CN113939311A - 灭活病毒组合物和寨卡疫苗制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种液体灭活病毒组合物，其包含：灭活全寨卡病毒；浓度为至少约6.5mM的至少一种药学上可接受的缓冲液；和任选地多元醇，其中所述至少一种药学上可接受的缓冲液不包含磷酸根离子；并且涉及衍生自所述液体灭活病毒组合物的疫苗。

Description

灭活病毒组合物和寨卡疫苗制剂

技术领域

本公开涉及包含灭活全寨卡病毒和制剂的灭活病毒组合物、其制造方法和用途以及从其衍生的疫苗。

背景技术

寨卡病毒是与其他蚊媒病毒(例如，黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗河(WestNile)病毒和日本脑炎病毒)一起被分类在黄病毒科(Flaviviridae family)内的黄病毒(flavivirus)，自从所述病毒在2013年被引入巴西以来，它以遍及全半球的流行病的形式迅速蔓延。病毒已到达中美洲和北美洲，包括美国领土，因此现在正威胁着美国大陆。实际上，寨卡病毒毒株PRVABC59是从一名2015年前往波多黎各的人的血清中分离出来的。此毒株的基因组已被测序至少三次(参见Lanciotti等人Emerg.Infect.Dis.2016年5月,22(5):933-5和GenBank登录号KU501215.1；GenBank登录号KX087101.3；以及Yun等人GenomeAnnounc.2016年8月18日；4(4)和GenBank登录号ANK57897.1)。

病毒最初于1947年在乌干达被分离出来，1952年首次与人类疾病相关联，并且在非洲和东南亚偶尔被认为是导致轻度、自限性发热性疾病的原因(Weaver等人(2016)Antiviral Res.130:69-80；Faria等人(2016)Science.352(6283):345-349)。然而，2007年，北太平洋雅浦岛出现爆发，然后跨太平洋在岛屿之间传播，2013-2014年在法属波利尼西亚导致大面积爆发，然后蔓延到新喀里多尼亚、库克群岛，并最终蔓延到复活节岛。亚洲谱系病毒随后通过尚未确定的途径转移到西半球(Faria等人(2016)Science.352(6283):345-349)。病毒可通过埃及伊蚊(Aedes aegypti)、白纹伊蚊(A.albopictus)并且可能通过赫斯里伊蚊(A.hensilli)和波利尼西亚伊蚊(A.polynieseinsis)进行人兽共患性传播(Weaver等人(2016)Antiviral Res.130:69-80)。另外，据认为可能存在用于传播病毒的其他载体，并且病毒可通过输血、经胎盘和/或通过性传播来传播。

在2015年末，寨卡病毒广泛感染地区的胎儿畸形(例如，小头畸形)和格-巴二氏综合征(Guillain-Barre syndrome；GBS)的显著增加引起了警惕，寨卡病毒可能比原先想象的更具毒性，促使世界卫生组织(WHO)宣布国际关注的突发公共卫生事件(Public HealthEmergency of International Concern；PHEIC)(Heymann等人(2016)Lancet 387(10020):719-21)。虽然寨卡病毒对公共健康构成重大威胁，但目前尚不存在FDA批准的疫苗或治疗方法，并且用于控制寨卡病毒的唯一预防措施涉及管理蚊子群体。

在最近表征重组寨卡病毒以开发潜在疫苗的努力中，鉴定了非人细胞适应的寨卡病毒，其在病毒包膜蛋白的位置330处携带突变(Weger-Lucarelli等人2017.Journal ofVirology)。此研究的作者发现寨卡病毒毒株PRVABC59的全长感染性cDNA克隆在克隆期间扩增时在遗传上不稳定，并且选择分裂病毒基因组以解决观察到的不稳定性，开发并应用两质粒系统。然而，用于开发寨卡疫苗的两质粒系统不太理想。因此，需要开发利用遗传稳定的寨卡病毒来治疗和/或预防寨卡病毒感染的疫苗。

希望灭活病毒组合物表现出良好的稳定性，特别是在疫苗制造期间有必要使已经纯化且灭活的作为通常称为“原料药”的中间产品的灭活病毒组合物可在延长的时间段内运输和储存，并且在等待配制为最终产品(即疫苗)时不丧失其活性。例如，灭活病毒组合物可被冷冻(例如像在-80℃下)，使得它们可被储存延长的时间段。因此，重要的是灭活病毒组合物在-80℃下的储存期间稳定。此外，重要的是灭活病毒组合物能够承受温度的变化。特别地，重要的是灭活病毒组合物不会因导致一个或多个冻融循环的冷冻和解冻而丧失活性。对一个或多个冻融循环的耐受性也意味着在生产过程期间有可能冷冻原料药材料。

发明内容

本发明的目的是提供灭活病毒组合物，其中灭活全寨卡病毒在储存期间稳定。特别地，本发明的目的是提供灭活病毒组合物，其中灭活的全寨卡病毒在-80℃下储存延长的时间段例如像储存至少10天直至例如6个月或一年期间稳定。旨在冷冻储存的此类组合物通常不(尚未)含有铝基佐剂，诸如铝盐，诸如明矾/氢氧化铝-如果需要，可在之后不再安排冷冻储存时添加此类铝基佐剂。

本发明的另一个目的是提供能够在一个或多个冻融循环期间稳定灭活全寨卡病毒的灭活病毒组合物。

上述目的通过如本文所述和要求保护的本发明的实施方案来实现。

因此，本发明涉及一种液体灭活病毒组合物，其包含：

a)灭活全寨卡病毒，

b)至少一种药学上可接受的缓冲液，其浓度为至少约6.5mM，和

c)任选地多元醇，

其中液体灭活病毒组合物优选不含选自铝盐的佐剂，并且

所述至少一种药学上可接受的缓冲液不包含磷酸根离子。

在某个方面，液体灭活病毒组合物中磷酸根离子的浓度小于约7mM、或小于约6mM、或小于约5mM、或小于约4mM、或小于约3mM、或小于约2mM、或小于约1mM。

本发明还涉及灭活病毒组合物的用途，所述灭活病毒组合物包含：

a)灭活全寨卡病毒，

b)至少一种药学上可接受的缓冲液，其浓度为至少约6.5mM，和

c)任选地多元醇，

其中所述液体灭活病毒组合物优选不含选自铝盐的佐剂，并且

其中所述至少一种药学上可接受的缓冲液不包含磷酸根离子，用于稳定灭活的全寨卡病毒。

本发明还涉及一种制备液体灭活病毒组合物的方法，所述组合物包含：

a)灭活全寨卡病毒，

b)药学上可接受的缓冲液，其中所述缓冲液不是磷酸盐缓冲液，并且其中所述缓冲液的浓度为至少6.5mM；和

c)任选地多元醇，

其中所述灭活病毒组合物不含选自铝盐的佐剂；所述方法包括以下步骤：

步骤1.从一种或多种非人细胞获得的上清液中分离寨卡病毒制备剂；

步骤2.纯化所述寨卡病毒制备剂；

步骤3.灭活所述病毒制备剂；

步骤4.将所述寨卡病毒制备剂转移到药学上可接受的缓冲液中，以获得寨卡病毒原料药。

本发明还涉及一种液体疫苗，其包含：

a)根据本发明的灭活病毒组合物，和

b)佐剂，诸如氢氧化铝。

在某个方面，液体疫苗包含约50mM至约200mM NaCl、约8.5mM至约80mM Tris和约0.4％重量/体积至约4.7％重量/体积蔗糖。

本发明还涉及一种治疗或预防，特别是预防有需要的人受试者的寨卡病毒感染的方法，其包括向受试者施用单位剂量的根据本发明的液体疫苗，如上所述。

本发明还涉及一种制备液体疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1.提供根据本发明的灭活病毒组合物，如上所述，

步骤2.向灭活病毒组合物中添加佐剂和任选地另一种药学上可接受的缓冲液体，所述佐剂优选为铝盐。

本发明还涉及一种可通过上述方法获得的产品。

附图说明

图1示出了模拟感染(上图)或感染ZIKAV毒株PRVABC59(下图)的Vero细胞单层的明视野显微镜图像。

图2示出了ZIKAV PRVABC59 P1在Vero细胞单层上的生长动力学，如通过TCID₅₀测定的。

图3示出了寨卡病毒PRVABC59 P5克隆a至f的效力测定测试(TCID₅₀)。

图4示出了描绘寨卡病毒PRVABC59 P6克隆a至f在Vero细胞单层上生长的细胞病变效应(CPE)的明视野显微镜图像。

图5示出了寨卡病毒PRVABC59 P6克隆a至f的效力测定测试(TCID₅₀)。

图6示出了将来自寨卡病毒毒株PRVABC59 P6e(SEQ ID NO:8)和PRVABC59(SEQ IDNO:9)的残基330附近的寨卡病毒包膜糖蛋白序列与几种其他黄病毒(WNV(SEQ ID NO:10)；JEV(SEQ ID NO:11)；SLEV(SEQ ID NO:12)；YFV(SEQ ID NO:13)；DENV 1 16007(SEQ IDNO:14)；DENV 2 16681(SEQ ID NO:15)；DENV 3 16562(SEQ ID NO:16)；和DENV 4 1036(SEQ ID NO:17))进行比较的氨基酸序列比对。

图7示出了将来自寨卡病毒毒株PRVABC59 P6e(SEQ ID NO:18)和PRVABC59(SEQID NO:19)的残基98附近的寨卡病毒NS1蛋白序列与几种其他黄病毒(WNV(SEQ ID NO:20)；JEV(SEQ ID NO:21)；SLEV(SEQ ID NO:22)；YFV(SEQ ID NO:23)；DENV 1 16007(SEQ IDNO:24)；DENV 2 16681(SEQ ID NO:25)；DENV 3 16562(SEQ ID NO:26)；和DENV 4 1036(SEQ ID NO:27))进行比较的氨基酸序列比对。

图8示出了ZIKAV PRVABC59 P6病毒克隆a至f与ZIKAV PRVABC59 P1病毒相比的噬斑表型。

图9示出了ZIKAV PRVABC59 P6病毒克隆与ZIKAV PRVABC59 P1病毒相比的平均噬斑大小。

图10示出了ZIKAV PRVABC59 P6克隆a至f在无血清生长条件下在Vero细胞中的生长动力学。

图11示出了灭活数据的汇编动力学。数据将来自四个毒理学批次的样品的感染效力(TCID50)与RNA拷贝和灭活完全性(COI)进行了比较。这些数据表明COI测定的灵敏度大于TCID50。

图12示出了测定中C6/36和Vero灵敏度的比较，如输入病毒滴度为0.31TCID50所示。

图13示出了使用C6/36细胞位点对CPE相对于log TCID50进行的逻辑回归分析，其包括目标值0.01TCID50/孔(-2log TCID50/孔)周围的99％置信区间，模型预测0.85％的孔将为阳性。

图14：在-80℃下储存67天后，Tris+7％蔗糖缓冲液中的寨卡病毒疫苗原料的SEC色谱图中对应于完整寨卡病毒的峰(保留时间为约8分钟)(此峰对应于实施例3C，表16b)。

图15：在-80℃下储存67天后，ZPB缓冲液中的寨卡病毒疫苗原料的SEC色谱图中对应于完整寨卡病毒的峰(保留时间为约8分钟)(此峰对应于实施例3C，表16b)。

图16：在5℃±3℃和-80℃下储存10天后，剩余的完整寨卡病毒的百分比(通过SEC测量)(对应于实施例3A)。

图17：在-80℃下储存60天后，剩余的完整寨卡病毒的百分比(通过SEC测量)(对应于实施例3B)。

图18：在5℃±3℃和-80℃下储存67天后，剩余的完整寨卡病毒的百分比(通过SEC测量)(对应于实施例3C)。

图19：在-80℃下储存3个月后，ZPB和Tris+Suc中的寨卡疫苗原料药的剩余的完整寨卡病毒的百分比(通过SEC测量)(对应于实施例3D)。

图20：在5℃±3℃下储存0至60天后，ZPB和TBS中的寨卡疫苗原料药的剩余的完整寨卡病毒的百分比(通过SEC测量)(对应于实施例3E)。

图21：在重复的冻融循环后，剩余的完整寨卡病毒的百分比(通过SEC测量)(对应于实施例3F)。

定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然与本文中所述的那些方法和材料相似或相等的任何方法和材料可用于实践以测试本发明，但是本文描述优选材料和方法。在描述并要求保护本发明时，将根据下文陈述的定义来使用以下术语。

除非另外明确指出，否则术语“一个/种(a/an)”等的使用是指一个(种)或多个(种)。

如本文所用，术语“灭活寨卡病毒”旨在包括已经用灭活方法(诸如用有效量的甲醛处理)处理的寨卡病毒。

如本文所用，术语“灭活全寨卡病毒”旨在包括已经用灭活方法(诸如用有效量的福尔马林处理)处理的寨卡病毒。此种处理被认为不会破坏病毒的结构，即它不会破坏病毒的二级、三级或四级结构和免疫原性表位，但灭活寨卡病毒不再能够感染宿主细胞，所述宿主细胞可被尚未灭活的寨卡病毒感染。在一个实施方案中，灭活寨卡病毒不再能够感染VERO细胞并对VERO细胞产生细胞病变效应。特别地，灭活(全)寨卡病毒可从以下方法可获得/获得，其中在20℃至24℃的温度下用以约0.01％重量/体积的量的甲醛处理寨卡病毒10天。全寨卡病毒的样品可在尺寸排阻色谱法中提供为曲线下总面积的至少85％的主峰。

为了本发明的目的，术语“多元醇”被定义为是指具有多个羟基的物质，并且包括糖(还原糖和非还原糖)、糖醇和糖酸。多元醇的另一个实例为甘油。任选地，如本文所定义的多元醇的分子量小于约600Da(例如，在约120Da至约400Da的范围内)。

为了本发明的目的，术语“含氨基的分子”被定义为包括含伯胺、仲胺、叔胺和季胺基团(RNH₂、R₂NH、R₃N、R₄N+)的分子。R基团通常为环烃或无环烃。含氨基的分子包括氨基酸(例如像组氨酸)、Tris、ACES、CHES、CAPSO、TAPS、CAPS、Bis-Tris、TAPSO、TES、Tricine和ADA(每种缓冲液的所有缩写都具有与本领域公知的相同含义)。

为了本发明的目的，术语“室温”被定义为指正常室温，例如像约25℃。

在本发明的含义内，术语“灭活病毒组合物”或“液体灭活病毒组合物”通常是指液体形式或冷冻液体形式的组合物。此类组合物是包括灭活病毒的中间组合物，所述灭活病毒通常以冷冻状态储存，然后通过至少进一步添加佐剂来用于最终制备疫苗/药物产品。

“Tris”是指三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液。

如果没有另外指出，则“％”是指“每体积重量(w/v)”

具体实施方式

通用技术

本领域技术人员通常很好地理解并通常使用常规方法来应用本文所述或参考的技术和程序，所述常规方法例如像描述于以下中的广泛应用的方法：Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编,(2003))；the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B,D,Hames和G.R.Taylor编(1995)),Harlow和Lane编(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,and Animal CellCulture(R.I.Freshney编(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984),Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney)编1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts.1998)PlenumPress；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编,1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell,编)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编,1994),Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人编,1991)；ShortProtocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.编,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean编,Oxford University Press,2000)；Using Antibodies:ALaboratory Manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；以及The Antibodies(M.Zanetti和J,D.Capra编,Harwood Academic Publishers,1995)。

灭活病毒组合物

本发明涉及一种液体灭活病毒组合物，其包含：

a)灭活全寨卡病毒，

b)至少一种药学上可接受的缓冲液，其浓度为至少约6.5mM，和

c)任选地多元醇，

其中所述至少一种药学上可接受的缓冲液不包含磷酸根离子。

在某些此类实施方案中，液体灭活病毒组合物不含选自铝盐的佐剂。特别地，铝盐可选自明矾(诸如氢氧化铝)、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾的组。在某些此类实施方案中，液体灭活病毒组合物不含可吸附灭活全寨卡病毒的佐剂。在某些此类实施方案中，液体灭活病毒组合物不含选自以下的佐剂：铝盐、磷酸钙、toll样受体(TLR)激动剂、单磷酰脂质A(MLA)、MLA衍生物、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡核苷酸、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳剂(油乳剂)、壳聚糖、维生素D、硬脂酰或十八烷基酪氨酸、病毒体、脂质卷(cochleates)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。在某些此类实施方案中，液体灭活病毒组合物不含佐剂，即技术人员已知的任何佐剂化合物。

在某些实施方案中，液体灭活病毒组合物中磷酸根离子的浓度小于约7mM、或小于约6mM、或小于约5mM、或小于约4mM、或小于约3mM、或小于约2mM、或小于约1mM。包含磷酸根离子的液体例如可通过将磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)和/或磷酸二氢钾(KH₂PO₄)溶解或分散在液体中来获得。当将磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)和磷酸二氢钾(KH₂PO₄)以特定比例溶解在含水液体中时，这样产生磷酸盐缓冲溶液。

在某些实施方案中，液体灭活病毒组合物中所述至少一种药学上可接受的缓冲液的浓度为至少约7mM、或至少约7.5mM、或至少约8mM、或至少约8.5mM、或至少约9mM、或至少约10mM。在某些此类实施方案中，液体灭活病毒组合物中至少一种药学上可接受的缓冲液的浓度为约7mM至约200mM、或约7.5mM至约200mM、或约8mM至约200mM、或约8.5mM至约200mM、或约9mM至约100mM、或约9mM至约60mM、或9mM至约30mM、或约9mM至约11mM、或为约10mM、或为约20mM、或为约50mM。

在某些实施方案中，液体灭活病毒组合物仅包含一种药学上可接受的缓冲液。另外，在某些实施方案中，液体灭活病毒组合物可基本上仅包含一种药学上可接受的缓冲液和仅残留量的另外的缓冲液组分，其中浓度为小于2mM、或小于1.5mM、或小于1mM、或小于0.9mM、或小于0.5mM、或小于0.2mM。

在某些实施方案中，液体灭活病毒组合物包含至少两种不同的药学上可接受的缓冲液，其中液体灭活病毒组合物中两种浓度最高的药学上可接受的缓冲液的摩尔比不在1:2至2:1之间、或不在1:5至5:1之间、或不在8:1至1:8之间、或不在10:1至1:10之间。

在某些实施方案中，液体灭活病毒组合物中钾离子的浓度小于约4mM、或小于约3mM、或小于约2mM、或小于约1.5mM、或小于约0.5mM、或小于约0.1mM、或为约0mM(即基本上不含钾离子)。

在某些实施方案中，液体灭活病毒组合物基本上不含或不含硫酸鱼精蛋白。

在某些实施方案中，液体灭活病毒组合物的pH为约pH 6.0至约pH 9.0、或约pH6.5至约pH 8.0、或约pH 6.8至约pH 7.8、约pH 7.4或约pH 7.6，如在室温下测定的。

缓冲液

在某些实施方案中，根据本发明的液体灭活病毒组合物包含：

a)灭活全寨卡病毒，

b)至少一种药学上可接受的缓冲液，其浓度为至少约6.5mM，和

c)任选地多元醇，

其中液体灭活病毒组合物不含选自铝盐的佐剂，并且

所述至少一种药学上可接受的缓冲液包含含氨基的分子且不包含磷酸根离子。

包含含氨基的分子的缓冲液可选自组氨酸(His)、Tris、ACES、CHES、CAPSO、TAPS、CAPS、Bis-Tris、TAPSO、TES、Tricine和ADA的组。在某些优选的实施方案中，药学上可接受的缓冲液为Tris或组氨酸(His)缓冲液，优选Tris缓冲液。

多元醇

在某些实施方案中，液体灭活病毒组合物还包含至少一种多元醇。

在某些此类实施方案中，液体灭活病毒组合物包含约1％重量/体积至约60％重量/体积多元醇、或约6％重量/体积至约50％重量/体积多元醇、或约6％重量/体积至约40％重量/体积多元醇、或约6％重量/体积至约35％重量/体积多元醇、或约6％重量/体积至约30％重量/体积多元醇、或约6％重量/体积至约25％重量/体积多元醇、或约6％重量/体积至约20％重量/体积多元醇、或约6％重量/体积至约15％重量/体积多元醇、或约6％重量/体积至约12％重量/体积多元醇、或约7％重量/体积多元醇、或约10％重量/体积多元醇。

在某些优选的实施方案中，液体灭活病毒组合物包含：药学上可接受的缓冲液，其包含含氨基的分子；和约6％重量/体积至约15％重量/体积多元醇。在某些此类实施方案中，液体灭活病毒组合物包含Tris和约6％重量/体积至约15％重量/体积多元醇。

在某些实施方案中，多元醇为糖。在某些此类实施方案中，糖为二糖。在某些此类实施方案中，二糖为非还原糖。在某些此类实施方案中，非还原糖为蔗糖。

在某些此类实施方案中，液体灭活病毒组合物包含约5％重量/体积至约20％重量/体积蔗糖、或约6％重量/体积至约15％重量/体积蔗糖。在某些此类实施方案中，液体灭活病毒组合物包含约6％重量/体积至约8％重量/体积蔗糖，例如约7％重量/体积蔗糖。

在某个优选的方面，液体灭活病毒组合物包含约8.5mM至约50mM Tris和约6％重量/体积至约15％重量/体积蔗糖，其中在室温下测量时，灭活病毒组合物的pH为约pH 7.0至约pH 8.0。

在某些替代实施方案中，多元醇为甘油。在某些此类实施方案中，液体灭活病毒组合物包含约1％体积/体积至约60％体积/体积甘油、或约7％体积/体积至约15％体积/体积甘油、或约10％体积/体积甘油。

在某个优选的方面，灭活病毒组合物包含约8.5mM至约50mM Tris和约6％体积/体积至约15％体积/体积甘油，其中在室温下测量时，灭活病毒组合物的pH为约pH 7.0至约pH8.0。

氯化钠

在某些实施方案中，液体灭活病毒组合物还包含氯化钠。在某些此类实施方案中，液体灭活病毒组合物包含浓度为约5mM至约500mM的氯化钠、或约10mM至约200mM的氯化钠。

在某些此类实施方案中，液体灭活病毒组合物包含浓度为约10mM至约40mM、或约10mM至约30mM的氯化钠，诸如约20mM的氯化钠。在某个优选的实施方案中，液体灭活病毒组合物包含约8.5mM至约80mM Tris、约10mM至约30mM氯化钠、约6％重量/体积至约15％重量/体积蔗糖，其中在室温下测量时，液体灭活病毒组合物的pH为约pH 7.0至约pH 8.0。在某个优选的实施方案中，液体灭活病毒组合物包含约8.5mM至约15mM Tris、约10mM至约25mM氯化钠、约6％重量/体积至约10％重量/体积蔗糖，其中在室温下测量时，液体灭活病毒组合物的pH为约pH 7.0至约pH 8.0。

在某些替代实施方案中，液体灭活病毒组合物包含浓度为约100mM至约200mM、或约140mM至约160mM(诸如约150mM)的氯化钠。在某些此类实施方案中，液体灭活病毒组合物包含约8.5mM至约80mM Tris和约140mM至约160mM NaCl，其中在室温下测量时，液体灭活病毒组合物的pH为约pH 7.0至约pH 8.0。在某些此类实施方案中，液体灭活病毒组合物包含约8.5mM至约15mM Tris和约140mM至约160mM NaCl，其中在室温下测量时，液体灭活病毒组合物的pH为约pH 7.0至约pH 8.0。

在某些实施方案中，液体灭活病毒组合物的离子强度低于约80mM、或低于约70mM、或低于约60mM、或低于约50mM、或低于约40mM、或低于约30mM。术语离子强度由以下等式定义：

其中，C_i为离子I的摩尔浓度，Z_i为该离子的电荷数，并且取溶液中所有离子的总和。

寨卡病毒

本发明涉及一种包含灭活全寨卡病毒的灭活病毒组合物。在本发明的某些方面，灭活全寨卡病毒可指通过噬斑纯化从寨卡病毒群体中分离的纯化的灭活全寨卡病毒。本发明涉及任何类型的灭活全寨卡病毒。下面以具体的寨卡病毒作为实例进行描述。

寨卡病毒(ZIKV)是在1947年首次从乌干达寨卡森林的哨兵恒河猴(sentinelrhesus monkey)中分离出来的蚊媒黄病毒。从那时起，已从非洲和亚洲以及最近美洲的人类进行了分离。ZIKV存在于两个(可能三个)谱系中：非洲谱系(可能为分开的东非和西非谱系)和亚洲谱系。因此，本公开的合适寨卡病毒的实例包括但不限于来自非洲和/或亚洲谱系的病毒。在一些实施方案中，寨卡病毒为非洲谱系病毒。在一些实施方案中，寨卡病毒为亚洲谱系病毒。另外，先前已经鉴定了寨卡病毒的非洲和亚洲谱系中的多种毒株。本公开中可是用哪个本领域已知的任何一种或多种合适的寨卡病毒毒株，包括例如毒株Mr 766、ArD41519、IbH 30656、P6-740、EC Yap、FSS13025、ArD 7117、ArD 9957、ArD 30101、ArD 30156、ArD 30332、HD 78788、ArD 127707、ArD 127710、ArD 127984、ArD 127988、ArD 127994、ArD128000、ArD 132912、132915、ArD 141170、ArD 142623、ArD 149917、ArD 149810、ArD149938、ArD 157995、ArD 158084、ArD 165522、ArD 165531、ArA 1465、AfA 27101、ArA27290、ArA 27106、ArA 27096、ArA 27407、ArA 27433、ArA 506/96、ArA 975-99、Ara 982-99、ArA 986-99、ArA2718、ArB 1362、Nigeria68、Malaysia66、Kedougou84、Suriname、MR1429、PRVABC59、ECMN2007、DakAr41524、H/PF/2013、R103451、103344、8375、JMB-185、ZIKV/H、sapiens/Brazil/Natal/2015、SPH2015、ZIKV/Hu/Chiba/S36/2016和/或Cuba2017。在一些实施方案中，本公开中使用毒株PRVABC59。

在一些实施方案中，寨卡病毒基因组序列的实例作为SEQ ID NO:2在以下示出：

在一些实施方案中，寨卡病毒可包含GenBank登录号KU501215.1的基因组序列。在一些实施方案中，寨卡病毒来自毒株PRVABC59。在一些实施方案中，GenBank登录号KU501215.1的基因组序列包含序列SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，寨卡病毒可包含与序列SEQ ID NO:2具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的基因组序列。

在一些实施方案中，寨卡病毒可包含由序列SEQ ID NO:2编码的至少一种多肽。在一些实施方案中，寨卡病毒可包含氨基酸序列与由序列SEQ ID NO:2编码的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的至少一种多肽。

因此，在一些实施方案中，本公开的灭活寨卡病毒可用于本文公开的任一灭活病毒组合物中。例如，本公开的灭活寨卡病毒可用于提供可用于治疗或预防有需要的受试者的寨卡病毒感染和/或用于诱导有需要的受试者的对寨卡病毒的免疫应答(诸如保护性免疫应答)的一种或多种抗原。

本公开中使用的寨卡病毒可从细胞培养物中的一种或多种细胞获得(例如，通过噬斑纯化)。可使用本领域已知的用于产生寨卡病毒的任何合适的细胞，包括例如昆虫细胞(例如，蚊子细胞，诸如CCL-125细胞、Aag-2细胞、RML-12细胞、C6/36细胞、C7-10细胞、AP-61细胞、A.t.GRIP-1细胞、A.t.GRIP-2细胞、A.t.GRIP-3细胞、UM-AVE1细胞、Mos.55细胞、Sua1B细胞、4a-3B细胞、Mos.42细胞、MSQ43细胞、LSB-AA695BB细胞、NIID-CTR细胞、TRA-171细胞；以及来自诸如以下蚊子物种的另外的细胞或细胞系：埃及伊蚊、白纹伊蚊、假鳞斑伊蚊(Aedes pseudoscutellaris)、三列伊蚊(Aedes triseriatus)、刺扰伊蚊(Aedesvexans)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、斯氏按蚊(Anopheles stephensi)、白端按蚊(Anopheles albimus)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)、希氏库蚊(Culextheileri)、三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)、二带喙库蚊(Culexbitaeniorhynchus)和/或安汶巨蚊(Toxorhynchites amboinensis))；和哺乳动物细胞(例如，VERO细胞(来自猴肾)、LLC-MK2细胞(来自猴肾)、MDBK细胞、MDCK细胞、ATCC CCL34 MDCK(NBL2)细胞、MDCK 33016(保藏号DSM ACC 2219，如WO97/37001所述)细胞、BHK21-F细胞、HKCC细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。在一些实施方案中，寨卡病毒(例如，寨卡病毒克隆分离株)由非人细胞产生。在一些实施方案中，寨卡病毒(例如，寨卡病毒克隆分离株)由昆虫细胞产生。在一些实施方案中，寨卡病毒(例如，寨卡病毒克隆分离株)由蚊子细胞产生。在一些实施方案中，寨卡病毒(例如，寨卡病毒克隆分离株)由哺乳动物细胞产生。在一些实施方案中，寨卡病毒(例如，寨卡病毒克隆分离株)由VERO细胞产生。

寨卡病毒具有编码结构和非结构多肽的正义单链RNA基因组。基因组在5'末端和3'末端区还含有在病毒复制中起作用的非编码序列。由这些病毒编码的结构多肽包括但不限于衣壳(C)、前体膜(prM)和包膜(E)。由这些病毒编码的非结构(NS)多肽包括但不限于NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。

在某些实施方案中，寨卡病毒包括寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)中的突变。在一些实施方案中，寨卡病毒在SEQ ID NO:1的位置98处或在与SEQ ID NO:1的位置98对应的位置处含有Trp98Gly突变。

在一些实施方案中，突变在NS1多肽内。来自示例性寨卡病毒毒株的野生型NS1多肽的氨基酸序列如下所示：

在一些实施方案中，NSl多肽的氨基酸序列与序列SEQ ID NO:1具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，NS1多肽的氨基酸序列可来自由GenBank登录号KU501215.1的序列(SEQ ID NO:2)编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，NS1多肽的氨基酸序列可为由GenBank登录号KU501215.1的序列编码的氨基酸序列的氨基酸位置795至1145。在一些实施方案中，NS1多肽的氨基酸序列可来自寨卡病毒毒株PRVABC59。

“序列同一性”、“％序列同一性”、“％同一性”、“％相同”或“序列比对”意指第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的比较、或第一核酸序列与第二核酸序列的比较，并计算为基于比较的百分比。此计算的结果可描述为“百分比相同”或“百分比ID”。

通常，序列比对可用于通过两种不同方法中的一种来计算序列同一性。在第一种方法中，在最终序列同一性计算中，单个位置处的错配和单个位置处的空位均被计数为不同位置。在第二种方法中，在最终序列同一性计算中，单个位置处的错配被计数为不同位置；然而，在最终序列同一性计算中，单个位置处的空位不被计数(忽略)为不同位置。换句话说，在第二种方法中，在最终序列同一性计算中忽略了空位。这两种方法(即在单个位置处将空位计数为不同位置相对于忽略空位)之间的差异可导致两个序列之间序列同一性值的变异性。

在一些实施方案中，序列同一性由程序确定，所述程序产生比对，并且通过在最终序列同一性计算中，将单个位置处的错配和单个位置处的空位计数为不同位置来计算同一性。例如程序Needle(EMBOS)，它实现了Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)，并通过以下来由默认设置计算序列同一性：首先产生第一序列与第二序列之间的比对，然后计数比对长度上相同位置的数量，然后将相同残基数除以比对的长度，然后将此数字乘以100以生成％序列同一性[％序列同一性＝(相同残基数/比对长度)×100)]。

序列同一性可从在全长内显示两个序列(因此显示第一序列和第二序列的全长)的成对比对来计算(“全局序列同一性”)。例如，程序Needle(EMBOSS)产生此类比对；％序列同一性＝(相同残基数/比对长度)×100)]。

序列同一性可从仅显示第一序列或第二序列的局部区域的成对比对来计算(“局部同一性”)。例如，程序Blast(NCBI)产生此类比对；％序列同一性＝(相同残基数/比对长度)×100)]。

序列比对优选通过使用Needleman和Wunsch的算法来生成(J.Mol.Biol.(1979)48,第443-453页)。优选地，程序“NEEDLE”(欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS))以程序默认参数(空位开放＝10.0，空位扩展＝0.5，并且对于蛋白质，矩阵＝EBLOSUM62，且对于核苷酸，矩阵＝EDNAFULL)使用。然后，序列同一性可从在全长内显示两个序列(因此显示全长的第一序列和第二序列)的比对来计算(“全局序列同一性”)。例如：％序列同一性＝(相同残基数/比对长度)×100)]。

在一些实施方案中，突变发生在NS1多肽内的一个或多个氨基酸位置处。在一些实施方案中，突变发生在SEQ ID NO:1的位置98处，或在使用成对比对算法与SEQ ID NO:1比对时与SEQ ID NO:1的位置98对应的位置处。在一些实施方案中，位置98处的突变为色氨酸到甘氨酸的取代。

在一些实施方案中，寨卡病毒在SEQ ID NO:1的位置98处或在与SEQ ID NO:1的位置98对应的位置处包含突变。可通过使用成对比对算法将NS1蛋白的氨基酸序列与SEQ IDNO:1比对来确定与SEQ ID NO:1的位置98对应的位置。除了寨卡病毒以外的病毒中与SEQID NO:1的位置98处的色氨酸残基对应的氨基酸残基在本申请的图7中示出，在图中这些残基被加框。在一些实施方案中，位置98处的突变为色氨酸到甘氨酸的取代。在一些实施方案中，位置98处的突变为SEQ ID NO:1的位置98处的色氨酸到甘氨酸的取代。在一些实施方案中，当使用成对比对算法与SEQ ID NO:1比对时，位置98处的突变为与SEQ ID NO:1的位置98对应的位置处的色氨酸到甘氨酸的取代。

在一些实施方案中，寨卡病毒含有NS1蛋白内的突变以及C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5病毒蛋白中的一个或多个内的至少一个突变。在一些实施方案中，寨卡病毒含有NS1蛋白内的一个或多个突变，并且不含有C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5病毒蛋白中的一个或多个内的至少一个突变。在一些实施方案中，寨卡病毒含有NS1蛋白内的突变，并且不含有包膜蛋白E内的至少一个突变。在一些实施方案中，全灭活病毒含有寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)中的至少一个突变，并且不包括寨卡病毒包膜蛋白E(Env)中的突变。在一些实施方案中，寨卡病毒在SEQ ID NO:1的位置98处或在与SEQ IDNO:1的位置98对应的位置处含有突变，并且不含有包膜蛋白E内的任何突变。在一些实施方案中，全失活病毒在SEQ ID NO:1的位置98处或在与SEQ ID NO:1的位置98对应的位置处含有突变，且/或不包括寨卡病毒包膜蛋白E(Env)中的突变。在一些实施方案中，全灭活病毒含有寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)中的至少一个突变，并且编码包膜蛋白的序列与SEQ IDNo.2中的对应序列相同。在一些实施方案中，寨卡病毒在SEQ ID NO:1的位置98处或在与SEQ ID NO:1的位置98对应的位置处含有突变，并且编码包膜蛋白的序列与SEQ ID NO.2中的对应序列相同。在一些实施方案中，全灭活寨卡病毒在SEQ ID NO:1的位置98处或在与SEQ ID NO:1的位置98对应的位置处含有突变，并且编码包膜蛋白的序列与SEQ ID NO:2中的对应序列相同。在一些实施方案中，全灭活寨卡病毒在SEQ ID NO:1的位置98处或在与SEQ ID NO:1的位置98对应的位置处含有色氨酸到甘氨酸的取代，并且编码包膜蛋白的序列与SEQ ID NO:2中的对应序列相同。

在一些实施方案中，寨卡病毒含有至少一种突变，与缺乏所述至少一种突变的寨卡病毒相比，其增强遗传稳定性。在一些实施方案中，寨卡病毒含有至少一种突变，与缺乏所述至少一种突变的寨卡病毒相比，其增强病毒复制。在一些实施方案中，寨卡病毒含有减少或以其他方式抑制不希望的突变的发生(诸如发生在寨卡病毒的包膜蛋白E(Env)内)的至少一种突变。

在本公开的上述实施方案中，示例性成对比对算法为使用默认参数(例如，其中空位开放罚分＝10.0，并且其中空位扩展罚分＝0.5，使用EBLOSUM62评分矩阵)的Needleman-Wunsch全局比对算法。此算法在EMBOSS程序包中的needle工具中方便地实现。

在一些实施方案中，灭活寨卡病毒可用于灭活病毒组合物中。例如，灭活寨卡病毒可用于治疗或预防有需要的受试者的寨卡病毒感染和/或诱导有需要的受试者的对寨卡病毒的免疫应答，诸如保护性免疫应答。

灭活病毒组合物的生产

本公开的其他方面涉及寨卡病毒灭活病毒组合物，其含有纯化的灭活全病毒，诸如具有突变的寨卡病毒，所述突变为在SEQ ID NO:1的位置98处或在与SEQ ID NO:1的位置98对应的位置处的色氨酸到甘氨酸的取代，如本文所述。在一些实施方案中，灭活病毒组合物包含纯化的灭活全寨卡病毒，其在SEQ ID NO:1的位置98处或在与SEQ ID NO:1的位置98对应的位置处包含Trp98Gly突变，其中寨卡病毒衍生自毒株PRVABC59。在一些实施方案中，灭活病毒组合物包含纯化的灭活全寨卡病毒，其在SEQ ID NO:1的位置98处或在与SEQ IDNO:1的位置98对应的位置处包含Trp98Gly突变，其中寨卡病毒衍生自包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59。在一个实施方案中，灭活病毒组合物含有噬斑纯化的克隆寨卡病毒分离株。

本公开的灭活病毒组合物的生产包括寨卡病毒的生长。在细胞培养物中生长是用于制备本公开的灭活病毒组合物的方法。用于病毒生长的细胞可在悬浮或贴壁条件下培养。

适用于本公开的至少一种病毒的生长的细胞系包括但不限于：昆虫细胞(例如，如本文所述的蚊子细胞)、VERO细胞(来自猴肾)、马、牛(例如，MDBK细胞)、绵羊、狗(例如，来自狗肾的MDCK细胞、ATCC CCL34 MDCK(NBL2)或MDCK 33016(保藏号DSM ACC 2219，如WO97/37001中所述))、猫和啮齿动物(例如，仓鼠细胞，诸如BHK21-F、HKCC细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞))，并且可从多种发育阶段获得，包括例如成年、新生儿、胎儿和胚胎。在某些实施方案中，细胞是永生化的(例如，PERC.6细胞，如WO 01/38362和WO 02/40665中所述，并且以EC ACC保藏号96022940保藏)。在优选的实施方案中，使用哺乳动物细胞，并且其可选自和/或衍生自以下非限制性细胞类型中的一种或多种：成纤维细胞(例如，真皮细胞、肺细胞)、内皮细胞(例如，主动脉细胞、冠状动脉细胞、肺细胞、血管细胞、真皮微血管细胞、脐带细胞)、肝细胞、角质形成细胞、免疫细胞(例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞)、乳腺细胞(例如，上皮乳腺细胞)、平滑肌细胞(例如，血管细胞、主动脉细胞、冠状动脉细胞、动脉细胞、子宫细胞、支气管细胞、宫颈细胞、视网膜周细胞)、黑素细胞、神经细胞(例如，星形胶质细胞)、前列腺细胞(例如，上皮细胞、平滑肌细胞)、肾细胞(例如，上皮细胞、系膜细胞、近端小管细胞)、骨骼细胞(例如，软骨细胞、破骨细胞、成骨细胞)、肌肉细胞(例如，成肌细胞、骨骼细胞、平滑细胞、支气管细胞)、肝细胞、成视网膜细胞和基质细胞。WO 97/37000和WO 97/37001描述了能够在悬浮液和无血清培养基中生长且可用于病毒的生产和复制的动物细胞和细胞系的生产。在一个实施方案中，用于生长至少一种病毒的细胞为Vero细胞。

上述细胞类型的培养条件是已知的并且在多种出版物中描述。替代地，培养基、补充剂和条件可商业购买，例如像描述于Cambrex Bioproducts(East Rutherford,N.J.)的目录和另外的文献中。

在某些实施方案中，本文所述的方法中使用的细胞在无血清和/或无蛋白质培养基中培养。在本公开的上下文中，如果培养基不含来自人或动物来源的血清的任何添加剂，则培养基称为无血清培养基。无蛋白质被理解为意指在排除蛋白质、生长因子、其他蛋白质添加剂和非血清蛋白质的情况下发生细胞增殖的培养物，但可任选地包括诸如胰蛋白酶或可能是病毒生长所必需的其他蛋白酶的蛋白质。在此类培养物中生长的细胞本身天然含有蛋白质。

已知的无血清培养基包括伊思柯夫培养基(Iscove's medium)、Ultra-CHO培养基(BioWhittaker)或EX-CELL(JRH Bioscience)。普通的含血清培养基包括伊格尔氏基础培养基(BME)或最低必需培养基(MEM)(Eagle,Science,130,432(1959))或达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium；DMEM或EDM)，它们通常与高达10％胎牛血清或类似添加剂一起使用。任选地，可使用最低必需培养基(MEM)(Eagle,Science,130,432(1959))或达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM或EDM)，而无需任何含血清的补充剂。无蛋白质培养基(如PF-CHO(JHR Bioscience))、化学成分明确的培养基(chemically-definedmedia)(如ProCHO 4CDM(BioWhittaker)或SMIF 7(Gibco/BRL Life Technologies))和促有丝分裂肽(如Primactone、Pepticase或HyPep.TM.(均来自Quest International)或乳清蛋白水解产物(Gibco和其他制造商))在现有技术中也充分已知。基于植物水解产物的培养基添加剂具有可排除病毒、支原体或未知感染因子的污染的特殊优势。

细胞培养条件(温度、细胞密度、pH值等)由于根据本公开所采用的细胞系的适用性而在非常宽的范围内可变，并且可适应特定病毒毒株的要求。

用于在培养细胞中繁殖病毒的方法通常包括以下步骤：用待培养的毒株接种培养细胞；将感染的细胞培养所需的时间段以实现病毒繁殖，例如像通过病毒滴度或抗原表达(例如，接种后24小时与168小时之间)所确定；以及收集繁殖的病毒。在一些实施方案中，通过噬斑纯化收集病毒。以病毒(通过PFU或TCID50测量)与细胞的比率1:500至1:1、优选1:100至1:5接种培养细胞。将病毒添加到细胞悬浮液中或施加到细胞单层上，并在25℃至40℃、优选28℃至38℃下将病毒吸附在细胞上至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、在至少50分钟、至少60分钟但通常少于300分钟。感染的细胞培养物(例如，单层)可通过收获上清液(不含细胞)、冻-融或通过酶促作用来去除，以增加收获的培养物上清液的病毒含量。然后将收获的液体灭活或冷冻储存。培养的细胞可以约0.0001至10、优选0.002至5、更优选0.001至2的感染复数(“MOI”)进行感染。更优选地，以约0.01的MOI感染细胞。在感染期间，培养基与细胞培养容器面积的比率可低于细胞培养期间的比率。保持此比率较低最大化病毒感染细胞的可能性。可在感染后30至60小时或感染后3至10天收获受感染的细胞的上清液。在某些优选的实施方案中，在感染后3至7天收获感染的细胞的上清液。更优选地，在感染后3至5天收获感染的细胞的上清液。在一些实施方案中，可在细胞培养期间添加蛋白酶(例如，胰蛋白酶)以允许病毒释放，并且可在培养期间的任何合适阶段添加蛋白酶。替代地，在某些实施方案中，可收获受感染的细胞培养物的上清液，并且可从上清液中分离或以其他方式纯化病毒。

病毒接种物和病毒培养物优选不含以下(即将针对以下进行测试并给出其污染的阴性结果)：单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、双瘤病毒、圆环病毒和/或细小病毒(WO 2006/027698)。

在病毒已经在细胞系上生长的情况下，则标准操作是最小化最终液体灭活病毒组合物中残留的细胞系DNA的量，以便最小化宿主细胞DNA的任何致癌活性。在液体灭活病毒组合物制备期间，可使用标准纯化程序例如色谱法等去除污染DNA。可通过核酸酶处理(例如，通过使用DNA酶)来增强残留宿主细胞DNA的去除。参考文献(Lun dblad(2001)Biotechnology and Applied Biochemistry 34:195-197,Guidance for Industry:Bioanalytical Method Validation.U.S.Depart ment of Health and Human ServicesFood and Drug AdministrationCenter for Drug Evaluation and Research(CDER)Center for Vete rinary Medicine(CVM).2001年5月)中公开的用于减少宿主细胞DNA污染的方便方法涉及两步处理，首先使用可在病毒生长期间使用的DNA酶(例如，Benzonase)，然后使用可在病毒粒子破坏期间使用的阳离子洗涤剂(例如，CTAB)。也可使用通过β-丙内酯处理进行去除。在一个实施方案中，通过对培养物上清液进行benzonase处理来去除污染DNA。

抗原的生产

寨卡病毒可通过本领域已知的任何合适的方法来生产和/或纯化或以其他方式分离。在一个实施方案中，本公开的抗原为纯化的灭活全寨卡病毒。

在一些实施方案中，可如标题为“灭活病毒组合物的生产”的上述部分中所述生产灭活病毒。

在某些实施方案中，本公开的寨卡病毒可通过培养非人细胞来生产。适用于生产本公开的寨卡病毒的细胞系可包括昆虫细胞(例如，本文所述的蚊子细胞中的任一种)。适用于生产本公开的寨卡病毒的细胞系也可为哺乳动物来源的细胞，并且包括但不限于：VERO细胞(来自猴肾)、马、牛(例如，MDBK细胞)、绵羊、狗(例如，来自狗肾的MDCK细胞、ATCCCCL34 MDCK(NBL2)或MDCK 33016(保藏号DSM ACC 2219，如WO 97/37001中所述))、猫和啮齿动物(例如，仓鼠细胞，诸如BHK21-F、HKCC细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞))，并且可从多种发育阶段获得，包括例如成年、新生儿、胎儿和胚胎。在某些实施方案中，细胞是永生化的(例如，PERC.6细胞，如WO 01/38362和WO 02/40665中所述，并且以ECACC保藏号96022940保藏)。在优选的实施方案中，使用哺乳动物细胞，并且其可选自和/或衍生自以下非限制性细胞类型中的一种或多种：成纤维细胞(例如，真皮细胞、肺细胞)、内皮细胞(例如，主动脉细胞、冠状动脉细胞、肺细胞、血管细胞、真皮微血管细胞、脐带细胞)、肝细胞、角质形成细胞、免疫细胞(例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞)、乳腺细胞(例如，上皮乳腺细胞)、平滑肌细胞(例如，血管细胞、主动脉细胞、冠状动脉细胞、动脉细胞、子宫细胞、支气管细胞、宫颈细胞、视网膜周细胞)、黑素细胞、神经细胞(例如，星形胶质细胞)、前列腺细胞(例如，上皮细胞、平滑肌细胞)、肾细胞(例如，上皮细胞、系膜细胞、近端小管细胞)、骨骼细胞(例如，软骨细胞、破骨细胞、成骨细胞)、肌肉细胞(例如，成肌细胞、骨骼细胞、平滑细胞、支气管细胞)、肝细胞、成视网膜细胞和基质细胞。WO 97/37000和WO 97/37001描述了能够在悬浮液和无血清培养基中生长且可用于病毒抗原的生产的动物细胞和细胞系的生产。在某些实施方案中，非人细胞在无血清培养基中培养。在某些实施方案中，本公开的寨卡病毒可通过培养Vero细胞来产生。

病毒灭活

根据本发明的液体灭活病毒组合物包含灭活全寨卡病毒。

灭活或杀灭病毒以破坏其感染哺乳动物细胞的能力但不破坏病毒的二级、三级或四级结构和免疫原性表位的方法是本领域已知的。此类方法包括化学和物理手段。用于灭活病毒的合适手段包括但不限于用有效量的选自以下的一种或多种剂处理：洗涤剂、福尔马林(本文中也称为“甲醛”)、过氧化氢、β-丙内酯(BPL)、二元乙胺(BEI)、乙酰基乙烯亚胺、热、电磁辐射、X射线辐射、γ辐射、紫外线辐射(UV辐射)、UV-A辐射、UV-B辐射、UV-C辐射、亚甲蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C₆₀)、过氧化氢及其中任何的任何组合。如上所述，为了本申请的目的，术语“福尔马林”和“甲醛”可互换使用。当在本文中提及甲醛浓度时，是指甲醛浓度而不是福尔马林浓度。因此，“0.01％(重量/体积)的甲醛浓度”是指0.01％(重量/体积)甲醛，并且不必针对福尔马林储备溶液中的甲醛浓度(其通常含有按质量计37％的甲醛)对此浓度进行进一步校正。例如，可通过将福尔马林稀释成甲醛含量为1.85％(重量/体积)的工作溶液，然后在将其与病毒制备剂(诸如寨卡病毒制备剂)混合时进一步稀释到所需浓度来获得病毒制备剂中的此种甲醛浓度。

在本公开的某些实施方案中，至少一种(寨卡)病毒是化学灭活的。用于化学灭活的剂和化学灭活方法是本领域众所周知的并在本文中描述。在一些实施方案中，至少一种病毒用BPL、过氧化氢、福尔马林或BEI中的一种或多种化学灭活。在至少一种病毒用BPL化学灭活的某些实施方案中，病毒可含有一种或多种修饰。在一些实施方案中，一种或多种修饰可包括修饰的核酸。在一些实施方案中，修饰的核酸为烷基化的核酸。在其他实施方案中，一种或多种修饰可包括修饰的多肽。在一些实施方案中，修饰的多肽含有修饰的氨基酸残基，包括修饰的半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸中的一种或多种。

在某些实施方案中，至少一种(寨卡)病毒用甲醛灭活。

在至少一种病毒用福尔马林(甲醛)化学灭活的某些实施方案中，灭活病毒可含有一种或多种修饰。在一些实施方案中，一种或多种修饰可包括修饰的多肽。在一些实施方案中，一种或多种修饰可包括交联多肽。在至少一种病毒用福尔马林化学灭活的一些实施方案中，液体灭活病毒组合物还包括福尔马林。在至少一种病毒用BEL化学灭活的某些实施方案中，病毒可含有一种或多种修饰。在一些实施方案中，一种或多种修饰可包括修饰的核酸。在一些实施方案中，修饰的核酸为烷基化的核酸。

在至少一种病毒用福尔马林化学灭活的一些实施方案中，任何残留的未反应福尔马林可用焦亚硫酸钠中和，可透析出来和/或可进行缓冲液交换以去除残留的未反应福尔马林。在一些实施方案中，过量添加焦亚硫酸钠。在一些实施方案中，可使用混合器诸如在线静态混合器混合溶液，并随后过滤或进一步纯化(例如，使用错流过滤系统)。

在一些实施方案中，甲醛浓度为0.005％(重量/体积)至0.02％(重量/体积)。在一些实施方案中，甲醛浓度为0.0075％(重量/体积)至0.015％(重量/体积)。在一些实施方案中，甲醛浓度为0.01％(重量/体积)。

在一些实施方案中，寨卡病毒是通过以下方法获得/可获得的灭活全病毒，在所述方法中在约15℃至约37℃范围内的温度下用约0.001％重量/体积至约3.0％重量/体积范围内的量的甲醛处理寨卡病毒5至15天。在某些此类实施方案中，寨卡病毒是通过用0.005％重量/体积至0.02％重量/体积甲醛处理全活寨卡病毒所获得/可获得的灭活全病毒。在某些此类实施方案中，寨卡病毒是通过用小于0.015％重量/体积甲醛处理全活寨卡病毒所获得/可获得的灭活全病毒。

在某些实施方案中，灭活全寨卡病毒被认为通过以下方法可获得/获得，在所述方法中在22℃的温度下用约0.02％重量/体积范围内的量的甲醛处理寨卡病毒14天。在一些实施方案中，灭活的全寨卡病毒制剂被认为通过以下方法可获得/获得，在所述方法中在22℃的温度下用约0.01％重量/体积的量的甲醛处理寨卡病毒10天。

寨卡病毒纯度

寨卡病毒的纯度可通过尺寸排阻色谱法确定。本公开的某些实施方案涉及灭活病毒组合物，其包含灭活全寨卡病毒，所述寨卡病毒为至少85％纯，如通过尺寸排阻色谱中寨卡病毒的主峰多于曲线下总面积的85％确定的。在某些此类实施方案中，寨卡病毒可为90％纯，如通过尺寸排阻色谱中寨卡病毒的主峰多于曲线下总面积的90％确定的。在某些此类实施方案中，寨卡病毒可为95％纯，如通过尺寸排阻色谱中寨卡病毒的主峰多于曲线下总面积的95％确定的。

用途

在某个实施方案中，本发明涉及灭活病毒组合物的用途，所述灭活病毒组合物包含：

a)灭活全寨卡病毒，

b)至少一种药学上可接受的缓冲液，其浓度为至少约6.5mM，和

c)任选地，多元醇，

其中灭活病毒组合物不含选自铝盐的佐剂，并且所述至少一种药学上可接受的缓冲液不包含磷酸根离子，以用于稳定灭活全寨卡病毒。

在某些实施方案中，本发明涉及根据本发明(如上所述)的灭活病毒组合物用于稳定灭活全寨卡病毒的用途。

在某些此类实施方案中，本发明涉及灭活病毒组合物用于在5℃±3℃下储存至少10天期间稳定灭活全寨卡病毒的用途。

在某些实施方案中，本发明涉及灭活病毒组合物用于在-80℃下储存至少10天期间稳定灭活全寨卡病毒的用途。在某些此类实施方案中，本发明涉及灭活病毒组合物用于在-80℃下储存至少6个月期间稳定灭活全寨卡病毒的用途。在某些此类实施方案中，本发明涉及灭活病毒组合物用于在-80℃下储存至少12个月期间稳定灭活全寨卡病毒的用途。

在某些此类实施方案中，本发明涉及灭活病毒组合物用于在一个或多个冻融循环(诸如至少4个冻融循环)期间稳定灭活全寨卡病毒的用途。

灭活病毒组合物的制造方法

在某些实施方案中，本发明涉及一种制备灭活病毒组合物的方法，所述灭活病毒组合物包含：

a)灭活全寨卡病毒；

b)药学上可接受的缓冲液，其中所述缓冲液不是磷酸盐缓冲液，并且其中所述缓冲液的浓度为至少6.5mM；和

c)任选地，多元醇；

其中所述灭活病毒组合物不含选自铝盐的佐剂；所述方法包括以下步骤：

步骤1.从一种或多种非人细胞获得的上清液中分离寨卡病毒制备剂，

步骤2.纯化所述寨卡病毒制备剂；

步骤3.灭活所述病毒制备剂；

步骤4.将所述寨卡病毒制备剂转移到药学上可接受的缓冲液中，以获得寨卡病毒原料药。

在一些实施方案中，步骤1中使用的细胞为非人细胞。合适的非人哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞、LLC-MK2细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、ATCC CCL34 MDCK(NBL2)细胞、MDCK 33016(保藏号DSM ACC 2219，如WO97/37001中所述)细胞、BHK21-F细胞、HKCC细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。在一些实施方案中，哺乳动物细胞为Vero细胞。

在步骤2中，可采用本领域已知的纯化病毒制备剂的任何方法来分离寨卡病毒，所述方法包括但不限于使用错流过滤(CFF)、多峰色谱法、尺寸排阻色谱法、阳离子交换色谱法和/或阴离子交换色谱法。在一些实施方案中，病毒制备剂通过错流过滤(CFF)分离。在一些实施方案中，病毒制备剂被纯化至量为约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多的高程度。

在步骤3中，寨卡病毒制备剂可通过在15℃至30℃的温度下用0.005％(重量/体积)至0.02％(重量/体积)福尔马林处理8至12天来灭活。在一些实施方案中，寨卡病毒制备剂在15℃至30℃的温度下用0.005％(重量/体积)至0.02％(重量/体积)福尔马林处理9至11天。在一些实施方案中，寨卡病毒制备剂在15℃至30℃的温度下用0.005％(重量/体积)至0.02％(重量/体积)福尔马林处理10天。在一些实施方案中，寨卡病毒制备剂在15℃至30℃的温度下用0.008％(重量/体积)至0.015％(重量/体积)福尔马林处理8至12天。在一些实施方案中，寨卡病毒制备剂在15℃至30℃的温度下用0.008％(重量/体积)至0.015％(重量/体积)福尔马林处理9至11天。在一些实施方案中，寨卡病毒制备剂在15℃至30℃的温度下用0.008％(重量/体积)至0.015％(重量/体积)福尔马林处理10天。在一些实施方案中，寨卡病毒制备剂在15℃至30℃的温度下用0.01％(重量/体积)福尔马林处理8至12天。在一些实施方案中，寨卡病毒制备剂在15℃至30℃的温度下用0.01％(重量/体积)福尔马林处理9至11天。在一些实施方案中，寨卡病毒制备剂在15℃至30℃的温度下用0.01％(重量/体积)福尔马林处理10天。

在一些实施方案中，步骤3还涉及用有效量的焦亚硫酸钠中和未反应的福尔马林。

在某些实施方案中，本发明还涉及一种可通过上述方法获得的产品(诸如灭活病毒组合物)。

寨卡病毒疫苗

根据本发明的灭活病毒组合物通常是指用于制造疫苗的中间体组合物。本发明的另一方面涉及从上述灭活病毒组合物获得/可获得的液体疫苗(或适用于治疗或预防疾病或病状的组合物，特别是适用于治疗或预防寨卡病毒感染的组合物)。疫苗含有佐剂，并且可具有不同于灭活病毒组合物的缓冲液和赋形剂浓度。

在某些此类实施方案中，本发明涉及一种液体疫苗，其包含：

a)根据前述权利要求中任一项所述的灭活病毒组合物，和

b)佐剂，诸如氢氧化铝。

在某些此类实施方案中，本发明涉及一种包含灭活寨卡病毒的液体疫苗，其中液体疫苗中氯化钠的浓度为约50mM至约200mM、或约50mM至约150mM，诸如约84mM。在某些此类实施方案中，本发明涉及一种液体疫苗，其中液体疫苗包含约8.5mM至约80mM Tris和约50mM至约150mM NaCl，并且其中在室温下测量时，液体疫苗的pH为约pH 7.0至约pH 8.0。

在某些此类实施方案中，液体疫苗中Tris的浓度为约9mM至约80mM、或约9mM至约60mM、或9mM至约30mM、或约9mM至约11mM、或约10mM。

在某些实施方案中，本发明涉及一种液体疫苗，其中液体疫苗包含约0.4％(重量/体积)至4.7％(重量/体积)蔗糖。

在某些实施方案中，液体疫苗的渗透压为约300±50mOsm/kg。渗透压是遵循制造商的说明书并使用其校准和参考溶液，通过Advanced Instruments

多样品微量渗透压仪(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)中的凝固点降低来确定的。

佐剂

根据本发明的疫苗包含来自至少一种寨卡病毒的一种或多种抗原与一种或多种佐剂的组合。

实现疫苗佐剂作用的各种方法是已知的，并且可与本文公开的寨卡病毒疫苗结合使用。一般原则和方法在“The Theory and Practical Application of Adjuvants”,1995,Duncan E.S.Stewart-Tull(编),John Wiley&Sons Ltd,ISBN 0-471-95170-6，并且还在“Vaccines:New Generation Immunological Adjuvants”,1995,Gregoriadis G等人(编),Plenum Press,New York,ISBN 0-306-45283-9中详细说明。

示例性佐剂可包括但不限于铝盐、磷酸钙、toll样受体(TLR)激动剂、单磷酰脂质A(MLA)、MLA衍生物、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡核苷酸、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳剂(油乳剂)、壳聚糖、维生素D、硬脂酰或十八烷基酪氨酸、病毒体、脂质卷、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。在一些实施方案中，佐剂为铝盐。

在一些实施方案中，佐剂包括明矾(诸如氢氧化铝)、磷酸铝、羟基氧化铝、氢氧化铝、沉淀氢氧化铝、硫酸铝钾和凝胶状氢氧化铝(例如像Alhydrogel 85)中的至少一种。在下文中，药学上可接受的形式，特别是用作佐剂的羟基氧化铝、氢氧化铝和沉淀和/或凝胶状氢氧化铝，也统称为“氢氧化铝”。在一些实施方案中，已发现本公开的铝盐佐剂增加本公开的寨卡病毒疫苗的抗原的吸附。因此，在一些实施方案中，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％的抗原被吸附到铝盐佐剂。

本公开的某些实施方案包括一种用于制备佐剂化寨卡病毒疫苗的方法，其涉及(a)将疫苗与铝盐佐剂混合，其中疫苗包含来自本文所述的至少一种寨卡病毒的一种或多种抗原，以及(b)将混合物在合适的条件下孵育约1小时至约24小时(例如，约16小时至约24小时)范围内的一段时间，其中至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％的抗原吸附到铝盐佐剂。在所述方法的某些实施方案中，至少一种寨卡病毒是包含非人细胞适应突变(例如，蛋白质NS1中的非人细胞适应突变，诸如Trp98Gly突变)的寨卡病毒。在一些实施方案中，至少一种寨卡病毒是在SEQ ID NO:1的位置98处或在与SEQ ID NO:1的位置98对应的位置处包含Trp98Gly突变的纯化的灭活全寨卡病毒，其中寨卡病毒衍生自毒株PRVABC59。在一些实施方案中，寨卡病毒是在SEQ ID NO:1的位置98处或在与SEQ ID NO:1的位置98对应的位置处包含Trp98Gly突变的纯化的灭活全寨卡病毒，其中寨卡病毒衍生自毒株PRVABC59，其包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列。

不希望受任何理论束缚，将寨卡病毒抗原(灭活全寨卡病毒)吸附到铝盐(例如像氢氧化铝/明矾)可增强寨卡病毒抗原的稳定性。

在某些优选的实施方案中，佐剂为氢氧化铝。

在某些实施方案中，本发明涉及一种液体疫苗，其包含基于元素铝的100μg/ml至800μg/ml氢氧化铝、或200μg/ml至600μg/ml氢氧化铝、或300μg/ml至500μg/ml氢氧化铝、或约400μg/ml氢氧化铝。

在某些此类实施方案中，本发明涉及一种液体疫苗，其中液体疫苗包含约8.5mM至约50mM Tris和约50mM至约150mM NaCl以及基于元素铝，约300μg/ml至约500μg/ml氢氧化铝，并且其中在室温下测量时，液体疫苗的pH为约pH 7.0至约pH 8.0。

剂量

在某些实施方案中，本发明涉及一种单位剂量的根据本发明的液体疫苗。

在某些此类实施方案中，单位剂量的液体疫苗包含剂量约1μg至约15μg的灭活全寨卡病毒。在某些此类实施方案中，单位剂量的疫苗包含剂量约2μg灭活全寨卡病毒。在某些此类实施方案中，单位剂量的疫苗包含剂量约5μg的灭活全寨卡病毒。在某些此类实施方案中，单位剂量的疫苗包含剂量约10μg的灭活全寨卡病毒。

在某些实施方案中，单位剂量的疫苗以约0.4mL至约0.8mL药学上可接受的液体的形式提供。

在某些此类实施方案中，单位剂量的液体疫苗包含基于元素铝的约100μg至约300μg氢氧化铝，诸如约200μg氢氧化铝。如技术人员所熟知的，短语“基于元素铝”是指指定疫苗制剂的铝含量的方式。不同量的水和复杂化学计量的(水合)氢氧化铝、羟基氧化铝和相关铝化合物需要标准化方式来指示组合物的铝含量。为此，通常给出以“元素铝”表示的铝离子量。因此，例如，称为含有“基于元素铝的100μg/ml氢氧化铝”的组合物(或者，通常以简写形式出现，称为含有“100μg/ml氢氧化铝”的组合物)含有100μg/ml铝离子。

治疗方法

在某些实施方案中，本发明涉及一种治疗或预防，特别是预防有需要的人受试者的寨卡病毒感染的方法，其包括向受试者施用单位剂量的根据本发明的疫苗。

在某些实施方案中，本发明涉及一种治疗或预防，特别是预防有需要的人受试者群体的寨卡病毒感染的方法，其包括向所述人受试者群体的个体人受试者施用单位剂量的根据本发明的疫苗。

在某些实施方案中，本发明涉及一种单位剂量的根据本发明的疫苗，其用于治疗或预防，特别是预防有需要的人受试者的寨卡病毒感染。

在某些实施方案中，本发明涉及单位剂量的根据本发明的疫苗在制造用于预防有需要的人受试者的寨卡病毒感染的药物中的用途。

在一些实施方案中，本公开涉及用于通过向受试者施用治疗有效量的根据本发明的疫苗来诱导有需要的受试者的对寨卡病毒的免疫应答的方法。在一些实施方案中，施用步骤诱导受试者的对寨卡病毒的保护性免疫应答。

在某些此类实施方案中，受试者为女性受试者。在一些实施方案中，受试者怀孕或打算怀孕。

本公开的方法包括施用治疗有效量或免疫原性量的本公开的寨卡病毒疫苗。治疗有效量或免疫原性量可为本公开的疫苗诱导其所施用的未感染、感染或未暴露受试者的保护性免疫应答的量。此种应答通常导致受试者对疫苗的分泌、细胞和/或抗体介导的免疫应答的发展。通常，此种应答包括但不限于以下效应中的一种或多种：产生任何免疫类别的抗体，诸如免疫球蛋白A、D、E、G或M；B和T淋巴细胞的增殖；向免疫细胞提供活化、生长和分化信号；辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞的扩增。

优选地，治疗有效量或免疫原性量足以引起疾病症状的治疗或预防。所需的确切数量将根据以下而变化：所治疗的受试者；待治疗受试者的年龄和一般状况；受试者免疫系统合成抗体的能力；所需的保护程度；所治疗病状的严重程度；选择的特定寨卡病毒抗原及其施用方式等。适当的治疗有效量或免疫原性量可由本领域技术人员容易地确定。治疗有效量或免疫原性量将在可通过常规试验确定的相对广泛的范围内下降。

通常，本公开的疫苗被制备为注射用液体溶液或悬浮液。

疫苗可常规地通过注射(例如，皮下、经皮、皮内、真皮下或肌内注射)来肠胃外施用。适用于其他施用方式的另外的制剂包括栓剂，并且在一些情况下包括口服、经口、鼻内、经颊、舌下、腹膜内、阴道内、肛门和颅内制剂。对于栓剂，传统粘合剂和载剂可包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酯；此类栓剂可由含有0.5％至10％或甚至1％至2％范围内的活性成分的混合物形成。在某些实施方案中，首先熔融低熔点蜡，诸如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物，并且例如通过搅拌将本文所述的寨卡病毒疫苗均匀分散。然后将熔融的均匀混合物倒入合适大小的模具中并使其冷却并固化。

本公开的疫苗可以与剂量制剂相容的方式并且以将为治疗有效和免疫原性的量施用。施用的量取决于待治疗的受试者，包括例如个体免疫系统产生免疫应答的能力和所需的保护程度。合适的剂量范围可包括例如约0.1μg至约100μg纯化的灭活全寨卡病毒。

初始施用和加强注射的合适方案也可变，但是典型地在初始施用之后进行后续接种或其他施用。

疫苗的制造方法

在某些实施方案中，本发明还涉及一种制备液体疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1.提供根据本发明的灭活病毒组合物，

步骤2.向灭活病毒组合物中添加佐剂(优选铝盐)和任选地另一种药学上可接受的缓冲液体。

在某些此类实施方案中，在步骤2中，另一种药学上可接受的缓冲液体包含与灭活病毒组合物中具有最高浓度的缓冲液相同的缓冲液。

在某些实施方案中，本发明涉及一种可通过上述方法获得的产品。

实施例

包括以下实施例以展示如权利要求中所述的本发明的某些方面和实施方案。然而，本领域技术人员应理解，以下描述仅是示例性的，并且不应以任何方式被视为对本发明的限制。

实施例1：克隆寨卡病毒毒株的产生

此实施例描述了具有已知研究历史的寨卡病毒(ZIKAV)毒株的生产。

材料和方法

Vero细胞维持

将一小瓶WHO Vero 10-87细胞在水浴中快速解冻，并且在36℃+/2℃、5％CO₂下将其直接接种到T-75cm²烧瓶中含有青霉素-链霉素、40mM L-谷氨酰胺和10％FBS的19mL预热DMEM(达尔伯克改良的最低必需培养基)中。使细胞生长至汇合，并使用TryplE进行继代培养。将此烧瓶扩大至两个T-185cm²烧瓶，生长至汇合并继代培养至31xT-185cm²烧瓶并生长直至细胞达到100％汇合。通过胰蛋白酶消化收获细胞，以800x g离心10分钟，并以1.9×10⁷个细胞/mL的浓度重悬于含有10％FBS和10％DMSO的DMEM中。将一小瓶Vero细胞如上所述快速解冻并复苏到T-75cm²烧瓶中。将这些细胞继代培养两次以在13x T-185cm²烧瓶中产生细胞库。胰蛋白酶消化后，将细胞以800x g离心并以4.68×10⁵个细胞/mL的浓度重悬于冷冻培养基(含有10％FBS和10％DMSO的DMEM)中。将此细胞库分装到冷冻小瓶中。

Vero细胞在含有青霉素-链霉素、L-谷氨酰胺和10％FBS的DM EM(cDMEM-10％-FBS)中生长和维持。使用TryplExpress维持和胰蛋白酶化细胞。在病毒吸附前两天，以4×10⁵至5×10⁵个细胞/孔接种于6孔板中的3mL cDMEM-10％-FBS中，或以7×10⁵个细胞接种于T-25cm²烧瓶中的5mL cDMEM-10％-FBS中，或以1×10⁴个细胞/孔接种于96孔板中的0.1mLcDMEM-10％-FBS中。每天对培养箱进行监测，以维持指示温度。将Vero细胞系储存在液氮中。

噬斑测定

病毒滴度通过在6孔板中生长的Vero细胞的新鲜汇合单层中的噬斑滴定来确定。将冷冻的等分试样解冻，并在96孔板中的cDMEM-0％-FBS中对等分试样进行10倍系列稀释。将稀释的病毒维持在冰上，之后接种Vero细胞单层。在测定时，从6孔板中吸出生长培养基，并将100μL的每种病毒稀释液添加到孔中。病毒在36℃±2℃、5％CO₂下吸附60min，并频繁(每10min)摇动板以防止细胞片干燥。在病毒吸附后，将维持在40℃至41℃下的4mL第一琼脂糖覆盖液(1X cDMEM-2％-FBS+0.8％琼脂糖)添加到每个孔中。使琼脂糖在室温下固化30min，然后将板在36℃+/2℃、5％CO₂下倒置培养4至6天。在第4天添加含有160μg/mL中性红活体染料的2mL第二琼脂糖覆盖液。在第5天和第6天可视化噬斑。

通过TCID50测定进行病毒定量

病毒滴度也通过在96孔板中生长的Vero细胞的新鲜汇合单层中的滴定来确定。将冷冻的等分试样解冻，并在96孔板中的cDMEM-2％-FBS稀释剂中对等分试样进行10倍系列稀释。将稀释的病毒维持在冰上，之后接种Vero细胞单层。在测定时，从96孔板中吸出生长培养基，并将100μL的每种病毒稀释液添加到孔中。将板在36℃+/2℃、5％CO₂下孵育5天。使用Reed/Muench计算器计算50％组织培养感染剂量(TCID50)滴度。

测试物品

寨卡病毒毒株PRVABC59(干冰上的一个0.5mL小瓶)是从疾病控制和预防中心(CDC)收到的。寨卡病毒鉴定通过RT-PCR确认。通过PCR测试的毒株呈α病毒和支原体污染阴性。此信息总结于表1中。

表1：PRVABC59毒株信息

测序

根据制造商的方案，使用QIAampViral RNA Mini Spin试剂盒从每个分离株的稳定病毒收获物中提取RNA。从每个分离株中提取的RNA用于创建和扩增包含整个寨卡病毒基因组的6个cDNA片段。在1％琼脂糖/TBE凝胶上分析扩增的cDNA片段的大小和纯度，并随后使Qiagen Quick凝胶回收试剂盒进行凝胶纯化。使用ABI 3130XL Genetic Analyzer测序仪进行自动测序反应。使用Lasergene SeqMan软件分析测序数据。

结果

寻找与美洲当前的ZIKAV爆发相关的具有已知研究历史的ZIKAV毒株。为此，选择了ZIKAV毒株PRVABC59。为了产生适合Vero细胞生长的良好表征的病毒，首先使ZIKAVPRVABC59在Vero细胞中扩增(P1)。

在4mL cDMEM-0％-FBS中以0.01的MOI感染100％汇合的Vero细胞的烧瓶(T-175cm²)。在36℃±2℃、5％CO₂下将病毒吸附到单层持续60分钟，然后在36℃±2℃、5％CO₂下施加20mL cDMEM-0％-FBS以用于病毒扩增。接种后每天监测细胞层的细胞病变效应(CPE)(图1)。96小时后通过收集培养基并通过离心(600x g，4℃，10min)进行澄清来收获上清液。通过添加海藻糖至最终浓度18％重量/体积来稳定收获物。将大部分分装到0.5mL冷冻小瓶中并储存在-80℃下。

通过TCID50测定来分析稳定的P1收获物在Vero细胞单层上感染性病毒的存在。从第0小时开始，通过每天取等分试样来监测生长动力学。在第72小时达到峰值滴度(图2)。

通过在Vero细胞的6孔单层上滴定第3天的收获物来对P1材料进行噬斑纯化。在第6天可视化噬斑，并且通过在塑料板底部的明显且独立的噬斑周围画圆圈来鉴别待分离的10个噬斑。通过使用无菌宽口移液管提取琼脂糖块，同时刮孔底并用cDMEM-10％-FBS冲洗来挑选噬斑。将琼脂糖块添加到0.5mL cDMEM-10％-FBS中，涡旋，标记为PRVABC59 P2a-j并在36℃±2℃、5％CO₂的培养箱中放置过夜。

对三个噬斑(PRVABC59 P2a-c)进行另外的纯化。将每个分离株一式两份整齐地铺板到新鲜的Vero细胞的6孔单层上。对此P2/P3转变进行噬斑纯化，并标记为PRVABC59 P3a-j。

对六个噬斑(PRVABC59 P3a-f)进行最后一轮纯化。将每个分离株一式两份整齐地铺板到新鲜的Vero细胞的6孔单层上。对此P3/P4转变进行噬斑纯化，并标记为PRVABC59P4a-j。

将来自P4噬斑纯化的六个噬斑(PRVABC59 P4a-f)在T-25cm²烧瓶中的Vero细胞单层上盲传代。将挑选的每个噬斑在2mL cDMEM-0％-FBS中稀释，1mL在36℃±2℃、5％CO₂下吸附1小时；另外1mL用海藻糖(最终18％体积/体积)稳定并储存在<-60℃下。病毒吸附后，将cDMEM-0％-FBS添加到每个烧瓶中，并使其在36℃±2℃、5％CO₂下生长4天。收获病毒上清液，通过离心(600x g，4C，10min)澄清，在18％海藻糖中稳定并等分且储存在<-60℃下。通过TCID50测试此P5种子的寨卡病毒效力(图3)。

在4mL cDMEM-0％-FBS中以0.01的MOI用六个PRVABC59克隆(P5a-f)中的每一个感染T-175cm²烧瓶的Vero细胞的汇合单层。使病毒在36℃+/2℃、5％CO₂下吸附60分钟，然后将20mL cDMEM-0％-FBS添加到每个烧瓶中并使其在36℃+/2℃、5％CO₂下生长。每天监测Vero细胞单层健康和CPE。如所示在第3天和第5天收获病毒(图4)。汇集第3天和第5天的P6毒株收获物，用18％海藻糖稳定，分装并储存在<-60℃下。

测试了六个PRVABC59克隆(P6a-f)中的每一个的寨卡病毒体外效力(图5)。效力通过两种不同的方法确定，TCID50和噬斑滴定。TCID50是通过目视检查CPE(显微镜)并通过测量显示CPE(黄色)的孔与红色(无CPE)的孔的吸光度差异(A560-A420)来计算的。在读板器上读取板，并将其应用于与显微镜读取板(吸光度)相同的计算器。两种评分技术之间的TCID50值非常相似，而通过噬斑滴定获得的值较低。

P6病毒的产生和表征的总结在下表2中示出。

表2：用于产生克隆ZIKAV毒株的病毒传代和表征的总结

寻找了与原始分离株的包膜糖蛋白序列非常相似的分离的寨卡病毒克隆，因为黄病毒的包膜蛋白是病毒的优势免疫原性部分。PRVABC59克隆P6a、P6c、p6d和P6f在包膜区中的核苷酸990处含有G→T突变(G990T)，导致在包膜残基330处的Val→Leu氨基酸突变，而PRVABC59克隆P6b和P6e的包膜基因相对于参考毒株(GenBank参考KU501215.1)是相同的(表3和图6)。

表3：PRVABC59 P6克隆的测序

然后对在寨卡包膜序列中缺乏突变的两个克隆进行全基因组测序。上表3总结了测序结果。序列分析显示两个克隆在NS1区中的核苷酸292处的T→G取代，导致NS1残基98处的Trp→Gly突变。此突变后来也通过深度测序得到确认。NS1 W98G突变位于ZIKAV NS1侧翼结构域的交织环中，这与膜结合、与包膜蛋白的相互作用和潜在的六聚体NS1形成有关。虽然其他色氨酸残基(W115、W118)在黄病毒中高度保守，但W98不是(图7)。然而，有趣的是，在11种不同的ZIKAV毒株(包括来自非洲和亚洲谱系的毒株)中观察到W98残基的100％保守。每个毒株中鉴定的突变总结于表4中。

表4：PRVABC59 P6克隆中鉴定的突变的总结

对ZIKAV PRVABC59 P6储备液进行表型分析，以表征ZIKAV克隆。如在图8中示出和在图9中定量的，与具有大噬斑和小噬斑的混合群体的P1病毒相比，每个克隆分离株由相对均匀的大型噬斑群体组成。这些数据表明单个ZIKAV克隆的成功分离。

接下来，分析了ZIKAV PRVABC59 P6克隆的Vero细胞中的生长动力学分析。在无血清生长培养基中，Vero细胞以每个ZIKAV P6克隆的0.01TCID50/个细胞感染。每天采集病毒上清液样品，并同时通过TCID50测定来测定感染滴度。对于所有P6克隆，峰值滴度出现在第3天和第4天之间(～9.0log₁₀ TCID50/mL)。各种P6克隆的生长动力学没有显著差异(图10)。

综上所述，结果表明成功产生了寨卡病毒种子。这种种子选择需要了解病毒的生长历史、动力学、产量、基因型和表型。重要的是，对寨卡病毒毒株的克隆分离允许成功地从污染因子(例如，可能在亲本人分离株中的偶然性因子)中纯化病毒。有趣的是，三次连续的噬斑纯化成功地快速选择了Vero细胞适应的病毒(毒株P6a-f)，其中这些毒株能够在无血清Vero细胞培养物中很好地复制，其中毒株P6a、c、d和f在病毒包膜蛋白中携带突变，而毒株p6b和p6e在病毒NS1蛋白中获得突变(病毒包膜没有任何修饰)。另外，Vero适应的毒株能够有效且可再现地生长和制造由这些毒株繁殖的后续病毒传代。不希望受理论束缚，在毒株P6a、c、d和f中观察到的Env-V330L突变可能是体外适应的结果，因为在Vero细胞中传代时也观察到了Env330处的突变(Weger-Lucarelli等人2017.Journal of Virology)。因为包膜蛋白是寨卡病毒的优势免疫原性表位，所以在Env中含有Vero适应性突变的毒株可能对疫苗免疫原性产生负面影响。不希望受理论束缚，蛋白质NS1中的适应突变似乎不仅增强病毒复制，而且还可减少或以其他方式抑制不希望的突变的发生，诸如在寨卡病毒的包膜蛋白E(Env)中的突变。另外，可已知NS1在病毒的生命周期中与包膜蛋白结合。此种突变(NS1 W98G)可能与改变NS1在下游加工期间与病毒结合并可能共纯化的能力有关。也已知NS1具有免疫原性，并且可能与对疫苗的免疫应答有关。

实施例2：确定灭活有效性的灭活完全性测定

开发了也称为灭活完全性(COI)测定的双重感染性测定，以确定甲醛灭活(0.01％甲醛)的有效性和纯化的灭活寨卡病毒(PIZV)散装原料药(BDS)的潜在残留感染性病毒活性。

样品制备：通过在Vero细胞中生长制造了如上所述的克隆e的四个纯化的灭活寨卡疫苗(PIZV)批次(Tox批次1-4)。通过色谱法纯化来自4份每天收获物的上清液(总计约4000mL)，之后添加甲醛至最终浓度为0.01％重量/体积。使灭活在22℃下进行10天。在灭活期间，每天从散装原料药(BDS)中取出中间过程控制(IPC)样品，以进行表征和分析。将每天IPC样品用焦亚硫酸钠中和，并透析到DMEM(病毒生长培养基)中。样品含有纯化的灭活寨卡病毒。在灭活的最后一天，未中和剩余体积的BDS样品，而是用TFF处理以去除甲醛，并将缓冲液交换到PBS中。

灭活完全性测定(COI)：COI测定用于分析每天IPC样品中灭活的有效性，以了解灭活动力学和最终BDS。为了最大灵敏度，此测定中最初使用两种细胞系Vero和C6/36来检测IPC和DS样品中的潜在活病毒。当寨卡病毒在含有酚红的生长培养基存在的情况下感染Vero细胞时，细胞死亡的副产物导致pH下降。因此，培养基颜色从红色/粉红色变为黄色，指示培养基pH的这种酸性偏移。此现象是由细胞凋亡和细胞病变效应(CPE)引起的，所述细胞病变效应是指在病毒复制期间观察到的由病毒入侵、感染和细胞出芽引起的宿主细胞的细胞结构的变化。最终，虽然C6/36蚊子细胞和Vero细胞均为允许感染的细胞系，但寨卡病毒感染在体外只杀死Vero细胞。因此，将Vero细胞用作测定的指示细胞系。相比之下，衍生自寨卡病毒的天然宿主载体的C6/36细胞在寨卡感染时不表现出CPE，并且不裂解。培养基的颜色不变，并且C6/36细胞的活力不改变。

因此，测定分为两部分：测定的第一部分允许在两个易感细胞系的96孔板上平行扩增潜在的活病毒颗粒6天。测定的第二步涉及将96孔板的上清液(包括潜在的扩增颗粒)转移到含有Vero细胞单层的6孔板上，并且再孵育8天以允许病毒感染和细胞病变效应在Vero细胞上发展。使用光学显微镜确认观察到的任何CPE。

虽然关于在测定的第一部分(即在C6/36细胞中的培养)中96孔板的使用和在测定的第二部分(即观察细胞吞噬效应的Vero细胞的培养)中6孔板的使用进行了详细描述，但是可容易地放大测定，如下表5所示。

显而易见的是，在放大期间，部分1的每cm²容器的样品体积保持恒定，并且在部分2中保持相同的病毒感染条件。

COI测定对照：此测定的滴度和反滴定对照使用Vero指示细胞进行，并以TCID5096孔格式进行评分，其中基于由于细胞死亡的替代或CPE的存在，培养基颜色从粉红色变为黄色，将孔评分为阳性。

病毒滴度对照测试：在含有2％FBS的培养基中对已知滴度的对照病毒(PRVABC59)的两个独立重复进行10倍系列稀释，并将100μL的每种稀释液添加到含有Vero细胞的96孔板的四个孔中。将板孵育5天，然后记录含有CPE的孔并使用Reed-Meunch计算器计算病毒滴度。

病毒反滴定对照测试：将已知滴度的对照病毒系列稀释至200TCID50。在含有2％FBS的培养基中对200TCID50对照病毒的两个独立重复进行2倍系列稀释，并将100μL的每种稀释液添加到含有Vero细胞的96孔板的四个孔中。将细胞孵育5天，然后记录含有CPE的孔并使用Reed-Meunch计算器计算病毒滴度。

详细的COI方案：

1.测定的第一部分：在添加样品前两天，将Vero(1.4E+05个细胞/mL)和埃及伊蚊C6/36(4E+05个细胞/mL)细胞接种在96孔板中。将Vero细胞在37℃下于DMEM+10％最终FBS+2％L-谷氨酰胺+1％青霉素/链霉素中培养。将C6/36细胞在28℃下于DMEM+10％FBS+2％L-谷氨酰胺+1％青霉素/链霉素+1％非必需氨基酸中培养。

2.将200TCID50对照病毒(在病毒反滴定对照测试中制备)或DS样品的三个独立重复稀释(5倍和10倍稀释)到含有2％FBS的培养基中。

3.用样品接种96孔板中的细胞。在感染96孔板中的细胞单层之前，涡旋样品以破坏任何可能的聚集。将100μL的每种稀释液应用于分别含有Vero和C6/36细胞的两个单独的96孔板中的5个孔中的每个中。

4.对于每种细胞类型，将单独培养基包括在另一个孔中作为阴性CPE对照。

5.在细胞系的适当温度下将板孵育6天。

6.测定的第二部分：为了使活病毒在允许的细胞系上进一步扩增并通过CPE可视化，将来自Vero和C6/36细胞的每个96孔上清液的全部体积转移到Vero细胞的6孔板的各个孔中。接种进行90分钟，其中每隔15分钟摇动一次。

7.将含有2％FBS的培养基添加到孔中，并将板再孵育8天，以便随后检测随CPE变化的扩增样品。如果DS的重复中的任一个在第8天结束时显示CPE，则认为灭活不完全。

7.通过在转移到6孔板后，在易感细胞单层上形成噬斑或CPE，并且孵育8天以允许病毒复制，来将活/复制病毒粒子的存在可视化。测定结束时，6孔板中的％CPE评分计算如下：

通过将比色变化可视化来检查Vero细胞的每个6孔板的CPE，之后通过在倒置光学显微镜下检查来确认CPE。

每个6孔板代表上述5倍和10倍稀释液中制备的DS稀释液的重复之一(5个孔，加上仅含有培养基的一个孔)。

因此，每个重复的％CPE反映了每个样品5个总孔中具有CPE的孔数(每次测定使用120个总孔)。平均％CPE和标准偏差是基于每种稀释液的三个重复计算的。

结果：如下表6至表9所示，在Tox批次号1-4中的每个中分析每天样品。

表6：灭活动力学，Tox批次号1

表7：灭活动力学，Tox批次号2

表8：灭活动力学，Tox批次号3

表9：灭活动力学，Tox批次号4

灭活数据的汇编动力学：将来自四个毒理学批次的样品的COI数据与如上所述确定的感染效力(TCID50)和RNA拷贝进行比较。RNA拷贝是通过从样品中纯化核酸并使用RT-PCR试剂盒用血清型特异性引物扩增寨卡RNA来确定的。图11所示的结果示出COI测定的灵敏度显著高于TCID50的灵敏度。

COI测定的性能特征-准确度：使用目标稀释液(TCID50/孔)及其相应的CPE比例确定相对准确度。对于Vero细胞，观察到的和预期的阳性CPE比例之间存在统计学上显著的线性关系。与观察到的和预期的结果相关的直线斜率为0.92，其中95％置信区间(CI)为0.83至1.01，重叠1指示100％准确度。对于C6/36细胞，观察到的和预期的阳性CPE比例之间存在统计学上显著的线性关系。与观察到的和预期的结果相关的直线斜率为0.88，其中95％置信区间(CI)为0.80至0.95，这指示此细胞系存在轻微偏差(5％至20％)。两种细胞系均表现出令人满意的准确度(相对)。

COI测定的性能特征-检测限(LoD)：评估了C6/36至Vero和Vero至Vero板的测定灵敏度。如上所述，使用每个总孔观察到的+ve CPE比例的最小二乘回归法对数据进行拟合，所述孔用从10,00TCID50/孔开始降至较低滴度0.08TCID50铺板的滴度稀释液铺板。此外，板内包括每种稀释液的阴性对照(0.00TCID50/孔)。对C6/36至Vero和Vero至Vero板上的每种稀释液进行CPE评分。可看出CPE与log输入病毒滴度之间的明确关系。这显示了CPE阳性孔的比例相对于TCID50/孔的log₁₀浓度连同99％置信下限和上限之间的逻辑(S形)关系。在-2log₁₀浓度(＝0.01TCID50/孔)下，基于并考虑定量数据中所有固定和随机来源变异的模型预测0.85％，或当在0.01TCID50/孔下四舍五入时预测0.01，其中99％置信下限为0.42％。由于99％置信下限不包括零，所以0.85％CPE孔产生于0TCID50/孔(即，由于噪音)的概率非常小(<1％)。这确立测定的检测限为至少0.01TCID50/孔(即，样品中可检测到的活寨卡颗粒的最低量)。也就是说，当上舍入时，60个孔中有1个孔将为CPE阳性，或者鉴于这些参数，可在60个孔中检测到的CPE+ve的最低理论比例为1.67％或0.0167。

比较了细胞类型(C363和Vero)的相对灵敏度，其中C6/36证明与Vero细胞相比，可检测到病毒滴度的较低稀释液，如图12所示；在相同的病毒输入水平(0.31TCID50)下，C6/36细胞的CPE阳性孔比例高于Vero细胞。

在此测定的鉴定期间使用的最低病毒输入值为0.02TCID50(-1.61log TCID50)。使用C6/36细胞的拟合曲线，这样得到0.035或3.5％的孔评分为CPE阳性(28个孔中有1个)。如果将曲线外推至最低实际水平0.167或1.6％，则这相当于病毒输入水平为0.015TCID50(-1.82log TCID50)。然而，在确定可检测到的最低感染性病毒水平时，需要考虑传播测定变异的影响，如+ve CPE结果中所反映的那样。此噪音是由输入病毒的工作储备液的产生引起的。目标TCID50和反滴定计算的比较显示，当储备液TCID50/mL浓度目标为200时，工作储备液病毒的TCID50表现出标准偏差(SD)85TCID50/mL，由平均值213得出。％CV计算为约40％，其中偏差为约+7％。将此噪音考虑到逻辑回归模型中，以在病毒稀释液的目标值周围生成置信区间。在目标值0.01TCID50/孔下，基于并考虑两个位置的定量数据中所有固定和随机变异来源的模型预测，0.86％的孔将为CPE阳性(60个孔中有1个)。由于99％置信下限不包括零，所以0.85％CPE阳性孔产生于0TCID50/孔(由于噪音)的概率非常小(<1％)(图13)。这为测定确立了检测限：0.01TCID50/孔是样品中可检测到的活寨卡病毒颗粒的最低量。

COI测定的性能特征-范围：测定的范围是0.01TCID50/孔至4.5TCID50/孔，并定义为导致CPE+ve比例评分大于0％但小于100％的输入病毒范围。

结论：对四个Tox批次的分析表明，在室温下于0.01％甲醛中孵育10天后，灭活完成。如通过COI测定所测量的，在生产的所有批次中，在第3天至第4天实现灭活。COI测定比TCID50效力或RNA测量更灵敏；通过LoD也观察到了灵敏度的提高。

实施例3：灭活病毒组合物的配制

在实施例3中，术语“寨卡病毒疫苗原料药”用于指作为寨卡疫苗生产中的中间体的灭活病毒组合物。

设备

表10：实施例3中所使用的材料

在实验部分中提到水时，意指电阻率为18MΩ的MilliQ水。

所使用的缓冲液及其缩写列于表11中。

表11：实施例3中所使用的缓冲液

缓冲液	缩写	pH
			寨卡磷酸盐缓冲液	ZPB	7.4
6.46mM磷酸二钠
			1.47mM磷酸氢二钾
137mM NaCl
			Tris缓冲液<sup>1</sup>	Tris	7.6
10mM三(羟甲基)氨基甲烷碱
			20mM NaCl
组氨酸缓冲液<sup>1</sup>	His	7.0
			20mM组氨酸
20mM NaCl
			Tris缓冲盐水	TBS	7.6
50mM三(羟甲基)氨基甲烷碱
			150mM NaCl

¹当不以另外方式指定时，Tris+蔗糖和His+蔗糖是指Tris或组氨酸缓冲液中的7％重量/体积蔗糖溶液。

按需要，用HCl或NaOH将缓冲液全部滴定至正确的pH。

寨卡疫苗原料药的制造

纯化的灭活寨卡疫苗原料药是如上所述通过在Vero细胞中生长来制造的。在第3天至第9天进行每天收获，并在纯化和灭活前汇集这些每天收获物。通过过滤和色谱法纯化来自每天收获物的上清液，对其进行浓缩并通过添加甲醛至最终浓度0.01％进行灭活。使灭活在22℃下进行10天，之后用焦亚硫酸钠中和样品，然后将缓冲液交换到寨卡磷酸盐缓冲液(6.46mM磷酸二钠，1.47mM磷酸氢二钾，137mM NaCl，6％蔗糖，pH 7.4)中。

缓冲液交换

一旦制造，将寨卡病毒疫苗原料药在+5℃±3℃/环境湿度下储存长达6个月。

然后使用切向流过滤(TFF)将寨卡病毒疫苗原料药缓冲液交换到每个实施例中使用的适当缓冲液(如表11中所列)中，如下所述。使用表12中列出的设备进行切向流过滤：缓冲液交换过程在室温约25℃下进行。

表12：缓冲液交换程序的材料和设备

使用以下程序进行切向流过滤(TFF)：

设置：根据制造商的说明书(KR2i/KMPi TFF Systems product information andoperating instructions 2016，http://spectrumlabs.com/lit/400-12355-000rev02.pdf)设置KR2i TFF系统。这涉及将TFF柱(M icroKros中空纤维过滤模块(mPES/100kD)Spectrum Labs C02-E100-05-N)连接到TFF系统。然后用50mL至150mL水洗涤柱，并随后用大约100mL的适当缓冲液进行平衡。在洗涤和平衡步骤期间，将流速保持在25mL/min左右，并且使总压在任何时候都不超过18psi.。

浓度：最初，将5mL至40mL样品(寨卡病毒疫苗原料药)添加到样品贮存器中，并以2倍进行浓缩。

渗滤：浓缩后，进行渗滤。渗滤是同时稀释和过滤寨卡病毒疫苗原料药样品的行为。稀释增加样品的体积，而过滤减少样品的体积。

通过启动辅助泵(用于渗滤)并使用足以在渗滤期间维持样品体积的流速(即约0.5mL/min至1.5mL/min)来进行渗滤。压力始终使用背压控制阀手动控制。压力保持在14psi.至18psi.之间，使用的剪切力不多于5000，通量在66至72之间，流速(主泵)在25mL/min至28mL/min之间，并且辅助流速(辅助泵)在0.5mL/min与1mL/min之间。辅助泵控制稀释速率。手动调整此速率以匹配过滤速率(以便净样品体积在此步骤期间不改变)。过滤速率是复杂的，因为它由许多因素(主泵的流速、跨膜压力、柱堵塞程度等)决定，并且速率在整个运行过程中发生变化；因此，通过手动调节辅助泵流速来控制样品的体积。

为了确保完全渗滤，交换至少10个渗滤体积(diavolume)的适当(新)缓冲液(通过渗透物的累积质量测量)。在本实施例中，进行了定容渗滤(连续渗滤)。这涉及在过滤过程中通过以与去除滤液相同的速率添加新缓冲液来保持原料药(渗余物)的体积恒定。渗滤体积(diavolume)交换的数量可使用以下等式来计算：

其中，原料药(渗余物)的体积在整个过程中保持恒定。

渗滤过程提供了寨卡病毒疫苗原料药(DS)的样品，其已被缓冲液交换到表11中列出的缓冲液中。

样品回收和储存：在一些情况下，样品在渗滤后进一步浓缩(最多大约10次)。这是通过关闭辅助泵并继续过滤(即保持主泵打开)来进行的。为了在渗滤过程结束时回收样品，将进料和再循环管线升高到高于样品水平，并且反转泵的流动以收集残余体积(通常为约1mL至3mL)。随后对TFF后的最终产品(缓冲液交换的寨卡病毒疫苗原料药)进行适当的确认测定，诸如pH测定、渗透压和SEC。

然后将缓冲液交换后的寨卡病毒疫苗原料药(DS)在+5℃±3℃/环境湿度下储存长达5天，之后进行稳定性测试。

稳定性测试程序

在每项研究开始时(实施例3A至3F)，将缓冲液交换后的寨卡病毒疫苗原料药(DS)样品等分到单独的3mL小瓶中，其中每个小瓶含有在相应缓冲液中的大约0.67mL寨卡病毒疫苗原料药(DS)。然后用ETFE层压塞密封小瓶。

在研究开始时(第0天/冻融循环0)，然后立即使用尺寸排阻色谱法(SEC，如下所述)对每种不同的缓冲液的单个样品(对应于一个等分试样)进行测试，以确定峰面积(并因此，以μg/mL为单位的蛋白质的量)。

在每项研究开始时，将足够的每个相应缓冲液的寨卡病毒疫苗原料药(DS)小瓶放置在+5℃±3℃，环境湿度以及-80℃，环境湿度下。对于测量的每个时间点和温度条件，制备单独的小瓶。

储存在-80℃下的样品在-80℃的室中冷冻。由于0.67mL填充体积，样品被相对较快地冷冻，但未在液氮中“速冻”。

尺寸排阻色谱法(SEC)程序

用使用单个柱的尺寸排阻色谱法(SEC)进行稳定性分析。尺寸排阻色谱法是用于基于蛋白质的分子量来分离蛋白质的技术。蛋白质样品的分子量越大，其洗脱时间越短。看到完整寨卡病毒在SEC迹线中的峰，其保留时间为约8分钟。通过将此峰的积分与参考样品的积分(在第零天)进行比较，可以确定储存一段时间后样品中仍然存在多少完整寨卡病毒。

此外，通过注意是否在更早的保留时间出现任何进一步的峰，可以确定寨卡病毒是否已聚集。

用于尺寸排阻色谱法(SEC)的设备和材料详述于下表13中。

表13：用于SEC的设备

使用以下详述的程序进行尺寸排阻色谱法(SEC)。

标准品和测试样品的制备

BSA参考标准：通过用水稀释BSA储备溶液制备浓度为200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL和1,000μg/mL的牛血清白蛋白(BSA)参考样品，所述储备溶液具有明确定义的浓度2mg/mL。然后将每个参考样品的等分试样转移到标记的HPLC小瓶中并封盖。以下实施例3A至3F中给出的所有蛋白质浓度均基于基于BSA标准曲线的寨卡病毒浓度。

SEC样品的制备：在测试的每个特定时间点，在+5℃±3℃或-80℃下从储存中取出所需的3mL小瓶。将在-80℃下冷冻的样品在室温下解冻。然后通过将至少400μL每个测试样品从适当的3mL小瓶转移到标记的HPLC小瓶中并封盖小瓶来制备SEC样品。然后将HPLC小瓶放入HPLC自动进样器托盘中。将HPLC自动进样器托盘在5℃±3℃下冷却，确保所有SEC样品在进行SEC之前已冷却至5℃±3℃。

测量：每个SEC测量涉及使用自动进样器/自动注射器将每个样品的100μL等分试样注入SEC柱中。

用于从SEC色谱图确定寨卡蛋白浓度的计算

对于每次SEC运行，制作牛血清白蛋白(BSA)的标准曲线，运行200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL和1,000μg/mL浓度的标准品并准备标准曲线(线性回归，y＝mx+b，其中b＝0)。BSA总峰面积计算为BSA的单体和二聚体峰面积的总和。

此标准曲线用于测定寨卡病毒疫苗原料药(DS)的浓度(根据BSA的浓度，以μg/mL为单位)。

然后相对于在第0天对每个样品进行的测量(将其取为100％值)，将浓度值归一化。

寨卡病毒疫苗原料药(DS)峰面积被确定为在SEC色谱图中保留时间大约8分钟后洗脱的整个峰。通过连接峰前和峰后约8分钟的基线来进行峰拟合。这包括主峰和以较短保留时间洗脱的任何其他肩峰(即在峰的左侧)。保留时间显著更长的峰或肩峰不包括在积分中，因为这些峰可能对应于降解或变性的寨卡病毒蛋白。

寨卡病毒疫苗原料药(DS)的浓度测定：基于BSA校准曲线计算寨卡病毒疫苗原料药(DS)的总质量。寨卡病毒疫苗原料药(DS)浓度以μg/mL为单位报告，并且通过将从校准曲线获得的质量除以0.1mL计算(参见等式1)。

每个实施例给出的结果均为同一样品的两次重复SEC读数的平均值。

实施例3A

实施例3A中样品的制备如上所述进行。制备寨卡病毒疫苗原料药，然后将缓冲液交换到下表14a和表14b中列出的每个相应缓冲液中。在实施例3A中，在5℃±3℃和-80℃下进行10天的稳定性测试。

表14a和表14b显示了在0天和10天后针对多种不同缓冲液中的寨卡病毒疫苗原料药样品进行SEC的结果。第10天SEC峰面积为第0天峰面积的百分比，这些实验的结果以百分比形式给出。

表14a：实施例3A在5℃±3℃下的SEC结果

表14b：实施例3A在-80℃下的SEC结果

实施例3B

实施例3B中样品的制备如上所述进行。制备寨卡病毒疫苗原料药，然后将其缓冲液交换到下表中列出的每个相应缓冲液中。在实施例3B中，在-80℃下进行60天的稳定性测试。

表15显示了在0天和60天后针对多种不同缓冲液中的寨卡病毒疫苗原料药样品进行SEC的结果。第60天SEC峰面积为第0天峰面积的百分比，这些实验的结果以百分比形式给出。

表15：实施例3B在-80℃下的SEC结果

实施例3C

实施例3C中样品的制备如上所述进行。制备寨卡病毒疫苗原料药，然后将其缓冲液交换到下表中列出的每个相应缓冲液中。在实施例3C中，在5℃±3℃和-80℃下进行67天的稳定性测试。

表16a和表16b显示了在0天和67天后针对多种不同缓冲液中的寨卡病毒疫苗原料药样品进行SEC的结果。基于第67天SEC峰面积为第0天峰面积的百分比，这些实验的结果以百分比形式给出。

表16a：实施例3C在5℃±3℃下的SEC结果

表16b：实施例3C在-80℃下的SEC结果

另外，图14和图15显示了在-80℃下储存在Tris+7％蔗糖缓冲液和ZPB缓冲液中67天的寨卡病毒疫苗原料药的SEC色谱图。对于Tris+7％蔗糖缓冲液中的原料药(图14)，第67天的峰形与第0天的峰形非常相似。相比之下，对于ZPB中的原料药(图15)，在第67天，色谱曲线偏移，特别是主峰的大小减小，并且肩峰的大小增加(即，肩峰在约7.5分钟处从基线升起)，这表明聚集。

实施例3D

实施例3D中样品的制备如上所述进行。制备寨卡病毒疫苗原料药样品，然后将其缓冲液交换到Tris和ZPB缓冲液(如上表11所列)中。在实施例3D中，在-80℃下进行3个月的稳定性测试。

此研究的结果示出于图19中。

实施例3E

实施例3E中样品的制备如上所述进行。制备寨卡病毒疫苗原料药，然后将其缓冲液交换到下表中列出的每个相应缓冲液中。在实施例3E中，在5℃±3℃下进行60天的稳定性测试。

表17显示了1天、3天、8天、15天、30天和60天后针对ZPB和TBS中的寨卡病毒疫苗原料药样品进行SEC的结果。基于第1天、第3天、第8天、第15天、第30天和第60天SEC峰面积为第0天峰面积的百分比，这些实验的结果以百分比形式给出。

表17：实施例3E在5℃±3℃下的SEC结果

实施例3F

实施例3F中样品的制备如上所述进行。制备寨卡病毒疫苗原料药，然后将其缓冲液交换到Tris缓冲液中。随后将蔗糖添加到样品中(以获得总浓度分别为3％重量/体积、5％重量/体积、7％重量/体积和10％重量/体积的样品)。

表18显示了在0、1、2、3和4次冻融循环后进行的SEC的结果。

在单独的小瓶中制备一盘样品。每个冻融循环涉及通过在室温(25℃)下解冻来使托盘(含有所有样品)升温至室温。在每次冻融循环后，取每个条件下的单个小瓶以用于分析。

基于1至4次冻融循环之前和之后的SEC峰面积，结果以百分比形式给出。

表18：多次冻融循环的SEC柱结果

序列表

<110> 武田疫苗股份有限公司(Takeda Vaccines, Inc.)

<120> 灭活病毒组合物和寨卡疫苗制剂

<130> 743505

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 351

<212> PRT

<213> 寨卡病毒(Zika virus)

<400> 1

Asp Val Gly Cys Ser Val Asp Phe Ser Lys Lys Glu Thr Arg Cys Gly

1 5 10 15

Thr Gly Val Phe Val Tyr Asn Asp Val Glu Ala Trp Arg Asp Arg Tyr

20 25 30

Lys Tyr His Pro Asp Ser Pro Arg Arg Leu Ala Ala Ala Val Lys Gln

35 40 45

Ala Trp Glu Asp Gly Ile Cys Gly Ile Ser Ser Val Ser Arg Met Glu

50 55 60

Asn Ile Met Trp Arg Ser Val Glu Gly Glu Leu Asn Ala Ile Leu Glu

65 70 75 80

Glu Asn Gly Val Gln Leu Thr Val Val Val Gly Ser Val Lys Asn Pro

85 90 95

Met Trp Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro Val Asn Glu Leu Pro

100 105 110

His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser Tyr Phe Val Arg Ala Ala Lys

115 120 125

Thr Asn Asn Ser Phe Val Val Asp Gly Asp Thr Leu Lys Glu Cys Pro

130 135 140

Leu Lys His Arg Ala Trp Asn Ser Phe Leu Val Glu Asp His Gly Phe

145 150 155 160

Gly Val Phe His Thr Ser Val Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr Ser

165 170 175

Leu Glu Cys Asp Pro Ala Val Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly Lys Glu

180 185 190

Ala Val His Ser Asp Leu Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Asp

195 200 205

Thr Trp Arg Leu Lys Arg Ala His Leu Ile Glu Met Lys Thr Cys Glu

210 215 220

Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Thr Asp Gly Ile Glu Glu Ser Asp

225 230 235 240

Leu Ile Ile Pro Lys Ser Leu Ala Gly Pro Leu Ser His His Asn Thr

245 250 255

Arg Glu Gly Tyr Arg Thr Gln Met Lys Gly Pro Trp His Ser Glu Glu

260 265 270

Leu Glu Ile Arg Phe Glu Glu Cys Pro Gly Thr Lys Val His Val Glu

275 280 285

Glu Thr Cys Gly Thr Arg Gly Pro Ser Leu Arg Ser Thr Thr Ala Ser

290 295 300

Gly Arg Val Ile Glu Glu Trp Cys Cys Arg Glu Cys Thr Met Pro Pro

305 310 315 320

Leu Ser Phe Arg Ala Lys Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg

325 330 335

Pro Arg Lys Glu Pro Glu Ser Asn Leu Val Arg Ser Met Val Thr

340 345 350

<210> 2

<211> 10675

<212> DNA

<213> 寨卡病毒(Zika virus)

<400> 2

gttgttgatc tgtgtgaatc agactgcgac agttcgagtt tgaagcgaaa gctagcaaca 60

gtatcaacag gttttatttt ggatttggaa acgagagttt ctggtcatga aaaacccaaa 120

aaagaaatcc ggaggattcc ggattgtcaa tatgctaaaa cgcggagtag cccgtgtgag 180

cccctttggg ggcttgaaga ggctgccagc cggacttctg ctgggtcatg ggcccatcag 240

gatggtcttg gcgattctag cctttttgag attcacggca atcaagccat cactgggtct 300

catcaataga tggggttcag tggggaaaaa agaggctatg gaaacaataa agaagttcaa 360

gaaagatctg gctgccatgc tgagaataat caatgctagg aaggagaaga agagacgagg 420

cgcagatact agtgtcggaa ttgttggcct cctgctgacc acagctatgg cagcggaggt 480

cactagacgt gggagtgcat actatatgta cttggacaga aacgatgctg gggaggccat 540

atcttttcca accacattgg ggatgaataa gtgttatata cagatcatgg atcttggaca 600

catgtgtgat gccaccatga gctatgaatg ccctatgctg gatgaggggg tggaaccaga 660

tgacgtcgat tgttggtgca acacgacgtc aacttgggtt gtgtacggaa cctgccatca 720

caaaaaaggt gaagcacgga gatctagaag agctgtgacg ctcccctccc attccaccag 780

gaagctgcaa acgcggtcgc aaacctggtt ggaatcaaga gaatacacaa agcacttgat 840

tagagtcgaa aattggatat tcaggaaccc tggcttcgcg ttagcagcag ctgccatcgc 900

ttggcttttg ggaagctcaa cgagccaaaa agtcatatac ttggtcatga tactgctgat 960

tgccccggca tacagcatca ggtgcatagg agtcagcaat agggactttg tggaaggtat 1020

gtcaggtggg acttgggttg atgttgtctt ggaacatgga ggttgtgtca ccgtaatggc 1080

acaggacaaa ccgactgtcg acatagagct ggttacaaca acagtcagca acatggcgga 1140

ggtaagatcc tactgctatg aggcatcaat atcagacatg gcttctgaca gccgctgccc 1200

aacacaaggt gaagcctacc ttgacaagca atcagacact caatatgtct gcaaaagaac 1260

gttagtggac agaggctggg gaaatggatg tggacttttt ggcaaaggga gcctggtgac 1320

atgcgctaag tttgcatgct ccaagaaaat gaccgggaag agcatccagc cagagaatct 1380

ggagtaccgg ataatgctgt cagttcatgg ctcccagcac agtgggatga tcgttaatga 1440

cacaggacat gaaactgatg agaatagagc gaaagttgag ataacgccca attcaccgag 1500

agccgaagcc accctggggg gttttggaag cctaggactt gattgtgaac cgaggacagg 1560

ccttgacttt tcagatttgt attacttgac tatgaataac aagcactggt tggttcacaa 1620

ggagtggttc cacgacattc cattaccttg gcacgctggg gcagacaccg gaactccaca 1680

ctggaacaac aaagaagcac tggtagagtt caaggacgca catgccaaaa ggcaaactgt 1740

cgtggttcta gggagtcaag aaggagcagt tcacacggcc cttgctggag ctctggaggc 1800

tgagatggat ggtgcaaagg gaaggctgtc ctctggccac ttgaaatgtc gcctgaaaat 1860

ggataaactt agattgaagg gcgtgtcata ctccttgtgt actgcagcgt tcacattcac 1920

caagatcccg gctgaaacac tgcacgggac agtcacagtg gaggtacagt acgcagggac 1980

agatggacct tgcaaggttc cagctcagat ggcggtggac atgcaaactc tgaccccagt 2040

tgggaggttg ataaccgcta accccgtaat cactgaaagc actgagaact ctaagatgat 2100

gctggaactt gatccaccat ttggggactc ttacattgtc ataggagtcg gggagaagaa 2160

gatcacccac cactggcaca ggagtggcag caccattgga aaagcatttg aagccactgt 2220

gagaggtgcc aagagaatgg cagtcttggg agacacagcc tgggactttg gatcagttgg 2280

aggcgctctc aactcattgg gcaagggcat ccatcaaatt tttggagcag ctttcaaatc 2340

attgtttgga ggaatgtcct ggttctcaca aattctcatt ggaacgttgc tgatgtggtt 2400

gggtctgaac acaaagaatg gatctatttc ccttatgtgc ttggccttag ggggagtgtt 2460

gatcttctta tccacagccg tctctgctga tgtggggtgc tcggtggact tctcaaagaa 2520

ggagacgaga tgcggtacag gggtgttcgt ctataacgac gttgaagcct ggagggacag 2580

gtacaagtac catcctgact ccccccgtag attggcagca gcagtcaagc aagcctggga 2640

agatggtatc tgcgggatct cctctgtttc aagaatggaa aacatcatgt ggagatcagt 2700

agaaggggag ctcaacgcaa tcctggaaga gaatggagtt caactgacgg tcgttgtggg 2760

atctgtaaaa aaccccatgt ggagaggtcc acagagattg cccgtgcctg tgaacgagct 2820

gccccacggc tggaaggctt gggggaaatc gtatttcgtc agagcagcaa agacaaataa 2880

cagctttgtc gtggatggtg acacactgaa ggaatgccca ctcaaacata gagcatggaa 2940

cagctttctt gtggaggatc atgggttcgg ggtatttcac actagtgtct ggctcaaggt 3000

tagagaagat tattcattag agtgtgatcc agccgttatt ggaacagctg ttaagggaaa 3060

ggaggctgta cacagtgatc taggctactg gattgagagt gagaagaatg acacatggag 3120

gctgaagagg gcccatctga tcgagatgaa aacatgtgaa tggccaaagt cccacacatt 3180

gtggacagat ggaatagaag agagtgatct gatcataccc aagtctttag ctgggccact 3240

cagccatcac aataccagag agggctacag gacccaaatg aaagggccat ggcacagtga 3300

agagcttgaa attcggtttg aggaatgccc aggcactaag gtccacgtgg aggaaacatg 3360

tggaacaaga ggaccatctc tgagatcaac cactgcaagc ggaagggtga tcgaggaatg 3420

gtgctgcagg gagtgcacaa tgcccccact gtcgttccgg gctaaagatg gctgttggta 3480

tggaatggag ataaggccca ggaaagaacc agaaagcaac ttagtaaggt caatggtgac 3540

tgcaggatca actgatcaca tggaccactt ctcccttgga gtgcttgtga tcctgctcat 3600

ggtgcaggaa gggctgaaga agagaatgac cacaaagatc atcataagca catcaatggc 3660

agtgctggta gctatgatcc tgggaggatt ttcaatgagt gacctggcta agcttgcaat 3720

tttgatgggt gccaccttcg cggaaatgaa cactggagga gatgtagctc atctggcgct 3780

gatagcggca ttcaaagtca gaccagcgtt gctggtatct ttcatcttca gagctaattg 3840

gacaccccgt gaaagcatgc tgctggcctt ggcctcgtgt cttttgcaaa ctgcgatctc 3900

cgccttggaa ggcgacctga tggttctcat caatggtttt gctttggcct ggttggcaat 3960

acgagcgatg gttgttccac gcactgataa catcaccttg gcaatcctgg ctgctctgac 4020

accactggcc cggggcacac tgcttgtggc gtggagagca ggccttgcta cttgcggggg 4080

gtttatgctc ctctctctga agggaaaagg cagtgtgaag aagaacttac catttgtcat 4140

ggccctggga ctaaccgctg tgaggctggt cgaccccatc aacgtggtgg gactgctgtt 4200

gctcacaagg agtgggaagc ggagctggcc ccctagcgaa gtactcacag ctgttggcct 4260

gatatgcgca ttggctggag ggttcgccaa ggcagatata gagatggctg ggcccatggc 4320

cgcggtcggt ctgctaattg tcagttacgt ggtctcagga aagagtgtgg acatgtacat 4380

tgaaagagca ggtgacatca catgggaaaa agatgcggaa gtcactggaa acagtccccg 4440

gctcgatgtg gcgctagatg agagtggtga tttctccctg gtggaggatg acggtccccc 4500

catgagagag atcatactca aggtggtcct gatgaccatc tgtggcatga acccaatagc 4560

catacccttt gcagctggag cgtggtacgt atacgtgaag actggaaaaa ggagtggtgc 4620

tctatgggat gtgcctgctc ccaaggaagt aaaaaagggg gagaccacag atggagtgta 4680

cagagtaatg actcgtagac tgctaggttc aacacaagtt ggagtgggag ttatgcaaga 4740

gggggtcttt cacactatgt ggcacgtcac aaaaggatcc gcgctgagaa gcggtgaagg 4800

gagacttgat ccatactggg gagatgtcaa gcaggatctg gtgtcatact gtggtccatg 4860

gaagctagat gccgcctggg atgggcacag cgaggtgcag ctcttggccg tgccccccgg 4920

agagagagcg aggaacatcc agactctgcc cggaatattt aagacaaagg atggggacat 4980

tggagcggtt gcgctggatt acccagcagg aacttcagga tctccaatcc tagacaagtg 5040

tgggagagtg ataggacttt atggcaatgg ggtcgtgatc aaaaacggga gttatgttag 5100

tgccatcacc caagggagga gggaggaaga gactcctgtt gagtgcttcg agccctcgat 5160

gctgaagaag aagcagctaa ctgtcttaga cttgcatcct ggagctggga aaaccaggag 5220

agttcttcct gaaatagtcc gtgaagccat aaaaacaaga ctccgtactg tgatcttagc 5280

tccaaccagg gttgtcgctg ctgaaatgga ggaggccctt agagggcttc cagtgcgtta 5340

tatgacaaca gcagtcaatg tcacccactc tggaacagaa atcgtcgact taatgtgcca 5400

tgccaccttc acttcacgtc tactacagcc aatcagagtc cccaactata atctgtatat 5460

tatggatgag gcccacttca cagatccctc aagtatagca gcaagaggat acatttcaac 5520

aagggttgag atgggcgagg cggctgccat cttcatgacc gccacgccac caggaacccg 5580

tgacgcattt ccggactcca actcaccaat tatggacacc gaagtggaag tcccagagag 5640

agcctggagc tcaggctttg attgggtgac ggatcattct ggaaaaacag tttggtttgt 5700

tccaagcgtg aggaacggca atgagatcgc agcttgtctg acaaaggctg gaaaacgggt 5760

catacagctc agcagaaaga cttttgagac agagttccag aaaacaaaac atcaagagtg 5820

ggactttgtc gtgacaactg acatttcaga gatgggcgcc aactttaaag ctgaccgtgt 5880

catagattcc aggagatgcc taaagccggt catacttgat ggcgagagag tcattctggc 5940

tggacccatg cctgtcacac atgccagcgc tgcccagagg agggggcgca taggcaggaa 6000

tcccaacaaa cctggagatg agtatctgta tggaggtggg tgcgcagaga ctgacgaaga 6060

ccatgcacac tggcttgaag caagaatgct ccttgacaat atttacctcc aagatggcct 6120

catagcctcg ctctatcgac ctgaggccga caaagtagca gccattgagg gagagttcaa 6180

gcttaggacg gagcaaagga agacctttgt ggaactcatg aaaagaggag atcttcctgt 6240

ttggctggcc tatcaggttg catctgccgg aataacctac acagatagaa gatggtgctt 6300

tgatggcacg accaacaaca ccataatgga agacagtgtg ccggcagagg tgtggaccag 6360

acacggagag aaaagagtgc tcaaaccgag gtggatggac gccagagttt gttcagatca 6420

tgcggccctg aagtcattca aggagtttgc cgctgggaaa agaggagcgg cttttggagt 6480

gatggaagcc ctgggaacac tgccaggaca catgacagag agattccagg aagccattga 6540

caacctcgct gtgctcatgc gggcagagac tggaagcagg ccttacaaag ccgcggcggc 6600

ccaattgccg gagaccctag agaccataat gcttttgggg ttgctgggaa cagtctcgct 6660

gggaatcttc ttcgtcttga tgaggaacaa gggcataggg aagatgggct ttggaatggt 6720

gactcttggg gccagcgcat ggctcatgtg gctctcggaa attgagccag ccagaattgc 6780

atgtgtcctc attgttgtgt tcctattgct ggtggtgctc atacctgagc cagaaaagca 6840

aagatctccc caggacaacc aaatggcaat catcatcatg gtagcagtag gtcttctggg 6900

cttgattacc gccaatgaac tcggatggtt ggagagaaca aagagtgacc taagccatct 6960

aatgggaagg agagaggagg gggcaaccat aggattctca atggacattg acctgcggcc 7020

agcctcagct tgggccatct atgctgcctt gacaactttc attaccccag ccgtccaaca 7080

tgcagtgacc acctcataca acaactactc cttaatggcg atggccacgc aagctggagt 7140

gttgtttggc atgggcaaag ggatgccatt ctacgcatgg gactttggag tcccgctgct 7200

aatgataggt tgctactcac aattaacacc cctgacccta atagtggcca tcattttgct 7260

cgtggcgcac tacatgtact tgatcccagg gctgcaggca gcagctgcgc gtgctgccca 7320

gaagagaacg gcagctggca tcatgaagaa ccctgttgtg gatggaatag tggtgactga 7380

cattgacaca atgacaattg acccccaagt ggagaaaaag atgggacagg tgctactcat 7440

agcagtagcc gtctccagcg ccatactgtc gcggaccgcc tgggggtggg gggaggctgg 7500

ggctctgatc acagccgcaa cttccacttt gtgggaaggc tctccgaaca agtactggaa 7560

ctcctctaca gccacttcac tgtgtaacat ttttagggga agttacttgg ctggagcttc 7620

tctaatctac acagtaacaa gaaacgctgg cttggtcaag agacgtgggg gtggaacagg 7680

agagaccctg ggagagaaat ggaaggcccg cttgaaccag atgtcggccc tggagttcta 7740

ctcctacaaa aagtcaggca tcaccgaggt gtgcagagaa gaggcccgcc gcgccctcaa 7800

ggacggtgtg gcaacgggag gccatgctgt gtcccgagga agtgcaaagc tgagatggtt 7860

ggtggagcgg ggatacctgc agccctatgg aaaggtcatt gatcttggat gtggcagagg 7920

gggctggagt tactacgtcg ccaccatccg caaagttcaa gaagtgaaag gatacacaaa 7980

aggaggccct ggtcatgaag aacccgtgtt ggtgcaaagc tatgggtgga acatagtccg 8040

tcttaagagt ggggtggacg tctttcatat ggcggctgag ccgtgtgaca cgttgctgtg 8100

tgacataggt gagtcatcat ctagtcctga agtggaagaa gcacggacgc tcagagtcct 8160

ctccatggtg ggggattggc ttgaaaaaag accaggagcc ttttgtataa aagtgttgtg 8220

cccatacacc agcactatga tggaaaccct ggagcgactg cagcgtaggt atgggggagg 8280

actggtcaga gtgccactct cccgcaactc tacacatgag atgtactggg tctctggagc 8340

gaaaagcaac accataaaaa gtgtgtccac cacgagccag ctcctcttgg ggcgcatgga 8400

cgggcctagg aggccagtga aatatgagga ggatgtgaat ctcggctctg gcacgcgggc 8460

tgtggtaagc tgcgctgaag ctcccaacat gaagatcatt ggtaaccgca ttgaaaggat 8520

ccgcagtgag cacgcggaaa cgtggttctt tgacgagaac cacccatata ggacatgggc 8580

ttaccatgga agctatgagg cccccacaca agggtcagcg tcctctctaa taaacggggt 8640

tgtcaggctc ctgtcaaaac cctgggatgt ggtgactgga gtcacaggaa tagccatgac 8700

cgacaccaca ccgtatggtc agcaaagagt tttcaaggaa aaagtggaca ctagggtgcc 8760

agacccccaa gaaggcactc gtcaggttat gagcatggtc tcttcctggt tgtggaaaga 8820

gctaggcaaa cacaaacggc cacgagtctg caccaaagaa gagttcatca acaaggttcg 8880

tagcaatgca gcattagggg caatatttga agaggaaaaa gagtggaaga ctgcagtgga 8940

agctgtgaac gatccaaggt tctgggctct agtggacaag gaaagagagc accacctgag 9000

aggagagtgc cagagctgtg tgtacaacat gatgggaaaa agagaaaaga aacaagggga 9060

atttggaaag gccaagggca gccgcgccat ctggtatatg tggctagggg ctagatttct 9120

agagttcgaa gcccttggat tcttgaacga ggatcactgg atggggagag agaactcagg 9180

aggtggtgtt gaagggctgg gattacaaag actcggatat gtcctagaag agatgagtcg 9240

tataccagga ggaaggatgt atgcagatga cactgctggc tgggacaccc gcattagcag 9300

gtttgatctg gagaatgaag ctctaatcac caaccaaatg gagaaagggc acagggcctt 9360

ggcattggcc ataatcaagt acacatacca aaacaaagtg gtaaaggtcc ttagaccagc 9420

tgaaaaaggg aaaacagtta tggacattat ttcgagacaa gaccaaaggg ggagcggaca 9480

agttgtcact tacgctctta acacatttac caacctagtg gtgcaactca ttcggaatat 9540

ggaggctgag gaagttctag agatgcaaga cttgtggctg ctgcggaggt cagagaaagt 9600

gaccaactgg ttgcagagca acggatggga taggctcaaa cgaatggcag tcagtggaga 9660

tgattgcgtt gtgaagccaa ttgatgatag gtttgcacat gccctcaggt tcttgaatga 9720

tatgggaaaa gttaggaagg acacacaaga gtggaaaccc tcaactggat gggacaactg 9780

ggaagaagtt ccgttttgct cccaccactt caacaagctc catctcaagg acgggaggtc 9840

cattgtggtt ccctgccgcc accaagatga actgattggc cgggcccgcg tctctccagg 9900

ggcgggatgg agcatccggg agactgcttg cctagcaaaa tcatatgcgc aaatgtggca 9960

gctcctttat ttccacagaa gggacctccg actgatggcc aatgccattt gttcatctgt 10020

gccagttgac tgggttccaa ctgggagaac tacctggtca atccatggaa agggagaatg 10080

gatgaccact gaagacatgc ttgtggtgtg gaacagagtg tggattgagg agaacgacca 10140

catggaagac aagaccccag ttacgaaatg gacagacatt ccctatttgg gaaaaaggga 10200

agacttgtgg tgtggatctc tcatagggca cagaccgcgc accacctggg ctgagaacat 10260

taaaaacaca gtcaacatgg tgcgcaggat cataggtgat gaagaaaagt acatggacta 10320

cctatccacc caagttcgct acttgggtga agaagggtct acacctggag tgctgtaagc 10380

accaatctta atgttgtcag gcctgctagt cagccacagc ttggggaaag ctgtgcagcc 10440

tgtgaccccc ccaggagaag ctgggaaacc aagcctatag tcaggccgag aacgccatgg 10500

cacggaagaa gccatgctgc ctgtgagccc ctcagaggac actgagtcaa aaaaccccac 10560

gcgcttggag gcgcaggatg ggaaaagaag gtggcgacct tccccaccct tcaatctggg 10620

gcctgaactg gagatcagct gtggatctcc agaagaggga ctagtggtta gagga 10675

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工(artificial)

<220>

<223> 寡核苷酸1 (CpG 1826)

<400> 3

tccatgacgt tcctgacgtt 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工(artificial)

<220>

<223> 寡核苷酸2 (CpG 1758)

<400> 4

tctcccagcg tgcgccat 18

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工(artificial)

<220>

<223> 寡核苷酸3

<400> 5

accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工(artificial)

<220>

<223> 寡核苷酸4 (CpG 2006)

<400> 6

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工(artificial)

<220>

<223> 寡核苷酸5 (CpG 1668)

<400> 7

tccatgacgt tcctgatgct 20

<210> 8

<211> 31

<212> PRT

<213> 寨卡病毒(Zika virus)

<400> 8

Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu

1 5 10 15

Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln

20 25 30

<210> 9

<211> 31

<212> PRT

<213> 寨卡病毒(Zika virus)

<400> 9

Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu

1 5 10 15

Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln

20 25 30

<210> 10

<211> 31

<212> PRT

<213> 西尼罗河病毒(West Nile Virus)

<400> 10

Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Leu Glu

1 5 10 15

Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile Ser

20 25 30

<210> 11

<211> 31

<212> PRT

<213> 日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)

<400> 11

Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu

1 5 10 15

Leu Thr Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Val

20 25 30

<210> 12

<211> 31

<212> PRT

<213> 圣路易斯脑炎病毒(Saint Louis Encephalitis Virus)

<400> 12

Phe Ser Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Ile Val Glu

1 5 10 15

Leu Gln Tyr Thr Gly Ser Asn Gly Pro Cys Arg Val Pro Ile Ser

20 25 30

<210> 13

<211> 30

<212> PRT

<213> 黄热病病毒(Yellow Fever Virus)

<400> 13

Phe Val Lys Asn Pro Thr Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Met Gln

1 5 10 15

Val Lys Val Ser Lys Gly Ala Pro Cys Arg Ile Pro Val Ile

20 25 30

<210> 14

<211> 31

<212> PRT

<213> 登革热病毒(Dengue virus)

<400> 14

Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln

1 5 10 15

Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser

20 25 30

<210> 15

<211> 31

<212> PRT

<213> 登革热病毒(Dengue virus)

<400> 15

Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg

1 5 10 15

Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu

20 25 30

<210> 16

<211> 31

<212> PRT

<213> 登革热病毒(Dengue virus)

<400> 16

Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile Lys

1 5 10 15

Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser

20 25 30

<210> 17

<211> 31

<212> PRT

<213> 登革热病毒(Dengue virus)

<400> 17

Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys

1 5 10 15

Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu

20 25 30

<210> 18

<211> 29

<212> PRT

<213> 寨卡病毒(Zika virus)

<400> 18

Ser Val Lys Asn Pro Met Gly Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro

1 5 10 15

Val Asn Glu Leu Pro His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys

20 25

<210> 19

<211> 29

<212> PRT

<213> 寨卡病毒(Zika virus)

<400> 19

Ser Val Lys Asn Pro Met Trp Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro

1 5 10 15

Val Asn Glu Leu Pro His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys

20 25

<210> 20

<211> 29

<212> PRT

<213> 西尼罗河病毒(West Nile Virus)

<400> 20

Lys Gln Glu Gly Met Tyr Lys Ser Ala Pro Lys Arg Leu Thr Ala Thr

1 5 10 15

Thr Glu Lys Leu Glu Ile Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys

20 25

<210> 21

<211> 29

<212> PRT

<213> 日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)

<400> 21

Lys Pro Val Gly Arg Tyr Arg Ser Ala Pro Lys Arg Leu Ser Met Thr

1 5 10 15

Gln Glu Lys Phe Glu Met Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys

20 25

<210> 22

<211> 29

<212> PRT

<213> 圣路易斯脑炎病毒(Saint Louis Encephalitis Virus)

<400> 22

Glu Asp Pro Lys Tyr Tyr Lys Arg Ala Pro Arg Arg Leu Lys Lys Leu

1 5 10 15

Glu Asp Glu Leu Asn Tyr Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys

20 25

<210> 23

<211> 29

<212> PRT

<213> 黄热病病毒(Yellow Fever Virus)

<400> 23

Asp Pro Lys Asn Val Tyr Gln Arg Gly Thr His Pro Phe Ser Arg Ile

1 5 10 15

Arg Asp Gly Leu Gln Tyr Gly Trp Lys Thr Trp Gly Lys

20 25

<210> 24

<211> 29

<212> PRT

<213> 登革热病毒(Dengue virus)

<400> 24

Asp Val Ser Gly Ile Leu Ala Gln Gly Lys Lys Met Ile Arg Pro Gln

1 5 10 15

Pro Met Glu His Lys Tyr Ser Trp Lys Ser Trp Gly Lys

20 25

<210> 25

<211> 29

<212> PRT

<213> 登革热病毒(Dengue virus)

<400> 25

Asp Ile Lys Gly Ile Met Gln Ala Gly Lys Arg Ser Leu Arg Pro Gln

1 5 10 15

Pro Thr Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys

20 25

<210> 26

<211> 29

<212> PRT

<213> 登革热病毒(Dengue virus)

<400> 26

Asp Ile Thr Gly Val Leu Glu Gln Gly Lys Arg Thr Leu Thr Pro Gln

1 5 10 15

Pro Met Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys

20 25

<210> 27

<211> 29

<212> PRT

<213> 登革热病毒(Dengue virus)

<400> 27

Asp Val Lys Gly Val Leu Thr Lys Gly Lys Arg Ala Leu Thr Pro Pro

1 5 10 15

Val Asn Asp Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys

20 25

Claims (69)

1.一种液体灭活病毒组合物，其包含：

a)灭活全寨卡病毒，

b)至少一种药学上可接受的缓冲液，其浓度为至少约6.5mM，和

c)任选地多元醇，

其中所述液体灭活病毒组合物优选不含选自铝盐的佐剂，并且

所述至少一种药学上可接受的缓冲液不包含磷酸根离子。

2.如权利要求1所述的液体灭活病毒组合物，其中所述液体灭活病毒组合物中磷酸根离子的浓度小于约7mM、或小于约6mM、或小于约5mM、或小于约4mM、或小于约3mM、或小于约2mM、或小于约1mM。

3.如权利要求1或2所述的液体灭活病毒组合物，其中所述液体灭活病毒组合物仅包含一种药学上可接受的缓冲液。

4.如权利要求1或2所述的液体灭活病毒组合物，其中所述液体灭活病毒组合物包含至少两种不同的药学上可接受的缓冲液，其中所述液体灭活病毒组合物中两种浓度最高的药学上可接受的缓冲液的摩尔比不在1:2至2:1之间、或不在1:5至5:1之间、或不在8:1至1:8之间、或不在10:1至1:10之间。

5.如前述权利要求中任一项所述的液体灭活病毒组合物，其中所述液体灭活病毒组合物中钾离子的浓度小于约4mM、或小于约3mM、或小于约2mM、或小于约1.5mM、或小于约0.5mM、或小于约0.1mM、或为约0mM。

6.如前述权利要求中任一项所述的液体灭活病毒组合物，其中所述液体灭活病毒组合物基本上不含或不含硫酸鱼精蛋白。

7.如前述权利要求中任一项所述的液体灭活病毒组合物，其中所述液体灭活病毒组合物的pH为约pH 6.0至约pH 9.0、或约pH 6.5至约pH 8.0、或约pH 6.8至约pH 7.8、或约pH7.6，如在室温下测定的。

8.如前述权利要求中任一项所述的液体灭活病毒组合物，其中所述药学上可接受的缓冲液的浓度为至少约7mM、或至少约7.5mM、或至少约8mM、或至少约8.5mM、或至少约9mM、或至少约10mM。

9.如权利要求8所述的液体灭活病毒组合物，其中所述药学上可接受的缓冲液的浓度为约7mM至约200mM、或约7.5mM至约200mM、或约8mM至约200mM、或约8.5mM至约200mM、或约9mM至约100mM、或约9mM至约60mM、或约10mM、或约20mM、或约50mM。

10.如前述权利要求中任一项所述的液体灭活病毒组合物，其中所述药学上可接受的缓冲液包含含氨基的分子。

11.如权利要求10所述的液体灭活病毒组合物，其中所述药学上可接受的缓冲液为Tris或组氨酸缓冲液。

12.如权利要求11所述的液体灭活病毒组合物，其中所述药学上可接受的缓冲液为Tris。

13.如前述权利要求中任一项所述的液体灭活病毒组合物，其中所述组合物还包含至少一种多元醇。

14.如权利要求13所述的液体灭活病毒组合物，其中所述液体灭活病毒组合物包含约1％重量/体积至约60％重量/体积所述多元醇、或约6％重量/体积至约50％重量/体积所述多元醇、或约6％重量/体积至约40％重量/体积所述多元醇、或约6％重量/体积至约35％重量/体积所述多元醇、或约6％重量/体积至约30％重量/体积所述多元醇、或约6％重量/体积至约25％重量/体积所述多元醇、或约6％重量/体积至约20％重量/体积所述多元醇、或约6％重量/体积至约15％重量/体积所述多元醇、或约6％重量/体积至约12％重量/体积所述多元醇、或约7％重量/体积所述多元醇、或约10％重量/体积所述多元醇。

15.如权利要求14所述的液体灭活病毒组合物，其中所述液体灭活病毒组合物包含：药学上可接受的缓冲液，其包含含氨基的分子；和约6％重量/体积至约15％重量/体积多元醇。

16.如权利要求15所述的液体灭活病毒组合物，其中所述液体灭活病毒组合物包含Tris和约6％重量/体积至约15％重量/体积多元醇。

17.如权利要求13至16中任一项所述的液体灭活病毒组合物，其中所述多元醇为糖。

18.如权利要求17所述的液体灭活病毒组合物，其中所述糖为二糖。

19.如权利要求18所述的液体灭活病毒组合物，其中所述二糖为非还原糖。

20.如权利要求19所述的液体灭活病毒组合物，其中所述非还原糖为蔗糖。

21.如权利要求20所述的液体灭活病毒组合物，其中所述液体灭活病毒组合物包含约5％重量/体积至约20％重量/体积蔗糖、或约6％重量/体积至约15％重量/体积蔗糖。

22.如权利要求21所述的液体灭活病毒组合物，其中所述液体灭活病毒组合物包含约6％重量/体积至约8％重量/体积蔗糖，例如约7％重量/体积蔗糖。

23.如权利要求21所述的液体灭活病毒组合物，其中所述液体灭活病毒组合物包含约8.5mM至约50mM Tris和约6％重量/体积至约15％重量/体积蔗糖，其中在室温下测量时，所述灭活病毒组合物的pH为约pH 7.0至约pH 8.0。

24.如权利要求13所述的液体灭活病毒组合物，其中所述多元醇为甘油。

25.如权利要求24所述的液体灭活病毒组合物，其中所述液体灭活病毒组合物包含约1％体积/体积至约60％体积/体积甘油、或约7％体积/体积至约15％体积/体积甘油、或约10％体积/体积甘油。

26.如权利要求25所述的液体灭活病毒组合物，其中所述灭活病毒组合物包含约8.5mM至约50mM Tris和约6％体积/体积至约15％体积/体积甘油，其中在室温下测量时，所述灭活病毒组合物的pH为约pH 7.0至约pH 8.0。

27.如前述权利要求中任一项所述的液体灭活病毒组合物，其中所述液体灭活病毒组合物还包含氯化钠。

28.如权利要求27所述的液体灭活病毒组合物，其中所述液体灭活病毒组合物中氯化钠的浓度为约5mM至约500mM氯化钠、或约10mM至约200mM氯化钠。

29.如权利要求28所述的液体灭活病毒组合物，其中所述液体灭活病毒组合物中氯化钠的浓度为约10mM至约40mM、或约10mM至约30mM，诸如约20mM。

30.如前述权利要求中任一项所述的液体灭活病毒组合物，其中所述液体灭活病毒组合物的离子强度低于约80mM、或低于约70mM、或低于约60mM、或低于约50mM、或低于约40mM、或低于约30mM。

31.如前述权利要求中任一项所述的液体灭活病毒组合物，其中所述寨卡病毒为非洲谱系病毒或亚洲谱系病毒。

32.如权利要求31所述的液体灭活病毒组合物，其中所述寨卡病毒为亚洲谱系病毒。

33.如权利要求32所述的液体灭活病毒组合物，其中所述寨卡病毒衍生自毒株PRVABC59。

34.如权利要求33所述的液体灭活病毒组合物，其中毒株PRVABC59包含根据SEQ IDNO:2的基因组序列。

35.如前述权利要求中任一项所述的液体灭活病毒组合物，其中所述寨卡病毒在SEQID NO:1的位置98处或在与SEQ ID NO:1的位置98对应的位置处具有突变。

36.如权利要求35所述的液体灭活病毒组合物，其中所述突变为SEQ ID NO:1中的Trp98Gly突变。

37.如前述权利要求中任一项所述的液体灭活病毒组合物，其中所述寨卡病毒不包含包膜蛋白(Env)中的突变。

38.如前述权利要求中任一项所述的液体灭活病毒组合物，其中编码所述包膜蛋白的序列与SEQ ID No.2中的对应序列相同，或其中所述包膜蛋白的序列显示出与SEQ ID No.2的序列至少99％同一性、或至少95％同一性、或至少90％同一性、或至少85％同一性。

39.如前述权利要求中任一项所述的液体灭活病毒组合物，其中所述寨卡病毒为至少85％纯，如通过尺寸排阻色谱法中纯化的寨卡病毒的主峰多于尺寸排阻色谱法中曲线下总面积的85％确定的。

40.如前述权利要求中任一项所述的液体灭活病毒组合物，其中所述寨卡病毒是化学灭活的。

41.如权利要求40所述的液体灭活病毒组合物，其中所述寨卡病毒用洗涤剂、甲醛、过氧化氢、β-丙内酯(BPL)、二元乙胺(BEI)、乙酰基乙烯亚胺、亚甲蓝和补骨脂素中的一种或多种灭活。

42.如权利要求41所述的液体灭活病毒组合物，其中所述寨卡病毒用甲醛灭活。

43.如权利要求42所述的液体灭活病毒组合物，其中所述寨卡病毒是可从以下方法获得的灭活全病毒，其中在约15℃至约37℃范围内的温度下用约0.001％重量/体积至约3.0％重量/体积范围内的量的甲醛处理所述寨卡病毒5至15天。

44.如权利要求43所述的液体灭活病毒组合物，其中所述寨卡病毒是可通过用0.005％重量/体积至0.02％重量/体积甲醛处理全活寨卡病毒获得的灭活全病毒。

45.如权利要求44所述的液体灭活病毒组合物，其中所述寨卡病毒是可通过用小于0.015％重量/体积甲醛处理全活寨卡病毒获得的灭活全病毒。

46.一种液体疫苗，其包含：

a)根据前述权利要求中任一项所述的灭活病毒组合物，和

b)佐剂，诸如氢氧化铝。

47.如权利要求46所述的液体疫苗，其中所述液体疫苗中氯化钠的浓度为约50mM至约200mM、或约60mM至约150mM，诸如约84mM。

48.如权利要求47所述的液体疫苗，其中所述液体疫苗包含约8.5mM至约80mM Tris和约60mM至约150mM NaCl，并且其中在室温下测量时，所述液体灭活病毒组合物的pH为约pH7.0至约pH 8.0。

49.如权利要求48所述的液体疫苗，其中所述液体疫苗包含约0.4％(重量/体积)至4.7％(重量/体积)蔗糖。

50.如权利要求49所述的液体疫苗，其包含基于元素铝的l00μg/ml至800μg/ml氢氧化铝、或200μg/ml至600μg/ml氢氧化铝、或300μg/ml至500μg/ml氢氧化铝、或约400μg/ml氢氧化铝。

51.一种单位剂量的如权利要求46至50中任一项所述的液体疫苗。

52.如权利要求51所述的单位剂量的疫苗，其包含约1μg至约15μg所述灭活全寨卡病毒。

53.如权利要求52所述的单位剂量的疫苗，其包含约2μg灭活全寨卡病毒。

54.如权利要求52所述的单位剂量的疫苗，其包含约5μg灭活全寨卡病毒。

55.如权利要求52所述的单位剂量的疫苗，其包含约10μg灭活全寨卡病毒。

56.如权利要求51至55中任一项所述的单位剂量的疫苗，其以约0.4mL至约0.8mL药学上可接受的液体的形式提供。

57.灭活病毒组合物的用途，所述灭活病毒组合物包含：

a)灭活全寨卡病毒，

b)至少一种药学上可接受的缓冲液，其浓度为至少约6.5mM，和

c)任选地多元醇，

其中所述灭活病毒组合物不含选自铝盐的佐剂，并且所述至少一种药学上可接受的缓冲液不包含磷酸根离子，

以用于稳定所述灭活全寨卡病毒。

58.如权利要求57所述的用途，用于在5℃±3℃下储存至少10天期间稳定所述灭活全寨卡病毒。

59.如权利要求57所述的用途，用于在-80℃下储存至少10天期间稳定所述灭活全寨卡病毒。

60.如权利要求59所述的用途，用于在-80℃下储存至少6个月期间稳定所述灭活全寨卡病毒。

61.如权利要求60所述的用途，用于在-80℃下储存至少12个月期间稳定所述灭活全寨卡病毒。

62.如权利要求57至61中任一项所述的用途，用于在诸如至少2个冻融循环或至少4个冻融循环的一个或多个冻融循环期间稳定所述灭活全寨卡病毒。

63.一种治疗或预防，特别是预防有需要的人受试者的寨卡病毒感染的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求51至56中任一项所述的单位剂量的疫苗。

64.如权利要求51至56中任一项所述的单位剂量的疫苗，其用于治疗或预防，特别是预防有需要的人受试者的寨卡病毒感染。

65.如权利要求51至56中任一项所述的单位剂量的疫苗在制造用于预防有需要的人受试者的寨卡病毒感染的药物中的用途。

66.一种制备液体灭活病毒组合物的方法，其包括：

a)灭活全寨卡病毒，

b)药学上可接受的缓冲液，其中所述缓冲液不是磷酸盐缓冲液，并且其中所述缓冲液的浓度为至少6.5mM；和

c)任选地多元醇；

其中所述灭活病毒组合物优选不含选自铝盐的佐剂；所述方法包括以下步骤：

步骤1.从一种或多种非人细胞获得的上清液中分离寨卡病毒制备剂，

步骤2.纯化所述寨卡病毒制备剂；

步骤3.灭活所述病毒制备剂；

步骤4.将所述寨卡病毒制备剂转移到药学上可接受的缓冲液中，以获得所述灭活病毒组合物。

67.一种制备液体疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1.提供如权利要求1至45所述的灭活病毒组合物，

步骤2.向所述灭活病毒组合物中添加佐剂，优选铝盐，和任选地另一种药学上可接受的缓冲液体。

68.如权利要求67所述的方法，其中在步骤2中，所述另一种药学上可接受的缓冲液体包含与所述灭活病毒组合物中具有最高浓度的缓冲液相同的缓冲液。

69.一种产品，其可通过如权利要求66至68中任一项所述的方法获得。

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