TW202108168A

TW202108168A - 不活化病毒組成物及茲卡(zika)疫苗調配物

Info

Publication number: TW202108168A
Application number: TW109114908A
Authority: TW
Inventors: 麥可強森; 蘇希瑪寇瑪瑞迪
Original assignee: 美商武田疫苗股份有限公司
Priority date: 2019-05-08
Filing date: 2020-05-05
Publication date: 2021-03-01
Also published as: IL288002A; MX2021011913A; KR20220007077A; CA3137652A1; BR112021019845A2; CN113939311A; AU2020269164B2; SG11202110975XA; EP3965811A1; AU2020269164A1; WO2020226831A1; AR118881A1; US20220211836A1; JP2022533550A

Abstract

本發明係關於一種液體不活化病毒組成物，其包含：不活化之全茲卡(Zika)病毒、至少一種具有至少約6.5 mM之濃度的醫藥學上可接受之緩衝液及視情況選用之多元醇，其中該至少一種醫藥學上可接受之緩衝液不包含磷酸根離子；及來源於該液體不活化病毒組成物之疫苗。

Description

不活化病毒組成物及茲卡(ZIKA)疫苗調配物

發明領域

本揭露係關於包含不活化之全茲卡病毒之不活化病毒組成物及調配物、製造方法及其用途以及來源於此之疫苗。

茲卡病毒為一種黃病毒，與其他蚊媒病毒(例如，黃熱病病毒、登革熱病毒、西尼羅河病毒及日本腦炎病毒)同屬黃病毒科，自2013年病毒傳入巴西以來，已在半個地球範圍內迅速傳播。該病毒已蔓延至中美洲及北美洲，包括美國領土，因此現在正威脅美國大陸。事實上，茲卡病毒株PRVABC59係自一名在2015年去過波多黎各之人的血清中分離。已對此株之基因體進行至少三次定序(參見Lanciotti等人 Emerg. Infect. Dis. 2016年5月;22(5):933-5及GenBank登錄號KU501215.1；GenBank登錄號KX087101.3；以及Yun等人 Genome Announc. 2016年8月18日;4(4)及GenBank登錄號ANK57897.1)。

該病毒最初於1947年在烏幹達分離，1952年首次與人類疾病相關，且在非洲及東南亞偶然經確認為輕度自限性發熱疾病之原因(Weaver等人 (2016) Antiviral Res. 130:69-80；Faria等人 (2016) Science. 352(6283):345-349)。然而，在2007年，一場疫情出現在北太平洋之雅浦島，接著在太平洋上自一島嶼傳播至另一島嶼，導致2013-2014年法屬波利尼西亞之大規模疫情，然後蔓延至新喀里多尼亞、庫克群島，且最終至複活節島。亞洲譜系病毒隨後轉移至西半球，其路線仍未確定(Faria等人 (2016) Science. 352(6283):345-349)。該病毒可由埃及伊蚊、白紋伊蚊以及可能由赫斯里伊蚊(A. hensilli)及波里尼西亞伊蚊(A. polynieseinsis)經動物傳播(Weaver等人 (2016) Antiviral Res. 130:69-80)。另外，認為可存在其他傳播病毒之載體，且病毒可藉由輸血經胎盤及/或藉由性接觸傳播。

2015年底，在茲卡病毒廣泛感染之地區，胎兒畸形(例如小頭症)及格巴二氏症候群(GBS)顯著增加，這敲響了警鐘，茲卡病毒之毒性可能比最初認為的要大得多，促使世界衛生組織(WHO)宣佈國際關注的公共衛生緊急事件(PHEIC)(Heymann等人 (2016) Lancet 387(10020): 719-21)。雖然茲卡病毒對公眾健康構成重大威脅，但目前尚無FDA批准之疫苗或治療方法，並且控制茲卡病毒之唯一預防措施為管理蚊子種群。

最近致力於表徵重組茲卡病毒以用於開發潛在疫苗，鑑別出非人類細胞適應之茲卡病毒，其在病毒包膜蛋白之位置330處載有突變(Weger-Lucarelli等人 2017. Journal of Virology)。此項研究作者發現，茲卡病毒株PRVABC59之全長感染性cDNA純系在選殖過程中擴增時存在遺傳不穩定性，並且選擇將病毒基因體進行分裂來解決所觀察到之不穩定性，開發並應用雙質體系統。然而，用於開發茲卡疫苗之雙質體系統不太理想。因此，需要開發用於治療及/或預防茲卡病毒感染之疫苗，其利用遺傳穩定之茲卡病毒。

希望不活化病毒組成物顯示出良好穩定性，具體而言，有必要在製造疫苗期間作為通常稱為「原料藥」(其已經純化及去活化)之中間產物的不活化病毒組成物可運輸及儲存較長時間，並且在等待調配成終產物(亦即疫苗)時不會喪失其活性。例如，不活化病毒組成物可經冷凍(諸如在-80℃下)，以便其可儲存較長時間。因此，重要的是，不活化病毒組成物在-80℃下儲存期間係穩定的。此外重要的是，不活化病毒組成物能夠承受溫度之變化。特別重要的是，不活化病毒組成物不因冷凍與解凍而喪失活性，此造成一個或多個凍融循環。對一個或多個凍融循環之耐受性亦意味著有可能在生產過程中冷凍原料藥材料。

本發明之一目標係提供不活化病毒組成物，其中不活化之全茲卡病毒在儲存期間係穩定的。具體而言，本發明之一目標係提供不活化病毒組成物，其中不活化之全茲卡病毒在-80℃下長時間儲存(諸如儲存至少10天直至例如6個月或1年)時係穩定的。欲冷凍儲存之此類組成物一般不(尚未)含有基於鋁之佐劑，諸如鋁鹽，諸如明礬/氫氧化鋁–若需要，則此類基於鋁之佐劑可在以後不再安排冷凍儲存時添加。

本發明之另一目標係提供不活化病毒組成物，其能夠在一個或多個凍融循環期間使不活化之全茲卡病毒穩定。

上述目標係由本文中描述及主張之本發明之實施例達成。

因此，本發明係關於液體不活化病毒組成物，其包含： a) 不活化之全茲卡病毒， b) 至少一種具有至少約6.5 mM之濃度的醫藥學上可接受之緩衝液，及 c) 視情況選用之多元醇，其中該液體不活化病毒組成物較佳不含選自鋁鹽之佐劑，並且該至少一種醫藥學上可接受之緩衝液不含磷酸根離子。

在某一態樣中，液體不活化病毒組成物內的磷酸根離子之濃度小於約7 mM、或小於約6 mM、或小於約5 mM、或小於約4 mM、或小於約3 mM、或小於約2 mM、或小於約1 mM。

本發明亦係關於不活化病毒組成物使不活化之全茲卡病毒穩定之用途，該不活化病毒組成物包含： a) 不活化之全茲卡病毒， b) 至少一種具有至少約6.5 mM之濃度的醫藥學上可接受之緩衝液，及 c) 視情況選用之多元醇，其中該液體不活化病毒組成物較佳不含選自鋁鹽之佐劑，並且其中該至少一種醫藥學上可接受之緩衝液不含磷酸根離子。

本發明進一步係關於一種製備液體不活化病毒組成物之方法，該液體不活化病毒組成物包含： a) 不活化之全茲卡病毒， b) 醫藥學上可接受之緩衝液，其中該緩衝液不為磷酸鹽緩衝液且其中該緩衝液之濃度為至少6.5 mM；以及 c) 視情況選用之多元醇，其中該不活化病毒組成物不含選自鋁鹽之佐劑，該方法包含以下步驟：步驟1. 自由一或多種非人類細胞獲得之上清液中分離茲卡病毒製劑；步驟2. 純化該茲卡病毒製劑；步驟3. 使該病毒製劑不活化；步驟4. 將該茲卡病毒製劑轉移至醫藥學上可接受之緩衝液中以獲得茲卡病毒原料藥。

本發明進一步係關於一種液體疫苗，其包含： a) 根據本發明之不活化病毒組成物，及 b) 佐劑，諸如氫氧化鋁。

在某一態樣中，液體疫苗包含約50 mM至約200 mM NaCl、約8.5 mM至約80 mM Tris及約0.4% w/v至約4.7% w/v蔗糖。

本發明亦係關於一種在有需要之人類個體中治療或預防、具體而言預防茲卡病毒感染之方法，該方法包含向該個體投與單位劑量之如上所述的根據本發明之液體疫苗。

本發明進一步係關於一種製備液體疫苗之方法，該方法包含以下步驟：步驟1. 提供如上所述的根據本發明之不活化病毒組成物，步驟2. 將佐劑(該佐劑較佳為鋁鹽)及視情況選用之另一醫藥學上可接受之緩衝液體添加至該不活化病毒組成物中。

本發明亦係關於可藉由如上所述之方法獲得之產物。

定義

除非另外定義，否則本文所用之全部技術及科學術語皆具有熟習本發明所屬技術者通常理解的相同含義。雖然與本文所述之彼等方法及材料類似或等效之任何方法及材料皆可用於實踐本發明之測試，但本文描述較佳之材料及方法。在描述及主張本發明時，下列術語將根據以下闡述之定義來使用。

除非另外清楚指出，否則使用術語「一個」、「一種」及其類似用法係指一或多個/種。

如本文所用之術語「不活化之茲卡病毒」旨在包含已用去活化方法處理(諸如用有效量之甲醛處理)之茲卡病毒。

如本文所用之術語「不活化之全茲卡病毒」旨在包含已用去活化方法處理(諸如用有效量之福爾馬林處理)之茲卡病毒。認為此類處理不破壞病毒之結構，亦即不破壞病毒之二級、三級或四級結構以及免疫原性表位，但不活化之茲卡病毒不再能感染宿主細胞，該宿主細胞可經未經去活化之茲卡病毒感染。在一個實施例中，不活化之茲卡病毒不再能感染VERO細胞並且對VERO細胞發揮細胞病變效應。具體而言，不活化(全)茲卡病毒可藉由/藉由以下方法獲得：其中在20℃至24℃之溫度下用約0.01% w/v之量的甲醛處理茲卡病毒10天。全茲卡病毒之樣品可在粒徑排阻層析法中提供至少85%的曲線下總面積之主峰。

術語「多元醇」在本發明中定義為指代具有多個羥基之物質並且包括糖(還原及非還原糖)、糖醇及糖酸。多元醇之另一實例為甘油。視情況，如本文所定義之多元醇具有小於約600 Da (例如，在約120至約400 Da之範圍內)之分子量。

術語「含有胺基之分子」在本文中定義為包括含有一級、二級、三級及四級胺基團(RNH₂ 、R₂ NH、R₃ N、R₄ N+)之分子。R基團通常為環烴或非環烴。含有胺基之分子包括胺基酸(諸如組胺酸)、Tris、ACES、CHES、CAPSO、TAPS、CAPS、Bis-Tris、TAPSO、TES、Tricine及ADA (每種緩衝液之所有縮寫皆具有與此項技術中通常已知之相同含義)。

術語「室溫」在本發明中定義為指代正常室溫，諸如約25℃。

在本發明之含義內，術語「不活化病毒組成物」或「液體不活化病毒組成物」一般係指呈液體形式或呈冷凍液體形式之組成物。此類組成物為包括不活化病毒之中間組成物，常常以冷凍狀態儲存，接著藉由至少進一步添加佐劑用於最終製備疫苗/藥物產物。

「Tris」係指參(羥甲基)胺基甲烷緩衝液。

若未另外指出，則「%」係指「重量/體積(w/v)」詳細描述 一般技術

本文中描述或參考之技術及程序一般充分瞭解且通常使用熟習此項技術者習知之方法採用，諸如在以下文獻中所述的廣泛利用之方法：Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第3版 (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel等人編, (2003))；the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames及G.R. Taylor編 (1995)), Harlow及Lane編 (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney編 (1987))；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait編, 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis編, 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R.I. Freshney)編, 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather及P.E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths及D.G. Newell編, 1993-8) J. Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir及C.C. Blackwell編)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller及M.P. Calos編, 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis等人編, 1994)；Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan等人編, 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C.A. Janeway及P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: A Practical Approach (D. Catty.編, IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd及C. Dean編, Oxford University Press, 2000)；Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow及D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；以及The Antibodies (M. Zanetti及J. D. Capra編, Harwood Academic Publishers, 1995)。不活化病毒組成物

本發明係關於一種液體不活化病毒組成物，其包含： a) 不活化之全茲卡病毒， b) 至少一種具有至少約6.5 mM之濃度的醫藥學上可接受之緩衝液，及 c) 視情況選用之多元醇，其中該至少一種醫藥學上可接受之緩衝液不含磷酸根離子。

在某些此類實施例中，液體不活化病毒組成物不含選自鋁鹽之佐劑。具體而言，鋁鹽可選自明礬(諸如氫氧化鋁)、磷酸鋁、氫氧化鋁、硫酸鋁鉀之群。在某些此類實施例中，液體不活化病毒組成物不含可吸收不活化之全茲卡病毒之佐劑。在某些此類實施例中，液體不活化病毒組成物不含選自以下各物之佐劑：鋁鹽、磷酸鈣、toll樣受體(TLR)促效劑、單磷醯脂質A (MLA)、MLA衍生物、合成脂質A、脂質A模擬物或類似物、細胞介素、皂角苷、胞壁醯二肽(MDP)衍生物、CpG寡聚物、革蘭氏陰性菌之脂多醣(LPS)、聚磷腈、乳液(油乳液)、殼聚糖、維生素D、硬脂基或十八基酪胺酸、病毒體、螺旋體、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆顆粒、微粒、脂質體、完全弗氏佐劑(CFA)及不完全弗氏佐劑(IFA)。在某些此類實施例中，液體不活化病毒組成物不含佐劑，亦即熟練技術人員已知之任何佐劑化合物。

在某些實施例中，液體不活化病毒組成物內的磷酸根離子之濃度小於約7 mM、或小於約6 mM、或小於約5 mM、或小於約4 mM、或小於約3 mM、或小於約2 mM、或小於約1 mM。包含磷酸根離子之液體例如可藉由將磷酸二鈉(Na₂ HPO₄ )及/或磷酸二氫鉀(KH₂ PO₄ )溶解或分散於液體中獲得。當磷酸二鈉(Na₂ HPO₄ )及磷酸二氫鉀(KH₂ PO₄ )以特定比率溶於水性液體中時，產生磷酸鹽緩衝液。

在某些實施例中，該至少一種醫藥學上可接受之緩衝液在液體不活化病毒組成物中之濃度為至少約7 mM、或至少約7.5 mM、或至少約8 mM、或至少約8.5 mM、或至少約9 mM、或至少約10 mM。在某些此類實施例中，至少一種醫藥學上可接受之緩衝液在液體不活化病毒組成物中之濃度為約7 mM至約200 mM、或約7.5 mM至約200 mM、或約8 mM至約200 mM、或約8.5 mM至約200 mM、或約9 mM至約100 mM、或約9 mM至約60 mM、或9 mM至約30 mM或約9 mM至約11 mM或約10 mM、或約20 mM、或約50 mM。

在某些實施例中，液體不活化病毒組成物僅包含一種醫藥學上可接受之緩衝液。另外，在某些實施例中，液體不活化病毒組成物可包含實質上僅一種醫藥學上可接受之緩衝液及僅殘餘量之額外的緩衝液組分，該等緩衝液之濃度小於2 mM、或小於1.5 mM、或小於1 mM、或小於0.9 mM、或小於0.5 mM、或小於0.2 mM。

在某些實施例中，液體不活化病毒組成物包含至少兩種不同的醫藥學上可接受之緩衝液，其中在液體不活化病毒組成物中兩種最濃的醫藥學上可接受之緩衝液之莫耳比不在1:2至2:1之間、或1:5至5:1之間、或8:1至1:8之間、或10:1至1:10之間。

在某些實施例中，鉀離子在液體不活化病毒組成物中之濃度小於約4 mM、或小於約3 mM、或小於約2 mM、或小於約1.5 mM、或小於約0.5 mM、或小於約0.1 mM或約0 mM (亦即實質上不含鉀離子)。

在某些實施例中，液體不活化病毒組成物實質上不含或不含硫酸魚精蛋白。

在某些實施例中，液體不活化病毒組成物之pH值如在室溫下所測定為約pH 6.0至約pH 9.0或約pH 6.5至約pH 8.0、或約pH 6.8至約pH 7.8、約pH 7.4或約pH 7.6。緩衝液

在某些實施例中，根據本發明之液體不活化病毒組成物包含： a) 不活化之全茲卡病毒， b) 至少一種具有至少約6.5 mM之濃度的醫藥學上可接受之緩衝液，及 c) 視情況選用之多元醇，其中該液體不活化病毒組成物不含選自鋁鹽之佐劑，並且該至少一種醫藥學上可接受之緩衝液包含含有胺基之分子且不含磷酸根離子。

包含含有胺基之分子的緩衝液可選自以下各物之群：組胺酸(His)、Tris、ACES、CHES、CAPSO、TAPS、CAPS、Bis-Tris、TAPSO、TES、Tricine及ADA。在某些較佳實施例中，醫藥學上可接受之緩衝液為Tris或組胺酸(His)緩衝液，較佳為Tris緩衝液。多元醇

在某些實施例中，液體不活化病毒組成物進一步包含至少一種多元醇。

在某些此類實施例中，液體不活化病毒組成物包含約1% w/v至約60% w/v多元醇、或約6% w/v至約50% w/v多元醇、或約6% w/v至約40% w/v多元醇、或約6% w/v至約35% w/v多元醇、或約6% w/v至約30% w/v多元醇、或約6% w/v至約25% w/v多元醇、或約6% w/v至約20% w/v多元醇、或約6% w/v至約15% w/v多元醇、或約6% w/v至約12% w/v多元醇、或約7% w/v多元醇或約10% w/v多元醇。

在某些較佳實施例中，液體不活化病毒組成物包含醫藥學上可接受之緩衝液(包括含有胺基之分子)及約6% w/v至約15% w/v多元醇。在某些此類實施例中，液體不活化病毒組成物包含Tris及約6% w/v至約15% w/v多元醇。

在某些實施例中，多元醇為糖。在某些此類實施例中，糖為雙醣。在某些此類實施例中，雙醣為非還原糖。在某些此類實施例中，非還原糖為蔗糖。

在某些此類實施例中，液體不活化病毒組成物包含約5% w/v至約20% w/v蔗糖、或約6% w/v至約15% w/v蔗糖。在某些此類實施例中，液體不活化病毒組成物包含約6% w/v至約8% w/v蔗糖，諸如約7% w/v蔗糖。

在某一較佳態樣中，液體不活化病毒組成物包含約8.5 mM至約50 mM Tris及約6%至約15% w/v蔗糖，其中不活化病毒組成物之pH值當在室溫下量測時為約pH 7.0至約pH 8.0。

在某些替代實施例中，多元醇為甘油。在某些此類實施例中，液體不活化病毒組成物包含約1% v/v至約60% v/v甘油、或約7% v/v至約15% v/v甘油、或約10% v/v甘油。

在某一較佳態樣中，不活化病毒組成物包含約8.5 mM至約50 mM Tris及約6% v/v至約15% v/v甘油，其中不活化病毒組成物之pH值當在室溫下量測時為約pH 7.0至約pH 8.0。氯化鈉

在某些實施例中，液體不活化病毒組成物進一步包含氯化鈉。在某些此類實施例中，液體不活化病毒組成物包含以下氯化鈉濃度：約5 mM至約500 mM氯化鈉、或約10 mM至約200 mM。

在某些此類實施例中，液體不活化病毒組成物包含以下氯化鈉濃度：約10 mM至約40 mM、或約10 mM至約30 mM，諸如約20 mM氯化鈉。在某一較佳實施例中，液體不活化病毒組成物包含約8.5 mM至約80 mM Tris、約10 mM至約30 mM氯化鈉、約6%至約15% w/v蔗糖，其中液體不活化病毒組成物之pH值當在室溫下量測時為約pH 7.0至約pH 8.0。在某一較佳實施例中，液體不活化病毒組成物包含約8.5 mM至約15 mM Tris、約10 mM至約25 mM氯化鈉、約6%至約10% w/v蔗糖，其中液體不活化病毒組成物之pH值當在室溫下量測時為約pH 7.0至約pH 8.0。

在某些替代實施例中，液體不活化病毒組成物包含以下氯化鈉濃度：約100 mM至約200 mM、或約140 mM至約160 mM，諸如約150 mM。在某些此類實施例中，液體不活化病毒組成物包含約8.5 mM至約80 mM Tris及約140 mM至約160 mM NaCl，其中液體不活化病毒組成物之pH值當在室溫下量測時為約pH 7.0至約pH 8.0。在某些此類實施例中，液體不活化病毒組成物包含約8.5 mM至約15 mM Tris及約140 mM至約160 mM NaCl，其中液體不活化病毒組成物之pH值當在室溫下量測時為約pH 7.0至約pH 8.0。

在某些實施例中，液體不活化病毒組成物之離子強度低於約80 mM、或低於約70 mM、或低於約60 mM、或低於約50 mM、或低於約40 mM、或低於約30 mM。術語離子強度由以下方程定義：

其中

為離子I之莫耳濃度，

為彼離子之電荷數，且總和係將溶液中之所有離子加起來。茲卡病毒

本發明係關於一種包含不活化之全茲卡病毒之不活化病毒組成物。在本發明之某些態樣中，不活化之全茲卡病毒可指的是藉由自茲卡病毒群進行蝕斑純化分離的經純化之不活化之全茲卡病毒。本發明係關於任何類型之不活化之全茲卡病毒。特定的茲卡病毒在下文中描述為一實例。

茲卡病毒(ZIKV)為一種蚊媒黃病毒，1947年於烏幹達之茲卡森林首次自哨兵恆河猴(sentinel rhesus monkey)上分離。自彼時起，在非洲及亞洲，以及最近在美洲，開始對人類進行隔離。ZIKV有兩種(可能有三種)譜系：非洲譜系(可能分為東非及西非譜系)及亞洲譜系。因此，本揭露之合適的茲卡病毒之實例包括但不限於來自非洲及/或亞洲譜系之病毒。在一些實施例中，茲卡病毒為非洲譜系病毒。在一些實施例中，茲卡病毒為亞洲譜系病毒。另外，先前已鑑別在茲卡病毒之非洲及亞洲譜系內的多個毒株。此項技術中已知之茲卡病毒之任何一或多個合適的毒株可在本揭露中使用，包括例如毒株Mr 766、ArD 41519、IbH 30656、P6-740、EC Yap、FSS13025、ArD 7117、ArD 9957、ArD 30101、ArD 30156、ArD 30332、HD 78788、ArD 127707、ArD 127710、ArD 127984、ArD 127988、ArD 127994、ArD 128000、ArD 132912、132915、ArD 141170、ArD 142623、ArD 149917、ArD 149810、ArD 149938、ArD 157995、ArD 158084、ArD 165522、ArD 165531、ArA 1465、ArA 27101、ArA 27290、ArA 27106、ArA 27096、ArA 27407、ArA 27433、ArA 506/96、ArA 975-99、Ara 982-99、ArA 986-99、ArA 2718、ArB 1362、Nigeria68、Malaysia66、Kedougou84、Suriname、MR1429、PRVABC59、ECMN2007、DakAr41524、H/PF/2013、R103451、103344、8375、JMB-185、ZIKV/H、sapiens/Brazil/Natal/2015、SPH2015、ZIKV/Hu/Chiba/S36/2016及/或Cuba2017。在一些實施例中，毒株PRVABC59用於本揭露中。

在一些實施例中，茲卡病毒基因體序列之一實例如下列為SEQ ID NO: 2：

在一些實施例中，茲卡病毒可包含GenBank登錄號KU501215.1之基因體序列。在一些實施例中，茲卡病毒來自毒株PRVABC59。在一些實施例中，GenBank登錄號KU501215.1之基因體序列包含SEQ ID NO: 2之序列。在一些實施例中，茲卡病毒可包含與SEQ ID NO: 2序列具有至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之基因體序列。

在一些實施例中，茲卡病毒可包含至少一種由SEQ ID NO: 2序列編碼的多肽。在一些實施例中，茲卡病毒可包含至少一種具有胺基酸序列之多肽，該胺基酸序列具有與由SEQ ID NO: 2序列編碼之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性。

因此，在一些實施例中，本揭露之不活化茲卡病毒可在本文所揭露之任何不活化病毒組成物中使用。例如，本揭露之不活化茲卡病毒可用於提供一或多種抗原，該一或多種抗原適用於在有需要之個體中治療或預防茲卡病毒感染及/或適用於在有需要之個體中誘導針對茲卡病毒之免疫反應，諸如保護性免疫反應。

本揭露中使用之茲卡病毒可由細胞培養中之一或多個細胞(例如經由蝕斑純化)獲得。可使用此項技術中已知用於產生茲卡病毒之任何合適的細胞，包括例如昆蟲細胞(例如蚊子細胞，諸如CCL-125細胞、Aag-2細胞、RML-12細胞、C6/36細胞、C7-10細胞、AP-61細胞、A.t. GRIP-1細胞、A.t. GRIP-2細胞、A.t. GRIP-3細胞、UM-AVE1細胞、Mos.55細胞、Sua1B細胞、4a-3B細胞、Mos.42細胞、MSQ43細胞、LSB-AA695BB細胞、NIID-CTR細胞、TRA-171細胞，及來自以下蚊子物種之另外的細胞或細胞株：諸如埃及伊蚊、白紋伊蚊、假鱗斑伊蚊(Aedes pseudoscutellaris)、三序伊蚊(Aedes triseriatus)、刺擾伊蚊(Aedes vexans)、岡比亞按蚊、斑須按蚊(Anopheles stephensi)、白端按蚊(Anopheles albimus)、致倦庫蚊、希氏庫蚊(Culex theileri)、三帶喙庫蚊、二帶喙庫蚊及/或安汶巨蚊(Toxorhynchites amboinensis))；及哺乳動物細胞(例如VERO細胞(來自猴腎)、LLC-MK2細胞(來自猴腎)、MDBK細胞、MDCK細胞、ATCC CCL34 MDCK (NBL2)細胞、MDCK 33016 (寄存編號DSM ACC 2219，如WO97/37001中所述)細胞、BHK21-F細胞、HKCC細胞或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)。在一些實施例中，茲卡病毒(例如，茲卡病毒純系分離株)係由非人類細胞產生。在一些實施例中，茲卡病毒(例如，茲卡病毒純系分離株)係由昆蟲細胞產生。在一些實施例中，茲卡病毒(例如，茲卡病毒純系分離株)係由蚊子細胞產生。在一些實施例中，茲卡病毒(例如，茲卡病毒純系分離株)係由哺乳動物細胞產生。在一些實施例中，茲卡病毒(例如，茲卡病毒純系分離株)係由VERO細胞產生。

茲卡病毒具有正義、單股RNA基因體，編碼結構及非結構多肽兩者。基因體在5’-及3’-末端區亦含有非編碼序列，其在病毒複製中起作用。由此等病毒編碼之結構多肽包括但不限於衣殼(C)、前驅物膜(prM)及包膜(E)。由此等病毒編碼之非結構(NS)多肽包括但不限於NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B及NS5。

在某些實施例中，茲卡病毒包括茲卡病毒非結構蛋白1 (NS1)中之突變。在一些實施例中，茲卡病毒含有在SEQ ID NO: 1之位置98處或在對應於SEQ ID NO: 1之位置98的位置處之Trp98Gly突變。

在一些實施例中，突變在NS1多肽內。來自示範性茲卡病毒株之野生型NS1多肽之胺基酸序列如下列出： DVGCSVDFSKKETRCGTGVFVYNDVEAWRDRYKYHPDSPRRLAAAVKQAWEDGICGISSVSRMENIMWRSVEGELNAILEENGVQLTVVVGSVKNPMWRGPQRLPVPVNELPHGWKAWGKSYFVRAAKTNNSFVVDGDTLKECPLKHRAWNSFLVEDHGFGVFHTSVWLKVREDYSLECDPAVIGTAVKGKEAVHSDLGYWIESEKNDTWRLKRAHLIEMKTCEWPKSHTLWTDGIEESDLIIPKSLAGPLSHHNTREGYRTQMKGPWHSEELEIRFEECPGTKVHVEETCGTRGPSLRSTTASGRVIEEWCCRECTMPPLSFRAKDGCWYGMEIRPRKEPESNLVRSMVT (SEQ ID NO: 1)。

在一些實施例中，NS1多肽之胺基酸序列與SEQ ID NO: 1序列具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性。在一些實施例中，NS1多肽之胺基酸序列可來自由GenBank登錄號KU501215.1之序列編碼的胺基酸序列(SEQ ID NO: 2)。在一些實施例中，NS1多肽之胺基酸序列可為由GenBank登錄號KU501215.1之序列編碼的胺基酸序列之胺基酸位置795至1145。在一些實施例中，NS1多肽之胺基酸序列可來自茲卡病毒株PRVABC59。

「序列一致性」、「序列一致性%」、「一致性%」、「一致%」或「序列比對」意謂第一胺基酸序列與第二胺基酸序列之比較，或第一核酸序列與第二核酸序列之比較，並且基於比較而計算為百分比。此計算結果可描述為「一致性百分比」或「ID百分比」。

通常，序列比對可用於藉由兩種不同手段中之一種來計算序列一致性。在第一種手段中，在單個位置處之錯配及在單個位置處之間隙在最終序列一致性計算皆計為不相同之位置。在第二種手段中，在單個位置處之錯配在最終序列一致性計算中計為不相同之位置；然後，在單個位置處之間隙在最終序列一致性計算中不計為(忽略不計)不相同之位置。換言之，在第二種手段中，在最終序列一致性計算中忽略間隙。這兩種手段之差異(亦即，在單個位置處將間隙計為不相同之位置對比忽略間隙)可導致介於兩個序列之間的序列一致性值之變化。

在一些實施例中，序列一致性係藉由程序測定，該程序產生比對並且計算一致性，在最終序列一致性計算中將在單個位置處之錯配及在單個位置處之間隙計為不相同之位置。舉例而言，執行Needleman及Wunsch之算法(Needleman及Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)的程序Needle (EMBOS)藉由以下步驟計算每個默認設置之序列一致性：首先進行第一序列與第二序列之間的比對，然後計數在比對長度上之相同位置的數目，接著將相同殘基之數目除以比對長度，隨後將此數乘100，得到序列一致性% [序列一致性%= (相同殘基之數目#/比對長度) x 100)]。

序列一致性可藉由展示兩個序列之全長的成對比對來計算，因此展示第一個序列與第二個序列之全長(「全域序列一致性」)。例如，程序Needle (EMBOSS)產生此類比對；序列一致性%= (相同殘基之數目#/比對長度) x 100)]。

序列一致性可藉由僅展示第一序列或第二序列之局部區域的成對比對來計算(「局部一致性」)。例如，程序Blast (NCBI)產生此類比對；序列一致性%= (相同殘基之數目#/比對長度) x 100)]。

序列比對較佳藉由使用Needleman及Wunsch之算法(J. Mol. Biol. (1979) 48, 第443-453頁)生成。較佳地，程序「NEEDLE」(The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS))與程序默認參數(間隙開放= 10.0、間隙延伸= 0.5且矩陣= EBLOSUM62 (對於蛋白質)且矩陣= EDNAFULL (對於核苷酸))一起使用。接著，序列一致性可藉由展示兩個序列之全長的比對來計算，因此展示第一個序列與第二個序列之全長(「全域序列一致性」)。例如，序列一致性% = (相同殘基之數目#/比對長度) x 100)]。

在一些實施例中，突變發生在NS1多肽內之一或多個胺基酸位置處。在一些實施例中，當使用成對比對算法與SEQ ID NO: 1比對時，突變發生在SEQ ID NO: 1之位置98處或在對應於SEQ ID NO: 1之位置98的位置處。在一些實施例中，位置98處之突變為色胺酸至甘胺酸之取代。

在一些實施例中，茲卡病毒包含在SEQ ID NO: 1之位置98處或在對應於SEQ ID NO: 1之位置98的位置處之突變。對應於SEQ ID NO: 1之位置98的位置可藉由使用成對比對算法比對NS1蛋白之胺基酸序列與SEQ ID NO: 1來判定。在除茲卡病毒以外之病毒中的胺基酸殘基(對應於SEQ ID NO: 1之位置98處之色胺酸殘基)示於本申請案之圖7中，其中此等殘基係加框的。在一些實施例中，位置98處之突變為色胺酸至甘胺酸之取代。在一些實施例中，位置98處之突變為在SEQ ID NO: 1之位置98處色胺酸至甘胺酸之取代。在一些實施例中，當使用成對比對算法與SEQ ID NO: 1比對時，位置98處之突變為在對應於SEQ ID NO: 1之位置98的位置處之色胺酸至甘胺酸之取代。

在一些實施例中，茲卡病毒含有在NS1蛋白內之突變及至少一個在以下一或多者內之突變：C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B及NS5病毒蛋白。在一些實施例中，茲卡病毒含有一或多個在NS1蛋白內之突變，且不含至少一個在以下一或多者內之突變：C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B及NS5病毒蛋白。在一些實施例中，茲卡病毒含有在NS1蛋白內之突變且不含至少一個在包膜蛋白E內之突變。在一些實施例中，不活化之全病毒含有至少一個在茲卡病毒非結構蛋白1 (NS1)中之突變，且不包括在茲卡病毒包膜蛋白E (Env)中之突變。在一些實施例中，茲卡病毒含有在SEQ ID NO: 1之位置98處或在對應於SEQ ID NO: 1之位置98之位置處的突變且不含任何在包膜蛋白E內之突變。在一些實施例中，不活化之全茲卡病毒含有在SEQ ID NO: 1之位置98處或在對應於SEQ ID NO: 1之位置98之位置處的突變且/或不包括在茲卡病毒包膜蛋白E (Env)中之突變。在一些實施例中，不活化之全病毒含有至少一個在茲卡病毒非結構蛋白1 (NS1)中之突變，且編碼包膜蛋白之序列與SEQ ID No. 2中之相應序列相同。在一些實施例中，茲卡病毒含有在SEQ ID NO: 1之位置98處或在對應於SEQ ID NO: 1之位置98之位置處的突變，且編碼包膜蛋白之序列與SEQ ID NO. 2中之相應序列相同。在一些實施例中，不活化之全茲卡病毒含有在SEQ ID NO: 1之位置98處或在對應於SEQ ID NO: 1之位置98之位置處的突變，且編碼包膜蛋白之序列與SEQ ID NO. 2中之相應序列相同。在一些實施例中，不活化之全茲卡病毒在SEQ ID NO: 1之位置98處或在對應於SEQ ID NO: 1之位置98之位置處含有色胺酸至甘胺酸之取代，且編碼包膜蛋白之序列與SEQ ID NO. 2中之相應序列相同。

在一些實施例中，與缺乏至少一種突變之茲卡病毒相比，茲卡病毒含有至少一種增強遺傳穩定性之突變。在一些實施例中，與缺乏至少一種突變之茲卡病毒相比，茲卡病毒含有至少一種增強病毒複製之突變。在一些實施例中，茲卡病毒含有至少一種突變，該至少一種突變減少或以其他方式抑制不希望有的突變在諸如茲卡病毒之包膜蛋白E (Env)內之出現。

在本揭露之以上實施例中，示範性成對比對算法為Needleman-Wunsch全域比對算法，使用默認參數(例如，間隙開放罰分= 10.0，且間隙延伸罰分= 0.5，使用EBLOSUM62評分矩陣)。此算法宜在EMBOSS包中之needle工具中實現。

在一些實施例中，不活化茲卡病毒可在不活化病毒組成物中使用。例如，不活化茲卡病毒可適用於在有需要之個體中治療或預防茲卡病毒感染及/或在有需要之個體中誘導針對茲卡病毒之免疫反應，諸如保護性免疫反應。不活化病毒組成物之產生

本揭露之其他態樣係關於茲卡病毒不活化病毒組成物，其含有經純化之不活化全病毒，諸如在如本文所述的SEQ ID NO: 1之位置98處或在對應於如本文所述的SEQ ID NO: 1之位置98的位置處具有色胺酸至甘胺酸取代之突變的茲卡病毒。在一些實施例中，不活化病毒組成物包含經純化之不活化之全茲卡病毒，該病毒包含在SEQ ID NO: 1之位置98處或在對應於SEQ ID NO: 1之位置98的位置處之Trp98Gly突變，其中茲卡病毒來源於毒株PRVABC59。在一些實施例中，不活化病毒組成物包含經純化之不活化之全茲卡病毒，該病毒包含在SEQ ID NO: 1之位置98處或在對應於SEQ ID NO: 1之位置98的位置處之Trp98Gly突變，其中茲卡病毒來源於包含根據SEQ ID NO: 2之基因體序列的毒株PRVABC59。在一個實施例中，不活化病毒組成物含有經蝕斑純化之純系茲卡病毒分離株。

本揭露之不活化病毒組成物之產生包括茲卡病毒之生長。細胞培養中之生長為一種製備本揭露之不活化病毒組成物的方法。用於病毒生長之細胞可在懸浮或貼壁條件下培養。

適用於本揭露之至少一種病毒之生長的細胞株包括但不限於：昆蟲細胞(例如，如本文所述之蚊子細胞、VERO細胞(來自猴腎)、馬、奶牛(例如MDBK細胞)、綿羊、狗(例如，來自狗腎之MDCK細胞，ATCC CCL34 MDCK (NBL2)或MDCK 33016，寄存編號DSM ACC 2219，如WO97/37001中所述)、貓、及齧齒動物(例如，倉鼠細胞，諸如BHK21-F、HKCC細胞或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞))，並且可由廣泛多個發育階段獲得，包括例如成年、新生兒、胎兒及胚胎。在某些實施例中，將細胞永生化(例如，PERC.6細胞，如WO 01/38362及WO 02/40665中所述，並且寄存在ECACC寄存編號96022940下)。在較佳實施例中，哺乳動物細胞經利用並且可選自及/或來源於以下非限制性細胞類型中之一或多者：成纖維細胞(例如真皮、肺)、內皮細胞(例如主動脈、冠狀動脈、肺動脈、血管、真皮微血管、臍)、肝細胞、角質細胞、免疫細胞(例如T細胞、B細胞、巨噬細胞、NK、樹突細胞)、乳腺細胞(例如上皮細胞)、平滑肌細胞(例如血管、主動脈、冠狀動脈、動脈、子宮、支氣管、子宮頸、視網膜周細胞)、黑素細胞、神經細胞(例如星狀膠質細胞)、前列腺細胞(例如上皮細胞、平滑肌細胞)、腎細胞(例如上皮細胞、系膜細胞、近端小管細胞)、骨骼細胞(例如軟骨細胞、破骨細胞、成骨細胞)、肌細胞(例如肌母細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞、支氣管細胞)、肝細胞、成視網膜細胞及基質細胞。WO 97/37000及WO 97/37001描述動物細胞及細胞株之產生，它們能夠在懸浮液中及在無血清之培養基中生長並且適用於生產及複製病毒。在一個實施例中，用於至少一種病毒之生長的細胞為Vero細胞。

上述細胞類型之培養條件係已知的且描述於多種出版物中。或者，培養基、補充劑及條件可自商業上購買，例如描述於Cambrex Bioproducts (East Rutherford, N.J.)之目錄及另外的文獻中。

在某些實施例中，在本文所述之方法中使用的細胞在無血清及/或無蛋白質之培養基中培養。培養基在本揭露之上下文中係稱為無血清之培養基，若其不含來自人類或動物來源之血清之任何添加劑。無蛋白質應理解為意謂在不含蛋白質、生長因子、其他蛋白質添加劑及非血清蛋白之情況下發生細胞增殖的培養物，但可視情況包括病毒生長所必需之蛋白質，諸如胰蛋白酶或其他蛋白酶。在此類培養物中生長之細胞含有蛋白質本身。

已知的無血清培養基包括伊氏培養基(Iscove's medium)、Ultra-CHO培養基(BioWhittaker)或EX-CELL (JRH Bioscience)。普通的含血清培養基包括伊戈氏基礎培養基(BME)或最低必需培養基(MEM)(Eagle, Science, 130, 432 (1959))或杜氏改良之伊戈培養基(DMEM或EDM)，其通常與高達10%胎牛血清或類似添加劑一起使用。視情況，最低必需培養基(MEM) (Eagle, Science, 130, 432 (1959))或杜氏改良之伊戈培養基(DMEM或EDM)可在沒有任何含血清之補充劑的情況下使用。無蛋白質之培養基像PF-CHO (JHR Bioscience)、化學上定義之培養基像ProCHO 4CDM (BioWhittaker)或SMIF 7 (Gibco/BRL Life Technologies)及細胞分裂肽像Primactone、Pepticase或HyPep.TM.(所有均來自Quest International)或乳白蛋白水解物(Gibco及其他製造商)在現有技術中亦充分已知。基於植物水解物之培養基添加劑具有特殊優點：可排除病毒、支原體或未知感染物之污染。

細胞培養條件(溫度、細胞密度、pH值等)由於根據本揭露採用之細胞株之適用性在極寬的範圍上可變並且可適於特定病毒株之要求。

在培養細胞中使病毒增殖之方法通常包括以下步驟：用有待培養之毒株接種培養細胞，培育受感染細胞持續病毒增殖所需之時間，例如如藉由病毒效價或抗原表現所確定(例如，在接種之後24與168小時之間)及收集增殖之病毒。在一些實施例中，經由蝕斑純化收集病毒。用病毒接種培養細胞(藉由PFU或TCID50量測)至1:500至1:1、較佳1:100至1:5之細胞比率。將病毒添加至細胞懸浮液中或施於細胞單層上，並且在25℃至40℃、較佳28℃至38℃下使病毒吸附於細胞上持續至少10分鐘、至少20分鐘、至少30分鐘、至少40分鐘、至少50分鐘、至少60分鐘，但通常少於300分鐘。可藉由收穫上清液(不含細胞)、凍融或藉由酶促作用移除受感染之細胞培養物(例如單層)以增加所收穫之培養上清液的病毒含量。接著去活化或冷凍儲存所收穫之液體。可將培養細胞在約0.0001至10、較佳0.002至5、更佳0.001至2之感染複數(「MOI」)下感染。仍更佳地，細胞在約0.01之MOI下感染。感染期間，培養基與細胞培養容器面積之比率可低於細胞培養期間。保持此低比率可最大限度地提高病毒將感染細胞之可能性。可在感染後30至60小時、或感染後3至10天收穫受感染細胞之上清液。在某些較佳實施例中，在感染後3至7天收穫受感染細胞之上清液。更佳地，在感染後3至5天收穫受感染細胞之上清液。在一些實施例中，可在細胞培養期間添加蛋白酶(例如胰蛋白酶)以便釋放病毒，並且蛋白酶可在培養期間的任何合適階段中添加。或者，在某些實施例中，可收穫受感染細胞培養物之上清液並且病毒可自上清液中分離或以其他方式經純化。

病毒接種物及病毒培養物較佳不含(亦即，將針對污染進行測試並且給出關於污染之陰性結果)單純皰疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠狀病毒、腺病毒、鼻病毒、呼腸孤病毒、多瘤病毒、雙RNA病毒、圓環病毒及/或細小病毒(WO 2006/027698)。

若病毒已在細胞株上生長，則標準方法係將最終液體不活化病毒組成物中剩餘的細胞株DNA之量減至最少，以便使宿主細胞DNA之任何致癌活性降至最低。在液體不活化病毒組成物製備期間，使用標準純化程序例如層析法等移除污染DNA。可藉由核酸酶處理，例如藉由使用DNase增加殘留宿主細胞DNA之移除。用於減少宿主細胞DNA污染之便利方法揭露於參考文獻(Lundblad (2001) Biotechnology and Applied Biochemistry 34:195-197, Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Veterinary Medicine (CVM). 2001年5月)中，該方法涉及兩步處理，首先使用DNase (例如Benzonase)，其可在病毒生長期間使用，接著使用陽離子清潔劑(例如CTAB)，其可在病毒體破壞期間使用。亦可藉由β-丙內酯處理進行移除。在一個實施例中，藉由用benzonase處理培養上清液移除污染DNA。抗原產生

茲卡病毒可藉由此項技術中已知之任何合適的方法產生及/或純化或以其他方式分離。在一個實施例中，本揭露之抗原為經純化之不活化之全茲卡病毒。

在一些實施例中，不活化病毒可如在標題為「不活化病毒組成物之產生」之以上部分中所述產生。

在某些實施例中，本揭露之茲卡病毒可藉由培養非人類細胞產生。適用於產生本揭露之茲卡病毒的細胞株可包括昆蟲細胞(例如，本文所述之任何蚊子細胞)。適用於產生本揭露之茲卡病毒的細胞株亦可為哺乳動物來源之細胞，並且包括但不限於：VERO細胞(來自猴腎)、馬、奶牛(例如MDBK細胞)、綿羊、狗(例如來自狗腎之MDCK細胞，ATCC CCL34 MDCK (NBL2)或MDCK 33016，寄存編號DSM ACC 2219，如WO 97/37001中所述)、貓及齧齒動物(例如，倉鼠細胞，諸如BHK21-F、HKCC細胞或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞))，並且可由廣泛多個發育階段獲得，包括例如成年、新生兒、胎兒及胚胎。在某些實施例中，將細胞永生化(例如，PERC.6細胞，如WO 01/38362及WO 02/40665中所述，並且寄存在ECACC寄存編號96022940下)。在較佳實施例中，哺乳動物細胞經利用並且可選自及/或來源於以下非限制性細胞類型中之一或多者：成纖維細胞(例如真皮、肺)、內皮細胞(例如主動脈、冠狀動脈、肺動脈、血管、真皮微血管、臍)、肝細胞、角質細胞、免疫細胞(例如T細胞、B細胞、巨噬細胞、NK、樹突細胞)、乳腺細胞(例如上皮細胞)、平滑肌細胞(例如血管、主動脈、冠狀動脈、動脈、子宮、支氣管、子宮頸、視網膜周細胞)、黑素細胞、神經細胞(例如星狀膠質細胞)、前列腺細胞(例如上皮細胞、平滑肌細胞)、腎細胞(例如上皮細胞、系膜細胞、近端小管細胞)、骨骼細胞(例如軟骨細胞、破骨細胞、成骨細胞)、肌細胞(例如肌母細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞、支氣管細胞)、肝細胞、成視網膜細胞及基質細胞。WO 97/37000及WO 97/37001描述動物細胞及細胞株之產生，它們能夠在懸浮液中及在無血清之培養基中生長並且適用於產生病毒抗原。在某些實施例中，在無血清培養基中培養非人類細胞。在某些實施例中，本揭露之茲卡病毒可藉由培養Vero細胞產生。病毒去活化

根據本發明之液體不活化病毒組成物包含不活化之全茲卡病毒。

此項技術中已知去活化或殺滅病毒之方法，該方法破壞病毒感染哺乳動物細胞之能力，但不破壞病毒之二級、三級或四級結構及免疫原性表位。此類方法包括化學與物理手段兩者。用於使病毒去活化之合適手段包括但不限於用一或多種選自以下各物之試劑的處理：清潔劑、福爾馬林(在本文中亦稱為「甲醛」)、過氧化氫、β-丙內酯(BPL)、二元乙胺(BEI)、乙醯次乙亞胺、熱、電磁輻射、x射線輻射、γ輻射、紫外線輻射(UV輻射)、UV-A輻射、UV-B輻射、UV-C輻射、亞甲藍、補骨脂素、羧酸富勒烯(C₆₀ )、過氧化氫及其任何組合。如上文所提及，在本申請案中，術語「福爾馬林」與「甲醛」可互換使用。當在本文中提及甲醛濃度時，其係指甲醛之濃度而非福爾馬林之濃度。因此，「0.01% (w/v)之甲醛濃度」係指0.01% (w/v)甲醛，並且不對福爾馬林儲備溶液(其通常含有37質量%甲醛)中之甲醛濃度的此濃度作進一步修正。例如，在病毒製劑中之此類甲醛濃度可藉由稀釋福爾馬林至具有1.85% (w/v)之甲醛含量的工作溶液來獲得，接著可對其進行進一步稀釋，直至當其與諸如茲卡病毒製劑之病毒製劑混合時要求的濃度。

在本揭露之某些實施例中，以化學方式使至少一種(茲卡)病毒去活化。用於化學去活化之試劑及化學去活化之方法係此項技術中熟知的且在本文中描述。在一些實施例中，用BPL、過氧化氫、福爾馬林或BEI中之一或多種以化學方式使至少一種病毒去活化。在某些實施例中，當用BPL以化學方式使至少一種病毒去活化時，該病毒可含有一或多種修飾。在一些實施例中，該一或多種修飾可包括經修飾之核酸。在一些實施例中，經修飾之核酸為烷基化核酸。在其他實施例中，該一或多種修飾可包括經修飾之多肽。在一些實施例中，經修飾之多肽含有經修飾之胺基酸殘基，包括以下中之一或多者：經修飾之半胱胺酸、蛋胺酸、組胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、酪胺酸、離胺酸、絲胺酸及酥胺酸。

在某些實施例中，用甲醛使至少一種(茲卡)病毒去活化。

在某些實施例中，當用福爾馬林(甲醛)以化學方式使至少一種病毒去活化時，該不活化病毒可含有一或多種修飾。在一些實施例中，該一或多種修飾可包括經修飾之多肽。在一些實施例中，該一或多種修飾可包括經交聯之多肽。在一些實施例中，當用福爾馬林以化學方式使至少一種病毒去活化時，液體不活化病毒組成物進一步包括福爾馬林。在某些實施例中，當用BEI以化學方式使至少一種病毒去活化時，該病毒可含有一或多種修飾。在一些實施例中，該一或多種修飾可包括經修飾之核酸。在一些實施例中，經修飾之核酸為烷基化核酸。

在一些實施例中，當用福爾馬林以化學方式使至少一種病毒去活化時，任何殘留的未反應之福爾馬林可用偏二亞硫酸鈉中和，可經透析出及/或可更換緩衝液以移除殘留的未反應之福爾馬林。在一些實施例中，添加過量的偏二亞硫酸鈉。在一些實施例中，溶液可使用混合器諸如在線靜態混合器來混合，且隨後過濾或進一步純化(例如使用錯流過濾系統)。

在一些實施例中，甲醛濃度為0.005% (w/v)至0.02% (w/v)。在一些實施例中，甲醛濃度為0.0075% (w/v)至0.015% (w/v)。在一些實施例中，甲醛濃度為0.01% (w/v)。

在一些實施例中，茲卡病毒為藉由以下方法獲得/可獲得之不活化全病毒，其中在約15℃至約37℃範圍內之溫度下用在約0.001% w/v至約3.0% w/v範圍內之量的甲醛處理茲卡病毒5至15天。在某些此類實施例中，茲卡病毒為藉由用0.005%至0.02% w/v甲醛處理活的全茲卡病毒而獲得/可獲得之不活化全病毒。在某些此類實施例中，茲卡病毒為藉由用少於0.015% w/v甲醛處理活的全茲卡病毒而獲得/可獲得之不活化全病毒。

在某些實施例中，認為不活化之全茲卡病毒可由/由以下方法獲得：其中在22℃之溫度下用約0.02% w/v範圍內之量的甲醛處理茲卡病毒14天。在一些實施例中，認為不活化之全茲卡病毒製劑可由/由以下方法獲得：其中在22℃之溫度下用約0.01% w/v之量的甲醛處理茲卡病毒10天。茲卡病毒純度

茲卡病毒之純度可藉由粒徑排阻層析法測定。本揭露之某些實施例係關於包含至少85%純的不活化之全茲卡病毒之不活化病毒組成物，該純度係藉由粒徑排阻層析法中大於85%之曲線下總面積的茲卡病毒之主峰來判定。在某些此類實施例中，茲卡病毒可為90%純的，如藉由粒徑排阻層析法中大於90%之曲線下總面積的茲卡病毒之主峰來判定。在某些此類實施例中，茲卡病毒可為95%純的，如藉由粒徑排阻層析法中大於95%之曲線下總面積的茲卡病毒之主峰來判定。用途

在某一實施例中，本發明係關於不活化病毒組成物使不活化之全茲卡病毒穩定之用途，該不活化病毒組成物包含： a) 不活化之全茲卡病毒， b) 至少一種具有至少約6.5 mM之濃度的醫藥學上可接受之緩衝液，及 c) 視情況選用之多元醇，其中該不活化病毒組成物不含選自鋁鹽之佐劑且該至少一種醫藥學上可接受之緩衝液不含磷酸根離子。

在某些實施例中，本發明係關於根據本發明之不活化病毒組成物(如上所述)用於使不活化之全茲卡病毒穩定之用途。

在某些此類實施例中，本發明係關於不活化病毒組成物用於使不活化之全茲卡病毒在5±3℃下儲存至少10天期間穩定之用途。

在某些實施例中，本發明係關於不活化病毒組成物用於使不活化之全茲卡病毒在-80℃下儲存至少10天期間穩定之用途。在某些此類實施例中，本發明係關於不活化病毒組成物用於使不活化之全茲卡病毒在-80℃下儲存至少6個月期間穩定之用途。在某些此類實施例中，本發明係關於不活化病毒組成物用於使不活化之全茲卡病毒在-80℃下儲存至少12個月期間穩定之用途。

在某些此類實施例中，本發明係關於不活化病毒組成物用於使不活化之全茲卡病毒在一個或多個凍融循環(諸如至少4個凍融循環)期間穩定之用途。製造不活化病毒組成物之方法

在某些實施例中，本發明係關於一種製備不活化病毒組成物之方法，該不活化病毒組成物包含： a) 不活化之全茲卡病毒； b) 醫藥學上可接受之緩衝液，其中該緩衝液不為磷酸鹽緩衝液且其中該緩衝液之濃度為至少6.5 mM；以及 c) 視情況選用之多元醇；其中該不活化病毒組成物不含選自鋁鹽之佐劑；該方法包含以下步驟：步驟1. 自由一或多種非人類細胞獲得之上清液中分離茲卡病毒製劑，步驟2. 純化該茲卡病毒製劑；步驟3. 使該病毒製劑去活化；步驟4. 將該茲卡病毒製劑轉移至醫藥學上可接受之緩衝液中以獲得茲卡病毒原料藥。

在一些實施例中，步驟1中使用之細胞為非人類細胞。合適的非人類哺乳動物細胞包括但不限於VERO細胞、LLC-MK2細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、ATCC CCL34 MDCK (NBL2)細胞、MDCK 33016 (寄存編號DSM ACC 2219，如WO97/37001中所述)細胞、BHK21-F細胞、HKCC細胞及中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)。在一些實施例中，哺乳動物細胞為Vero細胞。

在步驟2中，此項技術中已知的純化病毒製劑之任何方法皆可用於分離茲卡病毒，包括但不限於使用錯流過濾(CFF)、多元模式層析法、粒徑排阻層析法、陽離子交換層析法及/或陰離子交換層析法。在一些實施例中，藉由錯流過濾(CFF)分離病毒製劑。在一些實施例中，將病毒製劑以約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更多之量高度純化。

在步驟3中，茲卡病毒製劑可藉由在15℃至30℃之溫度下用0.005至0.02% (w/v)福爾馬林處理8至12天來去活化。在一些實施例中，在15℃至30℃之溫度下用0.005至0.02% (w/v)福爾馬林處理茲卡病毒製劑9至11天。在一些實施例中，在15℃至30℃之溫度下用0.005至0.02% (w/v)福爾馬林處理茲卡病毒製劑10天。在一些實施例中，在15℃至30℃之溫度下用0.008至0.015% (w/v)福爾馬林處理茲卡病毒製劑8至12天。在一些實施例中，在15℃至30℃之溫度下用0.008至0.015% (w/v)福爾馬林處理茲卡病毒製劑9至11天。在一些實施例中，在15℃至30℃之溫度下用0.008至0.015% (w/v)福爾馬林處理茲卡病毒製劑10天。在一些實施例中，在15℃至30℃之溫度下用0.01% (w/v)福爾馬林處理茲卡病毒製劑8至12天。在一些實施例中，在15℃至30℃之溫度下用0.01% (w/v)福爾馬林處理茲卡病毒製劑9至11天。在一些實施例中，在15℃至30℃之溫度下用0.01% (w/v)福爾馬林處理茲卡病毒製劑10天。

在一些實施例中，步驟3進一步涉及用有效量之偏二亞硫酸鈉中和未反應之福爾馬林。

在某些實施例中，本發明亦係關於可藉由如上所述之方法獲得的產物(諸如不活化病毒組成物)。茲卡病毒疫苗

根據本發明之不活化病毒組成物一般係指在疫苗製造中使用之中間組成物。本發明之某另一態樣係關於液體疫苗(或組成物，其適用於治療或預防疾病或病狀，特別是適用於治療或預防茲卡病毒感染之組成物)，其係/可由如上所述之不活化病毒組成物獲得。該疫苗含有佐劑且可具有不同於不活化病毒組成物之緩衝液及賦形劑濃度。

在某些此類實施例中，本發明係關於一種液體疫苗，其包含： a) 如前述請求項中任一項所述之不活化病毒組成物，及 b) 佐劑，諸如氫氧化鋁。

在某些此類實施例中，本發明係關於一種包含不活化茲卡病毒之液體疫苗，其中氯化鈉在液體疫苗中之濃度為約50 mM至約200 mM、或約50 mM至約150 mM，諸如約84 mM。在某些此類實施例中，本發明係關於一種液體疫苗，其中該液體疫苗包含約8.5 mM至約80 mM Tris及約50 mM至約150 mM NaCl，且其中液體疫苗之pH值在室溫下量測時為約pH 7.0至約pH 8.0。

在某些此類實施例中，Tris在液體疫苗中之濃度為約9 mM至約80 mM、或約9 mM至約60 mM、或9 mM至約30 mM、或約9 mM至約11 mM或約10 mM。

在某些實施例中，本發明係關於一種液體疫苗，其中該液體疫苗包含約0.4% (w/v)至4.7% (w/v)蔗糖。

在某些實施例中，液體疫苗之滲透壓為約300 ±50 mOsm/kg。按照製造商說明書並且使用其校準及參考溶液，在Advanced Instruments OsmoPRO®多樣品微滲壓計(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)中經由凝固點下降測定滲透壓。佐劑

根據本發明之疫苗包含一或多種來自至少一種Zika病毒之抗原，與一或多種佐劑組合。

達成疫苗之輔佐作用的各種方法係已知的並且可聯合本文所揭露之茲卡病毒疫苗使用。一般原理及方法詳述於"The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E. S. Stewart-Tull (編), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6以及"Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G等人 (編), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9中。

示範性佐劑可包括但不限於鋁鹽、磷酸鈣、toll樣受體(TLR)促效劑、單磷醯脂質A (MLA)、MLA衍生物、合成脂質A、脂質A模擬物或類似物、細胞介素、皂角苷、胞壁醯二肽(MDP)衍生物、CpG寡聚物、革蘭氏陰性菌之脂多醣(LPS)、聚磷腈、乳液(油乳液)、殼聚糖、維生素D、硬脂基或十八基酪胺酸、病毒體、螺旋體、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆顆粒、微粒、脂質體、完全弗氏佐劑(CFA)及不完全弗氏佐劑(IFA)。在一些實施例中，佐劑為鋁鹽。

在一些實施例中，佐劑包括以下至少一種：明礬(諸如氫氧化鋁)、磷酸鋁、氫氧化鋁氧化物、氫氧化鋁、沉澱氫氧化鋁、硫酸鋁鉀及膠狀氫氧化鋁，諸如Alhydrogel 85。在下文中，呈醫藥學上可接受之形式(特別是用作佐劑)的氫氧化鋁氧化物、氫氧化鋁及沉澱及/或膠狀氫氧化鋁亦統稱為「氫氧化鋁」。在一些實施例中，已發現本揭露之鋁鹽佐劑增加本揭露之茲卡病毒疫苗抗原之吸附。因此，在一些實施例中，至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%之抗原吸附至鋁鹽佐劑。

本揭露之某些實施例包括一種用於製備配有佐劑之茲卡病毒疫苗的方法，該方法涉及(a) 將疫苗與鋁鹽佐劑混合，其中疫苗包括一或多種來自至少一種本文所述之茲卡病毒的抗原，及(b) 將混合物在合適條件下與吸附至鋁鹽佐劑上之至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%抗原一起培育約1小時至約24小時(例如，約16小時至約24小時)範圍內之時間。在該方法之某些實施例中，至少一種茲卡病毒為包含非人類細胞適應突變(例如，在蛋白NS1中之非人類細胞適應突變，諸如Trp98Gly突變)之茲卡病毒。在一些實施例中，至少一種茲卡病毒為經純化之不活化之全茲卡病毒，該病毒包含在SEQ ID NO: 1之位置98處或在對應於SEQ ID NO: 1之位置98的位置處之Trp98Gly突變，其中茲卡病毒來源於毒株PRVABC59。在一些實施例中，茲卡病毒為經純化之不活化之全茲卡病毒，該病毒包含在SEQ ID NO: 1之位置98處或在對應於SEQ ID NO: 1之位置98的位置處之Trp98Gly突變，其中茲卡病毒來源於包含根據SEQ ID NO: 2之基因體序列的毒株PRVABC59。

不希望受任何理論約束，使茲卡病毒抗原(不活化之全茲卡病毒)吸附至鋁鹽(諸如氫氧化鋁/明礬)可提高茲卡病毒抗原之穩定性。

在某些較佳實施例中，佐劑為氫氧化鋁。

在某些實施例中，本發明係關於一種液體疫苗，其基於元素鋁包含100 µg/ml至800 µg/ml氫氧化鋁、或200 µg/ml至600 µg/ml氫氧化鋁、或300 µg/ml至500 µg/ml氫氧化鋁、或約400 µg/ml氫氧化鋁。

在某些此類實施例中，本發明係關於一種液體疫苗，其中該液體疫苗包含約8.5 mM至約50 mM Tris及約50 mM至約150 mM NaCl，及基於元素鋁約300 µg/ml至約500 µg/ml氫氧化鋁，且其中液體疫苗之pH值在室溫下量測時為約pH 7.0至約pH 8.0。劑量

在某些實施例中，本發明係關於根據本發明之液體疫苗之單位劑量。

在某些此類實施例中，液體疫苗之單位劑量包含約1 µg至約15 µg不活化之全茲卡病毒之劑量。在某些此類實施例中，疫苗之單位劑量包含約2 μg不活化之全茲卡病毒之劑量。在某些此類實施例中，疫苗之單位劑量包含約5 μg不活化之全茲卡病毒之劑量。在某些此類實施例中，疫苗之單位劑量包含約10 μg不活化之全茲卡病毒之劑量。

在某些實施例中，疫苗之單位劑量係提供為約0.4 mL至約0.8 mL之醫藥學上可接受之液體。

在某些此類實施例中，液體疫苗之單位劑量基於元素鋁包含約100 µg至約300 µg氫氧化鋁，諸如約200 µg氫氧化鋁。如熟練技術人員所熟知，片語「基於元素鋁」係指規定疫苗調配物之鋁含量的方式。鑒於(水合)氫氧化鋁、氫氧化鋁氧化物及相關鋁化合物之不同水含量及複雜的化學計量，因此需要一種標準化方法來指示組成物之鋁含量。對此，通常給出表示為「元素鋁」之鋁離子之量。因此，舉例而言，據稱「基於元素鋁含有100 µg/ml氫氧化鋁」之組成物(或常以簡明形式表示，據稱含有「100 µg/ml氫氧化鋁」之組成物)含有100 µg/ml鋁離子。治療方法

在某些實施例中，本發明係關於一種在有需要之人類個體中治療或預防、具體而言預防茲卡病毒感染之方法，該方法包含向該個體投與單位劑量之根據本發明之疫苗。

在某些實施例中，本發明係關於一種在有需要之人類個體群中治療或預防、特別是預防茲卡病毒感染之方法，該方法包含向該人類個體群之單個人類個體投與單位劑量之根據本發明之疫苗。

在某些實施例中，本發明係關於根據本發明之疫苗之單位劑量，其係用於在有需要之人類個體中治療或預防、特別是預防茲卡病毒感染。

在某些實施例中，本發明係關於根據本發明之疫苗的單位劑量在製造用於預防有需要之人類個體中的茲卡病毒感染之藥劑中的用途。

在一些實施例中，本揭露係關於藉由向有需要之個體投與治療有效量之根據本發明之疫苗而在該個體中誘導對茲卡病毒之免疫反應的方法。在一些實施例中，該投與步驟在個體中誘導針對茲卡病毒之保護性免疫反應。

在某些此類實施例中，個體為女性個體。在一些實施例中，個體正在懷孕或打算懷孕。

本揭露之方法包括投與治療有效量或免疫原性量之本揭露之茲卡病毒疫苗。治療有效量或免疫原性量可為將在投與其之未受感染、受感染或未經暴露之個體中誘導保護性免疫反應的本揭露之疫苗之量。此類反應通常將在個體中造成針對疫苗之分泌、細胞及/或抗體介導之免疫反應的發展。通常，此類反應包括但不限於以下效應中之一或多者：自任何免疫類別產生抗體，諸如免疫球蛋白A、D、E、G或M；B及T淋巴細胞之增殖；向免疫細胞提供活化、生長及分化信號；輔助T細胞、抑制T細胞及/或細胞毒性T細胞之擴增。

較佳地，治療有效量或免疫原性量足以治療或預防疾病症狀。所需確切量將視以下因素而變化：所治療之個體；有待治療之個體之年齡及一般狀況；個體免疫系統合成抗體之能力；所要保護程度；所治療病狀之嚴重性；所選特定茲卡病毒抗原及其投與模式；等等。適當的治療有效量或免疫原性量可易於由熟習此項技術者確定。治療有效量或免疫原性量將落在可經由常規試驗確定之相對較寬範圍內。

通常，本揭露之疫苗經製備為呈液體溶液或懸浮液之可注射劑。

疫苗習知地可藉由注射非經口，例如皮下、經皮、真皮內、真皮下或肌內投與。適用於其他投與模式之額外調配物包括栓劑且在一些情況下，包括經口、口服、鼻內、頰內、舌下、腹膜內、陰道內、肛門及顱內調配物。對於栓劑，傳統黏合劑及載劑可包括例如聚烷二醇或甘油三酯；此類栓劑可由含有在0.5%至10%或甚至1-2%範圍內之活性成分的混合物形成。在某些實施例中，首先熔化低熔點蠟(諸如脂肪酸甘油酯或可可脂之混合物)並且將本文所述之茲卡病毒疫苗例如藉由攪拌均勻分散。接著將熔化之均勻混合物傾入適宜尺寸之模具中，使冷卻並凝固。

本揭露之疫苗可以與劑量調配物相容之方式投與並且此類量將為治療有效的及免疫原性的。有待投與之量視有待治療之個體而定，包括例如個體之免疫系統產生免疫反應之能力及所要保護程度。合適的劑量範圍可包括例如約0.1 µg至約100 µg經純化之不活化之全茲卡病毒

用於初始投與及加強注射之合適方案亦可變，但以初始投與，隨後接種或其他投與為代表。製造疫苗之方法

在某些實施例中，本發明亦係關於一種製備液體疫苗之方法，該方法包含以下步驟：步驟1. 提供根據本發明之不活化病毒組成物，步驟2. 將佐劑(較佳鋁鹽)及視情況選用之另一醫藥學上可接受之緩衝液體添加至該不活化病毒組成物中。

在某些此類實施例中，在步驟2中，該另一醫藥學上可接受之緩衝液體包含與在不活化病毒組成物中具有最高濃度之緩衝液相同之緩衝液。

在某些實施例中，本發明係關於一種可藉由如上所述之方法獲得之產物。實例

包括以下實例以說明如申請專利範圍中所述的本發明之某些態樣及實施例。然而，熟習此項技術者應理解，以下描述僅為說明性的且不應視為以任何方式限制本發明。實例 1 ：純系茲卡病毒株之產生

此實例描述已知研究歷史的茲卡病毒(ZIKAV)株之產生。材料及方法 Vero細胞維持

將一小瓶WHO Vero 10-87細胞在水浴中快速解凍並在36℃+/2℃、5% CO₂ 下直接接種至T-75 cm² 燒瓶中之19 mL預熱之DMEM (杜氏改良之最低必需培養基)中，該DMEM含有青黴素-鏈黴素、L-谷氨醯胺40 mM及10% FBS。使細胞生長至匯合並使用TryplE進行繼代培養。將此燒瓶擴充為兩個T-185 cm² 燒瓶，生長至匯合並至31 xT-185 cm² 燒瓶中繼代培養，並且生長直至細胞達到100%匯合。藉由胰蛋白酶化收穫細胞，在800 x g下離心10分鐘，並且以1.9x10⁷ 個細胞/mL之濃度再懸浮於含有10% FBS及10% DMSO之DMEM中。將一小瓶Vero細胞快速解凍並且如上所述至T-75 cm² 燒瓶中復蘇。將此等細胞繼代培養兩次以便在13 x T-185 cm² 燒瓶中產生細胞庫。在胰蛋白酶化以後，將細胞在800 x g下離心並且以4.68x10⁵ 個細胞/mL之濃度再懸浮於冷凍培養基(含有10% FBS及10% DMSO之DMEM)中。將此細胞庫等分至冷凍管中。

使Vero細胞生長並維持在含有青黴素-鏈黴素、L-谷氨醯胺及10% FBS之DMEM (cDMEM-10%-FBS)中。將TryplExpress用於維持細胞並對細胞進行胰蛋白酶化。病毒吸附之前兩天，用在3 mL cDMEM-10%-FBS中之4-5 x 10⁵ 個細胞/孔、或在T-25 cm² 燒瓶中用在5 mL cDMEM-10%-FBS中之7 x 10⁵ 個細胞、或在96孔平板中用在0.1 mL cDMEM-10%-FBS中之1 x 10⁴ 個細胞/孔接種6孔平板。每日監測培養箱以維持指示溫度。將Vero細胞株儲存於液氮中。蝕斑檢定

病毒效價係藉由蝕斑滴定在6孔平板中生長的Vero細胞之新近匯合之單層來測定。對冷凍等分試樣進行解凍並且在96孔平板中於cDMEM-0%-FBS中製備等分試樣之十倍稀釋系列。在Vero細胞單層接種之前，將經稀釋之病毒保持在冰上。檢定之時，自6孔平板中抽吸生長培養基，並且將100 μL各病毒稀釋液添加至孔中。在36℃±2℃、5% CO₂ 下吸附病毒60 min，伴隨頻繁(每10 min)的平板搖動以防止細胞片乾燥。病毒吸附之後，將4 mL維持在40-41℃下之第一瓊脂糖覆蓋層(1X cDMEM-2%-FBS + 0.8%瓊脂糖)添加至各孔中。使瓊脂糖在室溫下凝固30 min，且接著在36℃+/2℃、5% CO₂ 下倒置培育平板4-6天。第4天添加2 mL含有160 μg/mL中性紅活性染料之第二瓊脂糖覆蓋層。第5天及第6天目測蝕斑。藉由TCID50檢定之病毒定量

病毒效價亦藉由滴定在96孔平板中生長的Vero細胞之新近匯合之單層來測定。對冷凍等分試樣進行解凍並且在96孔平板中於cDMEM-2%-FBS稀釋劑中製備等分試樣之十倍稀釋系列。在Vero細胞單層接種之前，將經稀釋之病毒保持在冰上。檢定之時，自96孔平板中抽吸生長培養基，並且將100 μL各病毒稀釋液添加至孔中。在36℃+/2℃、5% CO₂ 下培育平板5天。使用Reed/Muench計算器計算50%組織培養感染劑量(TCID50)效價。測試物品

茲卡病毒株PRVABC59 (一個0.5 mL小瓶，於乾冰上)係由the Centers for Disease Control and Prevention (CDC)獲得。經由RT-PCR證實茲卡病毒鑑別。藉由PCR測得該毒株之α病毒及支原體污染呈陰性。此資訊總結於表 1 中。表 1 ： PRVABC59 株之資訊

株	分離資訊	患者資訊	製備資訊	分析	PFU
PRVABC59 (亞洲)	人類血清；於2015年去波多黎各旅行	未提供	傳代：Vero(2)C6/36(1) 製備：2016年1月29日宿主：C6/36	▪ 藉由離子激流定序：基因登錄號KU501215 ▪ PFU(藉由蝕斑檢定) ▪ 一致性(藉由RT-PCR) ▪ α病毒(-) (藉由PCR) ▪ 支原體(-) (藉由ATCC及ABM PCR)	6.7 log pfu/mL

定序

根據製造商方案，QIAampViral RNA Mini Spin套組用於自各分離株之穩定的病毒收穫物中提取RNA。將來自各分離株之提取的RNA用於產生及擴增涵蓋整個茲卡病毒基因體之6個cDNA片段。在1%瓊脂糖/TBE凝膠上分析經擴增之cDNA片段的尺寸及純度，隨後使用Qiagen Quick Gel Extraction Kit進行凝膠純化。將ABI 3130XL Genetic Analyzer定序器用於進行自動定序反應。將Lasergene SeqMan軟體用於分析定序數據。結果

尋找已知研究歷史之ZIKAV株，該株與目前在美洲暴發之ZIKAV有關。由於此原因，選擇ZIKAV株PRVABC59。為了生成適於在Vero細胞中生長的充分表徵之病毒，首先使ZIKAV PRVABC59在Vero細胞(P1)中擴增。

在4 mL cDMEM-0%-FBS中以0.01之MOI感染燒瓶(T-175cm² )中100%匯合之Vero細胞。在36℃±2℃、5% CO₂ 下病毒吸附至單層持續60分鐘，接著在36℃±2℃、5% CO₂ 下將20 mL cDMEM-0%-FBS應用於病毒擴增。接種之後，每日監測細胞層之細胞病變效應(CPE)(圖 1 )。96小時之後藉由收集培養基並藉由離心(600 x g，4℃，10 min)進行澄清來收穫上清液。藉由添加海藻糖至18% w/v之最終濃度使收穫物穩定。將整體等分至0.5 mL冷凍管中並在-80℃下儲存。

藉由TCID50檢定，關於感染性病毒在Vero細胞單層上之存在對穩定之P1收穫物進行分析。藉由自0小時開始每日採集等分試樣來監測生長動力學。效價至72小時達到峰值(圖 2 )。

藉由滴定第3天來自Vero細胞6孔單層之收穫物對P1材料進行蝕斑純化。第6天目測蝕斑，並且藉由在塑料板底部圍繞不同及單獨的蝕斑畫個圈來鑑別10個有待分離之蝕斑。藉由使用無菌寬口徑吸移管提取瓊脂糖塞，同時刮取孔底部並用cDMEM-10%-FBS沖洗，來挑取蝕斑。將瓊脂糖塞添加至0.5 mL cDMEM-10%-FBS中，渦旋，標記為PRVABC59 P2a-j並置於36℃±2℃、5% CO₂ 下之培育箱中隔夜。

對3個蝕斑(PRVABC59 P2a-c)進行另外純化。將各分離株一式兩份整齊地平鋪於新鮮Vero細胞之6孔單層上。對此P2/P3轉變進行蝕斑純化，並且標記PRVABC59 P3a-j。

對6個蝕斑(PRVABC59 P3a-f)進行最後一輪純化。將各分離株一式兩份整齊地平鋪於新鮮Vero細胞之6孔單層上。對此P3/P4轉變進行蝕斑純化，並且標記PRVABC59 P4a-j。

將來自P4蝕斑純化之6個蝕斑(PRVABC59 P4a-f)在T-25 cm² 燒瓶中於Vero細胞之單層上進行盲目傳代。將各蝕斑挑取物在2 mL cDMEM-0%-FBS中稀釋-1 mL在36℃±2℃、5% CO₂ 下吸附持續1小時；另外1 mL用海藻糖(18% v/v最終)穩定並在＜-60℃下儲存。病毒吸附之後，將cDMEM-0%-FBS添加至各燒瓶中並且允許在36℃±2℃、5% CO₂ 下生長4天。收穫病毒上清液，藉由離心(600 x g，4C，10 min)澄清，在18%海藻糖中穩定，並且等分試樣並在＜-60℃下儲存。藉由TCID50測試此P5種子之茲卡病毒效力(圖 3 )。

在4 mL cDMEM-0%-FBS中，用PRVABC59 (P5a-f)六個純系中之每個以0.01之MOI感染Vero細胞在T-175 cm² 燒瓶中之匯合單層。在36℃+/2℃、5% CO₂ 下使病毒吸附持續60分鐘，之後將20 mL cDMEM-0%-FBS添加至各燒瓶中並且允許在36℃+/2℃、5% CO₂ 下生長。每日監測Vero細胞單層之健康情況及CPE。如所示在第3天及第5天收穫病毒(圖 4 )。彙集由第3天及第5天收穫之P6株，用18%海藻糖使其穩定，進行等分並且在＜-60℃下儲存。

針對茲卡病毒活體外效力測試6個PRVABC59純系(P6a-f)中之每個(圖 5 )。藉由兩種不同方法，亦即TCID50與蝕斑滴定來測定效力。藉由目測檢查CPE (顯微鏡)並藉由量測與紅色(無CPE)相比展示CPE (黃色)之孔的吸光度(A560-A420)差異來計算TCID50。在平板讀取器上讀取平板，並將讀數應用於與顯微讀板(吸光度)相同之計算器上。兩種評分技術之間的TCID50值十分相似，而藉由蝕斑滴定獲得之值則較低。

P6病毒之產生及表徵之概述示於下表2中。表 2 ：用於生成純系 ZIKAV 株之病毒傳代概述及表徵

傳代	種子產生/ 純化	表徵
P1	Vero中之病毒擴增	TCID50效價
P2	藉由蝕斑滴定擴增P1；P1之蝕斑純化	蝕斑純化
P3	由P2蝕斑檢定挑取蝕斑並使其傳代；P2之蝕斑純化	蝕斑純化
P4	由P3蝕斑檢定挑取蝕斑並使其傳代；P3之蝕斑純化	蝕斑純化
P5	在Vero細胞中擴增P4蝕斑(a-f)	TCID50效價
P6	在Vero細胞中擴增P5 (a-f)病毒	TCID50效價、蝕斑表型、基因分型、全基因體定序、生長動力學

尋找與原始分離株之包膜醣蛋白序列非常類似的經分離之茲卡病毒純系，因為黃病毒之包膜蛋白為該病毒之主要免疫原性部分。PRVABC59純系P6a、P6c、P6d及P6f在包膜區(G990T)之核苷酸990處含有G→T突變，造成在包膜殘基330處之Val→Leu胺基酸突變，而PRVABC59純系P6b及P6e之包膜基因則與參考株(GenBank ref KU501215.1)相同(表3及圖 6 )。表 3 ： PRVABC59 P6 純系之定序

包膜定序( 來自PRVABC59 之參考基因；登錄號KU501215)
株	核苷酸	胺基酸	突變	注釋
PRVABC59 P6a	Env-990: G→T	Env-330: Val330→Leu	Val/Leu	在4個讀碼中有3個突變。
PRVABC59 P6b	Env-1404: T→G 沉默	野生型	野生型	相對於參考之野生型。
PRVABC59 P6c	Env-990: G→T	Env-330: Val330→Leu	Val/Leu	在4個讀碼中有3個突變。
PRVABC59 P6d	Env-990: G→T	Env-330: Val330→Leu	Val/Leu	在2個讀碼中有2個突變。
PRVABC59 P6e	野生型	野生型	野生型	相對於參考之野生型。
PRVABC59 P6f	Env-990: G→T	Env-330: Val330→Leu	Val/Leu	在2個讀碼中有2個突變。190 bp未定序(aa 421 – 484)。
全基因體定序 ( 來自 PRVABC59 之參考基因；登錄號 KU501215)
株	核苷酸	胺基酸	突變	注釋
PRVABC59 P6b	Env-1404 T→G	野生型	沉默	在2個讀碼中有2個突變
NS1-292 T→G	NS1-98 Trp98→Gly	Trp/Gly	在2個讀碼中有2個突變
PRVABC59 P6e	NS1-292 T→G	NS1-98 Trp98→Gly	Trp/Gly	在2個讀碼中有2個突變

接著對在茲卡包膜序列中缺乏突變之兩個純系進行全基因體定序。定序結果總結於以上表3中。序列分析揭示在兩個純系之NS1區中的核苷酸292處之T→G取代，導致在NS1殘基98處之Trp→Gly突變。此突變稍後亦經由深度定序證實。NS1 W98G突變位於ZIKAV NS1之側翼結構域的纏繞環中，其牽涉於膜結合中，與包膜蛋白相互作用且潛在地造成六聚NS1形成。其他色胺酸殘基(W115、W118)在黃病毒中高度保守，而W98則不(圖 7 )。然而，有趣的是，在11個不同ZIKAV株中觀察到W98殘基100%保守，包括來自非洲及亞洲譜系之彼等。在各株中所鑑別之突變總結於表4中。表 4 ：在 PRVABC59 P6 純系中鑑別的突變之概述

在包膜中鑑別之突變
純系	核苷酸	胺基酸
P6a	G990T	V330L
P6b	T1404G	(沉默)
P6c	G990T	V330L
P6d	G990T	V330L
P6e	無	無
P6f	G990T	V330L
在基因體中鑑別之額外突變
純系	核苷酸	胺基酸
P6b	NS1-T292G	NS1-W98G
P6e	NS1-T292G	NS1-W98G
參考序列：KU501215.1 (PRVABC59)

對ZIKAV PRVABC59 P6儲備物進行表型分析以表徵ZIKAV純系。如圖 8 所示及圖 9 所量化，各純系分離株係由與P1病毒相比相對均勻之大號蝕斑群組成，而P1病毒具有大蝕斑與小蝕斑之混合群。此等數據提示單個ZIKAV純系之成功分離。

緊接著，在ZIKAV PRVABC59 P6純系之Vero細胞中進行生長動力學分析。在無血清生長培養基中用各個ZIKAV P6純系之0.01 TCID50/細胞感染Vero細胞。每日採集病毒上清液樣品且同時藉由TCID50檢定分析感染效價。對於所有P6純系，峰效價出現在第3天與第4天之間(~9.0 log₁₀ TCID50/mL)。在各種P6純系之生長動力學中不存在顯著差異(圖 10 )。

綜上所述，結果表明已成功生成茲卡病毒種子。此種子選擇需要瞭解病毒之生長歷史、動力學、產率、基因型及表型。重要的是，對茲卡病毒株之純系分離使得病毒能夠成功地自污染因子(例如，可存在於親代人類分離株中之外來因子)中純化出來。感興趣的是，三次連續蝕斑純化成功地快速選擇Vero-細胞適應病毒(毒株P6a-f)，其中此等毒株能夠在無血清之Vero細胞培養物中良好複製，毒株P6a、c、d及f在病毒包膜蛋白中載有突變，而毒株p6b及p6e在病毒NS1蛋白中獲得突變(對病毒包膜無修飾)。另外，Vero適應株能夠實現自此等毒株繁殖的後續病毒傳代之有效及可再現之生長及製造。不希望受理論約束，在P6a、c、d及f毒株中觀察到的Env-V330L突變可潛在地為活體外適應之結果，因為在Env 330處之突變亦在Vero細胞之傳代中觀察到(Weger-Lucarelli等人 2017. Journal of Virology)。因為包膜蛋白為茲卡病毒之主要免疫原性表位，所以在Env中含有Vero適應突變之毒株可能負面地影響疫苗免疫原性。不希望受理論約束，蛋白NS1中之適應突變似乎不僅增強病毒複製，而且亦減少或以其他方式抑制不希望有的突變諸如在茲卡病毒之包膜蛋白E (Env)中之出現。另外，已知NS1可在病毒之生命週期期間結合至包膜蛋白。此突變(NS1 W98G)可涉及改變在後續加工期間NS1與病毒結合及可能地共純化之能力。亦已知NS1具有免疫原性並且可牽涉於對疫苗之免疫反應中。實例 2 ：去活化完成檢定以確定去活化之有效性

開發一種雙重感染性檢定(亦稱為去活化完成(COI)檢定)以確定甲醛去活化(0.01%甲醛)之有效性及經純化之不活化茲卡病毒(PIZV)散裝原料藥(BDS)之潛在殘留感染性病毒活性。

樣品製備： 藉由在Vero細胞中生長來製造如上所述的純系e之四個經純化之不活化茲卡疫苗(PIZV)批次(Tox批次1-4)。藉由層析法純化來自4次每日收穫物之上清液(總計約4000 mL)，接著添加甲醛直至0.01%. w/v之最終濃度。允許去活化在22℃下繼續進行10天。在用於表徵及分析之去活化期間，自散裝原料藥(BDS)中每日移除製程對照(IPC)樣品。用偏二亞硫酸鈉中和每日IPC樣品並且透析至DMEM (病毒生長培養基)中。該等樣品含有經純化之不活化茲卡病毒。在去活化最後一天，剩餘體積之BDS樣品不經中和，但用TFF處理以移除甲醛並且將緩衝液更換為PBS。

去活化完成檢定 (COI) ：將COI檢定用於分析每日IPC樣品中之去活化有效性以便理解去活化之動力學並最終確定BDS。關於最大敏感性，最初在此檢定中利用兩個細胞株，亦即Vero及C6/36，以偵測IPC及DS樣品中之潛在活病毒。當茲卡病毒在含有酚紅之生長培養基存在下感染Vero細胞時，細胞死亡之副產物會造成pH值下降。因此，培養基顏色自紅色/粉紅色變為黃色，表明培養基pH值之酸性變化。此現象係由凋亡及細胞病變效應(CPE)引起，細胞病變效應係指在宿主細胞之細胞結構中觀察到的由病毒複製期間病毒侵入、感染及自細胞出芽引起之變化。最終，雖然C6/36蚊子及細胞皆為感染之容許細胞株，但茲卡病毒感染僅在活體外殺滅Vero細胞。因此，該檢定將Vero細胞用作指標細胞株。相反，來源於茲卡病毒之天然宿主載體的C6/36細胞在感染茲卡病毒後不表現出CPE且不溶解。培養基不變色且C6/36細胞之活力不改變。

該檢定由此分為兩部分：檢定之第一部分允許潛在的活病毒顆粒在兩個易感細胞株之96孔平板上並行擴增6天。檢定之第二步驟涉及96孔平板之上清液(包括潛在擴增之顆粒)轉移至含有Vero細胞單層之6孔平板上，並且再培育8天以允許病毒感染及細胞病變效應，以便在在Vero細胞上發育。使用光學顯微鏡證實觀察到之任何CPE。

雖然已對96孔平板在檢定之第一部分(亦即C6/36細胞中之培養)中及6孔平板在檢定之第二部分(亦即，Vero細胞之培養以觀察細胞病變效應)中之用途進行詳細描述，但該檢定可易於如下表5所示按比例擴大。

顯然，在部分1中，每cm² 容器之樣品體積保持不變，而在部分2中則保持相同的病毒感染條件。

COI 檢定對照： 使用Vero指標細胞進行此檢定之效價及反滴定對照並且以TCID50 96孔格式進行評定，其中基於培養基顏色自粉紅色變為黃色(作為對細胞死亡之替代)或CPE之存在將孔評為陽性。

病毒效價對照測試： 將具有已知效價之對照病毒(PRVABC59)的兩個獨立複製品在含2% FBS之培養基中進行10倍稀釋系列，並且將100 µL各稀釋物添加至含有Vero細胞之96孔平板之四個孔中。培育平板5天，接著記錄含有CPE之孔，並且使用Reed-Meunch計算器計算病毒效價。

病毒反滴定對照測試： 將已知效價之對照病毒連續稀釋至200 TCID50。將200 TCID50對照病毒之兩個獨立複製品在含有2% FBS之培養基中進行2倍稀釋系列，並且將100 µL各稀釋物添加至含有Vero細胞之96孔平板之四個孔中。培育細胞5天，接著記錄含有CPE之孔，並且使用Reed-Meunch計算器計算病毒效價。

COI方案詳情： 1. 檢定之第一部分：在添加樣品之前，在96孔平板中接種Vero (1.4E+05個細胞/mL)及埃及伊蚊C6/36 (4E+05個細胞/mL)細胞兩天。將Vero細胞在37℃下在DMEM + 10%最終FBS + 2% L-谷氨醯胺+ 1%青黴素/鏈黴素中培養。將C6/36細胞在28℃下在DMEM + 10% FBS + 2% L-谷氨醯胺+ 1%青黴素/鏈黴素+ 1%非必需胺基酸中培養。 2. 將200 TCID50對照病毒(在病毒反滴定對照測試中製備)之三個獨立複製品或DS樣品稀釋(5倍及10倍稀釋物)至含有2% FBS之培養基中。 3. 用樣品接種96孔平板中之細胞。在96孔平板中感染細胞單層之前，對樣品進行渦旋以破壞任何可能之聚集。將100 μL各稀釋物施加於分別含有Vero及C6/36細胞之兩個單獨96孔平板之5個孔的每個中。 4. 單獨之培養基作為每個細胞類型之陰性CPE對照包括在另一孔中。 5. 在對細胞株適當之溫度下培育平板6天。 6. 檢定之第二部分：為了使活病毒在容許細胞株上進一步擴增及關於CPE進行目測，將來自Vero及C6/36細胞之各個96孔上清液之總體積轉移至Vero細胞之6孔平板之單個孔中。以15分鐘之間隔時間，在搖動下繼續進行接種90分鐘。 7. 將含有2% FBS之培養基添加至孔中並且再培育平板8天以便後續偵測擴增樣品隨CPE之變化。若在第8天結束時DS之任何複製品顯示出CPE，則認為去活化為不完全的。 7. 在轉移至6孔平板並且培育8天以允許病毒複製之後，藉由易感細胞單層上蝕斑或CPE之形成目測到活的/複製病毒體之存在。在檢定結束時對6孔平板之CPE評分%計算如下：藉由以下步驟檢查Vero細胞之各個6孔平板的CPE：目測比色變化，接著在倒置光學顯微鏡下觀察來確認CPE。各個6孔平板代表在如上所述之5倍及10倍稀釋(5孔，加上一個含有單獨培養基之孔)中製備的DS稀釋物之複製品之一者。因此，每個複製品之CPE %反映每樣品共5個孔中有CPE之孔的數目(每次檢定共使用120個孔)。基於各稀釋之三個複製品計算平均CPE %及標準偏差。結果： 如下表6至9所示分析Tox批次#1-4之每批中的每日樣品。表 6 ：去活化之動力學， Tox 批次 #1

樣品	轉移	平均CPE%	STDV
1:10 第-1天	Vero-至-Vero	100	0
1:10 第0天	Vero-至-Vero	100	0
1:10 第1天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第2天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第3天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第4天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第7天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第8天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第9天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第10天	Vero-至-Vero	0	0
100TCID50/mL	Vero-至-Vero	100	0
1:10 第-1天	C6/36-至-Vero	100	0
1:10 第0天	C6/36-至-Vero	100	0
1:10 第1天	C6/36-至-Vero	6.7	12
1:10 第2天	C6/36-至-Vero	13.3	12
1:10 第3天	C6/36-至-Vero	0	0
1:10 第4天	C6/36-至-Vero	0	0
1:10 第7天	C6/36-至-Vero	0	0
1:10 第8天	C6/36-至-Vero	0	0
1:10 第9天	C6/36-至-Vero	0	0
1:10 第10天	C6/36-至-Vero	0	0
100TCID50/mL	C6/36-至-Vero	100	0

表 7 ：去活化之動力學， Tox 批次 #2

樣品	轉移	平均CPE%	STDV
1:10 第-1天	Vero-至-Vero	100	0
1:10 第0天	Vero-至-Vero	100	0
1:10 第1天	Vero-至-Vero	100	0
1:10 第2天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第3天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第4天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第7天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第8天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第9天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第10天	Vero-至-Vero	0	0
100TCID50/mL	Vero-至-Vero	100	0
1:10 第-1天	C6/36-至-Vero	100	0
1:10 第0天	C6/36-至-Vero	100	0
1:10 第1天	C6/36-至-Vero	100	12
1:10 第2天	C6/36-至-Vero	13.3	12
1:10 第3天	C6/36-至-Vero	0	0
1:10 第4天	C6/36-至-Vero	0	0
1:10 第7天	C6/36-至-Vero	0	0
1:10 第8天	C6/36-至-Vero	0	0
1:10 第9天	C6/36-至-Vero	0	0
1:10 第10天	C6/36-至-Vero	0	0
100TCID50/mL	C6/36-至-Vero	100	0

表 8 ：去活化之動力學， Tox 批次 #3

樣品	轉移	平均CPE%	STDV
1:10 第-1天	Vero-至-Vero	100	0
1:10 第0天	Vero-至-Vero	100	0
1:10 第1天	Vero-至-Vero	27	12
1:10 第2天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第3天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第4天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第7天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第8天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第9天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第10天	Vero-至-Vero	0	0
100TCID50/mL	Vero-至-Vero	100	0
1:10 第-1天	C6/36-至-Vero	100	0
1:10 第0天	C6/36-至-Vero	100	0
1:10 第1天	C6/36-至-Vero	87	12
1:10 第2天	C6/36-至-Vero	27	12
1:10 第3天	C6/36-至-Vero	0	0
1:10 第4天	C6/36-至-Vero	0	0
1:10 第7天	C6/36-至-Vero	0	0
1:10 第8天	C6/36-至-Vero	0	0
1:10 第9天	C6/36-至-Vero	0	0
1:10 第10天	C6/36-至-Vero	0	0
100TCID50/mL	C6/36-至-Vero	100	0

表 9 ：去活化之動力學， Tox 批次 #4

樣品	轉移	平均CPE%	STDV
1:10 第-1天	Vero-至-Vero	100	0
1:10 第0天	Vero-至-Vero	93	12
1:10 第1天	Vero-至-Vero		0
1:10 第2天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第3天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第4天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第7天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第8天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第9天	Vero-至-Vero	0	0
1:10 第10天	Vero-至-Vero	0	0
100TCID50/mL	Vero-至-Vero	100	0
1:10 第-1天	C6/36-至-Vero	100	0
1:10 第0天	C6/36-至-Vero	100	0
1:10 第1天	C6/36-至-Vero	33	23
1:10 第2天	C6/36-至-Vero	7	12
1:10 第3天	C6/36-至-Vero	0	0
1:10 第4天	C6/36-至-Vero	0	0
1:10 第7天	C6/36-至-Vero	0	0
1:10 第8天	C6/36-至-Vero	0	0
1:10 第9天	C6/36-至-Vero	0	0
1:10 第10天	C6/36-至-Vero	0	0
100TCID50/mL	C6/36-至-Vero	100	0

經編譯之去活化動力學數據：將來自四個毒理批次之樣品的COI數據與如上針對RNA複本所測定之感染效力(TCID50)相比。藉由純化來自樣品之核酸及使用RT-PCR套組用血清型特異性引子擴增茲卡RNA來測定RNA複本。圖 11 中所示之結果展示COI檢定之靈敏度顯著大於TCID50之靈敏度。

COI 檢定之性能特徵 - 準確度： 將靶稀釋物(TCID50/孔)及其各自之CPE比例用於確定相對準確度。對於Vero細胞，在觀察到的與預期的陽性CPE比例之間存在統計上顯著之線性關係。同觀察結果與預期結果相關之直線的斜率為0.92，其中95%信賴區間(CI)為0.83至1.01，重疊1表示100%準確度。對於C6/36細胞，在觀察到的與預期的陽性CPE比例之間存在統計上顯著之線性關係。同觀察結果與預期結果相關之直線的斜率為0.88，其中95%信賴區間(CI)為0.80至0.95，表明在此細胞株下發現輕微偏差(5-20%)。兩個細胞株均表現出令人滿意之準確度(相對)。

COI 檢定之性能特徵 – 偵測極限 (LoD) ：針對C6/36-至-Vero及Vero-至-Vero平板兩者評價檢定之靈敏度。如上所述，使用針對用稀釋物鋪板之所有孔觀察到的+ve CPE比例之最小平方迴歸來擬合數據，所鋪板之稀釋物之效價起始於10.00 TCID50/孔，降至較低效價0.08 TCID50。此外，為平板內之各稀釋物納入陰性對照(0.00 TCID50/孔)。對C6/36-至-Vero及Vero-至-Vero平板中之各稀釋物進行CPE評分。發現CPE與對數輸入病毒效價之間有明顯關係。此展示CPE陽性孔之比例與TCID50/孔之log₁₀ 濃度以及99%信賴上限及下限之間的邏輯(S形)關係。在-2 log₁₀ 濃度(= 0.01 TCID50/孔)下，基於並且考慮鑑定數據中所有固定及隨機來源變化的模型預測為0.85%，或當四捨五入至0.01 TCID50/孔時為0.01，其中99%信賴下限為0.42%。因為99%信賴下限不包括零，所以0.85% CPE孔可由0 TCID50/孔(亦即歸因於噪音)引起之可量化(＜ 1%)概率極小。由此為該檢定建立至少0.01 TCID50/孔之偵測極限(亦即，樣品中可偵測的活茲卡顆粒之最低量)。換言之，當四捨五入時，60個孔中有1個將為CPE陽性，或鑒於此等參數，在60個孔中可偵測之CPE +ve之最低理論比例將為1.67%或0.0167。

比較細胞類型(C363與Vero)之相對敏感性，其中如圖 12 所示，C6/36顯示與Vero細胞相比可偵測到較低的病毒稀釋效價；在相同病毒輸入水準(0.31 TCID50)下，CPE陽性孔之比例在C6/36中比在Vero細胞中更高。

此檢定之鑑定期間所用的最低病毒輸入值為0.02 TCID50 (-1.61 log TCID50)。使用C6/36細胞之擬合曲線，得到0.035或3.5%之CPE陽性孔評分(28個孔中有1個)。若曲線外推至0.167或1.6%之最低實際水準，則此相當於0.015 TCID50 (-1.82 log TCID50)之病毒輸入水準。然而，在確定可偵測到之最低感染性病毒水準時，需要考慮傳播檢定方差之影響，這反映在+ve CPE結果中。此噪音係由輸入病毒之研究儲備的生成所引起。靶TCID50與反滴定計算之比較展示，研究儲備病毒之TCID50呈現85 TCID50/mL之標準偏差(SD)，當靶向200之儲備TCID50/mL濃度時，由213之平均值導出。%CV經計算為~40%，偏差為約+7%。將此噪音納入邏輯迴歸模型，以在病毒稀釋物之目標值周圍生成信賴區間。在0.01 TCID50/孔之目標值下，基於並且考慮兩個地點處之鑑定數據中的所有固定及隨機來源變化的模型預測0.86%之孔為CPE陽性的(60個孔中有1個)。因為99%信賴下限不包括零，所以0.85% CPE陽性孔可由0 TCID50/孔(歸因於噪音)引起之可量化(＜ 1%)概率極小(圖 13 )。由此建立該檢定之偵測極限：0.01 TCID50/孔為樣品中可偵測的活茲卡顆粒之最低量。

COI 檢定之性能特徵 – 範圍： 檢定範圍為0.01 TCID50/孔至4.5 TCID50/孔並且係定義為產生大於0%但小於100%之CPE +ve比例評分的輸入病毒範圍。

結論： 四個Tox批次分析揭示，在室溫下於0.01%甲醛中培育10天之後，去活化完成。在產生的所有批次中，至第3-4天達成去活化，如藉由COI檢定所量測。COI檢定比TCID50效力或RNA量測更靈敏；亦藉由LoD觀察到提高的靈敏度。實例 3 ：不活化病毒組成物之調配

在實例3中，術語「茲卡病毒疫苗原料藥」用於係指不活化病毒組成物，其為生產茲卡疫苗之中間物。設備表 10 ：實例 3 中使用之材料

材料	製造商 / 供應商
用於製備原料藥之材料
緩衝鹽與添加劑
磷酸氫二鈉	EMPRove bio 10028-24-7
磷酸氫二鉀	Fisher P290-500
參(羥甲基)胺基甲烷鹼	Fisher T395-500
組胺酸	J.T. Baker N327-05
氯化鈉	Fisher S271-500
蔗糖	Fisher S3-212
鹽酸	Fisher A1445-500
氫氧化鈉溶液	Fisher SS255-1
在等分該等樣品中使用之材料
3 mL小瓶	Nuova Ompi, Italy, Ez-Fill, Nest & tub, ISO-2R小瓶，無矽化，備用(預滅菌)，
ETFE層壓塞	Daikyo Seiko, Japan, 項目：S2-F45-2, 配方：D777-1，備用塞(預滅菌)
在粒徑排阻層析法(SEC) 中使用之材料
2 mg/mL BSA溶液	Thermo/Pierce目錄號23209
無菌注射器過濾器(0.22 µm Millex GV)	EMD Millipore
HPLC小瓶	Agilent #5188-6591 小容量(固定插入)小瓶
HPLC小瓶蓋	National Scientific目錄號C4000-54B

當在實驗部分MilliQ水中提及水時，意謂18 MΩ之電阻率。

所用緩衝液及其縮寫列於表11中。表 11 ：實例 3 中使用之緩衝液

緩衝液	縮寫	pH
茲卡磷酸鹽緩衝液	ZPB	7.4
6.46 mM磷酸氫二鈉
1.47 mM磷酸氫二鉀
137 mM NaCl
Tris 緩衝液 ¹	Tris	7.6
10 mM參(羥甲基)胺基甲烷鹼
20 mM NaCl
組胺酸緩衝液 ¹	His	7.0
20 mM組胺酸
20 mM NaCl
Tris 緩衝鹽水	TBS	7.6
50 mM參(羥甲基)胺基甲烷鹼
150 mM NaCl

¹ 在未作另外規定之情況下，Tris +蔗糖及His +蔗糖係指在Tris或組胺酸緩衝液中之7% w/v蔗糖溶液。視需要，用HCl或NaOH將緩衝液全部滴定至正確的pH值。茲卡疫苗原料藥之製造

如上所述藉由在Vero細胞中生長來製造經純化之不活化茲卡疫苗原料藥。在第3天至第9天進行每日收穫，並且在純化及去活化之前彙集此等收穫物。藉由過濾及層析純化來自每日收穫物之上清液，濃縮並且藉由添加甲醛至0.01%之最終濃度來去活化。在22℃下繼續進行去活化10天，之後用偏二亞硫酸鈉中和樣品，接著將緩衝液更換為茲卡磷酸鹽緩衝液(6.46 mM磷酸氫二鈉、1.47 mM磷酸氫二鉀、137 mM NaCl、6%蔗糖，pH 7.4)。緩衝液更換

製造之後，將茲卡病毒疫苗原料藥在+5±3℃/環境濕度下儲存長達6個月。

接著使用如下所述之切向流過濾(TFF)將茲卡病毒疫苗原料藥之緩衝液更換為在各實例中使用之適當的緩衝液(如表11中所列)。使用表12中所列之設備進行切向流過濾：在約25℃之室溫下進行緩衝液更換過程。表 12 ：用於緩衝液更換程序之材料及設備

設備	製造商 / 供應商
TFF系統	Spectrum Labs KR2i
主泵	Spectrum Labs 900-1893
輔助泵	Spectrum Labs 708-13683-000
Balances(滲透及進給)	Spectrum Labs
自動背壓控制閥	Spectrum Labs
KR2i數據收集軟體	Spectrum Labs
主泵	Spectrum Labs 900-1893
MicroKros中空纖維過濾器模塊(mPES/100 kD)	Spectrum Labs C02-E100-05-N
製程儲槽錐形底，15 ml	Spectrum Labs ACBT-015-C1N
Pharmapure管包裝尺寸13	Spectrum Labs ACTU-P13-25N
壓力轉換器	Spectrum Labs ACPM-799-01N
配件套組	Spectrum Labs

使用以下程序進行切向流過濾(TFF)：

設置： 根據製造商說明書設置KR2i TFF系統(KR2i / KMPi TFF系統產品資訊及操作說明2016，http://spectrumlabs.com/lit/400-12355-000rev02.pdf)。此涉及將TFF管柱(MicroKros中空纖維過濾器模塊(mPES/100 kD) Spectrum Labs C02-E100-05-N)連接至TFF系統。接著用50至150 mL水洗滌管柱，且隨後用大約100 mL適當的緩衝液平衡。在洗滌及平衡步驟期間，流率維持在約25 mL/min且總壓力在任何時候皆不允許超過18 psi.。

濃縮： 最初將5至40 mL樣品(茲卡病毒疫苗原料藥)添加至樣品儲槽中並且濃縮2倍。

滲濾： 濃縮之後，進行滲濾。滲濾係同時稀釋與過濾茲卡病毒疫苗原料藥樣品之行為。稀釋增加樣品之體積，而過濾則減小樣品之體積。

藉由啟動輔助泵(用於滲濾)並使用足以在滲濾期間維持樣品體積之流率(亦即約0.5-1.5 mL/分鐘)進行滲濾。整個過程中使用背壓調節閥手動控制壓力。使壓力維持在14-18 psi.之間，所用轉向(sheer)不超過5000，通量介於66-72之間，流率(主泵)介於25-28 mL/min之間且輔助流率(輔助泵)介於0.5與1 mL/min之間。輔助泵控制稀釋率。手動調節此比率以匹配過濾速率(使得淨樣品體積在此步驟期間無變化)。過濾速率較為複雜，因為其係由許多因素(主泵之流率、跨膜壓力、管柱架度等)及在整個運轉過程中之速率變化決定；因此，藉由手動調節輔助泵之流率來控制樣品之體積。

為了確保完成滲濾，更換至少10個滲濾體積之適當的(新)緩衝液(如藉由滲透物之累積質量來量測)。在本實例中，進行恆定體積滲濾(連續滲濾)。此涉及藉由以與移除濾液相同之速率添加新緩衝液來使過濾過程期間之原料藥(滲餘物)體積保持恆定。可使用以下方程計算滲濾體積更換之次數：

其中原料藥(滲餘物)之體積在整個過程中保持保持不變。

滲濾過程提供茲卡病毒疫苗原料藥(DS)之樣品，已將其緩衝液更換為表11中所列之緩衝液。

樣品回收及儲存： 在一些情況下，在滲濾之後對樣品進行進一步濃縮(高達大約10倍)。此係藉由關閉輔助泵並且繼續過濾(亦即，保持主泵開啟)來進行。為了在滲濾過程結束時回收樣品，將進給及再循環管道抬高超過樣品之位準並且逆轉泵之流動以收集殘餘體積(一般約1-3 mL)。隨後，在TFF之後針對最終產物(經緩衝液更換之茲卡病毒疫苗原料藥)進行適當的確認檢定，諸如pH值測定、重量滲透濃度及SEC。

接著將在更換緩衝液之後的茲卡病毒疫苗原料藥(DS)在+5±3℃/環境濕度下儲存長達5天，之後進行穩定性測試。穩定性測試程序

在每項研究(實例3A-3F)開始時，將更換緩衝液之後的茲卡病毒疫苗原料藥(DS)樣品等分至單獨的3 mL小瓶中，其中每個小瓶在相應的緩衝液中含有大約0.67 mL茲卡病毒疫苗原料藥(DS)。接著用ETFE層壓塞密封小瓶。

隨後立即使用粒徑排阻層析法(SEC，如下所述)針對每種不同緩衝液對應於一個等分試樣之單一樣品進行測試以便在研究開始(第0天/凍融循環0)時確定峰面積(及因此以µg/mL)計之蛋白質之量)。

將在各個相應緩衝液中的茲卡病毒疫苗原料藥(DS)之足量小瓶在每項研究開始時置於+5±3℃環境濕度及-80℃環境濕度下。對於每個所量測之時間點及溫度條件，均準備單獨的小瓶。

將在-80℃下儲存之樣品在-80℃室中冷凍。由於0.67 mL之填充體積，樣品冷凍相對較快，但未在液氮中「快速冷凍」。粒徑排阻層析(SEC)程序

使用單管柱粒徑排阻層析(SEC)進行穩定性分析。粒徑排阻層析為一項基於蛋白質之分子量對其進行分離之技術。蛋白質樣品之分子量越大，其溶析時間越短。對於完整的茲卡病毒，在約8分鐘之滯留時間下在SEC跡線中見到峰。藉由將此峰之積分與參考樣品之積分(在第零天)相比較，有可能確定在儲存一段時期後仍存在於樣品中的完整茲卡病毒之量。此外，藉由觀察在較早滯留時間下是否出現任何進一步之峰，有可能確定茲卡病毒是否已經聚集。

用於粒徑排阻層析(SEC)之設備及材料詳述於下表13中。表 13 ：用於 SEC 之設備

設備	規格
HPLC(高效液相層析)系統	Agilent 1100或1260
數據系統方法	LP005.M
再處理方法	LP005R.M
管柱	Superose-6 Increase (GE Healthcare)
流動相	1x PBS (10.14 mM磷酸氫二鈉、1.79 mM磷酸二氫鈉、136.89 mM NaCl、2.68 mM KCl、250 ppm NaN₃ pH 7.4)
流率(mL/min)	1.0
UV—VIS偵測器波長	280 nm
管柱溫度	RT (未調節)
自動取樣器托盤溫度	5℃

使用下文詳述之程序進行粒徑排阻層析(SEC)。標準與測試樣品之製備

BSA 參考標準： 藉由用水稀釋BSA儲備溶液(其具有2 mg/mL之明確限定之濃度)來製備具有200、400、800及1,000 µg/mL之濃度的牛血清白蛋白(BSA)之參考樣品。隨後將各參考樣品之等分試樣轉移至經標記之HPLC小瓶中並加蓋。以下實例3A-3F中給出之所有蛋白質濃度係基於根據BSA標準曲線之茲卡病毒濃度。

SEC 之樣品製備： 在所測試之各特定時間點下，將所需3 mL小瓶自在+5±3℃或-80℃下之儲存中移除。在室溫下解凍在-80℃下冷凍之樣品。接著藉由將至少400 µL各測試樣品自適當的3 mL小瓶轉移至經標記之HPLC小瓶中並為小瓶加蓋來製備SEC樣品。隨後將HPLC小瓶置於HPLC自動取樣器托盤中。將HPLC自動取樣器托盤在5±3℃下冷卻，確保SEC樣品在進行SEC之前冷卻至5±3℃。

量測： 各SEC量測涉及使用自動取樣器/自動注射器將各樣品之100 µL等分試樣注射至SEC管柱中。用於自 SEC 層析圖確定茲卡蛋白濃度之計算

對於每個SEC輪次，產生牛血清白蛋白(BSA)之標準曲線，運轉200、400、800及1,000 µg/mL濃度之標準並且製備標準曲線(線性迴歸，y = mx + b，其中b = 0)。將BSA總峰面積計算為BSA之單體與二聚體峰面積之總和。

將此標準曲線用於確定茲卡病毒疫苗原料藥(DS)之濃度(依據以µg/mL計之BSA濃度)。

接著將濃度值相對於在第0天針對每個樣品進行之量測(其係視為100%值)歸一化。

茲卡病毒疫苗原料藥(DS)峰面積係確定為在SEC層析圖中大約8分鐘滯留時間之後溶析之整個峰。藉由在約8分鐘時連接峰前與峰後之基線進行峰擬合。此包括主峰及以較短滯留時間溶析之任何進一步之肩(亦即，在峰之左側)。滯留時間顯著更長之峰或肩未包括在整合中，因為此等峰可能與降解或變性之茲卡病毒蛋白相對應。

茲卡病毒疫苗原料藥(DS) 之濃度測定： 基於BSA校準曲線計算茲卡病毒疫苗原料藥(DS)之總質量。茲卡病毒疫苗原料藥(DS)濃度以µg/mL報告並且藉由將由校準曲線獲得之質量除以0.1 mL來計算(參見方程1)。

方程1

針對各實例給出之結果為相同樣品之兩次重複SEC讀數的平均值。實例 3A

如上所述進行實例3A中樣品之製備。製備茲卡病毒疫苗原料藥，接著將緩衝液更換為下表14a及14b中所列之相應緩衝液之每種。在實例3A中，在5±3℃及-80℃下進行穩定性測試10天餘。

表14a及14b展示在0及10天之後針對在許多不同緩衝液中之茲卡病毒疫苗原料藥樣品進行的SEC之結果。此等實驗之結果以百分比形式給出，以第10天SEC峰值面積佔第0天峰值面積之百分比為基礎。表 14a ：在 5±3℃ 下實例 3A 之 SEC 結果

	峰面積 / 針對 BSA 濃度標準來歸一化 [µg/mL]	第 10 天剩餘之百分比 /%
	第 0 天	第 10 天
緩衝液
ZPB	133	112	85
Tris	133	104	78
Tris + 7%蔗糖	135	111	83

表 14b ：在 -80 ℃ 下實例 3A 之 SEC 結果

	峰面積 / 針對 BSA 濃度標準來歸一化 [µg/mL]	第 10 天之剩餘百分比 /%
	第 0 天	第 10 天
緩衝液
ZPB	133	78	58
Tris	133	88	66
Tris + 7%蔗糖	135	109	81

實例 3B

如上所述進行實例3B中樣品之製備。製備茲卡病毒疫苗原料藥，接著將緩衝液更換為下表中所列之相應緩衝液之每種。在實例3B中，在-80℃下進行穩定性測試60天餘。

表15展示在0及60天之後針對在許多不同緩衝液中之茲卡病毒疫苗原料藥樣品進行的SEC之結果。此等實驗之結果以百分比形式給出，以第60天SEC峰值面積佔第0天峰值面積之百分比為基礎。表 15 ：在 -80℃ 下實例 3B 之 SEC 結果

	峰面積 / 針對 BSA 濃度標準來歸一化 [µg/mL]	第 60 天之剩餘百分比 /%
	第 0 天	第 60 天
緩衝液
His	27	11	41
His + 7%蔗糖	31	20	64

實例 3C

如上所述進行實例3C中樣品之製備。製備茲卡病毒疫苗原料藥，接著將緩衝液更換為下表中所列之相應緩衝液之每種。在實例3C中，在5±3℃及-80℃下進行穩定性測試67天餘。

表16a及16b展示在0及67天之後針對在許多不同緩衝液中之茲卡病毒疫苗原料藥樣品進行的SEC之結果。此等實驗之結果以百分比形式給出，以第67天SEC峰值面積佔第0天峰值面積之百分比為基礎。表 16a ：在 5±3℃ 下實例 3C 之 SEC 結果

	峰面積/ 針對BSA 濃度標準來歸一化[µg/mL]	第 67 天之剩餘百分比 /%
	第 0 天	第 67 天
緩衝液
ZPB	95	83	88
Tris+ 7%蔗糖	79	75	95
Tris+10% v/v甘油	78	81	104

表 16b ：在 -80℃ 下實例 3C 之 SEC 結果

	峰面積/ 針對BSA 濃度標準來歸一化[µg/mL]	剩餘百分比/%
	第 0 天	第 1 天	第 67 天	第 1 天	第 67 天
緩衝液
ZPB	95	68	65	72	69
Tris+ 7%蔗糖	79	74	62	94	78
Tris+10% v/v 甘油	78	79	81	101	104

另外，圖14及15展示在-80℃下於Tris + 7%蔗糖緩衝液及ZPB緩衝液中儲存67天的茲卡病毒疫苗原料藥之SEC層析圖。對於在Tris + 7%蔗糖緩衝液中之原料藥(圖14)，第67天之峰形狀非常類似於第0天之峰形狀。相反，對於ZPB中之原料藥(圖15)，第67天層析圖形已移位，具體而言，主峰之尺寸變小且肩峰尺寸增加(亦即，肩峰在約7.5分鐘時由基線上升)，此提示聚集。實例 3D

如上所述進行實例3D中樣品之製備。製備茲卡病毒疫苗原料藥之樣品，接著將緩衝液更換為Tris及ZPB緩衝液(如上表11中所列)。在實例3D中，在-80℃下進行穩定性測試3個月餘。

研究結果示於圖19中。實例 3E

如上所述進行實例3E中樣品之製備。製備茲卡病毒疫苗原料藥，接著將緩衝液更換為下表中所列之相應緩衝液之每種。在實例3E中，在5±3℃下進行穩定性測試60天餘。

表17展示在1、3、8、15、30及60天之後針對在ZPB及TBS中之茲卡病毒疫苗原料藥樣品進行的SEC之結果。此等實驗之結果以百分比形式給出，以第1、3、8、15、30及60天SEC峰值面積佔第0天峰值面積之百分比為基礎。表 17 ：在 5±3℃ 下實例 3E 之 SEC 結果

	天	0	1	3	8	15	30	60
	緩衝液
峰面積/ 作為BSA 之含量 [µg/mL]	ZPB	102	96	98	84	86	75	69
TBS	99	93	92	87	88	87	83
剩餘百分比 /%	ZPB	-	94	96	82	84	73	68
TBS	-	93	92	88	89	88	84

實例 3F

如上所述進行實例3F中之樣品製備。製備茲卡病毒疫苗原料藥，接著將緩衝液更換為Tris緩衝液。隨後將蔗糖添加至樣品中(以獲得分別具有3、5、7及10% w/v之總濃度的樣品)。

表18展示在0、1、2、3及4個凍融循環之後進行的SEC之結果。

在單獨的小瓶中準備樣品托盤。各凍融循環涉及藉由在室溫下解凍將托盤(含有所有樣品)溫至室溫(25℃)。在每個凍融循環後，在每種條件下取一個小瓶進行分析。

結果以百分比形式給出，以在1至4個凍融循環之前與之後的SEC峰面積為基礎。表 18 ：多個凍融循環之 SEC 管柱結果

	凍融循環	0	1	2	3	4
	緩衝液
峰面積/ 作為BSA 之含量 [µg/mL]	Tris + 3%蔗糖	288	272	259	252	207
Tris + 5%蔗糖	286	271	254	244	206
Tris + 7%蔗糖	284	278	267	268	267
Tris + 10%蔗糖	287	280	286	276	272
剩餘百分比 /%	Tris + 3%蔗糖	-	95	90	88	72
Tris + 5%蔗糖	-	95	89	85	72
Tris + 7%蔗糖	-	98	94	94	94
Tris + 10%蔗糖	-	98	100	96	95

圖 1 展示模擬感染(上圖)及感染有ZIKAV株PRVABC59(下圖)之Vero細胞單層之亮視野顯微鏡圖像。

圖 2 展示如由TCID₅₀ 所判定在Vero細胞單層上ZIKAV PRVABC59 P1之生長動力學。

圖 3 展示茲卡病毒PRVABC59 P5純系a-f之效力檢定測試(TCID₅₀ )。

圖 4 展示描繪茲卡病毒PRVABC59 P6純系a-f在Vero細胞單層上之生長的細胞病變效應(CPE)之亮視野顯微鏡圖像。

圖 5 展示茲卡病毒PRVABC59 P6純系a-f之效力檢定測試(TCID₅₀ )。

圖 6 展示胺基酸序列比對，比較茲卡病毒來自茲卡病毒株PRVABC59 P6e (SEQ ID NO: 8)及PRVABC59 (SEQ ID NO: 9)的殘基330附近之包膜醣蛋白序列與若干其他黃病毒(WNV (SEQ ID NO: 10)；JEV (SEQ ID NO: 11)；SLEV (SEQ ID NO: 12)；YFV (SEQ ID NO: 13)；DENV 1 16007 (SEQ ID NO: 14)；DENV 2 16681 (SEQ ID NO: 15)；DENV 3 16562 (SEQ IDNO: 16)；及DENV 4 1036 (SEQ ID NO: 17))。

圖 7 展示胺基酸序列比對，比較茲卡病毒來自茲卡病毒株PRVABC59 P6e (SEQ ID NO: 18)及PRVABC59 (SEQ ID NO: 19)的殘基98附近之NS1蛋白序列與若干其他黃病毒(WNV (SEQ ID NO: 20)；JEV (SEQ ID NO: 21)；SLEV (SEQ ID NO: 22)；YFV (SEQ ID NO: 23)；DENV 1 16007 (SEQ ID NO: 24)；DENV 2 16681 (SEQ ID NO: 25)；DENV 3 16562 (SEQ IDNO: 26)；及DENV 4 1036 (SEQ ID NO: 27))。

圖 8 展示與ZIKAV PRVABC59 P1病毒相比ZIKAV PRVABC59 P6病毒純系a-f之蝕斑表型。

圖 9 展示與ZIKAV PRVABC59 P1病毒相比ZIKAV PRVABC59 P6病毒純系之平均蝕斑尺寸。

圖 10 展示在Vero細胞中之ZIKAV PRVABC59 P6純系a-f在無血清之生長條件下的生長動力學。

圖 11 展示經編譯之去活化動力學數據。數據比較來自四個毒理批次之樣品的針對RNA複本之感染效力(TCID50)與去活化之完成(COI)。此等數據表明COI檢定之靈敏度大於TCID50。

圖 12 展示在如用0.31 TCID50之輸入病毒效價所證明之檢定中C6/36與Vero敏感性之比較。

圖 13 展示使用C6/36細胞位點的CPE對比log TCID50之邏輯迴歸分析，在0.01 TCID50/孔(-2 log TCID50/孔)目標值周圍包括99%信賴區間；該模型預測0.85%之孔將呈陽性。

圖 14 ：針對在Tris + 7%蔗糖緩衝液中之茲卡病毒疫苗原料藥在-80℃下儲存67天之後在SEC層析圖中對應於完整茲卡病毒(滯留時間約8分鐘)之峰(此峰對應於實例3C，表16b)。

圖 15 ：針對在ZPB緩衝液中之茲卡病毒疫苗原料藥在-80℃下儲存67天之後在SEC層析圖中對應於完整茲卡病毒(滯留時間約8分鐘)之峰(此峰對應於實例3C，表16b)。

圖 16 ：在5±3℃及–80℃下儲存10天(對應於實例3A)之後剩餘(藉由SEC量測)的完整茲卡病毒之百分比。

圖 17 ：在–80℃下儲存60天(對應於實例3B)之後剩餘(藉由SEC量測)的完整茲卡病毒之百分比。

圖 18 ：在5±3℃及–80℃下儲存67天(對應於實例3C)之後剩餘(藉由SEC量測)的完整茲卡病毒之百分比。

圖 19 ：在-80℃下儲存3個月(對應於實例3D)之後在ZPB及Tris+Suc中茲卡疫苗原料藥所剩餘(藉由SEC量測)的完整茲卡病毒之百分比。

圖 20 ：在5±3℃下儲存0至60天(對應於實例3E)之後在ZPB及TBS中茲卡疫苗原料藥所剩餘(藉由SEC量測)的完整茲卡病毒之百分比。

圖 21 ：在重複凍融循環(對應於實例3F)之後所剩餘(藉由SEC量測)的完整茲卡病毒之百分比。

(無)

Claims

一種液體不活化病毒組成物，其包含： a) 不活化之全茲卡(Zika)病毒， b) 至少一種具有至少約6.5 mM之濃度的醫藥學上可接受之緩衝液，及 c) 視情況選用之多元醇，其中該液體不活化病毒組成物較佳不含選自鋁鹽之佐劑，並且該至少一種醫藥學上可接受之緩衝液不含磷酸根離子。
如請求項1之液體不活化病毒組成物，其中磷酸根離子在該液體不活化病毒組成物中之濃度小於約7 mM、或小於約6 mM、或小於約5 mM、或小於約4 mM、或小於約3 mM、或小於約2 mM、或小於約1 mM。
如請求項1或2之液體不活化病毒組成物，其中該液體不活化病毒組成物僅包含一種醫藥學上可接受之緩衝液。
如請求項1或2之液體不活化病毒組成物，其中該液體不活化病毒組成物包含至少兩種不同的醫藥學上可接受之緩衝液，其中在該液體不活化病毒組成物中的兩種最濃的醫藥學上可接受之緩衝液之莫耳比不介於1:2至2:1之間、或不介於1:5至5:1之間、或不介於8:1至1:8之間、或不介於10:1至1:10之間。
如請求項1至4中任一項之液體不活化病毒組成物，其中鉀離子在該液體不活化病毒組成物中之濃度小於約4 mM、或小於約3 mM、或小於約2 mM、或小於約1.5 mM、或小於約0.5 mM、或小於約0.1 mM、或約0 mM。
如請求項1至5中任一項之液體不活化病毒組成物，其中該液體不活化病毒組成物實質上不含或不含硫酸魚精蛋白。
如請求項1至6中任一項之液體不活化病毒組成物，其中該液體不活化病毒組成物之pH值如在室溫下所測定為約pH 6.0至約pH 9.0或約pH 6.5至約pH 8.0、或約pH 6.8至約pH 7.8、或約pH 7.6。
如請求項1至7中任一項之液體不活化病毒組成物，其中該醫藥學上可接受之緩衝液之濃度為至少約7 mM、或至少約7.5 mM、或至少約8 mM、或至少約8.5 mM、或至少約9 mM、或至少約10 mM。
如請求項8之液體不活化病毒組成物，其中該醫藥學上可接受之緩衝液之濃度為約7 mM至約200 mM、或約7.5 mM至約200 mM、或約8 mM至約200 mM、或約8.5 mM至約200 mM、或約9 mM至約100 mM、或約9 mM至約60 mM、或約10 mM、或約20 mM、或約50 mM。
如請求項1至9中任一項之液體不活化病毒組成物，其中該醫藥學上可接受之緩衝液包含含有胺基之分子。
如請求項10之液體不活化病毒組成物，其中該醫藥學上可接受之緩衝液為Tris或組胺酸緩衝液。
如請求項11之液體不活化病毒組成物，其中該醫藥學上可接受之緩衝液為Tris。
如請求項1至12中任一項之液體不活化病毒組成物，其中該組成物進一步包含至少一種多元醇。
如請求項13之液體不活化病毒組成物，其中該液體不活化病毒組成物包含約1% w/v至約60% w/v多元醇、或約6% w/v至約50% w/v多元醇、或約6% w/v至約40% w/v多元醇、或約6% w/v至約35% w/v多元醇、或約6% w/v至約30% w/v多元醇、或約6% w/v至約25% w/v多元醇、或約6% w/v至約20% w/v多元醇、或約6% w/v至約15% w/v多元醇、或約6% w/v至約12% w/v多元醇、或約7% w/v多元醇、或約10% w/v多元醇。
如請求項14之液體不活化病毒組成物，其中該液體不活化病毒組成物包含擁有含有胺基之分子的醫藥學上可接受之緩衝液及約6% w/v至約15% w/v多元醇。
如請求項15之液體不活化病毒組成物，其中該液體不活化病毒組成物包含Tris及約6% w/v至約15% w/v多元醇。
如請求項13至16中任一項之液體不活化病毒組成物，其中該多元醇為糖。
如請求項17之液體不活化病毒組成物，其中該糖為雙醣。
如請求項18之液體不活化病毒組成物，其中該雙醣為非還原糖。
如請求項19之液體不活化病毒組成物，其中該非還原糖為蔗糖。
如請求項20之液體不活化病毒組成物，其中該液體不活化病毒組成物包含約5% w/v至約20% w/v蔗糖或約6% w/v至約15% w/v蔗糖。
如請求項21之液體不活化病毒組成物，其中該液體不活化病毒組成物包含約6% w/v至約8% w/v蔗糖，諸如約7% w/v蔗糖。
如請求項21之液體不活化病毒組成物，其中該液體不活化病毒組成物包含約8.5 mM至約50 mM Tris及約6%至約15% w/v蔗糖，其中該不活化病毒組成物之pH值在室溫下量測時為約pH 7.0至約pH 8.0。
如請求項13之液體不活化病毒組成物，其中該多元醇為甘油。
如請求項24之液體不活化病毒組成物，其中該液體不活化病毒組成物包含約1% v/v至約60% v/v甘油、或約7% v/v至約15% v/v甘油、或約10% v/v甘油。
如請求項25之液體不活化病毒組成物，其中該不活化病毒組成物包含約8.5 mM至約50 mM Tris及約6% v/v至約15% v/v甘油，其中該不活化病毒組成物之pH值在室溫下量測時為約pH 7.0至約pH 8.0。
如請求項1至26中任一項之液體不活化病毒組成物，其中該液體不活化病毒組成物進一步包含氯化鈉。
如請求項27之液體不活化病毒組成物，其中氯化鈉在該液體不活化病毒組成物中之濃度為約5 mM至約500 mM氯化鈉、或約10 mM至約200 mM氯化鈉。
如請求項28之液體不活化病毒組成物，其中氯化鈉在該液體不活化病毒組成物中之濃度為約10 mM至約40 mM、或約10 mM至約30 mM，諸如約20 mM。
如請求項1至29中任一項之液體不活化病毒組成物，其中該液體不活化病毒組成物之離子強度低於約80 mM、或低於約70 mM、或低於約60 mM、或低於約50 mM、或低於約40 mM、或低於約30 mM。
如請求項1至30中任一項之液體不活化病毒組成物，其中該茲卡病毒為非洲譜系病毒或亞洲譜系病毒。
如請求項31之液體不活化病毒組成物，其中該茲卡病毒為亞洲譜系病毒。
如請求項32之液體不活化病毒組成物，其中該茲卡病毒來源於株PRVABC59。
如請求項33之液體不活化病毒組成物，其中株PRVABC59包含根據SEQ ID NO: 2之基因體序列。
如請求項1至34中任一項之液體不活化病毒組成物，其中該茲卡病毒具有在SEQ ID NO: 1之位置98處或在對應於SEQ ID NO: 1之位置98的位置處之突變。
如請求項35之液體不活化病毒組成物，其中該突變為在SEQ ID NO: 1中之Trp98Gly突變。
如請求項1至36中任一項之液體不活化病毒組成物，其中該茲卡病毒在包膜蛋白(Env)中不包含突變。
如請求項1至37中任一項之液體不活化病毒組成物，其中編碼該包膜蛋白之序列與SEQ ID No. 2中之相應序列相同，或其中該包膜蛋白之序列展示與SEQ ID No. 2中之序列具有至少99%一致性、或至少95%一致性、或至少90%一致性、或至少85%一致性。
如請求項1至38中任一項之液體不活化病毒組成物，其中如藉由粒徑排阻層析法中經純化之茲卡病毒之主峰大於粒徑排阻層析法中85%之曲線下總面積所判定，該茲卡病毒為至少85%純的。
如請求項1至39中任一項之液體不活化病毒組成物，其中該茲卡病毒係以化學方式去活化。
如請求項40之液體不活化病毒組成物，其中該茲卡病毒係用以下一或多種來去活化：清潔劑、甲醛、過氧化氫、β-丙內酯(BPL)、二元乙胺(BEI)、乙醯次乙亞胺、亞甲藍及補骨脂素。
如請求項41之液體不活化病毒組成物，其中該茲卡病毒係用甲醛去活化。
如請求項42之液體不活化病毒組成物，其中該茲卡病毒為藉由以下方法可獲得之不活化全病毒：其中在約15℃至約37℃範圍內之溫度下用在約0.001% w/v至約3.0% w/v範圍內之量的甲醛處理該茲卡病毒5至15天。
如請求項43之液體不活化病毒組成物，其中該茲卡病毒為藉由用0.005%至0.02% w/v甲醛處理活的全茲卡病毒可獲得之不活化全病毒。
如請求項44之液體不活化病毒組成物，其中該茲卡病毒為藉由用小於0.015% w/v甲醛處理活的全茲卡病毒可獲得之不活化全病毒。
一種液體疫苗，其包含： a) 如前述請求項中任一項之不活化病毒組成物，及 b) 佐劑，諸如氫氧化鋁。
如請求項46之液體疫苗，其中氯化鈉在該液體疫苗中之濃度為約50 mM至約200 mM、或約60 mM至約150 mM，諸如約84 mM。
如請求項47之液體疫苗，其中該液體疫苗包含約8.5 mM至約80 mM Tris及約60 mM至約150 mM NaCl，且其中該液體不活化病毒組成物之pH值在室溫下量測時為約pH 7.0至約pH 8.0。
如請求項48之液體疫苗，其中該液體疫苗包含約0.4% (w/v)至4.7% (w/v)蔗糖。
如請求項49之液體疫苗，其基於元素鋁包含100 µg/ml至800 µg/ml氫氧化鋁、或200 µg/ml至600 µg/ml氫氧化鋁、或300 µg/ml至500 µg/ml氫氧化鋁、或約400 µg/ml氫氧化鋁。
一種如請求項46至50中任一項之液體疫苗之單位劑量。
如請求項51之疫苗之單位劑量，其包含約1 μg至約15 μg該不活化之全茲卡病毒。
如請求項52之疫苗之單位劑量，其包含約2 μg不活化之全茲卡病毒。
如請求項52之疫苗之單位劑量，其包含約5 μg不活化之全茲卡病毒。
如請求項52之疫苗之單位劑量，其包含約10 μg不活化之全茲卡病毒。
如請求項51至55中任一項之疫苗之單位劑量，其係作為約0.4 mL至約0.8 mL醫藥學上可接受之液體來提供。
一種不活化病毒組成物用於使不活化之全茲卡病毒穩定之用途，該不活化病毒組成物包含： a) 該不活化之全茲卡病毒， a) 至少一種具有至少約6.5 mM之濃度的醫藥學上可接受之緩衝液，及 b) 視情況選用之多元醇，其中該不活化病毒組成物不含選自鋁鹽之佐劑並且該至少一種醫藥學上可接受之緩衝液不含磷酸根離子。
如請求項57之用途，用於使該不活化之全茲卡病毒在5±3℃下儲存至少10天期間穩定。
如請求項57之用途，用於使該不活化之全茲卡病毒在-80℃下儲存至少10天期間穩定。
如請求項59之用途，用於使該不活化之全茲卡病毒在-80℃下儲存至少6個月期間穩定。
如請求項60之用途，用於使該不活化之全茲卡病毒在-80℃下儲存至少12個月期間穩定。
如請求項57至61中任一項之用途，用於使該不活化之全茲卡病毒在一個或多個凍融循環、諸如至少2個凍融循環或至少4個凍融循環期間穩定。
一種在有需要之人類個體中治療或預防、特別是預防茲卡病毒感染之方法，該方法包含向該個體投與如請求項51至56中任一項之疫苗之單位劑量。
如請求項51至56中任一項之疫苗之單位劑量，其係用於在有需要之人類個體中治療或預防、特別是預防茲卡病毒感染。
一種如請求項51至56中任一項之疫苗之單位劑量在製造供預防有需要之人類個體中的茲卡病毒感染用之藥劑中的用途。
一種製備液體不活化病毒組成物之方法，該液體不活化病毒組成物包含： a) 不活化之全茲卡病毒， b) 醫藥學上可接受之緩衝液，其中該緩衝液不為磷酸鹽緩衝液且其中該緩衝液之濃度為至少6.5 mM；及 c) 視情況選用之多元醇；其中該不活化病毒組成物較佳不含選自鋁鹽之佐劑；該方法包含以下步驟：步驟1. 自由一或多種非人類細胞獲得之上清液中分離茲卡病毒製劑，步驟2. 純化該茲卡病毒製劑；步驟3. 使該病毒製劑去活化；步驟4. 將該茲卡病毒製劑轉移至醫藥學上可接受之緩衝液中以獲得該不活化病毒組成物。
一種製備液體疫苗之方法，該方法包含以下步驟：步驟1. 提供如請求項1至45之不活化病毒組成物，步驟2. 將佐劑較佳鋁鹽及視情況選用之另一醫藥學上可接受之緩衝液體添加至該不活化病毒組成物中。
如請求項67之方法，其中在步驟2中，該另一醫藥學上可接受之緩衝液體包含與在該不活化病毒組成物中具有最高濃度之緩衝液相同之緩衝液。
一種產物，其可藉由如請求項66至68中任一項之方法獲得。