.C6 세포 상징액 10 ㎕를 장전하였다.
도 15는 중공 섬유 관류 시스템에서의 PER.C6 세포 생육성, 글루코스 농도 및 A/시드니/5/97의 성장속도.
도 16은 중공 섬유 관류 시스템에서의 PER.C6에서 증식된 인플루엔자 바이러스 A/시드니/5/97의 특성 및 수량화. SDS-PAGE와 웨스턴 블롯을 양 항-A/시드니-HA/항원에 대해 도 14에 기재된 것과 같이 실시하였다. 모노클로날 항체 항 HA-tag(HA 프로브(F7)), 마우스 모노크로날, (Santa Cruz))를 1:1000 희석으로 사용하였다. 두번째 항체로서 항-마우스 HRP 콘쥬게이트된 항원 1:7500희석이 사용되었다.
도 17는 A/시드니/5/97 바이러스를 이용한 바이러스 감염 후 최대 92 시간까지 12 리터 생물반응기에서 PER.C 세포 생육성(죄측 패널)과 글루코스 농도(우측 패널).
도 18은 12 리터 생물 반응기에서 10 리터 세포 현탁액 중 A/시드니/5/97 로 PER.C.6 의 감염. 면역형광 조사로 측정된 바이러스 복제 속도를 양성염색된 세포의 백분률로 제공하였다.
도 19는 12 리터 생물 반응기에서 10 리터 세포 현탁액 중 A/시드니/5/97 로 PER.C.6 세포의 감염. 면역형광 조사로 측정된 바이러스 복제 속도를 바이러스성 감염 후 며칠동안 HAU's로 나타내었다. 별표로 나타낸 바는 본문 기재와 같이 PowerfugeTM 분류로 얻은 HAU's의 수이다.
도 20은 12 리터 생물 반응기에서 10 리터 세포 현탁액 중 A/시드니/5/97 바이러스로 PER.C 6의 감염 후 웨스턴 블롯이다. 인플루엔자 바이러스 A/시드니/5/97 HA 폴리펩티드의 특성화 및 수량화를 나타낸다. SDS/PAGE와 웨스턴 블롯을 도 14의 설명과 같이 실시하였다. 다양한 서브유니트(HA1과 HA2)와 절단되지 않은 HA0 단백질을 화살촉으로 표시하였다. NIBSC로부터 얻은 HA는 양성 대조로서 작용하였다.
도 21은 12 리터 생물 반응기에서 10 리터 세포 현탁액 중 A/시드니/5/97 바이러스로 PER.C 6의 감염 후 HAU's 및 pfu/ml의 결정을 나타낸다. 감염후 하류 흐름가공(Down Stream Processing)을 실시하였다(DSP). 또한, 중공섬유 한외여과(20배 농도) 후 바이러스 수율의 복구를 나타내었다.
도 22는 3 리터 생물 반응기 중의 2 리터 세포 현탁액에서 PER.C6 상의 A/시드니/5/97 감염을 나타낸다. PER.C6 세포 생육성(좌측상부), 글루코스 농도(우측상부), 및 양성염색된 세포의 백분률로 나타낸 바이러스의 성장속도(좌측하부) 및 HAU's(우측하부)를 제공하였다.
도 23은 3 리터 생물 반응기중의 2 리터 세포 현탁액에서 PER.C6상의 A/베이징/262/95 감염을 나타낸다. PER.C6 세포 생육성(좌측상부), 글루코스 농도(우측상부), 및 양성염색된 세포의 백분률로 나타낸 바이러스의 성장속도(좌측하부) 및 HAU's(우측하부)를 제공하였다.
도 24는 3 리터 생물 반응기중의 2 리터 세포 현탁액에서 PER.C6상의 A/베이징/262/95의 감염을 나타낸다. PER.C6 세포 생육성(좌측상부), 글루코스 농도(우측상부), 및 양성염색된 세포의 백분률로 나타낸 바이러스의 성장속도(좌측하부) 및 HAU's(우측하부)를 제공하였다.
도 25는 절단되지 않은 A/시드니/5/97 HA0 단백질의 웨스턴 블롯 분석이다. 양성염색된 단백질을 도 14와 본문의 기재와 같이, NIBSC로부터 얻은 특이 항-A/시드니 항혈청으로 배양한 후 검출하였다.
도 26는 (A)트립신으로 소화시킨 A/시드니/5/97 유도된 HA0 단백질의 웨스턴 블롯 분석. 특이 항-A/시드니 항혈청으로 접종 후 단백질을 검출하였다. 좌측은 표준 절단된 A/시드니HA, 우측은 증가된 양의 트립신으로 처리된 HA0. (B)인플루엔자 A/시드니/5/97의 HA0를 기질로 이용한, 인플루엔자 B/하빈 생산 작업의 배양 상징액에서 트립신 활성의 결정. 도 14에 기재된 항 인플루엔자 A/시드니/5/97 HA 특이 항혈청으로 가시화시킨 HA0 절단 제품 HA1 및 HA2의 웨스턴 블롯 분석.
도 27은 N-글루코시다제 F로 소화시킨 A/시드니 HA0의 웨스턴 블롯 분석. 단백질은 특이 항-A/시드니 항혈청으로 인큐베이션 후 검출하였다. 별표로 나타낸 단백질 밴드는 탈(de)-당부가 생성물이다.
도 28은 아쿠타제(Accutase) 소화 후 A/시드니 HA0의 웨스턴 블롯 분석. 단백질은 특이 폴리클로날 항-A/시드니-HA 항혈청으로 인큐베이션 후 검출하였다. 좌측, 트립신 처리 전 후, 우측, 감소된 양의 아쿠타제로 소화된 HA0.
도 29는 인플루엔자 A/시드니/5/97의 전자현미경 사진이다. (A)감염 72시간 후 PER.C6 세포. (B와 C)감염된 PER.C6에서 유도된 바이러스에서의 음성염색. (D와E)슈크로스 정제된 재료의 음성염색.
도 30은 (A) PER.C6세포상 시험된 다양한 인플루엔자 A와 B 균주. (B)감염된 PER.C6세포에서 유도된 A-및 B-형 인플루엔자 바이러스의 감염성 적정농도.
도 31은 인플루엔자 이외의 바이러스로 감염된 PER.C6 및 Vero 세포의 면역 형광. (A)홍역 바이러스로 감염시킨 후 양성염색된 세포. (B) HSV-1 바이러스로 Vero 세포를 감염시킨 후의 양성염색 세포.(C) HSV-1바이러스로 PER.C6 세포 및 Vero 세포 감염 후의 양성염색 세포.
도 32는 홍역 바이러스(중간 패널), HSV-1(하부 패널) 및 HSV-2(상부 패널) 바이러스를 PER.C6 세포에서 증식시킨 후 결정된 감염성 적정농도이다.
도 33은 조 상징액 중에 다양한 감염 다중도를 갖는 PER.C6(상부패널)과 Vero(하부패널)의 감염 후 ELISA로 측정한 로타바이러스의 복제이다.
본 발명은 백신으로 사용하기 위한, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스성 단백질과 다른 바이러스 및/또는 바이러스성 단백질을 생산하는 방법으로, 세포에 아데노바이러스의 E1 유전자의 적어도 하나의 유전자 생성물 또는 그의 기능성 유도체를 코드화하는 적어도 하나의 서열을 제공하는 단계, 상기 세포에 상기 바이러스 또는 상기 바이러스성 단백질을 코드화하는 핵산을 제공하는 단계, 상기 세포를 적합한 배지에서 배양하고 상기 바이러스의 증식 또는 상기 바이러스성 단백질의 발현을 허용하는 단계 및 상기 배지 및/또는 상기 세포로부터 상기 바이러스 및/또는 바이러스성 단백질을 수확하는 단계로 이루어진 방법을 제공한다.
복제가능하고 및 설계가능한 방법 및/또는 충분히 높은 수율 및/또는 용이하게 정제할 수 있는 방법으로, 백신으로 사용하기 위한 바이러스 및/또는 바이러스성 단백질을 생산하기에 알맞다고 밝혀진 세포는 본 발명까지 거의 없었다. 본 발명자들은, 바람직하기는 게놈에 아데노바이러스성 E1 서열을 포함하는 세포들이 상당한 양으로 바이러스들을 계속 증식할 수 있음을 발견하였다.
본 발명에 따른 바람직한 세포는 인간 1차 세포, 바람직하기는 상기 E1 유전자의 유전자 생성물에 의해 불멸화된 세포로부터 유도된다. 1차 세포를 성장시키기 위해, 물론 세포를 불멸화시키는 것이 필요하다. 이와 같은 세포의 양호한 예로는 인간 배아 망막아세포로부터 유도된 것이다.
본 발명에 따른 세포에서, E1 유전자 서열이 세포 순환(cycle) 중에 손실되지 않는 것이 중요하다. 그러므로, E1 유전자의 적어도 하나의 유전자 생성물이 상기 (인간) 세포의 게놈에 존재하는 것이 바람직하다. 안전을 위해, 본 발명에 따른 세포내의 불필요한 아데노바이러스성 서열을 피하는 것이 가장 중요하다. 그러므로, 본 발명의 다른 구현예는 아데노바이러스성 단백질을 생산하지 않는 세포를 제공한다. 그러나, 세포 배양을 통해 대량의 바이러스를 연속 생산하기 위해, 고정 (anchorage)이 필요없이 성장할 수 있는 세포를 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 세포들은 그런 능력을 갖는다. 바이러스를 쉽게 복구할 수 있고, 필요에 따라 정제할 수 있는 깨끗하고 안전한 시스템을 갖기 위해, 본 발명에 따른 방법을 갖는 것이 중요하며, 그 방법에 의해 상기 인간 세포는 다른 아데노바이러스 서열을 포함하지 않는다. 본 발명의 방법과 용도에 알맞는 가장 바람직한 세포는 ECACC No. 96022940으로 기탁된 PER.C6 또는 그의 유도체이다.
그러므로, 본 발명은 본 발명에 따른 세포를 이용하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 세포는 추가로 E2A 또는 그의 기능성 유도체 또는 유사체 또는 단편을 코드화하는 서열을 포함하며, 바람직하기는 상기 E2A 또는 그의 기능성 유도체 또는 유사체 또는 단편을 코드화하는 서열이 상기 인간 세포의 게놈에 존재하는 세포이며, 가장 바람직하기는 상기 E2A 코드화 서열이 온도 민감성 돌연변이체 E2A를 코드화하는 세포이다.
그밖에, 언급한 바와 같이, 본 발명은 상기 (인간) 세포가 현탁액으로 성장할 수 있는 본 발명에 따른 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 인간 세포가 혈청없이 배양될 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 세포, 특히 PER.C6는 혈청 또는 혈청 성분들 없이 배양될 수 있는 장점을 갖는다. 따라서, 분리가 용이하며 안정성이 강화되며 시스템의 신뢰성이 양호하다(합성 배지는 신뢰성 면에서 가장 우수하다). 본 발명의 인간 세포들 및 특히 1차 세포를 기초로 한 인간 세포와 특히 HER 세포를 기초로 한 인간세포들은 정상 번역후 수식 (normal post translation modification) 및 번역주변 수식(peritranslation modification) 및 조립 능력이 있다. 이것은 이들이 백신으로 사용하기 위한 바이러스성 단백질과 단백질을 제조하는데 매우 알맞다는 것을 의미한다.
그러므로, 본 발명은 본 발명에 따른 방법을 제공하며, 여기서 상기 바이러스 및/또는 상기 바이러스성 단백질은 번역후 수식 및/또는 번역주변 수식을 겪는 단백질을 포함하며, 특히 여기서 상기 수식은 당부가(glycosylation)를 포함한다. 어떠한 믿을 수 있는 방법으로 생산되기 어려운 바이러스 백신의 양호한 예는 인플루엔자 백신이다. 본 발명은 본 발명에 따른 방법을 제공하며, 여기서 상기 바이러스성 단백질은 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제 및/또는 적혈구응집소를 포함한다. 본 발명에 따른 방법으로 생산될 수 있는 다른 바이러스성 단백질(서브유니트)및 바이러스(불활성화 될 야생형) 또는 약독 바이러스는 리노바이러스, 아프터바이러스 또는 폴리오미엘리티스 바이러스와 같은 장내바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 가성광견병 바이러스 또는 소 헤르페스 바이러스와 같은 헤르페스 바이러스, 인플루엔자 바이러스와 같은 오르소미소바이러스, 뉴케슬병 바이러스, 호흡장해 바이러스, 이하선염 바이러스 또는 홍역 바이러스와 같은 파라미소바이러스, 인간 면역결핍 바이러스와 같은 레트로바이러스 또는 파르보바이러스 또는파보바바이러스, 또는 전염성 위장염 바이러스와 같은 로타바이러스 또는 코로나바이러스, 또는 진드기매개성 뇌염 바이러스 또는 황열병 바이러스와 같은 플라비바이러스, 풍진바이러스 또는 이스턴-, 웨스턴-, 또는 베네수엘라 말 뇌척수염 바이러스와 같은 토가바이러스, 헤파티티스 A 또는 헤파티티스 B 바이러스와 같은 간염 유발 바이러스, 돼지 콜레라 바이러스와 같은 페스티바이러스, 또는 광견병 바이러스와 같은 라브도바이러스, 한타바이러스와 같은 부니아바이러스과(Bunyaviridae) 바이러스를 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명의 세포는 부화계란에서 매우 효과적으로 성장하지 않는 인플루엔자 바이러스 균주의 발생에 유용하다.
본 발명은 또한 바이러스 생산을 위한 구조적 아데노바이러스 단백질을 생산하지 않는 세포의 게놈에 아데노바이러스의 적어도 하나의 E1 단백질 또는 그것의 기능성 유도체, 동족체 또는 단편, 또는 백신으로 사용하기 위한 적어도 하나의 바이러스성 단백질을 암호화하는 서열을 갖는 인간 세포의 용도를 제공한다. 물론, 이와 같은 용도를 위해, 본 발명에 따른 방법에 바람직한 세포가 역시 바람직하다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법과 용도로 생산된 생성물, 특히 이들의 용도 및/또는 방법에 따라 특히 적합한 부형제를 포함하는 약학적 조성물 및 몇몇 포맷(불활성화된 바이러스, 서브유니트) 보조약에 도입함에 따라 얻을 수 있는 바이러스성 단백질과 바이러스를 제공한다. 투여량과 방법은 이들이 아직 이미 등록된 백신을 통해 얻을 수 없으므로 지금까지의 정상 임상 시험을 통해 선별될 수 있다.
그러므로, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법 또는 용도에 의해 얻을 수 있는 백신으로 사용하기 위한 바이러스 또는 바이러스성 단백질을 제공하며, 상기 바이러스 또는 바이러스성 단백질은 어느 비-인간 포유류 단백질분해성 물질이 없으며 약제적 제형은 이와 같은 바이러스 및/또는 바이러스성 단백질을 함유한다.
추가로, 본 발명은 아데노바이러스의 적어도 하나의 E1 단백질을 또는 그것의 기능성 유도체, 동족체 또는 단편을 코드화하는 서열을 게놈에 갖는 인간세포를 제공하며, 상기 세포는 구조적 아데노바이러스성 단백질을 생산하지 않으며, 바이러스 또는 적어도 하나의 비-아데노바이러스성 단백질을 코드화하는 핵산을 갖는다. 상기 세포는 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법 또는 본 발명에 따른 용도으로 얻을 수 있는 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법 또는 본 발명에 따른 용도에 의해 얻을 수 있는 인플루엔자 백신을 제공한다.
다른 면에서, 본 발명은 본 발명의 방법 또는 용도에 의해 얻을 수 있는 적 어도 하나의 바이러스성 단백질 또는 바이러스를 포함하며, 상기 바이러스 또는 상기 바이러스 단백질은 어느 비-인간 포유류 단백질 분해성 물질을 갖지 않는, 샘플에서 프로테아제의 활성을 측정하는 키트를 제공한다. 본 발명의 상기 면은 특히 배지에서 프로테아제 활성을 측정하는데 유용하다. 배지는 프로테아제의 활성을 측정하기 어려운 조건이다. 그러나, 프로테아제의 표적으로서 본 발명의 바이러스성 단백질 또는 바이러스의 사용은 배지에서 상기 프로테아제의 활성을 정확히 측정할 수 있게 한다. 그러므로, 바람직한 구현예에서 샘플 중의 상기 프로테아제 활성은 배양 배지를 포함한다. 바람직한 구현예에서 상기 프로테아제는 트립신을 포함한다. 바람직한 구현예에서 상기 바이러스 단백질은 HA0을 포함한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 적어도 부분적으로 바이러스 감염성을 보존할 수 있는 조건하에서 인플루엔자 바이러스를 농축하는 방법으로, 세포 배양물로부터 상기 바이러스를 포함하는 세포 소거된(cleared) 상징액을 얻고, 및 상기 상징액을 저전단 조건에서 한외여과하는 것으로 이루어진 방법을 제공한다. 통상적으로 부화계란으로부터 수확한 인플루엔자 바이러스 제제는 백신으로 사용하기 위해 정제되어야 한다. 정제는 통상적으로 적어도 하나의 바이러스 농축 단계를 요구한다. 인플루엔자 바이러스의 비교적 조악한 제제로부터 인플루엔자 바이러스를 농축하는 현 기술은 어렵다. 본 발명의 농축법을 이용하면, 바이러스의 감염성을 적어도 부분적으로 유지하는 조건하에서 인플루엔자 바이러스 제제를 농축하는 것이 가능하다. 바람직하기는, 바이러스는 전염성이며 또는 전염될 수 있도록 농축된다. 전염될 수 있는 것은 HA0의 절단을 통해 전염성 바이러스가 발생한다는 것을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 상기 농축은 중공섬유를 이용하여 실행된다. 중공섬유는 저전단 조건하에서 농축하기에 특히 알맞다. 바람직한 구현예에서, 상기 세포배양은 인비트로 배양된 세포를 포함한다. 특히 본 발명의 방법을 이용하는 농축에 알맞는 것은 인비트로 배양된 세포의 상징액이다. 특히, 상기 상징액이 무혈청 배지를 포함할 때 바람직하다. 바람직한 구현예에서 상기 한외여과는 바이러스는 보유하고 단일 단백질의 통과는 허용하는 필터로 실시된다. 바람직하기는 상기 섬유는 500 KD의 컷 오프(cutt off)로 이루어진다. 더욱 바람직하기는, 상기 필터는 750 KD의 컷오프로 이루어진다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 농축물은 추가로 분자량이 500KD보다 적은, 바람직하기는 750 KD 보다 적은 단백질을 적어도 부분적으로 제거하는 것을 포함한다. 바람직하기는, 상기 정제는 상기 필터를 이용하여 달성된다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 농축된 전염성 인플루엔자 바이러스 또는 그의 유도체를 제공한다. 본 발명의 전염성 인플루엔자 바이러스의 유도체는 통상적으로 접종목적에 사용될 수 있는 바이러스, 바이러스 입자, 또는 바이러스성 단백질 또는 그의 일부이다. 통상적으로 이것은 바이러스 전염성 불활성화 단계를 필요로 한다.
실시예
본 발명을 설명하기 위해 다음의 실시예들을 제공하였으나, 본 발명의 범위가 이것으로 제한되는 것은 아니다.
실시예 1
재료 및 방법
PER.C6와 MDCK 세포 배양
Madin Darby Canine Kidney(MDCK) 세포를 10% 열불활성 배아 송아지 혈청과 1x L-글루타민(Gibco-BRL)을 함유하는 둘베코스 변형 이글스 배지(DMEM, Life Technologies Breda, 네덜란드)에서 37 ℃ 및 10% CO2에서 배양하였다. PER.C6의 현탁 배양을 1x L-글루타민이 보충된 ExCell 525(JRH Biosciences), 37 ℃ 및 10 % CO2에서, 6웰 디쉬의 정치배양(Greiner)에서, 또는 490 cm2 조직 배양 회전병 (Corning Costar Corporation)에서 1 rpm으로 연속 회전하면서 배양하였다.
면역형광법 시험
인플루엔자 바이러스 감염을 검출하기 위해, 제조사의 표준약관에 따라 IMAGENTM 인플루엔자 바이러스 A 및 B 키트(Dako)를 이용하여 직접면역 형광조사를 실시하였다. 샘플들을 에피형광 조명(epifluorescence illumination)을 이용하여 현미경적으로 관찰하였다. 감염된 세포들은 밝은 애플-그린 형광으로 특징되었다.
프로피듐 아이오다이드 염색
세포 펠렛을 당업자들에게 알려진 PBS/FCS/아지드 용액 중에서 찬 PBS/0.5% BSA 300 ㎕ + 프로피듐 아이오다이드 (농도 50 ㎍/㎖) 5 ㎕ 중에 재현탁시켰다. 생존 및 사멸세포를 유동 세포형광분석(flow cytofluorometric analysis)을 통해 검출하였다.
적혈구 응집반응 조사
일반적으로, 인플루엔자 바이러스 적정농도를 측정하기 위해 당업자들에게 알려진 방법에 따라 적혈구 응집반응 조사를 실시하였다. PBS 중의 2배 희석된 바이러스 용액 50 ㎕를 PBS 25 ㎕와 PBS 중의 칠면조 적혈구 1% 현탁액(biotrading Benelux B.V.) 25 ㎕에 첨가하고 4 ℃에서 1 시간 동안 96 웰 마이크로타이터 플레이트에서 배양시켰다. 적혈구 응집반응 패턴을 조사하고 점수화하였고, 혈구응집단위(HAU's)로 나타내었다. HAU's수는 완전 적혈구 응집반응을 나타내는 최고의 바이러스 희석도의 역가에 해당한다.
인플루엔자 HA 단백질의 웨스턴 블롯 분석
일반적으로, 얻어진 인플루엔자 바이러스를 당업자들에게 알려진 방법으로 라엠리(Laemmli) 완충액에 분쇄시키고, 얻어진 다른 부피의 단백질 혼합물들을 10% SDS/PAGE 겔을 이용하여 분리시켰다. 간단히 말하면, 블롯들을 실온에서 30분 동안 블럭용액(1% 토끼 혈청(Rockland)이 보충된 TBST 중에 5% 건조 탈지분유(Biorad))로 블럭시킨 다음, TBST로 세번 세척하였다. 그리고, 블롯들을 실온에서 5% 토끼 혈청을 갖는 1% BSA/TBST에서 1/500으로 희석된 항A/시드니/5/97 HA 항혈청으로 배양시켰다. 다시 블롯들을 TBST로 8번 세척하였다. 마지막으로, 블롯들을 실온에서 1시간 동안 블럭액 중에 1/6000으로 희석된 토끼 항 양 항혈청(HRP labelled, Rockland)으로 배양시켰다. TBST로 8번 세척한 후, 단백질-컨쥬게이트 복합물을 ELC(Amersham Pharmacia Biotech)로 가시화시키고, 필름(Hyperfilm, Amersham Life Science)을 노출하였다. NIBSC(UK)로부터 항혈청을 얻었고 NIBSC에 의해 제안된 희석액에 공급하였다.
단일 라디칼 면역확산(SRID) 조사
인플루엔자 바이러스 감염-PER.C6 세포로부터 유도된, 상징액 중의 적혈구 응집소의 농축액을 상기와 같이 단일 라디칼 면역확산(SRIS) 시험으로 결정하였다(Wood et al 1997). 이 조사는 표준 NIBSC(UK) 항원과 항혈청 시약을 이용하여 실시되었다.
플라크 측정법
10배 연속 희석된 바이러스성 상징액 1ml 모두를 6-웰 플레이트에서 95% 컨플루언스(confluence)까지 성장된 MDCK 세포에 접종시켰다. 35 ℃에서 1 시간 후 세포들을 PBS로 2번 세척하고 아가로스 혼합물(1.2 ml 2.5% 아가로스, 1.5 ml 2x MEM, 30 ㎕ 200 mM L-글루타닌, 24 ㎕ 트립신-EDTA, 250 ㎕ PBS) 3 ml로 과부하시켰다. 그 다음, 세포들을 습한 10 % CO2 대기하의 35 ℃에서 약 3일간 배양하고 바이러스성 플라그를 시각적으로 점수화하였다.
바이러스 전염성 조사 (TCID 50 )
전염성 바이러스의 적정을 MDCK 세포에서 실시하였다. 간단히 말하면, 세포를 96 웰 플레이트에서 2 mM L-글루타민이 보충된 DMEM에 4 x 104 세포/웰의 밀도로 시드하였다. 24시간 후 세포들을, 농도 4 ㎍/㎖에서 트립신-EDTA 함유 배지에서 4중으로, 10배 연속 희석된 배양 상징액 10 ㎕으로 감염시켰다. 감염 2시간 후, 세포 단일층을 PBS 중에 2번 세척하고 트립신을 함유하는 배지에서 7일간 35 ℃에서 배양하였다. 그리고 이들 배양물의 상징액을 HA 조사로 시험하였다. TCID50 적정농도를 Karber법(1931)으로 산출하였다.
β-프로피오락톤 인플루엔자 바이러스 불활성화
PER.C6에서 유도된 백신을 발생시키도록 완전-불활성화된 바이러스를 얻기 위한 바이러스의 불활성화를 위해, β-프로피오락톤을 이용하여 당업자들에게 알려진 돌연변이 프로토콜을 실시하였다. β-프로피오락톤은 바이러스의 불활성화에 널리 사용되는 매우 효과적인 약제이며, 그의 돌연변이 효과가 잘 알려져 있다. 이것은 바이러스 게놈의 핵산염기와 숙주세포 게놈을 변형시키고 그 후 복제를 방해한다. 부화계란에서 제조된 완전 불활성화된 인플루엔자 백신을 제조하는데 사용하도록 확립된 프로토콜에 따라, 균주당 약 400 ㎍ HA에 해당하는 바이러스의 양을 비활성화시켰고 최종 백신 형성에 사용하였다. 간단히 말하면, 0.3 M 인산나트륨 완충액 1 부피를 인플루엔자 바이러스 제제의 9 부피에 첨가하였다. 바이러스의 불활성화는 10 % β-프로피오락톤(Newall Design, UK) 1부피를 인산 완충 바이러스제제 100 부피에 첨가하여 실시하였고 20 ℃에서 24 시간동안 배양하였다. 바이러스의 불활성화는 플라크 측정으로 확인하였고 불활성화 배치(batch) 중 어느 것에서도 플라그가 검출되지 않았다(자료 제시 안함).
실시예 2A
PER.C6 세포 저장(banking)과 전배양
세포계 PER.C6(수탁번호 제 96022940, European Collection of Aminal Cell Cultures at the Centre for Applied Microbiology and Research) 또는 그의 유도체(WO97/00326에 기재)를 사용하였다. 세포계는 2 적정농도 세포 뱅크 시스템에 저장하였다. 선택된 세포계를, 여러 위치에 보관되는 리서치 마스터 세포은행(rMCB)에 저장하였다. 이 rMCB로부터 리서치 작업 세포은행(rWCB)을 다음과 같이 제조하였다: rMCB의 앰풀을 녹이고, 드라이아이스를 이용하여 모든 세포가 냉각되기에 충분하게 증식시켰다. rWCB 1ml를 함유하는 최대 500 앰플을 액체 질소 냉각기의 증기상에 저장하였다. WBC의 PER.C6 세포 5x106을 함유하는 앰플 하나를 수조 중에서 녹였다. 세포들을 신속히 50 ml 튜브로 옮기고 현탁 배지 ExCell 525 (JRH Biosciences) 9 ml를 첨가하여 재현탁시켰다. 테이블 탑 원심분리기에서 1000 rpm으로 3분간 원심분리하고, 세포들을 최종 농도 3x 105세포/ml로 재현탁시키고 T80 조직 배양 플라스크, 37℃, 10% CO2에서 배양시켰다. 2일 내지 3일 후, 세포들을 490 cm2 조직 배양 회전병(Corining Costra Corporation)에 3x105/ml의 밀도로 시드하고 1rpm으로 연속 회전하며 배양하였다.
실시예 2B
인플루엔자A 바이러스에 대한 허용가능 세포계로서의 PER.C6세포
인간 세포 PER.C6의 인플루엔자 바이러스 감염과 복제를 유지하는 능력은 알려져 있지 않다. 그러므로, 양성대조로 사용되는 개 세포계 MDCK와 비교하여, PER.C6 세포들이 인플루엔자 바이러스 감염을 허용하는 것을 입증하였다.
감염 하루 전, 웰당 2x105 MDCK 세포를 6-웰 플레이트에 시드하였다. 24시간 후, 웰 당 4x105 시드된 PER.C6와 MDCK 세포를 H1N1 균주 A/Puerto Rico/8/34(적정농도 3.6x107 pfu/ml), (Dr,E,Claas, 라이덴 유니버시티 메디칼 센터, 네덜란드)로 감염시켰다. 0.1 내지 10 pfu/세포 범위의 다양한 감염(Moi's)을 실시하였다. 약 배양 2시간 후, 37 ℃에서 접종물을 제거하고 새로운 배지로 교환하였다. 인플루엔자 바이러스 감염을 검출하기 위해 감염 후 24시간과 48시간에 직접 면역형광조사를 실시하였다. 실험은 인플루엔자 감염에 대해 양성 세포 감염다중도ㅡ의존(moi-dependent) 확률과 MDCK와 비교할 수 있는, PER.C6의 허용가능성을 나타내었다(도 1).
실시예 3
인플루엔자 A 바이러스 증식에 사용되는 PER.C6
PER.C6가 인플루엔자 바이러스의 복제 및 증진을 지지하는지 여부를 증명하였다. 감염일에, PER.C6 세포를 트립신-EDTA(Gibco-BRL)의 존재하에 40 ml의 최종 부피에 2x105세포/ml의 밀도로, 490 cm2 조직 배양 회전병에 시드하였다. 세포들을 mock 접종하거나 또는 H3N3 균주 A/센젠/227/95(적정농도 1.5x106 pfu/ml)(Dr. E.Claas, 라이덴 유니버시티 메디칼 센터, 네덜란드)로 감염시켰다. 감염은 감염다중도 10-4과 10-3pfu/세포로 실시하였다. 37 ℃에서 배양 1시간 후, 1500 rpm으로 스핀을 낮춰 접종물을 제거하고, 트립신-EDTA 5 ㎍/ml와 새로운 배양 배지에서 세포를 재현탁 시켰다. 감염 1일부터 6일까지, 세포 현탁액 1.3 ml를 매일 수확하였다. 상징액을 -80 ℃에서 저장하고 적혈구 응집반응 조사에 사용하였다. 세포 펠렛을 직접 면역형광 조사와 프로피듐 요오드 염색에 이용하였다.
실시예 4
다른 인플루엔자 균주에 대한 PER.C6의 허용가능성
다양한 인플루엔자 균주의 증식에 대한 PER.C6의 허용가능성을 추가로 조사하기 위해, National Institute for Biological Standards and Control(NIBSC, UK)로부터 얻은 H1N1 백신 균주 A/베이징/262/95와 그의 재-분류체 (reassortant) X-127을 이용하여 감염시켰다. 감염일에, PER.C6세포를 490 cm2 조직 배양 롤러병에 최종부피 50 ml에서 밀도가 약 1x106세포/ml로 시드하였다. 세포를 트립신-EDTA 5 ㎕/ml의 존재하에 바이러스 5 ㎕(10-4희석)와 50 ㎕(10-3 희석)로 접종시켰다. 트립신이 정말로 필요한가를 확립하기 위해, 프로타아제가 없이 균주 A/베이징/262/95 5 ㎕로 접종시킨 감염을 하나 더 실시하였다. 37 ℃에서 접종 약 1시간 후, 세포를 1500 rpm으로 회전을 늦춰 접종물을 제거하였다. 감염 후 2일과 4일에 샘플에 트립신을 더욱 첨가하였다. 세포 현탁액 1.3 ml를 감염 후 day 1로부터 day 6까지 수확하였다. 상징액을 -80 ℃에서 저장하고 헤마글루틴 분석과 추가 감염에 사용하였다; 세포 펠렛을 직접 면역형광 시험에 사용하였다. 상기 면역형광법과 헤마글루틴화 시험으로 얻은 결과를 도 4와 도 5에 나타내었고, 각각 바이러스의 효과적인 복제와 방출을 설명한다.
실시예 5
PER.C6에서 증식된 바이러스의 감염성
PER.C6에서 성장한 바이러스들의 감염성 여부와 세포계에 대한 적응으로 바이러스 수율이 증가되는가를 확인하였다. 균주A/베이징/262/95와 그의 재-분류체 X-127(희석.10-3)로 감염된 PER.C6로부터 유도되고 감염 6일 후 수확된 바이러스 상징액을 사용하였다. 감염일에, PER.C6를 490 cm2 조직 배양 회전병에 최종부피 50 ml에서 약 1x106세포/ml의 밀도로 시드하였다. 세포를 트립신-EDTA 5 ㎕/ml의 존재하에 바이러스 상징액 100 ㎕와 1 ml로 접종시켰다. 트립신이 여전히 필요한가를 확립하기 위해, 프로타아제 없이 균주 A/베이징/262/95 100 ㎕로 접종시키는 감염을 하나 더 실시하였다. 37 ℃에서 접종 약 1시간 후, 세포를 1500 rpm으로 회전을 낮춰 접종물을 제거하고 트립신-EDTA ±5㎕/ml 새로운 배지에서 그들을 재현탁시켰다. 감염 후 day 2와 day 4에 샘플에 트립신을 더욱 첨가하였다. 세포 현탁액 1.3 ml를 감염 후 day 1 부터 day 6까지 수확하였다. 상징액을 -80 ℃에서 저장하고 적혈구응집소 분석과 추가 감염에 사용하였다; 세포 펠렛을 직접 면역형광 시험에 사용하였다. 상기 면역형광법과 적혈구응집반응 시험으로 얻은 결과를 도 6와 도 7에 나타내었다. 본 실시예로 얻은 자료들은 PER.C6에서 성장한 바이러스의 감염성과 바이러스 수율의 증가를 나타낸다.
실시예 6
PER.C6 상의 인플루엔자 바이러스에 대한 세포 표면 수용체의 존재
인간 인플루엔자 A와 B의 부화계란에서의 증식은, 노출되고 기능적으로 중요한 분자영역에서 HA 구형 헤드의 말단부분에 아미노산 치환체를 정박시키는 수용체-결합 변이체의 선택을 일으킨다. 이런 돌연변이 때문에, 알-적응 군주는 그것의 발병력 뿐만 아니라, 그것의 항원 및 면역 활성에서 조 인간 바이러스와 다르다. MDCK 세포로부터 분리된 인간 인플루엔자 바이러스들은 보통 조 병원체 샘플의 바이러스에 존재하는 HA 단백질과 동일한 HA 단백질이 존재한다. 최근의 연구(Govorkova 1999)는 달걀의 발병력 선택에 대한 분자 기준과 MDCK 세포에서의 상기 발병력 선택 현상을 명백히 하였다. MDCK 세포에서 분리된 모든 인간 인플루엔자 A와 B 균주는, 그것의 알-성장 대조물은 과당류를 전달하는 세포 표면 수용체의 알파 2,3-실라-갈락토스 연결에 증가된 친화성을 나타내는 반면, 표면 수용체에 존재하는 과당류(Sia2-3Gal)를 전달하는 세포표면 수용체에 시알산-글락토아제 연결에 대한 높은 친화성과 특이성으로 결합되는 것이 발견되었다. 특이적 렉틴을 이용하여, 오직 Sia2-3Gal 함유 수용체만이 닭 배아세포의 표면에 존재하며, 반면 MDCK 세포는 Sia2-6Gal과 Sia2-3Gal에서 발현된다. PER.C6 세포의 표면에 있는 Sia2-3Gal과 Sia2-6Gal 부분의 발현은 두개의 다른 딕옥시게닌(DIG)-라벨된 렉틴: Sia2-6Gal 연결을 특이적으로 인식하는 삼부쿠스 니그라 응집소(SNA)와 Sia2-3Gal을 특이적으로 인식하는 막키스 마무렌시스 응집소(MAA)를 이용하여, FACS 분석으로 연구하였다. 도 8A는 SNA와 MAA 렉틴의 인식과 당부가 부위에 그것의 결합을 나타낸다. 또한, 도8B는 세포 표면에 존재하는 당부가 백본에 있는 특이 실라닐 결합을 인식하는, FITC 라벨된 항-DIG 항원과 DIG-라벨된 렉틴 사이의 개략적 상호작용을 나타낸다. 렉틴 모두는 글리칸 미분화 키트로부터 취하였다 (Boehringer-La Roche).
실험을 현탁액의 PER.C6 세포와 부착성 MDCK와 CHO 세포에서 실시하였다. MDCK와 CHO 세포를 트립신-EDTA(Gibco-BRL)을 사용하여 고형 지지체로부터 방출하였다. 그리고 세포 현탁액을 Mem-5% FBS로 한번 씻고 이 배지에서 37 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBS(Gibco-BRL)로 세척한 후, 세포를 결합 배지(Tris-완충 살린, pH7.5, 0.5% BSA, 및 MgCl2, MnCl2와 CaCl2 각각 1 mM) 중에 약 106세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 세포 부분표본 (aliguots)을 실온에서 1시간 동안 DIG-라벨된 렉틴 SNA 및 MAA으로 배양하였다. 1 시간 후, 렉틴-처리된 세포를 PBS로 세척하고 실온에서 추가 1 시간 FITC-라벨된 항-DIG 항체(Boehringer Mannheim)로 배양하였다. 최종적으로, 세포들을 PBS로 세척하고 AC 분류장치(Bcton Dickinson)를 이용하여 형광 활성세포 분류법으로 분석하였다. 그 결과를 도 8B에 나타내었고, PER.C6는 Sia2-3Gal 수용체 뿐만 아니라 Sia2-6Gal의 존재를 나타내는 렉틴에 의해 염색되었다.
동일한 실험에서, MDCK 세포들은 실라닐화 수용체에 대한 양성 대조로 사용된 반면, CHO 세포는 이러한 햄스터 세포에 알파 2-6 실라닐트란스퍼라제 글리코실란화 효소가 없기 때문에, Sia2-6Gal 부분에 대한 음성 대조를 나타낸다. 상부 패널은 SNA 렉틴의 결과를 나타내며 하부 패널은 MAA 렉틴의 결과를 나타낸다. 이들 결과로부터, PER.C6가 그것의 과당류 사슬에 Sia2-3Gal과 Sia2-6Gal 연결을 모두 갖는 세포 표면 단백질을 발현한다고 결론지을 수 있다.
실시예 7
PER.C6 세포 상의 생육성, PER.C6 세포 상의 인플루엔자 바이러스 생산, 및 그것로부터 유도된 HA 단백질에 대한 상이한 트립신-EDTA 농도 효과
세포배양시, 인플루엔자 바이러스의 증식에 트립신이 절대적으로 필요하므로, PER.C6 세포 생육성 및 여러 인플루엔자 균주를 이용한 감염 후 PER.C6 세포상의 바이러스 복제에 대한 효과를 조사하였다.
트립신의 농도가 낮은 경우의 인플루엔자 바이러스 균주A/시드니/5/97로의 감염
감염일에, 트립신이 최종 농도 0.5, 1, 2, 3 과 5㎍/ml로 존재할 때, PER.C6 세포를 490 cm2 조직배양 회전병에서 밀도 1x106 세포/ml로 시드하였다.
상기의 트립신 농도는 세포들의 성장특성과 그것의 생육성을 간섭하지 않았다(자료는 나타내지 않음). 세포들은 감염다중도 10-4pfu/세포로, PER.C6에서 성장된 인플루엔자 바이러스A/시드니/5/97로 의사감염 또는 감염되었다. 바이러스 생성물을 상기와 같이, 직접면역형광, 적혈구응집반응 조사, 단일-라디칼-면역확산 (SRID) 및 플라크 측정으로 모니터하였다(자료는 나타내지 않음). 상기 실험결과를 도 9에 나타내었고, SRID로 측정된 HA 함량과 HAU로 나타낸 바이러스의 생물학적 활성은 트립신 농도가 1㎍/ml일 때 가장 높았다. 또한, 플라크 측정법을 이용한 도 9는, ml당 플라그 형성 단위(pfu)의 가장 높은 수가, 트립신 2 ㎕/ml를 함유하는 배지에서의 세포 성장에 해당하는 샘플에서 관찰되었다.
인플루엔자 바이러스 균주 B/하빈/7/94에 의한 감염
감염일에, 트립신-EDTA의 농도가 1 내지 5 ㎍/ml 범위로 다양하게 존재하는 경우, PER.C6 세포를 490 cm2 조직배양 회전병에 밀도 1x106 세포/ml로 시드하였다. 세포들을 감염다중도 10-3pfu/세포로 PER.C6-성장 인플루엔자 바이러스 B/하빈/7/94로 감염시켰다. 바이러스 생성물을 도 10에 나타낸 바와 같이, 직접면역형광, 적혈구응집반응 조사 및 플라크 측정으로 모니터하였다. Day 2에 PER.C6의 감염성은 트립신의 농도에 따라 증가하였다. 그러나 Day 3에는 트립신이 1, 2.5, 5 ㎍/ml로 존재할 때, 감염된 세포의 백분율에 중요한 차이가 관찰되지 않았다. 트립신이 없을 때(0 ㎍/ml), 인플루엔자 바이러스 감염이 검출되지 않았다. 최종 수확일(감염 day 4 후)에, 적혈구응집반응 분석으로 측정된 바에 따라, 바이러스의 생물학적 활성은 중요하게 다르지 않았다. 흥미롭게도, 감염 후 day 3과 day 4에 취한 샘플에 실시된 감염성 조사는 바이러스 생산의 차이를 나타내었다. 최고의 적정농도는 트립신 농도가 2.5 내지 5(day 3) 및 1 ㎍/ml(day 4)일 때, day 3과 day 4에 얻어졌다.
인플루엔자 바이러스 재-분류체 X-127로의 감염
감염일에, 트립신-EDTA의 농도가 0 내지 7.5 ㎍/ml 범위로 다양하게 존재하는 경우, PER.C6 세포를 T25 조직배양 플라스크에 밀도 1x106 세포/ml로 시드하였다. 세포들을 감염다중도 10-4과 10-3pfu/세포로 PER.C6-성장 바이러스 X-127(균주 A/베이징/262/95에 대한 알 재-분류체)로 감염시켰다. 바이러스 성장을 직접면역형광, 적혈구응집반응 조사법 및 플라크 측정법으로 모니터하였다. 도 11과 도 12에 나타낸 바와 같이, HAU 적정농도는 트립신 농도와 사용한 1차 감염다중도에 의존하지 않고 샘플 간에 동일하였다. 더우기, 플라크 측정법에 따라 측정된 바에 따르면, 감염성 적정농도에서 중요한 차이는 관찰되지 않았다.
고농도의 트립신 존재하에 인플루엔자 바이러스 균주A/시드니/5/97에 의한 PER.C6의 감염
세포 생육성과 바이러스 복제에 대한 트립신의 농도 증가 효과를 시험하기 위해, PER.C6 세포를 0 내지 12.5 ㎍/ml 범위의 상이한 농도로 트립신-EDTA이 존재할 때, 밀도 1x106 세포/ml로 회전병 중에서 시드하였다. 세포들을 PER.C6에서 성장된 바이러스A/시드니/5/97 바이러스로 감염다중도 4x10-5 pfu/세포에서 의사감염 또는 감염시켰다. 얻어진 배치에서 HAU의 존재를 다음과 같이 결정하였다. 중요하게, 도 13에 나타낸 자료는 최대 10 ㎍/ml까지의 트립신 농도는 세포 생육성을 방해하지 않는다는 것을 분명히 나타내었다. 더우기, HAU에 의한 측정에 따르면, 감염후 day 4에 얻어진 바이러스의 생물학적 활성은 트립신 농도가 2.5 내지 5 ㎍/ml일 때보다 더 높았다. 또한, TCID50을 측정하였고(도 14A), 플라크를 측정하였다(자료는 나타내지 않음). 이들 플라크 측정, 감염성 적정농도(TCID50), HA 절단 및 도 14B에 나타낸 웨스턴 블롯분석에 의해 측정된 정량에 관한 차이는 없었다.
실시예 8
중공섬유 관류 생물반응기 시스템에서 PER.C6 세포에서 인플루엔자 바이러스 생산
PER.C6 세포를 성장시키는 현탁액으로 인플루엔자 바이러스 생산의 측정가능성을 동물 또는 인간 유도된 단백질이 없는(ExCell 525, JRH Biosciences), 무혈청 배지에서 세포 현탁부피 2 리터 세포를 함유하는 3 리터(전체 부피) 생물반응기를 이용하여 연구하였다.
인플루엔자 감염은 세포밀도 약 3x106 세포/ml로 실시되었다. 세포에 PER.C6에서 성장된 A/시드니/5/97 바이러스를 감염다중도 10-4pfu/세포로 접종하였다. 세포의 생육성을 결정하기 위해, 세포 현탁액 5 내지 10 ml의 샘플을 매일 취하여 일반 세포를 계산하여 글루코스 농도 측정, 직접 면역형광법, 적혈구응집반응 및 감염분석을 실시하였다. 이들 실험 결과를 도 15에 나타내었다.
HA 단백질의 존재 및 상태를 조사하기 위해, NIBSC로부터 얻은 두개의 다른 항-HA 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 이용하였다. 또한, 상기와 같이 SRID 조사를 실시하였다. 도 16의 두개의 웨스턴 블롯에 나타낸 결과들은, 이 생물 반응기에서 생산된 인플루엔자 바이러스 배치가 예상농도 15 ㎍/ml의 HA 함량을 얻는다는 것을 나타내며, 이 값은 SRID 조사에 의해 확인되었다. 생산된 HA는 서브유니트 조성물과 참조 아형 특이 항혈청을 갖는 면역 반응성의 항에서 참조 NIBSC HA와 비교되었다.
실시예 9
15 리터 생물반응기에서 PER.C6 상의 A/시드니/5/97 감염 후 특이적 하류 흐름 가공(DSP)
현탁액 성장 PER.C6 세포들을 37 ℃에서 15 리터-생물반응기 중공 섬유 관류시스템에서, 무혈청 ExCell 525 배지(JRH Biosciences)에서 세포 현탁 부피 10 리터로 배양시켰다. 5 ㎍/ml의 트립신-EDTA(Life Technologyes) 함유 배지에서, 35 ℃에서, 세포밀도 약 3.3 x106 세포/ml로 인플루엔자 감염을 실시하였다. 세포를 PER.C6-성장 A/시드니/5/97 바이러스(passage number 3)로 감염다중도 10-4 pfu/세포로 접종시켰다. 트립신-EDTA를 함유하는 무혈청 ExCell 525 배지에서 감염 후 처음 24시간 동안 연속 관류하였다. 감염 2일 후, 세포에 글루코스, 필수 아미노산과 과량의 글루타민을 함유하는 유기배양 용액을 공급하였다: 50m/v% 글루코스 함유 현탁액(NPBI-The Netherlands) 리터당 82ml, 50 x Gln이 없는 필수 아마노산(Gibco-BRL-Life Technologies) 및 글루타민 200 mM(Gibco-BRL-Life Technologies). 세포 현탁액 샘플 10 ml를 매일 취하여 표준 세포 계수(결과는 도 17, 왼쪽 그래프에 나타내었다), 글루코스 농도 측정(도 17, 오른쪽 그래프) 및 감염성 조사(자료 나타내지 않음)를 실시하였다. 추가로, HA 단백질을 웨스턴 블롯 분석으로 조사하고 NIBSC 표준 HA 대조군과 비교하였다(도 20). 전체 세포를 최종 수확일(감염 후 92 h)에, 세포 잔해 정화를 제조자 지침에 따라 PowerfugeTM 분리시스템을 이용하여 20,000g에서 연속흐름 중에 실시하였다. 그 다음, 정화된 상징액을 500 kD 컷오프 중공 섬유 원심분리를 이용하여 20배 농축시켰다(A/G Technology, JM Separations). 도 21에 나타낸 결과는 적혈구 응집반응과 감염 조사에 의해 측정된 중공섬유로 농축 후 생 인플루엔자 바이러스의 정량 회수가 매우 중요함을 나태낸다.
실시예 10
PER.C6-성장 인플루엔자 바이러스와 그것으로부터 유도된 백신의 면역원성
PER.C6-성장 인플루엔자 바이러스의 면역원성을 결정하기 위해 인비보 연구와 펠렛에서의 공격모델(Challenging model)을 고안하였다. 세개의 균주가 각각 15 ㎍ HA를 함유하는 (A/시드니/5/97, A 베이징/262/95 및 B/하빈/7/94으로 이루어진) 3가 완전 불활성화 인플루엔자 백신 2 배치를 사용하였다. 첫번째 배치는 수정난에서 얻었고, 두번째는 PER.C6 세포에서 얻었다. 3가 완전 불활성화된 PER.C6-유도 인플루엔자 백신의 생산, 정제, 불활성화 및 제제화를 다음과 같이 실시하였다.
PER.C6 상의 A/시드니/5/97, A/베이징/262/95 및 B/하빈/7/94 인플루엔자 균주의 성장
세개의 인플루엔자 바이러스 배치들을 세포 현탁액 부피 2 리터로 3개의 분리된 3 리터 중공섬유 공급-배치 생물반응기 시스템에서 생산하였다. 공급배치는 다음의 용액을 첨가하여 실시하였다: 50 m/v% 글루코스(NPBI), 50x Gln이 없는 필수 아미노산(Gibco-BRL-Life Technologies), 200mM 글루타민 (Gibco-BRL-Life Technologies) 및 7.5 m/v% NaHCO3(Merck)로 이루어진 총 부피 96 ml를 한번에 첨가하였다. 인플루엔자 감염을, 트립신-EDTA 5 ㎕/ml를 함유하는 ExCell 525 무혈청 배지에서, 세포밀도 범위 1.8x106 내지 2.6x106 바이러스성 세포/ml로 실시하였다. PER.C6 세포를, 상이한 감염다중도의 A/시드니/5/97, A 베이징/262/95 및 B/하빈/7/94 바이러스 배치로 접종시켰다:10-4(A/시드니/5/97) 또는 10-3(A 베이징/262/95 및 B/하빈/7/94)pfu/세포. 바이러스 생산 기간 동안, 샘플 10 ml를 매일 취하여 표준 세포와 생육성 계산, 글루코스 농도 측정, 직접 면역형광 및 적혈구 응집반응 조사를 실시하였다. 도 22(A/시드니/5/97-감염된 PER.C6 세포에 대한 결과)는 바이러스로 감염 후의 전체 및 생육성 세포계산(좌측상부 패널), 글루코스 소모(우측상부 패널), 직접 형광분석 검출에서 양성 세포의 백분률(좌측하부 패널) 및 HAU's(우측하부 패널)을 나타낸다. 도 23(A/베이징/262/95-감염된 PER.C6 세포에 대한 결과)은 바이러스 감염 후의 전체 및 생육성 세포계산(좌측상부 패널), 글루코스 소모(우측상부 패널), 직접 형광분석 검출에서 양성 세포의 백분률(좌측하부 패널) 및 HAU's(우측하부 패널)을 나타낸다. 도 24(B/하빈/7/94-감염된 PER.C6 세포에 대한 결과)은 바이러스로 감염 후의 전체 및 생육성 세포계산(좌측상부 패널), 글루코스 소모(우측상부 패널), 직접 형광분석 검출에서 양성 세포의 백분률(좌측하부 패널) 및 HAU's(우측하부 패널)을 나타낸다. 농축물을 함유하는 바이러스는 DAP까지 -80 ℃에서 저장하였다.
모든 경우에, 글루코스 소모와 생육성 및 PER.C6 세포의 전체 세포 계수를 비교하였다. 또한, 직접 형광분석으로 측정한 바에 의하면 3개의 바이러스의 생산 수준은 비슷하였다. 비록 다른 균주에서 HAU와 감염성 적정농도는 달랐지만, PER.C6는 본 실시예에서 시험된 모든 인플루엔자 바이러스의 복제를 유지하였다.
전체 배치를 수확한 날 (감염 후 day 3 또는 day 4), 바이러스성 현탁액을 테이블탑 원심분리기에서 200 rpm으로 원심분리하여 정제하고, 제조사 지침에 따라 750 컷오프(A/G Technology, JM Separations)의 중공 섬유 카트리지를 이용한 한외여과로 10배 농축하였다. 인플루엔자 바이러스를 2 연속 밀도 원심분리 단계를 거친 농축된 상징액으로 정제하였다: 25 ~ 70% 블럭 슈크로스 구배(27 K에서 1.5 시간) 이후 연속 25 ~ 70% 슈크로스 구배(23 K에서 4 시간). 바이러스 밴드를 인산염 완충액 약 50 ml중에 희석시키고 최종적으로 한외원심 분리기에서 24,000 rpm으로 펠렛화하였다. 바이러스 펠렛을 1.5 내지 2.3 ml의 인산염 완충액에 녹이고, 부분 표본화하고 -80 ℃에서 냉동시켰다. 불활성화된 인플루엔자 백신의 제제화는 SRID 조사(Wood et al 1977)에 의해 측정된 "면역학적으로 활성인" HA의 양(마이크로그램으로)을 기준으로 한다. 상기 시험은 배치의 HA 함량을 특징화하기 위해 실시되었다. 동시에 단백질 총량을 제조사 지침에 따라, 로오리-기준 DC-단백질 조사 키트(Biorad)를 이용하여 측정하였다. HA가 바이러스 제제의 전체 단백질 농도의 20 ~ 30%를 구성한다는 것을 발견하였다.
실시예 11
알과 PER.C6상 생산된 불활성 백신 등의 인비보 면역원성
흰담비와 마이스는 인플루엔자 감염을 연구하기 위해 잘 확립된 동물 모델이며 인플루엔자 바이러스의 효율과 면역원성을 결정하는데 사용된다. 마우스 모델 시험 시스템을 사용하여, PER.C6와 A/시드니/5/97, A 베이징/262/95 및 B/하빈/7/94를 함유하는 3가 백신으로부터 유도된 달걀에서 생산된 면역원성을 적혈구응집반응 억제 조사로 백신화된 동물의 혈청을 분석하여 비교하였다. 흰담비 감염 모델을 이용하여, 면역은 A/시드니/5/97으로 공격되었다. MDCK 세포에 대한 바이러스 복구와 혈청에서 실시된 적혈구 응집반응 억제 조사를 두개의 백신의 면역원성과 효율을 비교하는데 사용하였다.
마이스에서의 인비보 연구
90 마리의 암컷 Balb/C 마이스를 10 마리의 마이스 9개 군으로 나누었다. Day 0에, 최대 100 ㎕의 혈액을 수집하였다. 혈청을 분리하고 -20 ℃에서 저장하였다. 그 다음, 각 마이스를 표 1의 스케줄에 따라 알맞는 백신으로 접종하였다. Day 28에, 혈액 100 ㎕을 추가로 취하였다. 혈청을 -20 ℃에서 저장하였다. 각 마이스를 표 1의 스케쥴에 따라 다시 접종하였다. Day 42에, 혈액 샘플 100 ㎕을 취하고 모든 마이스를 희생하였다. 혈청을 분리하고 -20 ℃에서 냉동시켰다. 적혈구 응집반응 억제(HI) 조사를 day 0, 28과 42에 혈청 샘플에 실시하였다. 이들 모든 분석은 알과 세포 성장 바이러스 모두에 대해 매일 동시에 실시되었다.
마이스에서의 면역원성 시험
군 번호 항원형 접종 부피(ml) 접종 경로 투여량 당 총HA㎍
1 알 3가 완전 바이러스입자 0.5 s.c. 9.0
2 알 3가 완전 바이러스입자 0.5 s.c. 3.0
3 알 3가 완전 바이러스입자 0.5 s.c. 1.5
4 알 3가 완전 바이러스입자 0.5 s.c. 0.15
5 PER.C6 3가 완전 바이러스입자 0.5 s.c. 9.0
6 PER.C6 3가 완전 바이러스입자 0.5 s.c. 3.0
7 PER.C6 3가 완전 바이러스입자 0.5 s.c. 1.5
8 PER.C6 3가 완전 바이러스입자 0.5 s.c. 0.15
9 PBS 0.5 s.c. 0
흰담비에서의 인비보 연구
18 마리 성체 암컷 흰담비(albino 또는 polecat)를 6 마리씩 3개군으로 다음 과 같이 나누었다: 1군은 근육내(IM)로 알 유도 시험 백신을 수용하였고, 동물들은 A/시드니/5/97로 공격되었다. 2군는 PER.C6 유도 시험백신을 IM 수용하였고, 동물들은 A/시드니/5/97로 공격되었다. 3군은 시험 백신 희석제 만을 수용하었고 A/시드니/5/97로 공격되었다. Day 0과 28에, 시험 백신을 투여하였다. Day 56에, 모든 흰담비를 TCID50 103에서 A/시드니/5/97 공격 바이러스 0.5 ml로 비내 감염시켰다. 코세척을 실시하고 감염성 세포의 수를 세고, 온도와 흰 담비의 중량을 day 57부터 63까지 매일 한번씩 모니터하였다. 혈청을 분리하고 -20 ℃에서 저장하였다. 코세척 샘플을 아이스에 저장하고 트리판 블루 제외조사를 이용하여 코세척 복구세포 수를 세었다. 코세척 샘플로부터 얻은 바이러스의 적정농도를 MDCK 세포에서 바이러스 회복을 측정하여 결정하였다. Spearman and Karber(1931)계산을 이용하여 TCID50값을 산출하였다. 적혈구응집반응 억제 분석을 day 0, 28, 56과 63에 취한 샘플에서 실시하였다. 이 실험으로부터 PER.C6 유도 시험 백신이 효과적이라고 결론지었다.
실시예 12
PER.C6에서 생산된 인플루엔자 바이러스로부터 유도된 HA 단백질의 특성
PER.C6 세포에서 HA의 당부가를 연구하기 위해, 절단되지 않은 HA(HA0)의 배치를 생성하였다. PER.C6 세포를, 최종 농도 5 ㎍/ml로 트립신-EDTA 함유 ExCell 525 배지에서, 바이러스 A/시드니/5/97(PER.C6에서 계대 수(passage number) 5)로 감염다중도 1, 0.1 및 0.01 pfu/세포로 감염시켰다. 배양 1시간 후, 세포를 PBS로 두번 씻어 트립신을 제거하고 35 ℃와 10 % CO2에서 트립신의 부재하에 O/N 배양시켰다. 그 후, 세포 현탁액을 수확하고 원심분리하고(500 g), 세포 펠렛을 배지로 두번 세척하였다. 바이러스 상징액을 -80 ℃에서 냉동시키고 그의 샘플을 절단되지 않은 HA 단백질의 존재 또는 비존재하에 조사하기 위해, 기재와 같이 웨스턴 블롯 분석에 이용하였다.
절단되지 않은 HA 단백질(HA0)은 두개의 서브유니트:HA1과 HA2로 이루어지며, 이황화 결합으로 연결된다. 상기 이황화 결합은 DTT로 환원되어 절단될 수 있으므로, HA1과 HA2는 분리될 수 있고, 환원겔에서 가시화되며, 그 다음 서브유니트를 인식하는 항혈청을 이용하여 웨스턴 블롯된다. HA 단백질이 오직 HA0만으로 이루어진다면, 하나의 밴드가 보일 것이며, 이것은 HQ1 서브 유니트 및 흰담비 이동 HA2 서브유니트와 비교할 때 SDS/PAGE 겔을 통해 천천히 이동한다. 도 25에 나타낸 결과는 NIBSC(UK)로부터 얻은 알 유도 양성 대조와 비교했을 때, PER.C6 감염으로부터 주로 미분화된 HA0의 존재를 제안한다. 검출된 밴드가 미분화된 적혈구 응집소임을 확인하기 위해, HA0 샘플을 배지 O/N 37 ℃에서 2.5 내지 10 ㎍/ml 범위의 다양한 농도의 트립신으로 소화시켰다. 그 다음, 소화된 단백질을 SDS/PAGE 겔에 환원 조건하에서 장전하고 도 14의 기재와 동일한 항혈청을 이용하여 웨스턴 블롯 분석하였다. 도 26A에 나타낸 바와 같이, PER.C6에서 절단되지 않은 HA 단백질의 발생을 확인하는, HA0의 절단을 얻었다. 이 결과를 기초로 배지에서 트립신 활성을 측정하기 위한 조사를 인플루엔자 HA0를 기질로 이용하여 전개시켰다.
트립신 활성 조사
인플루엔자 보호 작업의 배지에 존재하는 트립신이 여전히 활성인지 여부를 결정하기 위해, 트립신 활성을 조사하였다. 이 조사는 인플루엔자 백신 생산에 더 관련있는 기질을 절단시키기 위한 트립신의 효소활성의 측정을 기초로 한다:HA0.
인플루엔자 B/하빈/7/94(감염다중도 10-3/10-4 pfu/세포)로 접종된 PER.C6의 배양중에 트립신이 전체 생산 작업 중 활성으로 남아있는가를 결정하였다. 마지막에, 감염 후 day1, 2, 및 3에 취한 상징액 10 ㎕를 사용하여, O/N 37 ℃에서, 인플루엔자 A/시드니/5/97 바이러스의 HA0를 이루는 기질 68ng을 절단시켰다. 소화 후, 프로테아제 억제제를 150mM DTT(Fluck)로 3x 라엠리 완충액 중의 1x의 최종 농도로 첨가하였다. 샘플을 10% 트리스-HCl SDS/PAGE 겔(Biorad)에 장전하고 작동시켰다. 기재와 같이 웨스턴 블롯을 실행하였다. 그 결과를 도 26B에 나타내었고, PER.C6에 인플루엔자 B/하빈 바이러스를 접종시킨 배양에서, 트립신은 배양 상등액이 HA0를 완전히 절단시킬 수 있는 것과 같이, 전체 생산 작업동안 활성으로 남아있음을 나타낸다.
실시예 13
N-글리코시다제 F를 이용한 HA0의 소화
인플루엔자 바이러스 HA 단백질은 3 내지 9 N-연결 당부가 고당류 부위를 함유한다. 부위의 수는 바이러스 균주에 의존한다. 상기 부위의 위치는 HA 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 결정되며, 인플루엔자의 바이러스 게놈은 잘못이 있는 RNA 폴리머라제에 의해 복제되므로, 당부가의 첨가 또는 제거를 발생하는 돌연변이가 매우 자주 일어난다. HA상에 존재하는 과당류 사슬의 조성과 구조를 생합성법과 숙주 세포에 의해 제공되는 트리밍 당부가 효소법으로 결정하였다. HA의 당부가는 발병력과 백신 효율에 중요한 역할을 하므로, 인플루엔자 감염된 PER.C6상 생성된 HA의 특성을 조사하였다. N-글리코시다제 F 효소를 갖는 A/시드니/5/97 절단되지 않은 HA0 단백질의 소화를 제조사 지침에 따라 실시하여 A/시드니/5/97 HA 폴리펩티드에 존재한다고 예상되는 7개의 과당류를 제거하였다. 인플루엔자 A/시드니/5/97을 1% 트리톤 X-100(Mercck)으로 용해시켰다. 프로테아제 억제제를 HA 68 ng에 해당하는 상기 용해된 바이러스의 부분표본에 최종 농도 1x(완전 프로테아제 억제제 cocktail Boheringer Mannheim)까지 첨가하였다. 상기 샘플을 NaPO4 pH7 100 mM, EDTA 10 mM (J.T.Baker), 1% SDS(J.T. Baker)및 1% B-메르캅토에탄올(Merck)의 존재하에 배양하였다. 이것을 실온에서 10 분간 배양하였다. 상기 샘플을 NaPO4 pH7 mM, EDTA 10 mM (J.T.Baker), 0.625% NP-40 및 1% B-메르캅토에탄올(Merck)의 존재하에 5배 희석하였다. 이것의 40 ㎕를 글리코-F 소화에 사용하였다. 상기 2 ㎕에, 글리코-F(N-글리코시다제 F, Boehringer) 1 U/㎕ 를 첨가하고 37 ℃에서 16 시간의 최소기간 동안 배양하였다. 그 다음, 150 mM DTT를 갖는 3x 라엠리 완충액을 최종농도 1x까지 첨가하였다. SDS-Page와 웨스턴 블롯을 7.5% SDS/PAge 겔에서 실시하였다. 간단히 말하자면, 블롯은 블럭용액으로 실온에서 30분동안 블럭되었고(5% 탈지분유, 1% 토끼 혈청이 보충된 TBiorad in TBST (Rockland)), 그리고 TBST로 3번 세척하였다. 그 다음, 블롯을 5% 토끼 혈청 (Rockland)을 갖는 1% BSA/TBST중에 1/500 으로 희석된 항 A/시드니/5/97 HA 항혈청(98/768 NIBSC)로 실온에서 철야로 배양 하였다. 다시 블롯을 TBST로 1번 세척하였다. 마지막으로, 블롯을 실온에서 1시간 동안 블럭용액에서 1/6000 희석된 HRP 라벨된(Rockland) 토끼 항 양 항혈청(rabbit anti sheep antiserum-HRP labeled)으로 배양하였다. TBST로 8번 세척한 후, 단백질-컨쥬게이트 복합체를 ECL(Amersham Pharmacia Biotech)로 가시화시키고, 필름(Hyperflim, MAersham Life Science)을 노출시켰다. 도 27에서와 같이, 글리코시다제-F 효소로의 처리는 단백질 크기를 약 20 ~ 30 kD로 감소시키며, 과당류당 약 4kD의 예상 손실을 갖는다. 별표 표시된 단백질 밴드는 탈-당부가 HA0이며, 이것은 HA0이 HA1과 HA2 서브유니트로 절단 후 얻어진 HA1 서브유니트와 유사하게 이동한다(우측 선).
실시예 14
아쿠타제를 이용한 HA0의 절단
포유동물-유도 트립신-EDTA를 비포유류 또는 재-분류체 단백질로 치환하는 가능성을 조사하였다. 최근, 무척추 동물 종의 단백질 분해 및 콜라겐 분해 효소 (AccutaseTM, PAA)의 혼합물이 일반 세포배양으로부터 이용가능해졌다. 비-포유류에서 기인하므로, 아쿠타제는 프리온, 파보바이러스 및 트립신-EDTA 용액을 염색시킬 가능성이 있는 다른 성분들이 없다. 아쿠타제에 존재하는 프로테아제 타입에 관련하여 현재 얻을 수 있는 정보는 없다. HA0의 절단은 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 연구되었다. 트립신 없이, 감염다중도 1 pfu/세포로 A/시드니/5/97로 감염된 PER.C6에서 얻은 HA0 단백질의 일정량은 일련의 희석된 아쿠타제로 O/N 37 ℃에서 소화되었다. 양성 대조로서, 트립신-EDTA 100 ng으로 소화된 동일한 양의 HA0를 사용하였다. 그 다음, 소화된 단백질을 웨스턴 블롯 분석을 위해, 환원조건하에서 10 % SDS-PAGE 겔에 장전시켰다. 도 28에 나타난 바와 같이, 2 ㎕ 아쿠타제를 사용한 소화는 HA0을 완전히 절단시켰고; 0.2 ㎕의 사용에 의해 일부 절단이 관찰되었다.
상기 결과는 인플루엔자 복제와 생산중 아쿠타제로 처리하는 것은 PER.C6를 인플루엔자로 감염 중 트립신-EDTA를 대체할 수 있음을 제안한다.
실시예 15
PER.C6 세포상의 인플루엔자 바이러스 전자현미경 분석
PER.C6에서 생성된 인플루엔자 바이러스의 표현형을 결정하기위해, 상징액과 슈크로스 정제 재료를 함유하는 바이러스 뿐만 아니라 인플루엔자 균주 A/시드니/5/97로 감염된 PER.C6 세포들에 대해 투과전자현미경 연구를 실시하였다. 사용된 모든 방법은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 도 29는 상기 바이러스의 생활주기의 최종 단계를 버딩(budding)과 세포질막으로부터의 포장된 바이러스 입자 방출로 표현하였다. HA와 NA 바이러스 단백질에 해당하는, 바이러스 입자의 원주를 장식하는 스파이크가 검출되었다. 또한 모양들은 인플루엔자 바이러스의 특징적인 다면발현(pleiomorphism)을 나타낸다.
실시예 16
인플루엔자 바이러스 A와 B 균주의 광범위한 변이체에 의한 PER.C6의 감염
플렛폼 기술에 따라 인플루엔자 바이러스 백신 생산용 PER.C6로서, PER.C6는 다양한 인플루엔자 아형의 다양항 범위의 균주의 성장을 지지해야 한다.
T25 플라스크 및/또는 ExCell 525 배지 중의 6웰 플레이트에서 성장하는 PER.C6 세포의 정적(static) 현탁 배양은 도 30A에 나타낸 16개의 다른 균주의 인플루엔자 바이러스로 106세포/ml의 세포밀도로 감염되었다. 이들 균주들은 몇몇 H3N2, H1N1, B형 및 아비안 균주를 포함한다. 감염은 트립신 5㎍/ml의 존재하에 실시되었다. 바이러스들은 알-계대접종된 야생형 또는 재-분류체 균주와 같은 NIVSC(UK)로부터 얻어졌고 기록된다. 감염은 다른 균주로 전달된 제품 시트에서 NIBSC에 의해 제안되는 바이러스 희석으로 실시된다. 시험된 모든 바이러스들은 면역형광법(도시하지 않음) 및 pfu 조사에서 상징액 흐름의 적정으로 가시화된 바와 같이 PER.C6에서 증식될 수 있다(도 30B).
이들 결과는 A/요하네스버그/33/94, B/베이징/184/93 및 A/오리/싱카포르-Q/F119-3/97과 같은 평범한 인플루엔자 바이러스(별표로 나타냄)들이, 이들은 일반적으로 부화계란에서 생산하기에 매우 어려운데, 인간 PER.C6 세포에서 복제되고 생산될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 17
PER.C6 상의 단순 헤르페스 1(HSV-1)바이러스, 단순 헤르페스 2(HSV-2)바이러스 및 홍역 바이러스의 발생
인플루엔자 바이러스와 아데노바이러스와 다른 바이러스, 예를 들면 단순 헤르페스 바이러스 1형과 2형 및 홍역 바이러스들 역시 PER.C6세포에서 복제될 수 있 는지 여부를 시험하였다. 이들 PER.C6-성장 바이러스로부터 유도되고 야생형 감염을 예방하기 위한 인간 중화효과를 유도하는 PER.C6-성장 바이러스로부터 유도된 백신들을 PRE.C-성장 바이러스 배치로부터 발생하였다. ATCC에서 얻고 PER.C6세포의 감염에 사용되는 균주들을 표 2에 나타내었다.
ATCC에서 얻고 PER.C6 세포의 감염에 이용되는 단순 헤르파스 바이러스와 홍역 균주
바이러스 균주 ATCC catnr. Lotnr. 계대감염 병력 적정농도
단순 헤르페스 1형 Macintyre VR-539 1327850 y.s./12, PR Rabk/5, Mb/1, PrRabK/5, Vero/4, Vero(ATCC CCl-81)/1 106.75 TCID50/200 ㎕
단순 헤르페스 2형 MS VR-540 216463 Sheep choroid plexus/?, HeLa/?, PrRabK/7, Vero(ATCC CCl-81)/3 107.5 TCID50/200 ㎕
홍역 Edmonston VR-24 215236 HK/24, HuAm/40, MRC- 5/1, MRC-5(ATCC CCL- 171)/1 104 TCID50/ml
ATCC에서 얻은 HSV-1과 HSV-2 및 홍역 바이러스가 PER.C6에서 복제되고 생성될 수 있는지를 시험하기 위해, 계대 수 46 세포를 랩텍챔버에 시드하고, Poly-L-라이신을 당업자들에게 알려진 방법으로 105 세포/웰로 코팅하였다. 원숭이에서 유도된 (ATCC에서 얻음) 베로(Vero)세포를 계대 수 137로 배양하였고 양성대조로 사용하였고, 밀도 2.5x104 세포/웰로 시드하였다. Day 0에, 웰이 PER.C 세포가 60%이고 Vero 세포가 80% 합류된 웰일 때, 세포들을 다양한 감염다중도(10-3, 10-2, 10-1, 및 1 TCID50/세포)로 감염시켰다. 감염 후, 매일 세포들을 고정시키고, 제조사 지침에 따라, 키트를 이용하여 FITC-컨쥬게이트된 형의 특이적 모노크로날 항체(Imagen 헤르페스 단순 바이러스(HSV) 1형과 2형(Dako)) 및, HA와 홍역 바이러스의 매트릭스 단백질에 대해 FITC-콘쥬게이트된 항체를 이용하여 면역형광법으로 조사하였다. 항혈청은 HSV-1과 HSV-2 및 홍역 바이러스 항원에 대해 검출되었다.
도 31에 요약된 결과들은 PER.C6가 HSV-1(도 31D), HSV-2(도 31E) 및 홍역 바이러스(도 31A)에 대해 허용가능함을 나타낸다. 더우기, 반응 속도는 이들 바이러스들이 감염다중도-의존 방식으로 PER.C6에서 복제함을 제안한다.
그 다음, HSV-1, -2 및 홍역 바이러스들이 PER.C6에서 증식할 수 있는지를 조사하였다. 이것을 위해 세포들을 HSV-1(도 32C)와 HSV-2(도 32A)에 대해 감염다중도 0.01, 0.1. 및 1 TCID50/세포로, 및 홍역 바이러스(도 32B)에 대해 감염다중도 0.001 TCID50/세포로 감염시켰다 (계대 수 1). 거의 완전 cpe의 발생에서, 세포들과 상징액들을 수확하고, 액체 질소로 신속히 냉동시키고, 녹였다. 이후, 분류된 상징액들을 약 100 ㎕를 이용하여 PER.C6에 임의로 계대시켰다(이것은 계대 수 2이다). 거의 완전한 cpe에 다시 도달한 후, 세번째 계대(계대 수 3)를 유사한 방법으로 실시하였다. 계대 수 2와 3의 감염다중도는 TCID50 조사에 의해 소급하여 결정하였다.
이들 실험의 결과는 단순 헤르페스 바이러스 1형과 2형 및 홍역 바이러스가 PER.C6에서 복제가능하며 복제와 증식이 감염다중도가 10-7만큼 낮을 때에도 일어날 수 있음을 나타낸다.
실시예 18
PER.C6상의 복제를 위한 로타바이러스 선별법
PER.C6가 로타바이러스의 복제를 지지할 수 있는가 여부를 조사하기 위해, PER.C6 세포를 로타바이러스(MMU 18006; ATCC#VR-954; 균주 S:USA:79:2; lot# 2181153)로 감염시켰다. PER.C6 세포들(계대 수 41)을 밀도 1x105/ml로 배양하고 원숭이에서 유도된 Vero 세포(ATCC로부터 얻음. 계대 수 139)를 밀도 2.5x105/ml로 배양하고, 그 다음 랩텍챔버에 시드하였고, 이것은 당업자들에게 알려진 방법으로 폴리-L-라이신으로 예비코팅시켰다.
세포들을 트립신-EDTA 2 ㎍/ml의 존재 및 비존재하에 레서스 로타바이러스로감염다중도 1 TCID50/세포로 감염시켰다. 감염 90분 후, 세포들을 ExCell 525 배지로 세척하고, 습식대기중 10% CO2의 37℃에서 더욱 배양하였다. 감염 후 연속 5일, 상징액의 샘플을 수확하고, 테이블탑 원심분리기로 2000 rpm으로 원심분리하여 세포와 세포 조각들로부터 분리하고, 로타바이러스에 대해 특징적인 ELISA 에서 분석하였다(IDEIA Rotavirus, Dako). 도 33에 나타낸 결과는 로타 바이러스가 PER.C6에서 복제됨을 분명히 나타낸다.
Figure 112002016053966-pct00001
Figure 112002016053966-pct00002

Claims (45)

  1. 백신으로 사용하기 위한 아데노바이러스 이외의 바이러스의 제조방법으로,
    아데노바이러스의 E1 영역(region)이 제공되어 있는 인간 세포를 상기 바이러스로 감염시키고,
    상기 인간 세포를 적합한 배지에서 배양하여 상기 바이러스를 발현하게 하고, 그리고
    상기 배지 및/또는 상기 인간 세포로부터 상기 바이러스를 수확하는 단계들을 포함하고,
    여기서 상기 인간 세포는 배양으로 성장하기 위해 불멸화되어 있는 것인 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 세포는 인간 1차 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 1차 세포는 상기 E1 영역의 유전자 생성물에 의해 불멸화된 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 인간 배아 망막아세포에서 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 E1 영역은 상기 인간 세포의 게놈에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 아데노바이러스성 구조 단백질을 생성하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 추가로 E2A을 코드화하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 E2A을 코드화하는 서열은 상기 인간 세포의 게놈에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 E2A 코드화 서열은 온도 민감성 돌연변이체 E2A를 코드화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 세포는 다른 아데노바이러스성 서열은 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 세포는 현탁액으로 성장할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 세포는 혈청없이 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 세포는 ECACC No. 96022940으로 기탁된 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 번역-후 및/또는 번역주변(peritranslational) 수식을 겪는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 수식은 당부가를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 바이러스성 단백질은 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제 및 적혈구 응집소 중에서 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 리노바이러스, 아프터바이러스, 또는 폴리오미엘리티스 바이러스와 같은 장내 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 단순 헤르페스 바이러스, 가성광견병 바이러스 또는 소 헤르페스 바이러스와 같은 헤르페스 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스와 같은 오르소미소바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 호흡장해 바이러스, 이하선염 바이러스 또는 홍역 바이러스와 같은 파라미소바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스와 같은 레트로바이러스 또는 상기 바이러스는 파르보바이러스 또는 파포바바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 전염성 가스트로엔테리티스바이러스와 같은 로타바이러스 또는 코로나바이러스, 또는 진드기-매개성 뇌염 바이러스 또는 황열병 바이러스와 같은 플라비바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 풍진 바이러스 또는 이스턴-, 웨스턴-, 또는 베네수엘라 말 뇌촉수염 바이러스와 같은 토가바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 헤파티티스 A 또는 헤파티티스 B와 같은 간염 유발 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 돼지 콜레라 바이러스와 같은 페스티바이러스 또는 광견병 바이러스와 같은 라브도바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 한타바이러스와 같은 부니아바이러스과 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
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  32. 게놈 내에 아데노바이러스의 E1 영역을 갖는 인간 세포로, 상기 세포는 구조적 아데노바이러스성 단백질을 생성하지 않고 비-아데노바이러스성 바이러스를 코드화하는 핵산을 가지며, 상기 인간 세포는 인간 배아 망막아세포인 것을 특징으로 하는 인간 세포.
  33. 제 32항에 있어서, ECACC No. 96022940으로 기탁된 세포인 것을 특징으로 하는 인간 세포.
  34. 제 32항 또는 제33항에 있어서, 게놈 내에 E2A을 코드화하는 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 세포.
  35. 제 34항에 있어서, 상기 E2A는 온도 민감성인 것을 특징으로 하는 인간 세포.
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