KR20220007077A - 불활성화 바이러스 조성물 및 지카 백신 제형 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 액체 불활성화된 바이러스 조성물로서, 불활성화된 전체 지카 바이러스, 적어도 약 6.5mM의 농도를 갖는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 완충액, 및 임의적으로, 폴리올;을 포함하고 여기서 상기 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 완충제는 포스페이트 이온을 포함하지 않는 조성물 및 이로부터 유도된 백신에 관한 것이다.
Description
본 개시는 불활성화 전체 지카 바이러스를 함유하는 불활성화 바이러스 조성물 및 제제, 이의 제조 방법, 및 용도뿐만 아니라 이로부터 유도된 백신에 관한 것이다.
지카 바이러스, 플라비바이러스(flavivirus)는 다른 모기-매개 바이러스(예: 황열병, 뎅기열, 웨스트 나일 및 일본 뇌염 바이러스)로 분류되며 플라비바이리대(Flaviviridae) 계통의 바이러스는 2013년 상기 바이러스가 브라질에 도입된 이후 반구 전역에 유행병으로 빠르게 확산되었다. 상기 바이러스는 미국 영토를 포함 중미 및 북미에 도달하여 결과적으로 현재 미국 본토를 위협하고 있다. 실제로 지카 바이러스 균주 PRVABC59는 2015년 푸에르토리코를 여행한 사람의 혈청에서 분리되었다. 상기 균주의 게놈은 적어도 3번 시퀀스 되었다(Lanciotti 등 Emerg. Infect. Dis. 2016 May, 22(5):933-5, GenBank 수탁 번호 KU501215.1; GenBank 수탁 번호 KX087101.3; Yun 등 Genome Announc. 2016 8월 18일; 4(4) 및 GenBank 수탁 번호 ANK57897.1 참조).
1947년 우간다에서 처음 분리된 상기 바이러스는 1952년에 처음 인간의 질병과 관련되어있고 아프리카와 동남아시아에서 경미하며 자가 치유되는 열병의 원인으로 산발적으로 인식되었다(Weaver 등 (2016) Antiviral Res. 130:69-80; Faria 등 (2016) Science. 352(6283):345-349). 그러나 2007년 북태평양 얍섬에서 발병한 이 후 태평양을 가로질러 섬에서 섬으로 전파되어 2013~2014년 프랑스령 폴리네시아에서 대규모 발병을 일으켰고 이후 뉴칼레도니아, 쿡 제도, 그리고 최종적으로 이스터 섬으로 확산되었다. 아시아 계통 바이러스는 이후 불확실한 경로를 통해 서반구로 옮겨졌다 (Faria 등, (2016) Science. 352(6283): 345-349). 상기 바이러스는 이집트숲모기(Aedes aegypti), A. 알보픽투스(A. albopictus), 그리고 가능하게는 A. 헨실리(A. hensilli) 및 A. 폴리니에인시스(A. polynieseinsis)에 의해 인수공통감염으로 전염될 수 있다(Weaver 등, (2016) Antiviral Res. 130:69-80). 또한, 상기 바이러스를 전염시키는 다른 벡터가 존재할 수 있으며, 바이러스는 수혈, 태반 및/또는 성적 전달을 통해 전염될 수 있는 것으로 생각된다.
2015년 말, 지카 바이러스 감염이 널리 퍼진 지역에서 태아 기형(예: 소두증)과 길랭-바레 증후군(GBS)이 크게 증가하면서 지카 바이러스가 원래 생각했던 것보다 훨씬 더 치명적일 수 있다는 경고가 제기되어 세계 보건 기구(WHO)가 PHEIC(국제적 공중보건 비상사태)를 선포하는 것을 촉진하였다(Heymann 등 (2016) Lancet 387(10020):719-21). 지카 바이러스는 공중 보건에 상당한 위협이 되지만 현재 FDA 승인된 백신이나 치료법은 존재하지 않으며 지카 바이러스를 통제하기 위한 유일한 예방 조치는 모기 개체수를 관리하는 것이다.
잠재적인 백신 개발을 위해 재조합 지카 바이러스를 특징화하려는 최근의 노력으로, 330번 위치에서 바이러스 외피 단백질에 돌연변이가 있는 비인간 세포 적응 지카 바이러스가 확인되었다(Weger-Lucarelli 등 2017. Journal of Virology). 이 연구의 저자들은 지카 바이러스 균주 PRVABC59의 전체 길이(full-length) 감염 cDNA 클론이 클론닝 중에 증폭될 때 유전적으로 불안정하다는 것을 밝혀냈으며, 관찰된 불안정성을 해결하기 위해 바이러스 게놈을 분할하여 두개의 플라스미드 시스템을 개발 및 적용하기로 선택하였다. 그러나 지카 백신 개발을 위한 2개의 플라스미드 시스템은 덜 바람직하다. 따라서, 유전적으로 안정한 지카 바이러스를 이용하는 지카 바이러스 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한 백신을 개발할 필요가 있다.
불활성화 바이러스 조성물은 우수한 안정성을 나타내는 것이 바람직하며, 특히 백신의 제조시에 이미 정제되고 불활성화된 "의약 물질"로 지칭되는 중간 생성물인 불활성화 바이러스 조성물은 최종 제품, 즉 백신으로 제형화되기를 기다릴 때 장기간 운송 및 저장될 수 있고 활성을 잃지 않는 것이 필요하다. 예를 들어, 불활성화 바이러스 조성물은 냉동(예: -80℃) 하여 장기간 보관할 수 있다. 결과적으로 불활성화 바이러스 조성물은 -80℃에서 보관되는 동안 안정적이어야 한다. 또한, 불활성화 바이러스 조성물은 온도 변화를 견딜 수 있는 것이 중요하다. 특히, 불활성화 바이러스 조성물이 동결 및 해동의 결과로 활성을 잃지 않는 것이 중요하며, 이는 하나 또는 다수의 동결 융해 주기를 초래한다. 하나 또는 다수의 동결 융해 주기에 대한 내성은 또한 생산 공정 중에 의약 물질을 동결할 수 있음을 의미한다
발명의 목적 및 요약
본 발명의 목적은 불활성화 전체 지카 바이러스가 보관 중에 안정화된 불활성화 바이러스 조성물을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은 불활성화 전체 지카 바이러스가 예를 들어 적어도 10일 에서 6개월 또는 1년까지 보관하는 것과 같이 -80℃에서 장기간 보관하는 동안 안정화되는 불활성화 바이러스 조성물을 제공하는 것이다. 일반적으로 냉동 보관되도록 의도된 이러한 조성물들은 알루미늄 염, 예를 들어 알룸/수산화알루미늄과 같은 알루미늄 기반 보조제를 (아직)함유하지 않는다. 필요에 따라, 이러한 알루미늄 기반 보조제는 더 이상 냉동 보관이 예정되어 있지 않을 때 나중에 추가될 수 있다.
본 발명의 추가 목적은 불활성화된 전체 지카 바이러스를 하나 또는 다수의 동결 융해 주기 동안 안정화 시킬 수 있는 불활성화 바이러스 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적은 본원의 개시와 청구범위와 같은 본 발명의 실시 형태에 의해 달성된다.
따라서, 본 발명은 액상 불활성화 바이러스 조성물로서,
a) 불활성화된 전체 지카 바이러스,
b) 적어도 약 6.5mM의 농도를 갖는 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 완충액, 및
c) 임의적으로 폴리올;을 포함하며,
여기서 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 바람직하게는 알루미늄 염으로부터 선택된 보조제를 포함하지 않고, 상기 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 완충액은 포스페이트 이온을 함유하지 않는 조성물에 관한 것이다.
특정 양상에서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물 내의 포스페이트 이온의 농도는 약 7mM 미만, 또는 약 6mM 미만, 또는 약 5mM 미만, 또는 약 4mM 미만, 또는 약 3mM 미만, 또는 약 2mM 미만, 또는 약 1mM 미만이다.
본 발명은 또한 액상 불활성화 바이러스 조성물의 용도로서, 상기 조성물이
a) 불활성화된 전체 지카 바이러스,
b) 적어도 약 6.5mM의 농도를 갖는 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 완충액, 및
c) 임의적으로 폴리올;을 포함하며,
상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 바람직하게는 알루미늄 염으로부터 선택된 보조제를 포함하지 않고,
상기 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 완충액은 불활성화 전체 지카 바이러스를 안정화시키기 위하여 포스페이트 이온을 포함하지 않는, 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 액상 불활성화 바이러스 조성물의 제조 방법으로서, 상기 조성물이
a) 불활성화된 전체 지카 바이러스,
b) 약학적으로 허용가능한 완충액, 여기서 상기 완충액은 포스페이트 완충액이 아니며 상기 완충액의 농도가 적어도 6.5mM인 완충액, 및
c) 임의적으로 폴리올;을 포함하며,
여기서 상기 불활성화 바이러스 조성물은 알루미늄 염으로부터 선택된 보조제를 함유하지 않으며, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
단계 1. 하나 이상의 비인간 세포로부터 얻은 상등액으로부터 지카 바이러스 제제를 분리하는 단계;
단계 2. 지카 바이러스 제제를 정제하는 단계;
단계 3. 상기 바이러스 제제를 불활성화 하는 단계
단계 4. 지카 바이러스 제제를 약학적으로 허용가능한 완충액으로 옮겨 지카 바이러스 의약물질을 얻는 단계.
본 발명은 추가로 하기를 포함하는 액상 백신에 관한 것이다:
a) 본 발명에 따른 불활성화 바이러스 조성물, 및
b) 수산화알루미늄과 같은 보조제.
특정의 양태에서, 상기 액상 백신은 약 50mM 내지 약 200mM NaCl, 약 8.5mM 내지 약80mM 트리스 및 약 0.4% w/v 내지 약 4.7% w/v의 수크로스를 포함한다.
본 발명은 또한 치료 또는 예방에 관한 것으로 특히 상기에 개시된 바와 같이 본 발명에 따른 단위 투여량의 액상 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여 이를 필요로 하는 인간 대상체의 지카 바이러스 감염을 예방하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 다음 단계를 포함하는 액상 백신의 제조 방법에 관한 것이다.
단계 1. 상기에 개시한 바와 같은 본 발명에 따른 불활성화 바이러스 조성물을 제공하는 단계,
단계 2. 보조제 바람직하게는 알루미늄 염, 그리고 임의로 추가의 약학적으로 허용가능한 완충액인 보조제를 불활성화 바이러스 조성물에 첨가하는 단계.
본 발명은 또한 상기에 개시된 방법에 의해 얻을 수 있는 생산물에 관한 것이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 개시된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료들이 실제로 본 발명의 시험을 위해 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법들은 본원에 개시되어 있다. 본 발명을 개시하고 청구함에 있어서, 하기 정의에 따라 하기 용어가 사용될 것이다.
달리 명시되지 않는 한, "하나"("a", "an") 등의 용어는 하나 이상을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "불활성화된 지카 바이러스"는 유효량의 포름알데히드에 의한 처리와 같은 불활성화 방법으로 처리된 지카 바이러스를 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "불활성화된 전체 지카 바이러스"는 유효량의 포르말린에 의한 처리와 같은 불활성화 방법으로 처리된 지카 바이러스를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 처리는 바이러스의 구조를 파괴하지 않는 것으로 간주되는데 즉, 바이러스의 2차, 3차 또는 4차 구조 및 면역원성 부위(immunogenic epitopes)를 파괴하지 않지만 불활성화된 지카 바이러스는 불활성화되지 않은 지카 바이러스에 감염될 수 있는 숙주 세포를 더 이상 감염시킬 수 없다. 한 실시형태에 있어서, 상기 불활성화된 지카 바이러스는 더 이상 베로 세포를 감염시킬 수 없고 베로 세포에 대해 세포변성 효과를 발휘할 수 없다. 특히, 불활성화된 (전체) 지카 바이러스는 지카 바이러스를 20℃내지 24℃의 온도에서 10일 동안 약 0.01% w/v의 양의 포름알데히드로 처리하는 방법으로부터 얻을 수 있고/얻어진다. 전체 지카 바이러스의 샘플은 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에서 곡선 아래 전체 면적의 적어도 85%의 주요 피크를 제공할 수 있다.
용어 "폴리올"은 본 발명의 목적상 다중 히드록실 기를 갖는 물질을 지칭하는 것으로 정의되며, 당(환원 및 비환원 당), 당 알코올 및 당산을 포함한다. 폴리올의 또 다른 예는 글리세롤이다. 임의적으로, 본원에 정의된 폴리올은 약 600 Da 미만(예를 들어, 약 120 내지 약 400 Da 범위)의 분자량을 갖는다.
"아미노기 함유 분자"라는 용어는 본 발명의 목적상 1차, 2차-, 3차- 및 4차-아민 기(RNH2,, R2NH, R3N, R4N+) 함유 분자를 포함하는 것으로 정의된다. R 기는 일반적으로 환형 또는 비환형 탄화수소이다. 아미노 기 함유 분자는 아미노산(예: 히스티딘), 트리스, ACES, CHES, CAPSO, TAPS, CAPS, 비스-트리스, TAPSO, TES, 트리신 및 ADA를 포함한다(각 완충액에 대한 모든 약어는 당업계에서 일반적으로 알려진 것과 동일한 의미).
"실온"이라는 용어는 본 발명의 목적상 통상의 실온, 예를 들어 약 25℃를 지칭하는 것으로 정의된다.
본 발명의 의미 내에서, 용어 "불활성화 바이러스 조성물" 또는 "액상 불활성화 바이러스 조성물"은 일반적으로 액상 형태 또는 냉동 액상 형태의 조성물을 지칭한다. 이러한 조성물은 불활성화 바이러스를 포함하는 중간 조성물로서, 이 바이러스는 종종 냉동 상태로 보관된 후 적어도 보조제를 추가로 첨가하여 최종적으로 백신/약물 제품을 제조하는 데 사용된다.
트리스"는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충액을 의미한다.
달리 표시되지 않은 경우 "%"는 "부피당 중량(w/v)"을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
일반 기술
본원에 개시되거나 참조되는 기술 및 절차는 예를 들어 일반적으로 Sambrook 등의 문헌 Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, 등 eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds.(1995)), Harlow and Lane, eds.(1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (Rd. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984), Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory' Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis etal., eds., 1994), Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory' Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory'- Press, 1999); and The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995). eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds.(1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (Rd. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984), Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory' Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis etal., eds., 1994), Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory' Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory'- Press, 1999); and The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995))에 개시되는 널리 사용되는 방법론과 같은 당해 분야의 숙련자들에 의한 통상적인 방법론을 사용하여 일반적으로 웹에서 이해되고 일반적으로 사용된다
불활성화 바이러스 조성물
본 발명은 액상 불활성화 바이러스 조성물로서
a) 불활성화된 전체 지카 바이러스,
b) 적어도 약 6.5mM의 농도를 갖는 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 완충액, 및
c) 임의적으로, 폴리올을 포함하며,
상기 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 완충액은 포스페이트 이온을 포함하지 않는 액상 불활성화 바이러스 조성물에 관한 것이다.
이러한 특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 알루미늄 염으로부터 선택된 보조제를 함유하지 않는다. 특히, 알루미늄 염은 알룸(예: 수산화알루미늄), 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 황산알루미늄칼륨의 군으로부터 선택될 수 있다. 이러한 특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 불활성화된 전체 지카 바이러스가 흡수될 수 있는 보조제를 함유하지 않는다. 이러한 특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 알루미늄 염, 인산칼슘, 톨-유사 수용체(TLR) 작용제, 모노포스포릴 지질 A(MLA), MLA 유도체, 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, 사이토카인, 사포닌, 무라밀 디펩티드(MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람-음성균의 지질다당류(LPS), 폴리포스파젠, 에멀젼(오일 에멀젼), 키토산, 비타민 D, 스테아릴 또는 옥타데실 티로신, 비로솜, 코클레이트, 폴리(락타이드-코-글리코라이드) (PLG), 마이크로입자, 폴록사머 입자, 리포솜, 완전 Freund's 보조제(CFA), 및 불완전 Freund's 보조제(IFA)으로 부터 선택된 보조제를 함유하지 않는다. 이러한 특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 보조제, 즉 숙련가에게 공지된 임의의 보조제 화합물을 함유하지 않는다.
특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물 내의 포스페이트 이온의 농도는 약 7mM 미만, 또는 약 6mM 미만, 또는 약 5mM 미만, 또는 약 4mM 미만, 또는 약 3mM 미만, 또는 약 2mM 미만, 또는 약 1mM 미만이다. 포스페이트 이온을 포함하는 액상은 예를 들어 액상에 제 2 인산나트륨(Na2HPO4) 및/또는 제 1 인산칼륨(KH2PO4)을 용해 또는 분산시켜 얻을 수 있다. 제 2 인산나트륨(Na2HO4) 및/또는 제 1 인산칼륨(KH2PO4)이 수용액에 특정 비율로 용해되면 포스페이트 완충 용액이 생성된다.
특정의 실시형태에 있어서, 액상 불활성화 바이러스 조성물 중 상기 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 완충액의 농도는 적어도 약 7mM, 또는 적어도 약 7.5mM, 또는 적어도 약 8mM, 또는 적어도 약 8.5mM, 또는 적어도 약 9mM, 또는 적어도 약 10mM이다. 이러한 특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물 중 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 완충액의 농도는 약 7mM 내지 약 200mM, 또는 약 7.5mM 내지 약 약 200mM, 또는 약 8mM 내지 약 200mM, 또는 약 8.5mM 내지 약 200mM, 또는 약 9mM 내지 약 100mM, 또는 약 9mM 내지 약 60mM, 또는 약 9mM 내지 약 30mM 또는 약 9mM 내지 약 11mM, 또는 약 10mM 또는 약 20mM, 또는 약 50mM이다.
특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 단 하나의 약학적으로 허용가능한 완충액을 포함한다. 추가로, 특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 실질적으로 단지 하나의 약학적으로 허용가능한 완충액 및 단지 잔류하는 양의 추가적인 완충액 성분만을 포함할 수 있으며, 이때 농도는 2mM미만, 1.5mM미만, 또는 1mM미만, 또는 0.9 mM 미만, 또는 0.5 mM 미만, 또는 0.2 mM 미만이다.
특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 적어도 2개의 상이한 약학적으로 허용가능한 완충액을 포함하는데 여기서 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물에서 2개의 가장 농축된 약학적으로 허용가능한 완충액의 몰비는 1:2 내지 2:1, 또는 1:5 내지 5:1, 또는 8:1 내지 1:8, 또는 10:1 내지 1:10가 아니다.
특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물 내의 칼륨 이온의 농도는 약 4mM 미만, 또는 약 3mM 미만, 또는 약 2mM 미만, 또는 약 1.5mM 미만, 또는 약 0.5mM 미만, 또는 약 0.1mM 미만, 또는 약 0mM(즉 칼륨 이온을 실질적으로 함유하지 않음 )이다.
특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 프로타민 황산염를 실질적으로 함유하지 않거나 또는 함유하지 않는다.
특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물의 pH는 상온에서 측정시 약 pH 6.0 내지 약 pH 9.0 또는 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.0, 또는 약 pH 6.8 내지 약 pH 7.8, 약 pH 7.4 또는 약 pH 7.6이다.
완충액
특정의 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 액상 불활성화 바이러스 조성물,
a) 불활성화된 전체 지카 바이러스,
b) 적어도 약 6.5mM의 농도를 갖는 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 완충액, 및
c) 임의적으로, 폴리올을 포함하며,
상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 알루미늄 염으로부터 선택된 보조제를 포함하지 않고,
상기 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 완충액은 아미노 기를 함유하는 분자를 포함하며 포스페이트 이온을 포함하지 않는다.
아미노기-함유 분자를 포함하는 완충액은 히스티딘(His), 트리스, ACES, CHES, CAPSO, TAPS, CAPS, 비스-트리스, TAPSO, TES, 트리신, 및 ADA의 군으로부터 선택될 수 있으며, 특정 바람직한 실시형태에 있어서 약학적으로 허용가능한 완충액은 트리스 또는 히스티딘(His) 완충액, 바람직하게는 트리스 완충액이다.
폴리올
특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 적어도 하나의 폴리올을 추가로 포함한다.
이러한 특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 약 1% w/v 내지 약 60% w/v의 폴리올, 또는 약 6% w/v 내지 약 50% w/v의 폴리올, 또는 약 6% w/v 내지 약 40% w/v의 폴리올, 또는 약 6% w/v 내지 약 35% w/v의 폴리올, 또는 약 6% w/v 내지 약 30% w/v의 폴리올 폴리올, 또는 폴리올의 약 6% w/v 내지 약 25% w/v의 폴리올, 또는 약 6% w/v 내지 약 20% w/v 폴리올, 또는 약 6% w/v 내지 약 15% w/v의 폴리올, 또는 약 6% w/v 내지 약 12% w/v의 폴리올, 또는 약 7% w/v의 폴리올 또는 약 10% w/v의 폴리올을 포함한다.
특정의 바람직한 실시형태에 있어서, 액상 불활성 바이러스 조성물은 아미노 기 함유 분자를 포함하는 약학적으로 허용가능한 완충액, 및 약 6% w/v 내지 약 15% w/v의 폴리올을 포함한다. 이러한 특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 트리스, 및 약 6% w/v 내지 약 15% w/v의 폴리올을 포함한다.
특정의 실시형태에 있어서, 폴리올은 당이다. 이러한 특정의 실시형태에 있어서, 상기 당은 이당류이다. 이러한 특정의 실시형태에 있어서, 상기 이당류는 비환원당이다. 이러한 특정의 실시형태에 있어서, 상기 비환원당은 수크로스이다.
이러한 특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 약 5% w/v 내지 약 20% w/v의 수크로스, 또는 약 6% w/v 내지 약 15% w/v의 수크로스를 포함한다. 이러한 특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 약 6% w/v 내지 약 8% w/v 수크로스, 예컨대 약 7% w/v의 수크로스를 포함한다.
특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 약 8.5 mM 내지 약 50 mM 트리스 및 약 6% w/v 내지 약 15% w/v 수크로스를 포함하며, 여기서 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물의 pH는 상온에서 측정시 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0이다.
특정의 대안적 실시형태에 있어서, 상기 폴리올은 글리세롤이다. 이러한 특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 약 1% v/v 내지 약 60% v/v 글리세롤, 또는 약 7% v/v 내지 약 15% v/v 글리세롤, 또는 약 10% v/v의 글리세롤을 포함한다.
특정의 실시형태에 있어서, 상기 불활성화 바이러스 조성물은 약 8.5 mM 내지 약 50 mM 트리스 및 약 6% v/v 내지 약 15% v/v 글리세롤을 포함하며, 여기서 상기 불활성화 바이러스 조성물의 pH는 상온에서 측정시 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0이다.
염화나트륨
특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 염화나트륨을 더 포함한다. 이러한 특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 약 5 mM 내지 약 500 mM, 또는 약 10 mM 내지 약 200mM의 염화나트륨을 포함한다.
특정 이러한 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 약 10 mM 내지 약 40 mM, 또는 약 10 mM 내지 약 30mM의 농도, 예컨대 약 20mM의 염화나트륨의 농도를 포함한다. 특정 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 약 8.5 mM 내지 약 80 mM 트리스, 약 10mM 내지 30mM 염화나트륨, 약 6% w/v 내지 약 15% w/v 수크로스를 포함하며, 여기서 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물의 pH는 상온에서 측정시 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0이다. 특정 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 약 8.5 mM 내지 약 15 mM 트리스, 약 10mM 내지 25mM 염화나트륨, 약 6% w/v 내지 약 10% w/v 수크로스를 포함하며, 여기서 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물의 pH는 상온에서 측정시 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0이다.
특정 대안적인 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 약 100mM 내지 200mM, 또는 약 140mM 내지 160mM, 예컨대 약 150mM의 염화나트륨 농도를 포함한다. 이러한 특정의 실시형태에 있어서기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 약 8.5 mM 내지 약 80 mM 트리스 그리고 약 140mM 내지 약 160mM NaCl을 포함하며 여기서 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물의 pH는 상온에서 측정시 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0이다. 특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 약 8.5 mM 내지 약 15 mM 트리스 및 약 140mM 내지 약 160mM NaCl을 포함하며, 여기서 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물의 pH는 상온에서 측정시 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0이다.
특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물의 이온 강도는 약 80mM 미만, 또는 약 70mM 미만, 또는 약 60mM 미만, 또는 약 50mM 미만, 또는 약 40mM 미만, 또는 약 30mM 미만이다. 이온 강도라는 용어는 다음 방정식으로 정의된다.
여기서 Ci는 이온I의 몰 농도이고 Zi는 해당 이온의 전하 수이며 합은 용액의 모든 이온에 적용된다.
지카 바이러스
본 발명은 불활성화된 전체 지카 바이러스를 포함하는 불활성화 바이러스 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 특정의 양상에서, 상기 불활성화된 전체 지카 바이러스는 지카 바이러스 집단으로부터 플라크 정제에 의해 분리된 정제된 불활성화된 전체 지카 바이러스를 지칭할 수 있다. 본 발명은 모든 유형의 불활성화된 전체 지카 바이러스에 관한 것이다. 아래 특정 지카 바이러스는 하나의 예로 개시된다.
지카 바이러스(ZIKV)는 1947년 우간다 지카 숲의 센티넬 레서스 원숭이로부터 처음 분리된 모기-매개 플라비바이러스이다. 그 이후로 아프리카와 아시아, 그리고 최근에는 아메리카 대륙에서 인간으로부터 분리되었다. ZIKV는 두 가지(가능하게는 세 가지) 계통: 아프리카 계통(동아프리카 계통과 서아프리카 계통으로 분리될 수 있음)과 아시아 계통에서 발견된다. 따라서, 본 개시의 적합한 지카 바이러스의 예는 제한 없이 아프리카 및/또는 아시아 계통의 바이러스를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스는 아프리카 계통 바이러스이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스는 아시아 계통 바이러스이다. 또한 지카 바이러스의 아프리카 및 아시아 계통 내에서 여러 균주가 이전에 확인되었다. 당업계에 알려진 지카 바이러스 중 임의의 하나 이상의 적합한 균주가 본 개시에 사용되어 질 수 있다, 예를 들어 균주 Mr 766, ArD 41519, IbH 30656, P6-740, EC Yap, FSS13025, ArD 7117, ArD 9957, ArD 30101, ArD 30156, ArD 30332, HD 78788, ArD 127707, ArD 127710, ArD 127984, ArD 127988, ArD 127994, ArD 128000, ArD 132912, 132915, ArD 141170, ArD 142623, ArD 149917, ArD 149810, ArD 149938, ArD 157995, ArD 158084, ArD 165522, ArD 165531, ArA 1465, ArA 27101, ArA 27290, ArA 27106, Ar A. 27096, ArA 27407, ArA 27433, ArA 506/96, ArA 975-99, Ara 982-99, ArA 986-99, ArA 2718, ArB 1362, Nigeria68, Malaysia66, Kedougou84, Suriname, MR1429, PRVABC59, ECMN2007, DakAr41524, H/PF/2013, R103451, 103344, 8375, JMB-185, ZIKV/H, sapiens/Brazil/Natal/2015, SPH2015, ZIKV/Hu/Chiba/S36/2016, 및/또는 Cuba2017이다. 일부 실시형태에 있어서, 균주 PRVABC59가 본 개시에서 사용된다.
일부 실시형태에 있어서, 지카 바이러스 게놈 서열의 예는 하기 서열번호 2로 제시된다:
일부 실시형태에 있어서, 지카 바이러스는 GenBank 수탁 번호 KU501215.1의 게놈 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 지카 바이러스는 균주 PRVABC59로부터 유래한 것이다. 일부 실시형태에 있어서 GenBank 수탁 번호 KU501215.1의 게놈 서열은 서열번호 2의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 지카 바이러스는 서열번호 2의 서열과 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도. 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 개놈 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스는 서열번호 2의 서열에 의해 인코드된(encode) 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 지카 바이러스는 서열번호 2의 서열에 의해 인코드된 아마노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도. 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 불활성화된 지카 바이러스는 본원에 개시된 임의의 불활성화 바이러스 조성물에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 불활성화된 지카 바이러스는 이를 필요로 하는 대상체에서 지카 바이러스 감염을 치료 또는 예방하고/하거나 이를 필요로 하는 대상체에서 지카 바이러스에 대한 보호 면역 반응 등의 면역 반응을 유도하는데 유용한 하나 이상의 항원을 제공하는데 사용될 수 있다.
본 개시에서 사용되는 지카 바이러스는 세포 배양에서 하나 이상의 세포로부터 얻어질 수 있다(예를 들어, 플라크 정제를 통해). 예를 들어, 곤충 세포(예를 들어, CCL-125 세포, Aag-2 세포, RML-12 세포, C6/36 세포, C7-10 세포, AP-61 세포, A.t. GRIP-1 세포, A.t. GRIP-2 세포, A.t. GRIP-3 세포, UM-AVE1 세포, Mos.55 세포, Sua1B 세포, 4a-3B 세포, Mos.42 세포, MSQ43 세포, LSB-AA695BB 세포, NIID-CTR 세포, TRA-171, 세포 등과 같은 모기세포 및 아에데스 아에기프티(Aedes aegypti) 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus), 아에데스 슈도수텔라리스(Aedes pseudoscutellaris), 아에데스 트리세리아투스(Aedes triseriatus), 아에데스 벡산스(Aedes vexans), 아노펠레스 감비아(Anopheles gambiae), 아노펠레스 스테펜시 (Anopheles stephensi), 아노펠레스 알비무스(Anopheles albimus), 쿨렉스 퀸퀘파시아투스 Culex quinquefasciatus, 쿨렉스 테일레리(Culex theileri), 쿨렉 스 트리타에니오린쿠스(Culex tritaeniorhynchus), 쿨렉스 비타에니오린쿠스(Culex bitaeniorhynchus), 및/또는 톡소린치테스 앰보이넨시스(Toxorhynchites amboinensis) 와 같은 모기 종으로 부터의 추가 세포 또는 세포주 그리고 포유동물 세포(예를 들어 베로 세포(원숭이 신장 유래), LLC-MK2 세포(원숭이 신장 유래), MDBK 세포, MDCK 세포, ATCC CCL34 MDCK(NBL2) 세포, MDCK 33016(WO 97/37001에 개시된 기탁 번호 DSM ACC 2219) 세포, BHK21-F 세포, HKCC 세포 또는 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포)를 포함하여 지카 바이러스를 생산하기 위해 당업계에서 알려진 임의의 적합한 세포를 사용할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스(예를 들어, 지카 바이러스 클론 단리물(clonal isolate) )는 비인간 세포로부터 생산된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스(예를 들어, 지카 바이러스 클론 단리물)는 곤충 세포로부터 생산된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스(예를 들어, 지카 바이러스 클론 단리물)는 모기 세포로부터 생산된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스(예를 들어, 지카 바이러스 클론 단리물)는 포유동물 세포로부터 생산된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스(예를 들어, 지카 바이러스 클론 단리물)는 베로 세포로부터 생산된다.
지카 바이러스는 구조적 폴리펩타이드와 비구조적 폴리펩타이드를 모두 인코딩하는 양성 극성(positive sense) 단일 가닥 RNA 게놈을 가지고 있다. 상기 게놈은 또한 바이러스 복제에서 역할을 하는 5'- 및 3'- 말단 영역 모두에 비인코딩(nonencoding) 서열을 포함한다. 이들 바이러스에 의해 인코드되는 구조적 폴리펩타이드는 캡시드(C), 전구체 막(prM) 및 외피(E)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들 바이러스에 의해 인코드된 비구조(NS) 폴리펩타이드는 NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, 및 NS5를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정의 실시형태에 있어서, 지카 바이러스는 지카 바이러스 비구조 단백질 1(NS1)에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스는 서열번호 1의 위치 98, 또는 서열번호 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 함유한다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 돌연변이는 상기 NS1 폴리펩티드 내에 있다. 예시적인 지카 바이러스 균주로부터의 야생형(wild-type) NS1 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 다음과 같이 제시된다:
일부 실시형태에 있어서, NS1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 NS1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 GenBank 수탁 번호 KU501215.1(서열번호 2)의 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 NS1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 GenBank 수탁 번호 KU501215.1의 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열의 아미노산 위치 795 내지 1145일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 NS1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 지카 바이러스 균주 PRVABC59로부터 유래될 수 있다.
"서열 동일성", "서열 동일성", "동일성", "동일한", "서열 정렬"은 첫 번째 아미노산 서열과 두 번째 아미노산 서열의 비교, 또는 첫 번째 핵산 서열과 두 번째 핵산 서열의 비교를 의미하며, 비교에 기초하여 백분율로 계산된다. 이 계산의 결과는 "동일한 백분율" 또는 "ID 백분율"로 설명할 수 있다.
일반적으로 서열 정렬은 두 가지 다른 접근 방식 중 하나로 서열 동일성을 계산하는 데 사용될 수 있다. 첫 번째 접근 방식에서는 단일 위치에서의 불일치와 단일 위치에서의 갭(gap)이 모두 최종 서열 동일성 계산에서 동일하지 않은 위치로 계산된다. 두 번째 접근 방식에서는 단일 위치에서의 불일치는 최종 서열 동일성 계산에서 동일하지 않은 위치로 계산되지만 단일 위치에서의 갭은 최종 서열 동일성 계산에서 동일하지 않은 위치로 계산되지 않는다(무시된다). 즉, 두 번째 접근 방식에서는 최종 서열 동일성 계산에서 갭은 무시된다. 이러한 두 가지 접근 방식의 차이, 즉 단일 위치에서 갭을 동일하지 않은 위치로 계산하는 것과 갭을 무시하는 것은 두 서열 간의 서열 동일성 값의 변동성을 유발할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서 서열 동일성은 정렬을 생성하는 프로그램에 의해 결정되고, 단일 위치에서의 불일치와 단일 위치에서의 갭 모두를 최종 서열 동일성 계산에서 동일하지 않은 위치로 기록하는 동일성을 계산한다. Needleman 및 Wunsch(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol 48:443-453)의 알고리즘을 구현한 프로그램 Needle(EMBOS)을 예로 들 수 있는데 Needle(EMBOS)을사용하여 먼저 첫 번째 시퀀스와 두 번째 시퀀스 사이에 정렬을 생성한 다음 정렬 길이에 걸쳐 동일한 위치의 수를 세고 동일한 잔기의 수를 정렬 길이로 나눈 다음 이 숫자에 100을 곱하여 % 서열 동일성를 생성함으로써 기본 설정당 서열 동일성을 계산한다 . [% 서열 동일성 = (동일 잔기 수/정렬 길이) x 100)].
서열 동일성은 전체 길이에 걸쳐 두 서열 모두 표시하는, 그렇게 그들의 전체길이(전역 서열 동일성)에서 첫 번째 서열과 두 번째 서열을 표시하는 이중(pairwise) 정렬로부터 계산될 수 있다. 예를 들어, 프로그램 Needle(EMBOSS)은 이러한 정렬을 생성한다; % 서열 동일성 =(동일한 잔기의 수 / 정렬 길이) x 100)].
서열 동일성은 첫 번째 서열 또는 두 번째 서열의 국부 영역("국소 동일성")만을 나타내는 이중 정렬로부터 계산될 수 있다. 예를 들어, 프로그램 Blast(NCBI)는 이러한 정렬을 생성한다; % 서열 동일성 = (동일한 잔기의 수/정렬 길이) x 100)].
상기 서열 정렬은 바람직하게는 Needleman 및 Wunsch(J. Mol. Biol. (1979) 48, p. 443-453)의 알고리즘을 사용하여 생성된다. 바람직하게는, 프로그램 "NEEDLE"(European Molecular Biology Open Software Suite(EMBOSS))은 프로그램 기본 매개변수(단백질의 경우 갭 개방=10.0, 갭 확장=0.5 및 매트릭스=EBLOSUM62 및 뉴클레오티드의 경우 매트릭스=EDNAFULL)와 함께 사용된다. 그런 다음, 서열 동일성은 전체 길이에 걸쳐 두 서열 모두 표시하는, 그렇게 그들의 전체길이(전역 서열 동일성)에서 첫 번째 서열과 두 번째 서열을 표시하는 정렬로부터 계산될 수 있다. 예: % 서열 동일성 = (동일한 잔기의 수 / 정렬 길이) x 100)].
일부 실시형태에 있어서, 돌연변이는 상기 NS1 폴리펩티드 내 하나 이상의 아미노산 위치에서 발생한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 돌연변이는 서열번호 1의 위치 98에서, 또는 이중 정렬 알고리즘을 사용하여 서열번호 1에 정렬될 때 서열번호 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 실시형태에 있어서, 위치 98에서의 돌연변이는 글리신으로 치환되는 트립토판이다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스는 서열번호 1의 위치 98, 또는 서열번호 1의 위치 98에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함한다. 서열번호 1의 98번 위치에 해당하는 위치는 이중 정렬 알고리즘을 사용하여 서열번호 1에 NS1 단백질의 아미노산 서열을 정렬함으로써 결정될 수 있다. 서열번호 1의 위치 98에 있는 트립토판 잔기에 상응하는 지카 바이러스 이외의 바이러스에서 아미노산 잔기는 이들 잔기가 박스로 표시된 본 출원의 도 7에 나타나있다. 일부 실시형태에 있어서, 위치 98에서의 돌연변이는 글리신으로 치환되는 트립토판이다. 일부 실시형태에 있어서, 위치 98에서의 돌연변이는 서열번호 1의 위치 98에서의 글리신으로 치환되는 트립토판이다. 일부 실시형태에 있어서, 위치 98에서의 돌연변이는 이중 정렬 알고리즘을 사용하여 서열번호 1에 정렬될 때 서열번호 1의 위치 98에 해당하는 위치에서 글리신으로 치환되는 트립토판이다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스는 NS 1 단백질 내에, 그리고 C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5 바이러스 단백질 중 하나 이상의 내에 적어도 하나의 돌연변이를 함유한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스는 NS 1 단백질 내에 하나 이상의 돌연변이, 그리고 C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5 바이러스 단백질 중 하나 이상 내에 적어도 하나의 돌연변이를 함유하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스는 NS1 단백질 내에 돌연변이를 함유하고 외피 단백질 E 내에 적어도 하나의 돌연변이를 함유하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 전체, 불활성화된 바이러스는 지카 바이러스 비구조적 단백질 1(NS1)에 적어도 하나의 돌연변이를 함유하고, 지카 바이러스 외피 단백질 E(Env)에 돌연변이를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스는 서열번호 1의 위치 98에서 또는 서열번호 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 함유하고 외피 단백질 E 내에 어떤 돌연변이도 함유하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 전체, 불활성화된 바이러스는 서열번호 1의 위치 98 또는 서열번호 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 함유하고/하거나 지카 바이러스 외피 단백질 E(Env)에 돌연변이를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 전체, 불활성화 바이러스는 지카 바이러스 비구조 단백질(NS1)에 적어도 하나의 돌연변이를 함유하며 상기 서열 인코딩 외피 단백질은 서열번호. 2의 서열에 상응하는 것과 동일하다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스는 서열번호 1의 위치 98, 또는 서열번호 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 함유하며 상기 서열 인코딩 외피 단백질은 서열번호. 2의 서열에 상응하는 것과 동일하다. 일부 실시형태에 있어서, 전체, 불활성화된 지카 바이러스는 서열번호 1의 위치 98, 또는 서열번호 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 함유하며 상기 서열 인코딩 외피 단백질은 서열번호. 2의 서열에 상응하는 것과 동일하다. 일부 실시형태에 있어서, 전체, 불활성화된 지카 바이러스는 서열번호 1의 위치 98, 또는 서열번호 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 글리신으로 치환되는 트립토판 돌연변이를 함유하며 상기 서열 인코딩 외피 단백질은 서열번호. 2의 서열에 상응하는 것과 동일하다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스는 적어도 하나의 돌연변이가 없는 지카 바이러스와 비교하여 유전적 안정성을 향상시키는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스는 적어도 하나의 돌연변이가 없는 지카 바이러스와 비교하여 바이러스 복제를 증진시키는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스는 지카 바이러스의 외피 단백질 E(Env)내에서와 같이 바람직하지 않은 돌연변이의 발생을 감소시키거나 그렇지 않으면 억제하는 적어도 하나의 돌연변이를 함유한다.
본 개시의 상기 실시형태에 있어서, 예시적인 이중 정렬 알고리즘은 기본 매개변수(예를 들어, EBLOSUM62 스코어링 매트릭스를 사용하여 갭 개방 패널티=10.0 및 갭 확장 패널티=0.5) 를 사용하는 Needleman-Wunsch 전역 정렬 알고리즘이다. 이 알고리즘은 EMBOSS 패키지의 needle도구에서 편리하게 구현된다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 불활성화된 지카 바이러스는 불활성화 바이러스 조성물에 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 불활성화된 지카 바이러스는 이를 필요로 하는 대상체에서 지카 바이러스 감염을 치료 또는 예방하고/하거나 이를 필요로 하는 대상체에서 지카 바이러스에 대한 면역 반응, 예컨대 보호 면역 반응을 유도하는 데 유용할 수 있다.
불활성화 바이러스 조성물의 생산
본 개시의 다른 측면은 서열번호 1의 위치 98 또는 본원에 개시된 바와 같은 서열번호 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 글리신으로 치환되는 트립토판인 돌연변이를 갖는 지카 바이러스와 같은 정제된 불활성화된 전체 바이러스를 함유하는 지카 바이러스 불활성화 바이러스 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 불활성화 바이러스 조성물은 서열번호 1의 위치 98 또는 서열번호 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 불활성화된 전체 지카 바이러스를 포함한다, 여기서 지카 바이러스는 균주 PRVABC59로부터 유래된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 불활성화 바이러스 조성물은 서열번호 1의 위치 98 또는 서열번호 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 불활성화된 전체 지카 바이러스를 포함한다, 여기서 지카 바이러스는 서열번호 2에 따른 게놈 서열을 포함하는 균주 PRVABC59로부터 유래된다. 한 실시형태에 있어서, 상기 불활성화 바이러스 조성물은 플라크 정제 클론 지카 바이러스 단리물을 함유한다.
본 개시의 불활성화 바이러스 조성물의 생산은 지카 바이러스의 성장을 포함한다. 세포 배양에서의 성장은 본 개시의 불활성화 바이러스 조성물을 제조하는 방법이다. 바이러스 성장을 위한 세포는 현탁액 또는 접착 조건에서 배양될 수 있다.
본 개시의 적어도 하나의 바이러스의 성장에 적합한 세포주는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 곤충 세포 (예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 모기 세포, 베로 세포 (원숭이 신장으로부터), 말, 소 (예를 들어, MDBK 세포), 양, 개(예를 들어, 개 신장으로부터의 MDCK 세포, ATCC CCL34 MDCK(NBL2) 또는 MDCK 33016, W097/37001에 개시된 바와 같은 기탁번호 DSM ACC 2219), 고양이 및 설치류(예를 들어, BHK21-F, HKCC 세포와 같은 햄스터 세포, 또는 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포)), 및 예를 들어, 성인, 신생아, 태아, 및 배아를 포함하는 광범위하고 다양한 발달 단계로부터 얻어질 수 있다. 특정의 실시형태에 있어서, 상기 세포는 불멸화된다(예를 들어, WO 01/38362 및 WO 02/40665에 개시된 바와 같이, 그리고 ECACC 기탁 번호 96022940으로 기탁된 바와 같은 PERC.6 세포). 바람직한 실시형태에 있어서는, 포유동물 세포가 이용되며, 하기 비제한적 세포 유형 중 하나 이상으로부터 선택 및/또는 유도될 수 있다: 섬유아세포(예를 들어, 진피, 폐), 내피 세포(예를 들어, 대동맥, 관상동맥, 폐, 혈관, 진피 미세혈관, 제대), 간세포, 각질세포, 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 대식세포, NK, 수지상), 유방 세포(예를 들어, 상피), 평활근 세포(예를 들어 혈관, 대동맥, 관상동맥, 동맥, 자궁, 기관지, 자궁 경부, 망막 주위 세포), 멜라닌세포, 신경 세포(예를 들어, 성상세포), 전립선 세포(예를 들어, 상피, 평활근), 신장 세포(예를 들어, 상피, 혈관간세포, 근위 세뇨관), 골격 세포(예를 들어 연골 세포, 파골 세포, 조골 세포), 근육 세포(예를 들어, 근모세포, 골격, 평활근, 기관지), 간 세포, 망막아 세포 및 기질 세포. WO 97/37000 및 WO 97/37001은 현탁액 및 무혈청 배지에서 성장 가능한 그리고 바이러스의 생산 및 복제에 유용한 동물 세포 및 세포주의 생산을 개시한다. 한 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 바이러스를 성장시키는 데 사용되는 세포는 베로 세포이다.
상기 세포 유형에 대한 배양 조건은 공지되어 있고 다양한 간행물에 개시되어 있다. 대안적으로, 배양 배지, 보충제 및 조건들은 예를 들어 Cambrex Bioproducts(East Rutherford, NJ)의 카탈로그 및 추가 문헌에 개시된 것과 같이 상업적으로 구입할 수 있다.
특정의 실시형태에 있어서, 본원에 개시된 방법에 사용된 세포는 무혈청 및/또는 무단백질 배지에서 배양된다. 인간 또는 동물의 혈청으로부터의 어떤 첨가제도 함유하지 않는 경우 배지는 본 개시의 맥락에서 무혈청 배지로 지칭된다. 무단백질은 단백질, 성장 인자, 기타 단백질 첨가제 및 비혈청 단백질을 제외하고 세포 증식이 일어나는 배양을 의미하는 것으로 이해되지만, 선택적으로 바이러스 성장에 필요할 수 있는 트립신 또는 기타 단백질 분해 효소와 같은 단백질을 포함할 수 있다. 이러한 배양에서 자라는 세포는 자연적으로 단백질 자체를 포함한다.
공지된 무혈청 배지는 Iscove's 배지, Ultra-CHO 배지(BioWhittaker) 또는 EX-CELL(JRH Bioscience)을 포함한다 일반 혈청 함유 배지에는 일반적으로 최대 10%의 태아 송아지 혈청 또는 이와 유사한 첨가제와 함께 사용되는 Eagle's Basal 배지(BME) 또는 최소 필수 배지(MEM)(Eagle, Science, 130, 432(1959)) 또는 둘베코 개질 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM 또는 EDM))이 포함된다. 선택적으로 최소 필수 배지(MEM)(Eagle, Science, 130, 432(1959)) 또는 둘베코 개질 이글 배지(DMEM 또는 EDM)는 혈청 함유 보충제 없이 사용될 수 있다. PF-CHO(JHR Bioscience)와 같은 무단백질 배지, ProCHO 4CDM(BioWhittaker) 또는 SMIF 7(Gibco/BRL Life Technologies)과 같은 화학적으로 정의된 배지 및 Primactone, Pepticase 또는 HyPep.TM과 같은 유사분열 촉진 펩티드(모두 Quest International로부터) 또는 락트알부민 가수분해물(Gibco 및 기타 제조업체)도 선행 기술에 적절하게 공지되어 있다. 식물 가수분해물을 기반으로 한 배지 첨가제는 바이러스, 마이코플라스마 또는 알려지지 않은 감염원에 의한 오염을 배제할 수 있는 특별한 장점이 있다.
세포 배양 조건(온도, 세포 밀도, pH 값 등)은 본 개시에 따라 사용된 세포주의 적합성으로 인해 매우 넓은 범위에 걸쳐 가변적이며 특정 바이러스 균주의 요건에 적응될 수 있다.
배양세포에서 바이러스를 증식시키는 방법은 일반적으로 배양된 세포에 배양될 균주를 접종하는 단계, 예를 들어 바이러스 역가 또는 항원 발현에 의해 결정된 바와 같은 바이러스 증식을 위한 원하는 기간 동안 감염된 세포를 배양하는 단계(예를 들어, 접종 후 24 내지 168 시간) 및 증식된 바이러스를 수집하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 바이러스는 플라크 정제를 통해 수집된다. 배양된 세포는 바이러스와 함께 1:500 내지 1:1, 바람직하게는 1:100 내지 1:5의 세포 비(PFU 또는 TCID50로 측정)로 접종된다. 상기 바이러스는 세포의 현탁액에 첨가되거나 세포의 단층에 적용되고, 바이러스는 적어도 10분, 적어도 20분, 적어도 30분, 적어도 40분, 적어도 50분, 적어도 60분 하지만 일반적으로 25℃내지 40℃바람직하게는 28℃내지 38℃에서 300분미만 동안 세포에 흡수된다. 감염된 세포 배양물(예를 들어, 단층)은 상등액(세포가 없음)을 수확함으로써, 동결-융해에 의해 또는 수확된 배양 상등액의 바이러스 함량을 증가시키기 위한 효소 작용에 의해 제거될 수 있다. 수확된 유체는 불활성화되거나 냉동 보관된다. 배양된 세포는 약 0.0001 내지 10, 바람직하게는 0.002 내지 5, 보다 바람직하게는 0.001 내지 2의 감염 다중도("MOI")로 감염될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 세포는 약 0.01의 MOI로 감염된다. 감염 동안 세포 배양 용기의 면적에 대한 배양 배지의 비율은 세포를 배양하는 동안보다 낮을 수 있다. 이 비율을 낮게 유지하면 바이러스가 세포를 감염시킬 가능성이 극대화된다. 감염된 세포의 상등액은 감염 후 30 내지 60시간, 또는 감염 후 3 내지 10일에 수확될 수 있다. 특정 바람직한 실시형태에 있어서, 감염된 세포의 상등액은 감염 후 3 내지 7일에 수확된다. 보다 바람직하게는, 감염된 세포의 상등액은 감염 후 3 내지 5일에 수확된다. 일부 실시형태에 있어서, 단백질 분해 효소(예를 들어, 트립신)는 바이러스 방출을 허용하기 위해 세포 배양 동안 첨가될 수 있는데, 단백질 분해 효소는 배양 동안 임의의 적합한 단계에서 첨가될 수 있다. 대안적으로, 특정의 실시형태에 있어서, 감염된 세포 배양물의 상등액을 수확할 수 있고 바이러스를 상등액으로부터 분리하거나 그렇지 않으면 정제할 수 있다.
바이러스 접종물 및 바이러스 배양물은 바람직하게는, 단순 포진 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 3, SARS 코로나바이러스, 아데노바이러스, 리노바이러스, 레오바이러스, 폴리오마바이러스, 비마이러스, 서코바이러스, 및/또는 파르보바이러스(WO 2006/027698)가 없는 형태이다.(즉, 오염에 대해 시험되며 음성의 결과가 있을 것이다).
바이러스가 세포주에서 성장한 경우, 숙주 세포 DNA의 임의의 발암 활성을 최소화하기 위해 최종 액상 불활성화 바이러스 조성물에서 잔류 세포주 DNA의 양을 최소화하는 것이 표준 관행이다. 표준 정제 절차(예: 크로마토그래피 등)를 사용하여 액상 불활성화 바이러스 조성물을 제조하는 동안 오염 DNA를 제거할 수 있다. 잔류 숙주 세포 DNA의 제거는 예를 들어 DNase를 사용하는 것과 같이 핵산 분해 효소 처리에 의해 증진될 수 있다. 숙주 세포 DNA 오염을 감소시키기 위한 통상적인 방법은 참고문헌(Lundblad (2001) Biotechnology and Applied Biochemistry' 34:195-197, Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation에 개시되어 있다. 미국 보건복지부 식품의약국 의약품 평가 및 연구 센터(CDER)의 수의학 센터(CVM). May 2001.)는 바이러스 성장 중 사용될 수 있는 DNase(예: Benzonase)를 사용한 다음 바이러스 입자 파괴 중 사용될 수 있는 양이온성 세제(예: CTAB)를 사용하는 2단계 처리를 포함한다. β-프로피 오락톤 처리에 의한 제거도 사용될 수 있다. 한 실시형태에 있어서, 상기 오염 DNA는 배양 상등액의 벤조나제 처리에 의해 제거될 수 있다.
항원 생산
지카 바이러스는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생산 및/또는 정제되거나 그렇지 않으면 분리될 수 있다. 한 실시형태에 있어서, 본 개시의 항원은 정제된 불활성화된 전체 지카 바이러스이다.
일부 실시형태에 있어서, 불활성화된 바이러스는 "불활성화 바이러스 조성물의 생산"이라는 제목의 상기 섹션에 기재된 바와 같이 생산될 수 있다.
특정의 실시형태에 있어서, 본 개시의 지카 바이러스는 비-인간 세포를 배양함으로써 생산될 수 있다. 본 개시의 지카 바이러스 생산에 적합한 세포주는 곤충 세포(예를 들어, 본 원에 개시된 임의의 모기 세포)를 포함할 수 있다. 본 개시의 지카 바이러스의 생산에 적합한 세포주는 포유 동물 유래 세포일 수 있으나 이에 제한되지 않는다: 베로 세포 (원숭이 신장으로부터), 말, 소 (예를 들어, MDBK 세포), 양, 개(예를 들어, 개 신장으로부터의 MDCK 세포, ATCC CCL34 MDCK(NBL2) 또는 MDCK 33016, WO 97/37001에 개시된 바와 같은 기탁번호 DSM ACC 2219), 고양이 및 설치류 (예를 들어, BHK21-F, HKCC 세포와 같은 햄스터 세포, 또는 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포)), 및 예를 들어, 성인, 신생아, 태아, 및 배아를 포함하는 광범위하고 다양한 발달 단계로부터 얻어질 수 있다. 특정의 실시형태에 있어서, 상기 세포는 불멸화된다(예를 들어, WO 01/38362 및 WO 02/40665에 개시된 바와 같이, 그리고 ECACC 기탁 번호 96022940으로 기탁된 바와 같은 PERC.6 세포). 바람직한 실시형태에 있어서는, 포유동물 세포가 이용되며, 하기 비제한적 세포 유형 중 하나 이상으로부터 선택 및/또는 유도될 수 있다: 섬유아세포(예를 들어, 진피, 폐), 내피 세포(예를 들어, 대동맥, 관상동맥, 폐, 혈관, 진피 미세혈관, 제대), 간세포, 각질세포, 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 대식세포, NK, 수지상), 유방 세포(예를 들어, 상피), 평활근 세포(예를 들어 혈관, 대동맥, 관상동맥, 동맥, 자궁, 기관지, 자궁 경부, 망막 주위 세포), 멜라닌세포, 신경 세포(예를 들어, 성상세포), 전립선 세포(예를 들어, 상피, 평활근), 신장 세포(예를 들어, 상피, 혈관간 세포, 근위 세뇨관), 골격 세포(예를 들어 연골 세포, 파골 세포, 조골 세포), 근육 세포(예를 들어, 근모세포, 골격, 평활근, 기관지), 간 세포, 망막아 세포 및 기질 세포. WO 97/37000 및 WO 97/37001은 현탁액 및 무혈청 배지에서 성장할 수 있고 바이러스 항원 생산에 유용한 동물 세포 및 세포주의 생산을 개시한다.
특정의 실시형태에 있어서, 비인간 세포는 무혈청 배지에서 배양된다. 특정의 실시형태에 있어서, 본 개시의 지카 바이러스는 베로 세포를 배양함으로써 생산될 수 있다.
바이러스 불활성화
본 발명에 따른 액상 불활성화 바이러스 조성물은 불활성화된 전체 지카 바이러스를 포함한다.
포유동물 세포를 감염시키는 능력을 파괴하지만 바이러스의 2차, 3차 또는 4차 구조 및 면역원성 부위를 파괴하지 않기 위한 바이러스를 불활성화 또는 사멸시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법에는 화학적 및 물리적 수단이 모두 포함된다. 바이러스를 불활성화시키기 위한 적합한 수단은 세제, 포르말린 (본원에서 "포름알데히드"로도 지칭됨), 과산화수소, 베타-프로피올락톤(BPL), 2원 에틸아민(BEI), 아세틸 에틸렌이민, 열, 전자기 방사선, x-선 방사선, 감마 방사선, 자외선 방사선(UV 방사선), UV-A 방사선, UV-B 방사선, UV-C 방사선, 메틸렌 블루, 프소랄렌, 카복시풀러렌(C60), 과산화수소와 이들 중 어느 것과의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 제제의 유효량을 사용한 처리를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이미 위에서 언급한 바와 같이, 본 출원의 목적을 위해 용어 "포르말린" 및 "포름알데히드"는 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 포름알데히드의 농도에 대해 언급하는 경우, 이는 포르말린의 농도가 아니라 포름알데히드의 농도를 의미한다. 따라서, "0.01%(w/v)의 포름알데히드 농도"는 0.01%(w/v) 포름알데히드를 나타내며, 포르말린 스톡 용액(일반적으로 질량 기준 37% 포름알데히드를 함유하는)에서 포름알데히드 농도에 대한 이러한 농도의 추가 보정은 이루어지지 않는다. 예를 들어, 바이러스 제제에서 이러한 포름알데히드 농도는 포르말린을 1.85%(w/v)의 포름알데히드 함량을 갖는 작업 용액으로 희석한 다음 지카 바이러스 제제 같은 바이러스 제제와 혼합될 때 필요한 농도로 추가 희석함으로써 얻을 수 있다.
본 개시의 특정의 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 (지카) 바이러스는 화학적으로 불활성화된다. 화학적 불활성화를 위한 제제 및 화학적 불활성화 방법은 당업계에 잘 알려져 있고 본원에 개시되어 있다. 일부 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 바이러스는 BPL, 과산화수소, 포르말린 또는 BEI 중 하나 이상으로 화학적으로 불활성화된다. 특정의 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 바이러스가 BPL로 화학적으로 불활성화되며 바이러스는 하나 이상의 변형을 함유한다. 일부 실시형태에 있어서, 하나 이상의 변형은 변형된 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 변형된 핵산은 알킬화된 핵산이다. 다른 실시형태에 있어서, 하나 이상의 변형은 변형된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 변형된 폴리펩티드는 변형된 시스테인, 메티오닌, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산, 티로신, 라이신, 세린 및 트레오닌 중 하나 이상을 포함하는 변형된 아미노산 잔기를 함유한다.
특정의 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 (지카) 바이러스는 포름알데히드로 불활성화된다.
특정의 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 바이러스가 포르말린(포름알데히드)으로 화학적으로 불활성화되며 바이러스는 하나 이상의 변형을 함유한다 일부 실시형태에 있어서, 하나 이상의 변형은 변형된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 하나 이상의 변형은 가교된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 바이러스가 포르말린으로 화학적으로 불활성화된 일부 실시형태에 있어서, 액상 불활성화 바이러스 조성물은 포르말린을 추가로 포함한다. 하나 이상의 바이러스가 BEI로 화학적으로 불활성화된 특정의 실시형태에 있어서, 바이러스는 하나 이상의 변형을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 하나 이상의 변형은 변형된 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 변형된 핵산은 알킬화된 핵산이다.
적어도 하나의 바이러스가 포르말린으로 화학적으로 불활성화된 일부 실시형태에 있어서, 임의의 잔류 미반응 포르말린은 메타중아황산나트륨으로 중화될 수 있으며 투석될 수 있고/있거나 잔여 미반응 포르말린을 제거하기 위해 완충액 교환될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 메타중아황산나트륨이 과량으로 첨가된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 용액은 직렬 고정 혼합기와 같은 혼합기를 사용하여 혼합될 수 있고, 후속적으로 여과되거나 추가로 정제될 수 있다(예를 들어, 직교류 여과 시스템을 사용하여).
일부 실시형태에 있어서, 상기 포름알데히드 농도는 0.005%(w/v) 내지 0.02%(w/v)이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 포름알데히드 농도는 0.0075%(w/v) 내지 0.015%(w/v)이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 포름알데히드 농도는 0.01%(w/v)이다.
일부 실시형태에 있어서, 지카 바이러스는 지카 바이러스가 약 15℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도에서 5 내지 15일 동안 약 0.001% w/v 내지 약 3.0% w/v 의 양으로 포름알데히드로 처리되는 방법에 의해 얻어지는/얻어질수 있는 불활성화된 전체 바이러스이다. 특정의 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스는 약 0.005% 내지 약 0.02% w/v 양의 포름알데히드로 전체 살아있는 지카 바이러스를 처리함으로써 얻어지는/얻어질수 있는 불활성화된 전체 바이러스이다. 특정의 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스는 0.015% w/v 미만으로 전체 살아있는 지카 바이러스를 처리함으로써 얻어지는/얻어질 수 있는 불활성화된 전체 바이러스이다.
특정의 실시형태에 있어서, 상기 불활성화된 전체 지카 바이러스는 지카 바이러스를 22℃의 온도에서 14일 동안 약 0.02% w/v 범위의 양으로 포름알데히드로 처리하는 방법으로부터 얻을 수 있는/얻어지는 것으로 간주된다. 일부 실시형태에 있어서, 불활성화된 전체 지카 바이러스 제제는 지카 바이러스를 22℃의 온도에서 10일 동안 약 0.01% w/v의 양의 포름알데히드로 처리하는 방법으로부터 얻어질 수 있는/얻어지는 것으로 간주된다.
지카 바이러스 순도
지카 바이러스의 순도는 크기 배제 크로마토그래피로 결정할 수 있다.
본 개시의 특정 실시형태는 크기 배제 크로마토그래피에서 지카 바이러스의 주요 피크가 곡선 아래의 총 면적의 85% 초과인 것으로 결정될 때 적어도 85% 순수한 불활성화된 전체 지카 바이러스를 포함하는 불활성화 바이러스 조성물에 관한 것이다. 이러한 특정의 실시형태에 있어서, 지카 바이러스는 크기 배제 크로마토그래피에서 지카 바이러스의 주요 피크가 곡선 아래 총 면적의 90% 초과인 것에 의해 결정될 때 90% 순수할 수 있다. 이러한 특정의 실시형태에 있어서, 지카 바이러스는 크기 배제 크로마토그래피에서 지카 바이러스의 주요 피크가 곡선 아래 총 면적의 95% 초과인 것에 의해 결정될 때 95% 순수할 수 있다.
용도
특정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 불활성화 바이러스 조성물의 용도로서, 상기 조성물이
a) 불활성화된 전체 지카 바이러스,
b) 적어도 약 6.5mM의 농도를 갖는 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 완충액, 및
c) 임의적으로, 폴리올을 포함하며,
여기서 상기 불활성화 바이러스 조성물은 알루미늄 염으로부터 선택된 보조제를 포함하지 않고, 상기 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 완충액은 불활성화된 전체 지카 바이러스 안정화를 위해 포스페이트 이온을 함유하지 않는 용도에 관한 것이다.
특정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 불활성화된 전체 지카 바이러스를 안정화시키기 위한 본 발명에 따른(상기에 개시된 바와 같은) 불활성화 바이러스 조성물의 용도에 관한 것이다.
이러한 특정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 5±3℃에서 적어도 10일 동안 보관하는 동안 불활성화된 전체 지카 바이러스를 안정화시키기 위한 상기 불활성화된 바이러스 조성물의 용도에 관한 것이다.
특정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 -80℃에서 적어도 10일 동안 보관하는 동안 불활성화된 전체 지카 바이러스를 안정화시키기 위한 상기 불활성화된 바이러스 조성물의 용도에 관한 것이다. 이러한 특정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 -80℃에서 적어도 6개월 동안 보관하는 동안 불활성화된 전체 지카 바이러스를 안정화시키기 위한 상기 불활성화된 바이러스 조성물의 용도에 관한 것이다. 이러한 특정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 -80℃에서 적어도 12개월 동안 보관하는 동안 불활성화된 전체 지카 바이러스를 안정화시키기 위한 상기 불활성화된 바이러스 조성물의 용도에 관한 것이다.
이러한 특정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 적어도 4 동결 융해 주기와 같은 하나 이상 다수의 동결 융해 주기동안 불활성화된 전체 지카 바이러스를 안정화시키기 위한 상기 불활성화된 바이러스 조성물의 용도에 관한 것이다.
불활성화 바이러스 조성물의 제조 방법
특정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 불활성화된 바이러스 조성물의 제조방법으로서, 상기 조성물이
a) 불활성화된 전체 지카 바이러스,
b) 약학적으로 허용가능한 완충액, 상기 완충액은 포스페이트 완충액이 아니며 상기 완충액의 농도가 적어도 6.5mM인 완충액, 및
c) 임의적으로, 폴리올을 포함하며,
여기서 상기 불활성화 바이러스 조성물은 알루미늄 염으로부터 선택된 보조제를 함유하지 않으며; 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
단계 1. 하나 이상의 비인간 세포로부터 얻은 지카 바이러스 제제 상등액을 분리하는 단계;
단계 2. 지카 바이러스 제제 정제;
단계 3. 상기 바이러스 제제를 불활성화 하는 단계
단계 4. 상기 지카 바이러스 제제를 약학적으로 허용가능한 완충액으로 옮겨 지카 바이러스 의약물질을 얻는 단계.
일부 실시형태에 있어서, 단계 1에서 사용된 세포는 비인간 세포이다. 적합한 비인간 포유동물 세포에는 베로 세포, LLC-MK2 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, ATCC CCL34 MDCK(NBL2) 세포, MDCK 33016(W097/37001에 개시된 기탁 번호 DSM ACC 2219)세포, BHK21-F 세포, HKCC 세포 및 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포)가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 포유 동물 세포는 베로 세포이다.
단계 2에서, 지카 바이러스를 분리하기 위하여 당업계에 공지된 바이러스 제제를 정제하는 임의의 방법이 사용될 수 있는데, 그 방법으로 직교류 여과(CFF), 다중모드 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 바이러스 제제는 직교류 여과(CFF)에 의해 분리된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 바이러스 제제는 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상의 양으로 높은 정도까지 정제된다.
단계 3에서, 상기 지카 바이러스 제제는 15℃내지 30℃의 온도에서 8 내지 12일 동안 0.005 내지 0.02%(w/v) 포르말린으로 처리함으로써 불활성화될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스 제제는 15℃내지 30℃의 온도에서 9 내지 11일 동안 0.005 내지 0.02%(w/v) 포르말린으로 처리된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스 제제는 15℃내지 30℃의 온도에서 10일 동안 0.005 내지 0.02%(w/v) 포르말린으로 처리된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스 제제는 15℃내지 30℃의 온도에서 8 내지 12일 동안 0.008 내지 0.015%(w/v) 포르말린으로 처리된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스 제제는 15℃내지 30℃의 온도에서 9 내지 11일 동안 0.008 내지 0.015%(w/v) 포르말린으로 처리된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스 제제는 15℃내지 30℃의 온도에서 10일 동안 0.008 내지 0.015%(w/v) 포르말린으로 처리된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스 제제는 15℃내지 30℃의 온도에서 8 내지 12일 동안 0.01%(w/v) 포르말린으로 처리된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스 제제는 15℃내지 30℃의 온도에서 9 내지 11일 동안 0.01%(w/v) 포르말린으로 처리된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스 제제는 15℃내지 30℃의 온도에서 10일 동안 0.01%(w/v) 포르말린으로 처리된다.
일부 실시형태에 있어서, 단계 3은 미반응 포르말린을 유효량의 메타중아황산나트륨으로 중화시키는 것을 추가로 포함한다.
특정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 또한 상기에 개시된 방법에 의해 얻어질 수 있는 생성물(예를 들어, 불활성화 바이러스 조성물)에 관한 것이다.
지카 바이러스 백신
본 발명에 따른 불활성화 바이러스 조성물은 일반적으로 백신 제조에 사용되는 중간 조성물을 지칭한다. 본 발명의 특정 추가 측면은 액상 백신(또는 질병 또는 상태의 치료 또는 예방에 사용하기에 적합한 조성물, 특히 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 사용하기에 적합한 조성물)에 관한 것으로 상기에 개시된 불활성화 바이러스 조성물로부터 얻어진다/얻어질 수 있다. 상기 백신은 보조제를 포함하고 불활성화된 바이러스 조성물과는 다른 완충액과 부형제 농도를 가질 수 있다.
이러한 특정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 하기를 포함하는 액상 백신에 관한 것이다:
a) 상기 이전에 주장하는 것중 어느 하나에 따른 불활성화 바이러스 조성물, 및
b) 수산화알루미늄과 같은 보조제.
이러한 특정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 불황성화된 지카 바이러스를 포함하는 액상 백신에 관한것으로 액상 백신에서의 염화나트륨 농도는 약 50mM 내지 200mM, 또는 약 50mM 내지 150mM, 예컨대 약 84mM이다. 이러한 특정의 실시형태에 있어서 본 발명은 액상 백신에 관한것으로, 액상 백신은 약 8.5 mM 내지 약 80 mM 트리스 그리고 약 50mM 내지 약 150mM NaCl을 포함하며 여기서 상기 액상 백신의 pH는 상온에서 측정시 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0이다.
이러한 특정의 실시형태에 있어서, 액상 백신 중 트리스의 농도는 약 9mM 내지 약 80mM, 또는 약 9mM 내지 약 60mM, 또는 9mM 내지 약 30mM, 또는 약 9mM 내지 약 11mM 또는 약 10mM이다.
특정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 상기 액상 백신이 약 0.4%(w/v) 내지 4.7%(w/v) 수크로스를 포함하는 액상 백신에 관한 것이다.
특정의 실시형태에 있어서, 상기 액상 백신의 삼투질농도는 약 300±50mOsm/kg이다. 삼투질 농도는 제조업체의 지침에 따라 그리고 그들의 보정 및 참조 용액을 사용하여 Advanced Instruments OsmoPRO®다중 샘플 마이크로 삼투압계(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)에서 어는점 강하를 통해 측정된다.
보조제
본 발명에 따른 백신은 하나 이상의 보조제와 조합된 적어도 하나의 지카 바이러스로부터의 하나 이상의 항원을 포함한다.
백신에 대한 보조제 효과를 달성하는 다양한 방법이 공지되어 있으며 본원에 개시된 상기 지카 바이러스 백신과 함께 사용될 수 있다. 일반 원칙 및 방법은 "The Theory and Practical Application of Adjuvants"1995, Duncan E. S. Stewart-Tull fed., John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471- 95170-6, 그리고 또한 "Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G 등 (eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9에 자세히 기술되어 있다.
예시적인/보조제는 알루미늄 염, 인산칼슘, 톨-유사 수용체(TLR) 작용제, 모노포스포릴 지질 A(MLA), MLA 유도체, 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, 사이토카인, 사포닌, 무라밀 디펩티드(MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람 음성균의 지질다당류(LPS), 폴리포스파젠, 에멀젼(오일 에멀젼), 키토산, 비타민 D, 스테아릴 또는 옥타데실 티로신, 비로솜, 코클레이트, 폴리(락타이드-코-글리코라이드) (PLG), 폴록사머 입자, 마이크로입자, 리포솜, 완전 Freund's 보조제(CFA), 및 불완전 Freund's 보조제(IFA)를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 보조제는 알루미늄 염이다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 보조제는 알룸(예를 들어, 수산화알루미늄), 인산알루미늄, 산화알루미늄 수산화물, 수산화알루미늄, 침전된 수산화알루미늄, 황산알루미늄칼륨, 및 알하이드로겔 85과 같은 겔상 수산화알루미늄 중 적어도 하나를포함한다. 이하, 특히 보조제로서 사용하기 위한 약학적으로 허용가능한 형태의 산화알루미늄 수산화물, 수산화알루미늄 및 침전 및/또는 겔형 수산화알루미늄을 총칭하여 "수산화알루미늄"으로도 지칭한다. 일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 알루미늄 염 보조제는 본 개시의 지카 바이러스 백신의 항원의 흡착을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 일부 실시형태에 있어서, 상기 항원의 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%가 알루미늄 염 보조제에 흡착된다.
본 개시의 특정 실시형태는, (a) 상기 백신과 알루미늄 염 보조제를 혼합하는 단계, 상기 백신은 본원에 개시된 적어도 하나의 지카 바이러스로부터 하나 이상의 항원을 포함. (b )약 1시간 내지 약 24시간(예를 들어, 약 16시간 내지 약 24시간) 범위의 기간 동안 항원의 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%가 알루미늄염 보조제에 흡착된 상태에서 적합 조건하에 인큐베이션하는 단계를 포함하는 보조제 첨가 지카 바이러스 백신을 제조하는 방법을 포함한다. 상기 방법의 특정의 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 지카 바이러스는 비-인간 세포 적응 돌연변이(예를 들어, 단백질 NS1에서의 비인간 세포 적응 돌연변이, 예컨대 Trp98Gly 돌연변이)를 포함하는 지카 바이러스이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 적어도 하나의 지카 바이러스는 서열번호 1의 위치 98 또는 서열번호 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 불활성화된 전체 지카 바이러스이다, 여기서 상기 지카 바이러스는 균주 PRVABC59로부터 유래된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 지카 바이러스는 서열번호 1의 위치 98 또는 서열번호 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 불활성화된 전체 지카 바이러스이다, 여기서 지카 바이러스는 서열번호 2에 따른 게놈 서열을 포함하는 균주 PRVABC59로부터 유래된다.
어떠한 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 알루미늄 염(예를 들어, 수산화알루미늄 /알룸)에 상기 지카 바이러스 항원(불활성화된 전체 지카 바이러스)을 흡수하는 것은 상기 지카 바이러스 항원의 안정성을 증진시킬 수 있다.
특정 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 보조제는 수산화알루미늄이다.
특정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 원소 알루미늄을 기준으로 100μg/ml 내지 800μg/ml 수산화알루미늄, 또는 200μg/ml 내지 600μg/ml 수산화알루미늄, 또는 300μg/ml 내지 500μg/ml 수산화알루미늄, 또는 약 400μg/ml 수산화알루미늄을 포함하는 액상 백신에 관한 것이다.
이러한 특정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 액상 백신에 관한 것으로 상기 액상 백신은 약 8.5mM 내지 약 50mM 트리스 및 약 50mM 내지 약 150mM NaCl, 및 원소 알루미늄을 기준으로 약 300μg/ml 내지 약 500μg/ml 수산화알루미늄을 포함한다, 여기서 상기 액상 백신의 pH는 실온에서 측정할 때 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0이다.
투여량
특정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 단위 투여량의 액상 백신에 관한 것이다.
이러한 특정의 실시형태에 있어서, 상기 단위 투여량의 액상 백신은 약 1μg 내지 약 15μg의 불활성화된 잔체 지카 바이러스의 투여량을 포함한다. 이러한 특정의 실시형태에 있어서, 상기 백신의 단위 투여량은 약 2μg의 불활성화된 전체 지카 바이러스 투여량을 포함한다. 이러한 특정의 실시형태에 있어서, 상기 백신의 단위 투여량은 약 5μg의 불활성화된 전체 지카 바이러스 투여량을 포함한다. 이러한 특정의 실시형태에 있어서, 상기 백신의 단위 투여량은 약 10μg의 불활성화된 전체 지카 바이러스 투여량을 포함한다.
특정의 실시형태에 있어서, 상기 백신의 단위 투여량은 약 0.4mL 내지 약 0.8mL의 약학적으로 허용가능한 액상으로 제공된다.
이러한 특정의 실시형태에 있어서, 단위 투여량의 액상 백신은 원소 알루미늄을 기준으로 약 100μg 내지 약 300μg의 수산화알루미늄, 예컨대 약 200μg의 수산화알루미늄을 포함한다. 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, "알루미늄 원소 기준"이라는 문구는 백신 제형의 알루미늄 함량이 특정되는 방식을 의미한다. 다양한 양의 물 및 (수화된)수산화알루미늄, 산화알루미늄 수산화물 및 관련 알루미늄 화합물의 복잡한 화학량론은 조성물의 알루미늄 함량을 나타내는 표준화된 방법을 필요로 한다. 이를 위해 일반적으로 "원소 알루미늄"으로 표현되는 알루미늄 이온의 양이 제공된다. 따라서, 예를 들어, "원소 알루미늄을 기준으로 100μg/ml 수산화알루미늄"을 함유하는 것으로 언급된 조성물(또는, 종종 짧은 형태로 발견되는 경우, "100 μg/ml 수산화알루미늄"을 함유하는 것으로 언급된 조성물)은 100μg/ml 수산화알루미늄 이온을 함유한다.
치료 방법
특정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 치료 또는 예방하는 특히 이를 필요로 하는 인간 대상체에서 지카 바이러스 감염을 예방하는 방법에 관한 것으로 본 발명에 따른 백신의 단위 투여량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
특정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 치료 또는 예방하는 특히 이를 필요로 하는 인간 대상체에서 지카 바이러스 감염을 예방하는 방법에 관한 것으로 본 발명에 따른 백신의 단위 투여량을 상기 인간 대상체의 개인별 인간대상체에 투여하는 것을 포함한다.
특정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 치료 또는 예방, 특히 이를 필요로 하는 인간 대상체에서 지카 바이러스 감염을 예방하는데 사용하기 위한 본 발명에 따른 백신의 단위 투여량에 관한 것이다.
특정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 이를 필요로 하는 인간 대상체에서 지카 바이러스 감염을 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명에 따른 백신의 단위 투여량의 사용에 관한 것이다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시는 본 발명에 따른 백신의 치료 유효량을 대상체에게 투여함으로써 이를 필요로 하는 대상체에서 지카 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 투여 단계는 대상체에서 지카 바이러스에 대한 보호 면역 반응을 유도한다.
이러한 특정 실시예에서, 상기 대상체는 여성 대상체이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 대상체는 임신 중이거나 임신할 예정이다.
본 개시의 방법은 본 개시의 지카 바이러스 백신의 치료적 유효량 또는 면역원성 양의 투여를 포함한다. 치료학적 유효량 또는 면역원성량은 투여되는 감염되지 않은, 감염된 또는 노출되지 않은 대상체에서 보호 면역 반응을 유도할 본 개시의 백신의 양일 수 있다. 이러한 반응은 일반적으로 백신에 대한 분비, 세포 및/또는 항체-매개 면역 반응으로 인해 대상체에서 발달을 초래할 것이다. 일반적으로 이러한 반응에는 다음 효과 중 하나 이상이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다; 면역글로불린 A, D, E, G 또는 M과 같은 임의의 면역학적 부류로부터의 항체 생산; B 및 T 림프구의 증식; 면역 세포에 대한 활성화, 성장 및 분화 신호 제공; 보조 T 세포, 억제 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포의 확장.
바람직하게는, 상기 치료적 유효량 또는 면역원성 양은 질병 증상의 치료 또는 예방을 유발하기에 충분하다. 정확한 필요한 양은 치료 대상체의 연령 및 전반적인 상태; 항체를 합성하는 대상체의 면역 체계 능력; 원하는 보호의 정도, 치료되는 상태의 심각성; 특히 선택된 특정 지카 바이러스 항원 및 그것의 투여 방식, 기타 다른 인자 등 치료 대상체에 따라 다르다. 적절한 치료 유효량 또는 면역원성 양은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 치료적 유효량 또는 면역원성 양은 일상적인 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것이다.
일반적으로, 본 개시의 백신은 액상 용액 또는 현탁액으로서 주사제로 제조된다.
백신은 통상적으로 주사에 의해, 예를 들어 피하, 경피, 피내, 피부밑(subdermally) 또는 근육내로 비경구적으로 투여될 수 있다. 다른 투여 방식에 적합한 추가 제형은 좌약 및 일부 경우에 경구, 퍼오랄(peroral), 비강내, 협측, 설하, 복강내, 질내, 항문 및 두개내 제형을 포함한다. 좌제의 경우, 전통적인 결합제 및 담체는 예를 들어 폴리알칼렌 글리콜 또는 트리글리세리드를 포함한다; 이러한 좌제는 0.5% 내지 10%, 또는 심지어 1-2% 범위의 주성분을 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다. 특정의 실시형태에 있어서, 지방산 글리세리드 또는 코코아 버터의 혼합물과 같은 저융점 왁스가 우선 용융되고 본원에 개시된 지카 바이러스 백신은 예를 들어 교반에 의해 균질하게 분산된다. 그 다음 상기 용융된 균일 혼합물을 알맞은 크기의 주형에 붓고 냉각시키고 고화시킨다.
본 개시의 백신은 투여 제형과 양립가능한 방식으로, 그리고 치료학적으로 유효하고 면역원성이 되는 양으로 투여될 수 있다. 상기 투여되는 양은 예를 들어 면역 반응을 일으키는 개인의 면역 시스템의 능력 및 원하는 보호 정도를 포함하여 치료되는 대상체에 따라 달라진다. 적합한 투여량 범위는 예를 들어 정제된 불활성화된 전체 지카 바이러스 약 0.1μg 내지 약 100μg을 포함할 수 있다.
초기 투여 및 부스터 샷(booster shot)에 적합한 요법은 또한 가변적이지만 초기 투여 후 후속 접종 또는 기타 투여에 의해 대표된다.
백신의 제조 방법
특정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 액상 백신의 제조 방법에 관한 것이다:
단계 1. 본 발명에 따른 불활성화 바이러스 조성물을 제공하는 단계,
단계 2. 보조제, 바람직하게는 알루미늄 염 및 임의로 추가의 약학적으로 허용가능한 완충액을 불활성화 바이러스 조성물에 첨가하는 단계.
이러한 특정의 실시형태에 있어서, 단계 2에서 추가의 약학적으로 허용가능한 완충액은 불활성화 바이러스 조성물에서 가장 높은 농도를 갖는 완충액과 동일한 완충액을 포함한다.
특정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 상기에 개시된 방법에 의해 얻어질 수 있는 생성물에 관한 것이다.
도 1은 ZIKAV 균주 PRVABC59로 감염된(하부) 또는 모의 감염된(상부) 베로(Vero) 세포 단층의 명시야 현미경 이미지를 나타낸다.
도 2는 TCID50에 의해 측정된, 베로 세포 단층상에 ZIKAV PRVABC59 P1의 성장 동역학을 나타낸다.
도 3은 지카 바이러스 PRVABC59 P5 클론 a-f의 역가 검정 시험(TCID50)을 나타낸다.
도 4는 베로 세포 단층상에서 지카 바이러스 PRVABC59 P6 클론 a-f의 성장의 세포변성 효과(CPE)를 도시하는 명시야 현미경 이미지를 나타낸다.
도 5는 지카 바이러스 PRVABC59 P6 클론a-f의 역가 검정 시험(TCID50)을 나타낸다.
도 6은 지카 바이러스 균주 PRVABC59 P6e(서열번호 8) 및 PRVABC59(서열번호 9)로부터의 잔기 330 근처에 있는 지카 바이러스의 외피 당단백질 서열을 여러 다른 플라비바이러스 (WNV (서열번호 10); JEV (서열번호 11), SLEV (서열번호 12); YFV (서열번호 13); DENV 1 16007 (서열번호 14); DENV 2 16681 (서열번호 15); DENV 3 16562 (서열번호 16); 및 DENV 4 1036 (서열번호 17))와 비교하는 아미노산 서열 정렬을 나타낸다.
도 7은 지카 바이러스 균주 PRVABC59 P6e(서열번호 18) 및 PRVABC59(서열번호 19)로부터의 잔기 98 근처에 있는 지카 바이러스의 NS1 단백질 서열을 여러 다른 플라비바이러스 (WNV (서열번호 20), JEV (서열번호 21), SLEV (서열번호 22); YFV (서열번호 23); DENV 1 16007 (서열번호 24); DENV 2 16681 (서열번호 25); DENV 3 16562 (서열번호 26); 및 DENV 4 1036 (서열번호 27))와 비교하는 아미노산 서열 정렬을 보여준다.
도 8은 ZIKAV PRVABC59 P1 바이러스와 비교한 ZIKAV PRVABC59 P6 바이러스 클론 a-f의 플라크(plaque) 표현형을 나타낸다.
도 9는 ZIKAV PRVABC59 P1 바이러스와 비교한 ZIKAV PRVABC59 P6 바이러스 클론의 평균 플라크 크기를 나타낸다.
도 10은 무혈청 성장 조건 하에 베로 세포에서 ZIKAV PRVABC59 P6 클론 a-f의 성장 동역학을 나타낸다.
도 11은 불활성화 데이터의 수집된 동역학을 보여준다. 데이터는 감염성 효능(TCID50)을 RNA 카피(copy)와 비교하고, 4개의 독성학 로트(Toxicology lot)로 부터의 샘플에 대한 불활성화 완전성(completeness of inactivation, COI)을 비교한다.
이러한 데이터는 COI 분석의 민감도가 TCID50보다 크다는 것을 나타낸다.
도 12는 0.31 TCID50의 입력 바이러스 역가로 입증된 바와 같이 상기 분석에서 C6/36 및 베로 민감도의 비교를 나타낸다.
도 13은 0.01 TCID50/웰(-2log TCID50/웰)의 목표 값 주위에 99% 신뢰 구간을 포함하는 C6/36 세포 부위를 사용한 CPE 대 log TCID50의 로지스틱 회귀 분석을 나타내며, 상기 모델은 웰의 0.85%가 양성일 것으로 예측한다.
도 14: 67일 동안 -80℃에서 저장 후, 트리스 + 7% 수크로오스 완충액 중의 지카 바이러스 백신 의약물질에 대한 SEC 크로마토그램에서 온전한 지카 바이러스에 상응하는 피크(체류 시간 약 8분)이다(이 피크는 예 3C, 표 16b에 상응한다).
도 15: 67일 동안 -80℃에서 저장 후, ZPB 완충액 중의 지카 바이러스 백신 의약물질에 대한 SEC 크로마토그램에서 온전한 지카 바이러스에 상응하는 피크(체류 시간 약 8분)이다(이 피크는 예 3C, 표 16b에 상응한다).
도 16: 5±3℃ 및 -80℃에서 10일 동안 보관한 후 남아 있는 온전한 지카 바이러스의 백분율(SEC에 의해 측정됨)(실시예 3A에 해당).
도 17: -80℃에서 60일 보관 후 남아 있는 온전한 지카 바이러스의 백분율(SEC에 의해 측정)(실시예 3B에 해당).
도 18: 5±3℃ 및 -80℃에서 67일 동안 보관한 후 남아 있는 온전한 지카 바이러스의 백분율(SEC에 의해 측정됨)(실시예 3C에 해당).
도 19: -80℃에서 3개월 보관 후 ZPB 및 트리스+Suc에서 지카 백신 의약물질을 위해 남아 있는 온전한 지카 바이러스의 백분율(SEC에 의해 측정)(실시예 3D에 해당).
도 20: 5±3℃에서 0 내지 60일 동안 보관한 후 ZPB 및 TBS에서 지카 백신 의약물질을 위해 남아 있는 온전한 지카 바이러스의 백분율(SEC에 의해 측정)(실시예 3E에 해당).
도 21: 반복된 동결-융해 주기 후에 남아 있는 온전한 지카 바이러스의 백분율(SEC에 의해 측정됨)(실시예예 3F에 해당).
도 2는 TCID50에 의해 측정된, 베로 세포 단층상에 ZIKAV PRVABC59 P1의 성장 동역학을 나타낸다.
도 3은 지카 바이러스 PRVABC59 P5 클론 a-f의 역가 검정 시험(TCID50)을 나타낸다.
도 4는 베로 세포 단층상에서 지카 바이러스 PRVABC59 P6 클론 a-f의 성장의 세포변성 효과(CPE)를 도시하는 명시야 현미경 이미지를 나타낸다.
도 5는 지카 바이러스 PRVABC59 P6 클론a-f의 역가 검정 시험(TCID50)을 나타낸다.
도 6은 지카 바이러스 균주 PRVABC59 P6e(서열번호 8) 및 PRVABC59(서열번호 9)로부터의 잔기 330 근처에 있는 지카 바이러스의 외피 당단백질 서열을 여러 다른 플라비바이러스 (WNV (서열번호 10); JEV (서열번호 11), SLEV (서열번호 12); YFV (서열번호 13); DENV 1 16007 (서열번호 14); DENV 2 16681 (서열번호 15); DENV 3 16562 (서열번호 16); 및 DENV 4 1036 (서열번호 17))와 비교하는 아미노산 서열 정렬을 나타낸다.
도 7은 지카 바이러스 균주 PRVABC59 P6e(서열번호 18) 및 PRVABC59(서열번호 19)로부터의 잔기 98 근처에 있는 지카 바이러스의 NS1 단백질 서열을 여러 다른 플라비바이러스 (WNV (서열번호 20), JEV (서열번호 21), SLEV (서열번호 22); YFV (서열번호 23); DENV 1 16007 (서열번호 24); DENV 2 16681 (서열번호 25); DENV 3 16562 (서열번호 26); 및 DENV 4 1036 (서열번호 27))와 비교하는 아미노산 서열 정렬을 보여준다.
도 8은 ZIKAV PRVABC59 P1 바이러스와 비교한 ZIKAV PRVABC59 P6 바이러스 클론 a-f의 플라크(plaque) 표현형을 나타낸다.
도 9는 ZIKAV PRVABC59 P1 바이러스와 비교한 ZIKAV PRVABC59 P6 바이러스 클론의 평균 플라크 크기를 나타낸다.
도 10은 무혈청 성장 조건 하에 베로 세포에서 ZIKAV PRVABC59 P6 클론 a-f의 성장 동역학을 나타낸다.
도 11은 불활성화 데이터의 수집된 동역학을 보여준다. 데이터는 감염성 효능(TCID50)을 RNA 카피(copy)와 비교하고, 4개의 독성학 로트(Toxicology lot)로 부터의 샘플에 대한 불활성화 완전성(completeness of inactivation, COI)을 비교한다.
이러한 데이터는 COI 분석의 민감도가 TCID50보다 크다는 것을 나타낸다.
도 12는 0.31 TCID50의 입력 바이러스 역가로 입증된 바와 같이 상기 분석에서 C6/36 및 베로 민감도의 비교를 나타낸다.
도 13은 0.01 TCID50/웰(-2log TCID50/웰)의 목표 값 주위에 99% 신뢰 구간을 포함하는 C6/36 세포 부위를 사용한 CPE 대 log TCID50의 로지스틱 회귀 분석을 나타내며, 상기 모델은 웰의 0.85%가 양성일 것으로 예측한다.
도 14: 67일 동안 -80℃에서 저장 후, 트리스 + 7% 수크로오스 완충액 중의 지카 바이러스 백신 의약물질에 대한 SEC 크로마토그램에서 온전한 지카 바이러스에 상응하는 피크(체류 시간 약 8분)이다(이 피크는 예 3C, 표 16b에 상응한다).
도 15: 67일 동안 -80℃에서 저장 후, ZPB 완충액 중의 지카 바이러스 백신 의약물질에 대한 SEC 크로마토그램에서 온전한 지카 바이러스에 상응하는 피크(체류 시간 약 8분)이다(이 피크는 예 3C, 표 16b에 상응한다).
도 16: 5±3℃ 및 -80℃에서 10일 동안 보관한 후 남아 있는 온전한 지카 바이러스의 백분율(SEC에 의해 측정됨)(실시예 3A에 해당).
도 17: -80℃에서 60일 보관 후 남아 있는 온전한 지카 바이러스의 백분율(SEC에 의해 측정)(실시예 3B에 해당).
도 18: 5±3℃ 및 -80℃에서 67일 동안 보관한 후 남아 있는 온전한 지카 바이러스의 백분율(SEC에 의해 측정됨)(실시예 3C에 해당).
도 19: -80℃에서 3개월 보관 후 ZPB 및 트리스+Suc에서 지카 백신 의약물질을 위해 남아 있는 온전한 지카 바이러스의 백분율(SEC에 의해 측정)(실시예 3D에 해당).
도 20: 5±3℃에서 0 내지 60일 동안 보관한 후 ZPB 및 TBS에서 지카 백신 의약물질을 위해 남아 있는 온전한 지카 바이러스의 백분율(SEC에 의해 측정)(실시예 3E에 해당).
도 21: 반복된 동결-융해 주기 후에 남아 있는 온전한 지카 바이러스의 백분율(SEC에 의해 측정됨)(실시예예 3F에 해당).
실시예
하기 실시예는 청구범위에 개시된 바와 같은 본 발명의 특정 측면 및 실시형태를 입증하기 위해 포함된다. 그러나, 아래의 기술은 단지 예시적이며 어떤 식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 받아들여서는 안 된다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다.
실시예 1: 클론 지카 바이러스 균주 생성
이 실시예는 알려진 연구 이력을 갖는 지카 바이러스(ZIKAV) 균주의 생산을 기술한다.
재료 및 방법
베로 세포막
WHO 베로 10-87 세포의 한 바이알을 수조에서 신속하게 해동시키고, 페니실린-스트렙토마이신, L-글루타민 40mM, 및 10% FBS를 함유하는 미리 가온된 DMEM(Dulbecco's modified minimal essential medium) 19mL에 36℃+/2℃, 5% CO2에서 T-75 cm2 플라스크 내에 직접 접종하였다. 세포를 컨플루언시(confluency)까지 성장시키고 TryplE를 사용하여 계대배양하였다. 이 플라스크를 2개의 T-185 cm2 플라스크로 확장하고, 컨플루언시까지 성장시키고, 31 xT-185 cm2 플라스크로 계대배양하여 세포가 100% 컨플루언시에 도달할 때까지 성장시켰다. 세포를 트립신 처리에 의해 수확하고, 800 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 1.9x107 세포/mL의 농도로 10% FBS 및 10% DMSO를 함유하는 DMEM에서 재현탁시켰다. 베로 세포의 한 바이알을 빠르게 해동하고 상기에 개시된 바와 같이 T-75 cm2 플라스크내로 소생시켰다. 이들을 13 x T-185 cm2 플라스크에서 세포 은행(cell bank)을 생성하기 위해 두 번 계대배양하였다. 트립신 처리 후, 상기 세포를 800 x g에서 원심분리하고 4.68x105 세포/mL의 농도로 동결 배지(10% FBS 및 10% DMSO를 함유하는 DMEM)에 재현탁시켰다. 이 세포 은행을 Cryovial에 앨리쿼트(aliquot)했다.
상기 베로 세포를 페니실린스트렙토마이신, L-글루타민 및 10% FBS(cDMEM-10%-FBS)를 함유하는 DMEM에서 성장시키고 유지시켰다. TryplExpress는 세포를 유지하고 트립신화하는데 사용되었다. 바이러스 흡착 2일 전에 6-웰 플레이트에 3mL의 cDMEM-10%-FBS에서 4-5 x 105개 세포/웰 또는 5mL cDMEM-10%-FBS에서 T-25cm2 플라스크 내로 7 x 105개 세포 또는 96-웰 플레이트에 0.1mL의 cDMEM-10%-FBS에서 1 x 104 세포/웰를 시딩(seeding)하였다 인큐베이터는 지시된 온도를 유지하기 위해 매일 모니터링되었다. 상기 베로 세포주는 액체 질소에 보관되었다.
플라크 분석
바이러스 역가는 6-웰 플레이트에서 성장한 베로 세포의 새로운 균일한 단층에서 플라크 적정에 의해 측정되었다. 동결된 앨리쿼트를 해동하고 96-웰 플레이트의 cDMEM-0%-FBS에서 만들어진 앨리쿼트의 10배 희석 시리즈를 만들었다. 상기 희석된 바이러스는 베로 세포 단층의 접종 전에 얼음 위에서 유지되었다. 분석 시, 6-웰 플레이트로부터 성장 배지를 흡인하고, 각 바이러스 희석액 100μL를 웰에 첨가하였다. 바이러스는 36℃±2℃, 5% CO2에서 60분 동안 흡착되었으며, 세포 시트의 건조를 방지하기 위해 플레이트를 자주(10분마다) 흔들었다. 바이러스 흡착 후, 40-41℃에서 유지된 첫 번째 아가로즈 오버레이 (1X cDMEM-2%-FBS+0.8% 아가로스) 4 mL를 각각의 웰에 첨가하였다. 상기 아가로스를 실온에서 30분 동안 고형화시킨 다음 플레이트를 5% CO2, 36℃+/2℃에서 4-6일 동안 거꾸로 인큐베이션하였다. 4일째에 160μg/mL의 중성 적색 바이탈 염료를 포함하는 두 번째 아가로스 오버레이 2mL를 추가하였다. 플라크는 5 및 6일째에 시각화되었다.
TCID50 분석에 의한 바이러스 정량화
바이러스 역가는 또한 96-웰 플레이트에서 성장한 베로 세포의 새로운 균일한 단층에서 적정에 의해 측정되었다. 동결된 앨리쿼트를 해동하고 96-웰 플레이트의 cDMEM-2%-FBS에서 만들어진 앨리쿼트의 10배 희석 시리즈를 만들었다. 상기 희석된 바이러스는 베로 세포 단층의 접종 전에 얼음 위에서 유지되었다. 분석 시, 96-웰 플레이트로부터 성장 배지를 흡인하고, 각 바이러스 희석액 100μL를 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 36℃℃5% CO2에서 5일 동안 인큐베이션하였다. Reed/Muench 계산기를 사용하여 50% 조직 배양 감염 투여량(TCID50) 역가를 계산하였다.
시험 항목
지카 바이러스 균주 PRVABC59(드라이아이스 상의 0.5mL 바이알 1개)를 질병통제예방센터 (CDC)로부터 받았으며 지카 바이러스 식별은 RT-PCR을 통해 확인되었다. 상기 균주는 PCR에 의해 알파바이러스 및 마이코플라스마 오염에 대해 음성으로 시험되었다. 이 정보는 표 1에 요약되어 있다.
| 균주 | 분리 정보 | 환자 정보- | 프랩(Prep) 정보 | 분석 | PFU |
| PRVABC59 (Asian) |
인간 혈청; 2015년 푸에르토리코로 여행 |
제공되지 않음 | 계대(Passage): 베로(2)C6/36(1) Prep: 2016년 1월 29일 호스트: C6/36 |
■ 이온토렌트에 의한 시퀀싱: ■ 유전자 접근 #KU501215 ■ 플라크 분석에 의한PFU ■ RT-PCR에 의한 식별 ■ (-) PCR에 의한 알파바러스 경우 ■ (-) ATCC 및 ABM PCR에 의한 마이 코플라스마의 경우 |
6.7 log pfu/mL |
시퀀싱
QIAampViral RNA Mini Spin 키트를 사용하여 제조업체 프로토콜에 따라 각 분리주의 안정화된 바이러스 수확물로부터 RNA를 추출하였다. 각 분리주에서 추출된 RNA를 사용하여 전체 지카 바이러스 게놈을 포함하는 6개의 cDNA 단편을 만들고 증폭하였다. 증폭된 cDNA 단편을 1% 아가로스/TBE 겔상에서 크기와 순도에 대해 분석한 후 퀴아진 빠른 젤 추출 키트(Qiagen Quick Gel Extraction Kit)를 사용하여 겔 정제하였다. ABI 3130XL 유전자 분석기 시퀀서를 사용하여 자동 시퀀싱 반응을 수행하였다. Lasergene SeqMan 소프트웨어를 사용하여 시퀀싱 데이터를 분석하였다.
결과
아메리카에서 현재 ZIKAV 발병과 관련된 알려진 연구 이력을 가진 ZIKAV 균주를 찾았다. 이러한 이유로 ZIKAV 균주 PRVABC59가 선택되었다. 베로 세포에서 성장하도록 적응된 잘 특성화된 바이러스를 생성하기 위해 ZIKAV PRVABC59를 먼저 베로 세포(P1)에서 증폭하였다.
100% 컨플루언트한 베로 세포의 플라스크(T1 75cm2)를 4mL의 cDMEM-0%-FBS에서 MOI 0.01로 감염시켰다. 바이러스는 36℃±2℃, 5% CO2에서 60분 동안 단층에 흡착된 다음 20mL의 cDMEM-0%-FBS를 36℃±2℃, 5%CO2에서 바이러스 증폭을 위해 적용하였다 접종 후 세포변성 효과(CPE)에 대해 세포층을 매일 모니터링하였다(도 1). 배지를 수집하고 원심분리(600 x g, 4℃, 10분)에 의해 청징함으로써 96시간 후에 상등액을 수확하였다. 트레할로스를 18% w/v의 최종농도로 첨가하여 수확물을 안정화시켰다. 상기 벌크를 0.5mL Cryovial에 앨리쿼트하고 -80℃에서 보관하였다.
안정화된 P1 수확물을 TCID50 분석에 의해 베로 세포 단층 상의 감염성 바이러스의 존재에 대해 분석하였다. 성장 동력학은 0시간에 시작하여 매일 앨리쿼트를 취하여 모니터링 하였다. 피크 역가는 72시간에 도달하였다(도 2).
P1 물질은 베로 세포의 6-웰 단층에서 3일째의 수확물을 적정함으로써 플라크-정제되었다. 플라크는 6일째에 시각화되었으며, 분리되는 플라크 10개는 플라스틱 플레이트 바닥에 있는 뚜렷하고 분리된 플라크 주위에 원을 그려 식별하였다. 웰의 바닥을 긁고 cDMEM-10%-FBS로 헹구면서 멸균 광폭 피펫을 사용하여 아가로스 플러그(plug)를 추출함으로써 플라크를 선별하였다. 상기 아가로스 플러그를 0.5mL의 cDMEM-10%-FBS에 첨가하고, 보텍스(vortex)하고, PRVABC59 P2a-j로 라벨에 표기하고, 5% CO2에서 36℃±2℃의 인큐베이터에 밤새 두었다.
3개의 플라크(PRVABC59 P2a-c)를 추가 정제를 위해 이월시켰다. 각 분리물을 베로 세포의 새로운 6-웰 단층에 이중으로 적절하게 도말하였다. 이 P2/P3 전이는 플라크 정제되었고 PRVABC59 P3a-j로 라벨에 표기 되었다.
6개의 플라크(PRVABC59 P3a-f)는 정제의 최종 단계를 위해 이월되었다. 각 분리물을 베로 세포의 새로운 6-웰 단층에 이중으로 적절하게 도말하였다. 상기P3/P4 전이는 플라크 정제되었고 PRVABC59 P4a-j로 라벨에 표기 되었다.
P4 플라크 정제로부터의 6개의 플라크(PRVABC59 P4a-f)를 T-25 cm2 플라스크내의 베로 세포의 단층 상에서 단순 계대하였다. 각 플라크 픽(pick)은 2mL cDMEM-0%-FBS로 희석되었는데 1mL은 36℃±2℃, 5% CO2에서 1시간 동안 흡착되었고; 나머지 1mL는 트레할로스(최종 18% v/v)로 안정화하고 <-60℃에서 보관하였다. 바이러스 흡착 후, cDMEM-0%-FBS를 각 플라스크에 첨가하고 36℃±2℃, 5% CO2에서 4일 동안 성장되도록 하였다. 바이러스 상등액을 수확하고 원심분리(600 x g, 4C, 10분)로 청징하고 18% 트레할로스에서 안정화하고 앨로쿼트하여 <-60℃에서 보관하였다. 이 P5 시드는 지카 바이러스 역가에 대해 TCID50에 의해 테스트되었다(도 3).
베로 세포의 T-175 cm2 플라스크의 컨플루언트 단층을 4mL cDMEM-0%-FBS 중 MOI 0.01로 PRVABC59(P5a-f)의 6개 클론 각각을 감염시켰다. 상기 바이러스를 36℃+/2℃, 5% CO2에서 60분 동안 흡착시킨 후, 20mL의 cDMEM-0%-FBS를 각 플라스크에 첨가하고 36℃+/2℃, 5% CO2에서 성장하도록 두었다. 베로 세포 단층 상태 및 CPE를 매일 모니터링하였다. 바이러스는 3일 및 5일에 수확되었다(도 4). 3일과 5일차의 P6 균주 수확물을 모아서 18% 트레할로스로 안정화하고 앨로쿼트하여 <-60℃에 보관하였다.
PRVABC59(P6a-f)의 6개 클론 각각을 시험관내 역가에 있어서 지카 바이러스에 대해 시험하였다(도 5). 상기 역가는 TCID50 및 플라크 적정의 두 가지 다른 방법에 의해 측정되었다. TCID50은 CPE(현미경)의 육안 검사와 CPE(노란색)를 표시하는 웰의 흡광도 차이(A560-A420)를 빨간색(CPE 없음)과 비교하여 측정함으로써 계산하였다. 상기 플레이트를 플레이트 판독기에서 판독하고 현미경으로 판독된 플레이트(흡광도)와 동일한 계산기에 적용하였다. 두 스코어링(scoring) 기술 사이의 TCID50 값은 매우 유사하지만 플라크 적정에 의해 얻은 값은 더 낮다.
P6 바이러스의 생성 및 특성화에 대한 요약은 하기 표 2에 나타나 있다.
| 계대 | 시드 생성/정제 | 특성화 |
| Pl | 베로에서의 바이러스 증폭 | TCID50 역가 |
| P2 | 플라크 적정에 의한 PI 증폭, PI의 플라크 정제 | 플라크 정제 |
| P3 | P2 플라크 분석에서 플라크 선택 및 계대, P2의 플라크 정제 | 플라크 정제 |
| P4 | P3 플라크 분석에서 플라크 선택 및 계대; P3의 플라크 정화 | 플라크 정제 |
| P5 | 베로 세포에서 P4 플라크(a-f) 증폭 | TCID50 역가 |
| P6 | 베로 세포에서 P5(a-f) 바이러스 증폭 | TCID50 역가, 플라크 표현형, 유전자형, 전체 게놈 시퀀싱, 성장 동역학 |
플라비바이러스의 외피 단백질이 바이러스의 우세한 면역원성 부분이기 때문에 오리지날 분리물의 외피 당단백질 서열과 매우 유사한 분리된 지카 바이러스 클론을 찾았다. PRVABC59 클론 P6a, P6c, P6d 및 P6f는 외피 영역(G990T)의 뉴클레오티드 990에서 G->T 돌연변이를 포함하여 외피 잔기 330에서 Vai-->Leu의 아미노산 돌연변이를 초래한 반면, PRVABC59 클론 P6b 및 P6e의 외피 유전자는 참조 균주(GenBank ref KU501215.1)에 대해 동일하였다(표 3 및 도 6).
| 외피 시퀀싱(PRVABC59로부터의 참조 유전자; 수탁 번호 KU501215) | ||||
| 균주 | 뉴클리오티드 | 아미노산 | 돌연변이 | 비고 |
| PRVABC59P6a | Env-990: G-->T |
Env-330: Val330-->Leu |
Val/Leu | 4개의 판독 중 3개에서 돌여변이. |
| PRVABC59P6b | Env-1404: T-->G 침묵 |
야생형 | 야생형 | 참조에 대해 비교적 야생형 |
| PRVABC59P6c | Env-990: G->T |
Env-330: Val330--≫ |
Val/Leu | 4개의 판독 중 3개에서 돌여변이. |
| PRVABC59P6d | Env-990: G-->T |
Env-330: Val330--≫ |
Val/Leu | 2개의 판독 중 2개에서 돌여변이. |
| PRVABC59P6e | 야생형 | 야생형 | 야생형 | 참조에 대해 비교적 야생형 |
| PRVABC59P6f | Env-990: G-->T |
Env-330: Val330-->Leu |
Val/Leu | 2개의 판독 중 2개에서 돌여변이. 190bp는 시퀀싱되지 않음 (aa 421 - 484). |
| 전체 게놈 시퀀싱(PRVABC59의 참조 유전자, 접근 #KU501215) | ||||
| 균주 | 뉴클리오티드 | 아미노산 | 돌연변이 | 비고 |
| PRVABC59P6b | Env-1404 T-->G |
야생형 | 침묵 | 2개의 판독 중 2개에서 돌연변이. |
| NS 1-292 T-->G |
NS 1-98 Trp98-->Gly |
Trp/Gly | 2개의 판독 중 2개에서 돌연변이. | |
| PRVABC59P6e | NS 1-292 T-->G |
NS 1-98 Trp98-->Gly |
Trp/Gly | 2개의 판독 중 2개에서 돌연변이. |
지카 외피 서열내 돌연변이가 없는 2개의 클론은 이어서 전체 게놈 시퀀싱을 거쳤다. 시퀀싱 결과는 상기 표 3에 요약되어 있다. 서열 분석은 두 클론 모두에 대해 NS1 영역의 뉴클레오티드 292에서 T-->G 치환이 나타났고 그 결과 NS1 잔기 98에서 Trp->Gly 돌연변이를 초래하였다. 이 돌연변이는 나중에 딥 시퀀싱을 통해서도 확인되었다. 상기 NS1 W98G 돌연변이는 막 결합, 외피 단백질과의 상호작용 및 잠재적으로 6량체 NS1 형성과 관련이 있는 ZIKAV NS1의 날개 영역의 얽힌 루프에 위치한다. 다른 트립토판 잔기(W115, W118)는 플라비바이러스에 걸쳐 고도로 보존되지만 W98은 그렇지 않다(도 7). 그러나 흥미롭게도 W98 잔기의 100% 보존은 아프리카 및 아시아 계통의 것을 포함하여 11개의 다른 ZIKAV 균주에 걸쳐 관찰된다. 각 균주에서 확인된 돌연변이는 표 4에 요약되어 있다.
| 외피에서 확인된 돌연변이 | ||
| 클론 | 뉴클리오티드 | 아미노산 |
| P6a | G990T | V330L |
| P6b | T1404G | (침묵) |
| P6c | G990T | V330L |
| P6d | G990T | V330L |
| P6e | 없음 | 없음 |
| P6f | G990T | V330L |
| 게놈에서 확인된 추가 돌연변이 | ||
| 클론 | 뉴클리오티드 | 아미노산 |
| P6b | NS1-T292G | NS1-W98G |
| P6e | NS1-T292G | NS1-W98G |
| 참조 서열: KU501215.1 (PRVABC59) | ||
ZIKAV 클론을 특성화하기 위해 ZIKAV PRVABC59 P6 스톡(stock)의 표현형 분석을 수행하였다. 도 8에 도시되고 도 9에 정량화된 바와 같이, 각각의 클론 분리물은 크고 작은 플라크의 혼합 개체군을 갖는 P1 바이러스와 비교하여 상대적으로 균질한 큰 크기의 플라크 개체군으로 구성되어 있다. 이러한 데이터는 단일 ZIKAV 클론의 성공적인 분리를 제안한다.
다음으로, ZIKAV PRVABC59 P6 클론의 베로 세포에서 성장 동역학 분석을 분석하였다. 베로 세포를 무혈청 성장 배지에서 각 ZIKAV P6 클론의 0.01 TCID50/세포로 감염시켰다. 바이러스 상등액 샘플을 매일 채취하고 동시에 TCID50 분석에 의해 감염 역가에 대해 분석하였다. 모든 P6 클론에서 피크 역가는 3일과 4일 사이에 발생하였다(~9.0 log10 TCID50/mL). 다양한 P6 클론의 성장 동역학에는 유의한 차이가 없었다(도 10).
종합하면, 상기 결과는 지카 바이러스 시드가 성공적으로 생성되었음을 나타낸다. 이 시드 선택은 바이러스의 성장 이력, 동역학, 수확량, 유전자형 및 표현형에 대한 이해를 요구한다. 중요하게는, 지카 바이러스 균주의 클론 분리를 통해 오염 인자(예: 모체 인간 분리물에 있을 수 있는 외래성 인자)로부터 바이러스를 성공적으로 정제할 수 있었다. 흥미롭게도, 3개의 순차적 플라크 정제는 베로-세포 적응 바이러스(균주 P6a-f)를 신속하게 선택하는데 성공하였고, 여기서 이들 균주는 무혈청 베로 세포 배양에서 잘 복제될 수 있었으며, 균주 P6a, c, d, 및 f는 바이러스 외피 단백질에 돌연변이가 있었고, 균주 p6b 및 p6e는 바이러스 NS1 단백질 내에서 돌연변이(바이러스 외피에 대한 변형없이)를 얻었다. 추가적으로 상기 베로 적응 균주는 이러한 균주에서 전파된 후속 바이러스 계대의 효율적이고 재현 가능한 성장 및 제조를 가능하게 하였다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만 Env 330에서의 돌연변이가 Vero 세포에서 계대시에도 관찰되었기 때문에 균주 P6a, c, d 및 f에서 관찰된 Env-V330L 돌연변이는 잠재적으로 시험관 내 적응의 결과일 수 있다 (Weger-Lucarelli 등. 2017 Journal of VirologyJournal of Virology). 외피 단백질은 지카 바이러스의 지배적인 면역원성 부위이기 때문에 Env에 베로 적응 돌연변이를 포함하는 균주는 백신 면역원성에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 단백질 NS1 에서의 적응 돌연변이는 바이러스 복제를 증진시킬 뿐만 아니라, 지카 바이러스의 외피 단백질 E(Env) 에서와 같이 바람직하지 않은 돌연변이의 발생을 감소시키거나 그렇지 않으면 억제할 수 있다. 또한 NS1은 바이러스의 수명 주기 동안 외피 단백질에 결합하는 것으로 알려져 있다. 이 돌연변이(NS1 W98G)는 다운스트림 처리 동안 바이러스와 연합하고 가능하게는 공동-정제(co-purify)하는 NS1의 능력을 변화시키는 것과 관련이 있을 수 있다. NS1은 또한 면역원성이 있는 것으로 알려져 있으며 백신에 대한 면역 반응과 관련될 수 있다.
실시예 2: 불활성화의 유효성을 측정하기 위한 불활성화 분석의 완전성
불활성화 완전성(completibility of inactivation, COI) 분석이라고도 하는 이중 감염성 분석은 포름알데히드-불활성화(0.01% 포름알데히드)의 효과 및 정제된 불활성화 지카 바이러스(PIZV) 벌크 의약물질(BDS)의 잠재적 잔류 감염성 바이러스 활성을 측정하기 위해 개발되었다.
샘플 제조: 상기에서 개시된 클론 e의 4개의 정제된 불활성화된 지카 백신(PIZV) 로트(Tox 로트 1-4)는 베로 세포에서의 성장에 의해 제조되었다. 매일 4회 수확한 상등액(총 약 4000mL)을 크로마토그래피로 정제한 후 포름알데히드를 0.01% w/v의 최종 농도로 첨가하였다. 불활성화를 22℃에서 10일 동안 진행하도록 하였다. 공정괸리(IPC) 샘플은 특성화 및 분석을 위해 불활성화하는 동안 벌크 의약물질(BDS)으로부터 매일 제거되었다. 매일 IPC 샘플을 메타중아황산나트륨으로 중화하고 DMEM(바이러스 성장 배지)내로 투석하였다. 상기 샘플에는 정제된 불활성화된 지카 바이러스가 포함되어 있다. 불활성화 마지막 날, BDS 샘플의 나머지 부피는 중화되지 않았지만, 포름알데히드를 제거하기 위해 TFF로 처리되었고 PBS로 버퍼 교환되었다.
불활성화 분석의 완전성(COI): COI 분석은 불활성화의 동역학 및 최종 BDS를 이해하기 위해 일일 IPC 샘플에서 불활성화의 유효성 분석에 사용되었다. 최대 감도를 위해, IPC 및 DS 샘플내에 잠재적인 살아있는 바이러스를 검출하기 위해 이 분석에서 2개의 세포주, 베로 및 C6/36이 처음으로 사용되었다. 지카 바이러스가 페놀 레드를 함유한 성장 배지의 존재하에 베로 세포를 감염시키면 세포 사멸의 부산물은 pH를 저하시킨다. 결과적으로 상기 배지 색상이 빨간색/분홍색에서 노란색으로 변하는데, 이는 배지 pH에서 산성 변화를 나타낸다. 이러한 현상은 바이러스 복제 동안 바이러스 침입, 감염 및 세포로부터의 발아에 의해 유발되는 숙주 세포의 세포 구조에서의 관찰된 변화를 지칭하는 세포자멸 및 세포변성 효과(CPE) 에 의해 야기된다. 궁극적으로 C6/36 모기와 베로 세포는 모두 감염을 허용하는 세포주이지만 지카 바이러스 감염은 시험관 내에서 베로 세포만 죽인다. 따라서 베로 세포를 분석의 지표 세포주로 사용하였다. 대조적으로, 지카 바이러스를 위한 천연 숙주 벡터로부터 유래한 C6/36 세포는 지카 감염 시 CPE를 나타내지 않고 용해되지 않는다. 상기 배지는 색상을 변경하지 않으며 C6/36 세포의 생존력은 변경되지 않는다.
따라서 상기 분석은 두 부분으로 나뉜다: 분석의 첫 번째 부분은 6일 동안 2개의 감수성 세포주의 96-웰 플레이트상에서 잠재적으로 살아있는 바이러스 입자의 병렬 증폭을 허용한다. 분석의 두 번째 단계는 96웰-플레이트(잠재적으로 증폭된 입자 포함)의 상등액을 베로 세포의 단층을 포함하는 6웰-플레이트로 옮기고 베로 세포 상에서 발생하는 바이러스 감염 및 세포변성 효과를 허용하기 위해 다른 8일 동안 인큐베 이션하는 것을 포함한다. 관찰된 모든 CPE는 광학 현미경을 사용하여 확인하였다.
첫 번째 분석 부분에서 96웰 플레이트, 즉 C6/36 세포에서의 배양, 및 두 번째 분석 부분에서 6웰 플레이트, 즉 베로 세포의 배양을 세포병변 효과를 관찰하는 용도에 대해 상세히 개시하고 있지만, 상기 분석은 하기 표 5에 나타낸 바와 같이 같이 쉽게 스케일 업(scale up)될 수 있다.
| 분석 파트 1: BDS 적용(권장 볼륨 범위 내에 있어야 함) | 분석 파트 2: 베로로 이송(이송을 위해 풀링된 볼륨(pooled volume)을 수용해야 함) | |||||
| 권장 볼륨 범위(성장용) | cm2당 mL 샘플 | 웰당(또는 플라스크당) vol. 접종원 | 15X 스케일-업에 필요한 용기 # : 2배 희석 | 15X 스케일-업에 필요한 용기 # : 5배 희석 | 이송을 위한 풀링된 볼륨(mL) | |
| 100-200 μL | 0.3125 | 0.1 | ||||
| 0.076-1.14 ml | 0.3125 | 1.188 | 6.48 | 16.21 | 11.88 | |
| 1.9-2.9mL | 0.3125 | 2.969 | 4.32 | 10.81 | 17.81 | 0.0526 |
| 5-7.5 mL | 0.3125 | 7.813 | 9.86 | 24.64 | 7.813 | 0.0526 |
| 15-22.5 mL | 0.3125 | 23.438 | 3.29 | 8.21 | 23.438 | 0.0526 |
| 30-45 mL | 0.3125 | 46.875 | 1.64 | 4.11 | 46.88 | 0.0526 |
| 35-52.5 | 0.3125 | 54.688 | 1.41 | 3.52 | 54.69 | 0.0526 |
| 47-70.5 | 0.3125 | 73.438 | 1.05 | 2.62 | 73.44 | 0.0526 |
| 30-40 mL | 0.3125 | 93.750 | 0.82 | 2.05 | 93.75 | 0.0526 |
| 150-200 | 0.3125 | 198.750 | 0.39 | 0.0526 | ||
| 300-400 | 0.3125 | 397.500 | 0.19 | 0.0526 | ||
| 1500-2000 | 0.3125 | 19800.000 | 0.00 | 0.0526 | ||
스케일 업 동안 용기 cm2당 샘플의 부피는 파트 1에 대해 일정하게 유지되며 동일한 바이러스 감염 조건이 파트 2에서 유지되는 것이 분명하다.
COI분석 대조군: 이 분석을 위한 역가 및 역 적정 대조군은 베로 표시자 세포를 사용하여 수행하였고, 웰을 갖는 TCID50 96-웰 형태에서, 세포 사멸에 대한 대용물, 또는 CPE의 존재 시 배지 색상이 분홍색에서 노란색으로 변하는 것에 기초한 양성 스코어를 점수로 기록하였다.
바이러스 역가 대조군 시험: 공지된 역가의 대조군 바이러스(PRVABC59)의 2개의 독립적인 복제물을 2% FBS를 함유하는 배지 내에서 10배 희석 시리즈로 처리하고, 각 희석액 100μL을 베로 세포를 함유하는 96-웰 플레이트의 4개의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 5일 동안 인큐베이션한 다음 CPE를 포함하는 웰을 기록하고 Reed-Meunch 계산기를 사용하여 바이러스 역가를 계산하였다.
바이러스 역적정 대조 시험: 역가가 알려진 대조 바이러스를 200 TCID50으로 연속적으로 희석하였다. 상기 200 TCID50 대조군 바이러스의 2개의 독립적인 복제물을 2% FBS를 함유하는 배지에서 2배 희석 시리즈로 처리하고, 각각의 희석액 100μL를 베로 세포를 함유하는 96-웰 플레이트의 4개의 웰에 첨가하였다.
플레이트를 5일 동안 인큐베이션한 다음 CPE를 함유하는 웰을 기록하고 Reed-Meunch 계산기를 사용하여 바이러스 역가를 계산하였다.
자세한 COI 프로토콜:
1. 분석의 첫 번째 부분: 샘플을 첨가하기 2일 전에 베로(1.4E+05 세포/mL) 및 Aedes aegypti 모기 C6/36(4E+05 세포/mL) 세포를 96-웰 플레이트에 시드하였다. 베로 세포는 37℃에서 DMEM+10% 최종 FBS+2% L-글루타민+1% 페니실린/스트렙토 마이신에서 배양되었다. C6/36 세포는 28℃에서 DMEM+10% FBS+2% L-글루타민 + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 1% 비필수 아미노산에서 배양되었다.
2. 200 TCID50 대조군 바이러스(바이러스 역 적정 대조군 테스트에서 제조) 또는 DS 샘플의 3개의 독립적인 복제물을 2% FBS를 함유하는 배지에 희석(5배 및 10배 희석)하였다.
3. 96-웰 플레이트의 세포에 상기 샘플을 접종하였다. 96-웰 플레이트에서 세포 단층을 감염시키기 전에 가능한 응집을 방해하기 위해 샘플을 보텍스 하였다. 100μL의 각 희석액을 각각 베로 및 C6/36 세포를 포함하는 2개의 개별 96-웰 플레이트 각각 5개의 웰에 적용하였다.
4. 배지는 단독으로 음성 CPE 대조군으로서 각 세포 유형에 대해 다른 웰에 포함되었다.
5. 플레이트를 세포주에 적합한 온도에서 6일 동안 인큐베이션하였다.
6. 분석의 두 번째 부분: 살아있는 바이러스가 허용 세포주에서 CPE에 의해 추가로 증폭되고 시각화되도록 하기 위해 베로 및 C6/36 세포의 각 96-웰 상등액의 전체 부피를 베로 세포의 6-웰 플레이트의 개개의 웰로 옮겼다. 접종은 15분 간격으로 흔들면서 90분 동안 진행되었다.
7. 2% FBS를 함유하는 배지를 웰에 첨가하고 CPE의 기능으로 증폭된 샘플의 후속 검출을 위해 플레이트를 추가 8일 동안 인큐베이션하였다. 상기 불활성화는 DS의 복제물 중 어느 것이 8일째 종료 시점에 CPE를 나타낸다면 불완전한 것으로 간주되었다.
7. 살아있는/복제 바이러스 입자의 존재는 6-웰 플레이트로 옮기고 바이러스 복제를 허용하기 위해 8일 동안 인큐베이션한 후 감수성 세포 단층상에 플라크 또는 CPE의 형성에 의해 시각화되었다. 분석 종료 시 6-웰 플레이트에서 % CPE 점수를 다음과 같이 계산하였다.
베로 세포의 각 6-웰 플레이트는 비색 변화 시각화에 의해 CPE에 대해 검사한 다음 도립 광학 현미경으로 검사하여 CPE를 확인하였다.
각 6-웰 플레이트는 상기에 개시한 5배 및 10배 희석액으로 제조된 DS 희석액의 복제물 중 하나를 나타낸다(5개 웰 및 배지 단독을 포함하는 1개 웰).
따라서 각 복제에 대한 % CPE는 샘플당 총 5개의 웰 중 CPE가 있는 웰의 수를 반영한다(분석 당 총 120개의 웰이 사용된다). 평균 % CPE 및 표준 편차는 각 희석액의 3회 반복을 기반으로 계산되었다.
결과: 하기 표6 내지 9에 나타낸 바와 같이 각각의 톡스 로트 #1-4 에서 일일 샘플을 분석하였다.
| 샘플 | 이송 | 평균 %CPE |
STDV |
| 1:10 Day-1 | 베로-to-베로 | 100 | 0 |
| 1:10 Day 0 | 베로-to-베로 | 100 | 0 |
| 1:10 Day 1 | 베로-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 Day 2 | 베로-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 Day 3 | 베로-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 Day 4 | 베로-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 Day 7 | 베로-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 Day 8 | 베로-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 Day 9 | 베로-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 Day 10 | 베로-to-베로 | 0 | 0 |
| 100TCID50/mL | 베로-to-베로 | 100 | 0 |
| 1:10 Day-1 | C6/36-to-베로 | 100 | 0 |
| 1:10 Day 0 | C6/36-to-베로 | 100 | 0 |
| 1:10 Day 1 | C6/36-to-베로 | 6.7 | 12 |
| 1:10 Day 2 | C6/36-to-베로 | 13.3 | 12 |
| 1:10 Day 3 | C6/36-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 Day 4 | C6/36-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 Day 7 | C6/36-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 Day 8 | C6/36-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 Day 9 | C6/36-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 Day 10 | C6/36-to-베로 | 0 | 0 |
| 100TCID50/mL | C6/36-to-베로 | 100 | 0 |
| 샘플 | 이송 | 평균 %CPE |
STDV |
| 1:10 일-1 | 베로-to-베로 | 100 | 0 |
| 1:10 일 0 | 베로-to-베로 | 100 | 0 |
| 1:10 일 1 | 베로-to-베로 | 100 | 0 |
| 1:10 일 2 | 베로-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 3 | 베로-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 4 | 베로-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 7 | 베로-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 8 | 베로-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 9 | 베로-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 10 | 베로-to-베로 | 0 | 0 |
| 100TCID50/mL | 베로-to-베로 | 100 | 0 |
| 1:10 일-1 | C6/36-to-베로 | 100 | 0 |
| 1:10 일 0 | C6/36-to-베로 | 100 | 0 |
| 1:10 일 1 | C6/36-to-베로 | 100 | 12 |
| 1:10 일 2 | C6/36-to-베로 | 13.3 | 12 |
| 1:10 일 3 | C6/36-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 4 | C6/36-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 7 | C6/36-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 8 | C6/36-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 9 | C6/36-to-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 10 | C6/36-to-베로 | 0 | 0 |
| 100TCID50/mL | C6/36-to-베로 | 100 | 0 |
| 샘플 | 이송 | 평균 %CPE |
STDV |
| 1:10 일-1 | 베로-to-베로 | 100 | 0 |
| 1:10 일 0 | 베로-에서-베로 | 100 | 0 |
| 1:10 일 1 | 베로-에서-베로 | 27 | 12 |
| 1:10 일 2 | 베로-에서-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 3 | 베로-에서-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 4 | 베로-에서-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 7 | 베로-에서-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 8 | 베로-에서-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 9 | 베로-에서-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 10 | 베로-에서-베로 | 0 | 0 |
| 100TCID50/mL | 베로-에서-베로 | 100 | 0 |
| 1:10 일-1 | C6/36-에서-베로 | 100 | 0 |
| 1:10 일 0 | C6/36-에서-베로 | 100 | 0 |
| 1:10 일 1 | C6/36-에서-베로 | 87 | 12 |
| 1:10 일 2 | C6/36-에서-베로 | 27 | 12 |
| 1:10 일 3 | C6/36-에서-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 4 | C6/36-에서-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 7 | C6/36-에서-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 8 | C6/36-에서-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 9 | C6/36-에서-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 10 | C6/36-에서-베로 | 0 | 0 |
| 100TCID50/mL | C6/36-에서-베로 | 100 | 0 |
| 샘플 | 이송 | 평균 %CPE |
STDV |
| 1:10 일-1 | 베로-에서-베로 | 100 | 0 |
| 1:10 일 0 | 베로-에서-베로 | 93 | 12 |
| 1:10 일 1 | 베로-에서-베로 | 0 | |
| 1:10 일 2 | 베로-에서-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 3 | 베로-에서-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 4 | 베로-에서-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 7 | 베로-에서-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 8 | 베로-에서-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 9 | 베로-에서-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 10 | 베로-에서-베로 | 0 | 0 |
| 100TCID50/mL | 베로-에서-베로 | 100 | 0 |
| 1:10 일-1 | C6/36-에서-베로 | 100 | 0 |
| 1:10 일 0 | C6/36-에서-베로 | 100 | 0 |
| 1:10 일 1 | C6/36-에서-베로 | 33 | 23 |
| 1:10 일 2 | C6/36-에서-베로 | 7 I |
12 |
| 1:10 일 3 | C6/36-에서-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 4 | C6/36-에서-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 7 | C6/36-에서-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 8 | C6/36-에서-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 9 | C6/36-에서-베로 | 0 | 0 |
| 1:10 일 10 | C6/36-에서-베로 | 0 | 0 |
| 100TCID50/mL | C6/36-에서-베로 | 100 | 0 |
불활성화 데이터의 수집된 동역학: 4개의 독성학 로트로부터의 샘플에 대한 COI 데이터를 상기에 개시된 바와 같은 측정된 감염 역가(TCID50) 및 RNA 카피와 비교하였다. 상기 RNA 카피는 샘플로부터 핵산을 정제하고 RT-PCR 키트를 사용하여 혈청형 특이적 프라이머로 지카 RNA를 증폭함으로써 결정되었다. 도 11에 나타난 결과는 COI 분석의 민감도가 TCID50의 민감도보다 훨씬 더 크다는 것을 나타낸다.
COI 분석의 성능 특성-정확도: 목표 희석액(TCID50/웰) 및 CPE의 각각의 비율을 사용하여 상대적 정확도를 측정하였다. 베로 세포의 경우 관찰된 양성 CPE 비율과 예상 비율 사이에 통계적으로 유의한 선형 관계가 있었다. 관찰 및 예상 결과와 관련된 선의 기울기는 0.92이며 1과 겹치는 95% 신뢰 구간(CI)이 0.83 내지 1.01로 100% 정확도를 나타낸다. C6/36 세포의 경우 관찰된 양성 CPE 비율과 예상 비율 사이에 통계적으로 유의한 선형 관계가 있다. 관찰 및 예상 결과와 관련된 선의 기울기는 0.88이며 95% 신뢰 구간(CI)이 0.80 내지 0.95인 것은 이 세포주에서 약간의 편향(5-20%)이 관찰되었음을 나타낸다. 두 세포주는 만족스러운 정확도(상대적)를 보여준다.
COI 분석의 성능 특성-검출 한계(LoD): 상기 분석의 감도를 C6/36-에서-베로 및 베로-에서-베로 플레이트 모두에 대해 평가하였다. 상기에 개시된 바와 같이, 10.00 TCID50/웰에서 시작하여 0.08 TCID50의 더 낮은 역가까지 플레이팅된 역가 희석액으로 플레이팅된 총 웰당 관찰된 +ve CPE 비율의 최소 제곱 회귀를 사용하여 데이터를 적합화하였다. 또한, 플레이트 내의 각 희석액에 대해 음성 대조군(0.00 TCID50/웰)이 포함되었다. C6/36-에서-베로 및 베로-에서-베로 플레이트 모두에 걸쳐 각 희석액에 대한 CPE 점수를 기록하였다. CPE와 로그 입력 바이러스 역가 사이의 명확한 관계가 나타났다. 이것은 하한 및 상한 99% 신뢰 한계와 함께 TCID50/웰의 log10 농도에 대한 CPE 양성 웰의 비율 간의 로지스틱(sigmoidal) 관계를 나타낸다. 2 log10 농도(= 0.01 TCID50/웰)에서 적격 데이터의 모든 고정 및 무작위 소스 변동을 기반으로 하고 이를 설명하는 모델은 0.01 TCID50/웰에서 반올림할 때 0.85% 또는 0.01을 예측했으며 99% 신뢰 하한은 0.42%이다. 상기 99% 신뢰 하한은 0이 포함되지 않기 때문에 0.85% CPE 웰이 0 TCID50/웰에서 발생할 수 있는 매우 작은 정량화 가능한(< 1%) 기회가 있다(즉, 노이즈로 인해). 이것은 적어도 0.01 TCID50/웰(즉, 검출될 수 있는 샘플에서 살아있는 지카 입자의 최소량)의 분석에 대한 검출 한계를 설정한다. 즉, 반올림하면 60개의 웰 중 1개가 CPE 양성이거나 이러한 매개변수가 주어지는 경우 60개의 웰에서 검출될 수 있는 CPE +ve의 가장 낮은 이론적 비율은 1.67% 또는 0.0167이 된다.
세포 유형(C363 및 베로)은 상대적 민감도에 대해 비교되었으며, C6/36은 도 12에 나타낸 바와 같이 베로 세포에 비해 바이러스 역가의 더 낮은 희석도가 검출될 수 있음을 입증하였다; 동일한 바이러스 입력 수준(0.31 TCID50)에서 CPE 양성 웰의 비율은 베로 세포에 비해 C6/36에 대해 더 높다.
이 분석의 적격성 평가 동안 사용된 가장 낮은 바이러스 입력 값은 0.02 TCID50(-1.61 log TCID50)이었다. C6/36 세포에 대한 적합 곡선을 사용하면 0.035 또는 3.5%의 웰이 CPE 양성(28개 웰 중 1개)으로 기록된다. 상기 곡선을 0.167 또는 1.6%의 가장 낮은 실제 수준으로 추정하면 이는 0.015 TCID50(-1.82 log TCID50)의 바이러스 입력 수준과 같다. 그러나 +ve CPE 결과에 반영된 것으로 검출될 수 있는 가장 낮은 수준의 감염성 바이러스를 측정할 때 전달된 분석 편차의 영향을 고려하여야한다. 이 노이즈는 입력 바이러스의 작업 스톡(working stock) 생성으로 인해 발생한다. 대상 TCID50과 역적정 계산을 비교하면 작업 스톡 바이러스의 TCID50이 85 TCID50/mL의 표준 편차(SD)를 나타냈으며, 이는 스톡 TCID50/mL 농도 200을 목표로 할 때 평균 213로부터 도출되었다. 상기 %CV는 약 +7%의 편향으로 ~40%로 계산된다. 이 노이즈는 로지스틱 회귀 모델에 반영되어 바이러스 희석에 대한 목표 값 주변의 신뢰 구간을 생성한다. 0.01 TCID50/웰의 목표 값에서 두 사이트에 걸쳐 적격성 데이터의 모든 고정 및 무작위 변동 소스를 기반으로 하고 이를 설명하는 모델은 0.86%의 웰이 CPE 양성(60개 웰 중 1개)일 것으로 예측한다. 상기 99% 신뢰 하한은 0이 포함되지 않기 때문에 노이즈로 인해 0.85% CPE-양성 웰이 0 TClD50/웰에서 발생할 수 있는 매우 작은 정량화 가능한(< 1%) 기회가 있다(도 13). 이것은 분석에 대한 검출 한계를 설정한다. 0.01 TCID50/웰은 검출될 수 있는 샘플에서 살아있는 지카 입자의 가장 낮은 양이다.
COI 분석의 성능 특성-범위: 분석의 범위는 0.01 TCID50/웰 내지 4.5 TCID50/웰이었고 0% 초과 그러나 100% 미만의 CPE + ve 비율 점수를 초래한 입력 바이러스 범위로 정의된다.
결론: 4개의 톡스 로트의 분석은 실온에서 10일 동안 0.01% 포름알데히드에서 인큐베이션한 후 불활성화가 완료되었음이 나타났다. 불활성화는 COI 분석에 의해 측정된 바와 같이 생산된 모든 로트에서 3-4일에 달성되었다. 상기 COI 분석은 TCID50 역가 또는 RNA 측정보다 더 민감하다; 증가된 감도는 LoD에 의해서도 관찰되었다.
실시예 3: 불활성화 바이러스 조성물의 제형화
실시예 3에서 "지카 바이러스 백신 의약물질"이라는 용어는 지카 백신 생산의 중간체인 불활성화 바이러스 조성물을 지칭하는 데 사용된다.
장비
| 재료 | 제조자/공급자 |
| 의약물질의 제조를 위한 재료 | |
| 완충제 염 및 첨가제 | |
| 인산이나트륨 | EMPRove bio 10028-24-7 |
| 인산이칼륨 | Fisher P290-500 |
| 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 염기 | Fisher T395-500 |
| 히스티딘 | J.T. BakerN327-05 |
| 염화나트륨 | Fisher S271-500 |
| 수크로스 | Fisher S3-212 |
| 염산 | Fisher A1445-500 |
| 수산화나트륨 용액 | Fisher SS255-1 |
| 샘플을 앨리쿼팅하는데 사용되는 재료 | |
| 3mL 바이알 | Nuova Ompi, 이탈리아, Ez-Fill, Nest & tub, ISO-2R 바이알, 실리콘 처리 없음, 바로 사용 가능(사전 멸균). |
| ETFE 적층 스토퍼 | Daikyo Seiko, 일본, 품목: S2-F45-2, 제형: D777-1, 즉시 사용 가능한 스토퍼(사전 멸균) |
| 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 사용되는 재료 | |
| 2 mg/mL BSA 용액 | Thermo/Pierce Catalog #23209 |
| 멸균 주사기 필터(0.22μm Millex GV) | EMD Millipore |
| HPLC 바이알 | Agilent #5188-6591 소량(고정 삽입) 바이알 |
| HPLC 바이알 캡 | National Scientific Catalog #C4000-54B |
실험 섹션 MilliQ 물에서 물이 언급된 경우, 18MΩ의 저항을 의미한다.
| 완충액 | 약어 | pH |
| 지카 인산염 완충액 | ZPB | 7.4 |
| 6.46mM: 인산이나트륨 | ||
| 1.47mM 인산이칼륨 | ||
| 137mM NaCl | ||
| 트리스 완충액 1 | 트리스 | 7.6 |
| 10 mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 염기 | ||
| 20mM NaCl | ||
| 히스타딘 완충액 1 | His | 7.0 |
| 20mM 히스타딘 | ||
| 20mM NaCl | ||
| 트리스 완충 식염수 | TBS | 7.6 |
| 50mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 염기 | ||
| 150mM NaCl |
1달리 명시되지 않은 경우 트리스+수크로스 및 His+수크로스는 트리스 또는 히스티딘 완충액 에서의 7% w/v 수크로스 용액을 나타낸다.
완충액은 모두 필요에 따라 HCl 또는 NaOH를 사용하여 정확한 pH로 적정되었다.
지카 백신 의약물질 제조
정제된 불활성화된 지카 백신 의약물질은 상기에 개시된 바와 같이 베로 세포에서의 성장에 의해 제조되었다. 매일 수확은 3 내지 9일 동안 수행되었으며, 이들은 정제 및 불활성화 전에 풀(pool)되었다. 매일 수확한 상등액을 여과 및 크로마토그래피로 정제하고 농축하고 포름알데히드를 0.01%의 최종 농도로 첨가하여 불활성화시켰다. 샘플이 메타중아황산나트륨 으로 중화되기 전에 22℃에서 10일 동안 불활성화를 진행한 다음 지카 포스페이트 완충액(6.46mM 인산이나트륨, 1.47mM 인산이칼륨, 137mM NaCl, 6% 수크로스, pH 7.4)으로 완충액을 교환하였다.
완충액 교환
일단 제조되면, 지카 바이러스 백신 의약물질은 최대 6개월 동안 +5±3℃주변 습도에서 보관되었다.
그 다음, 상기 지카 바이러스 백신 의약물질을 하기에 개시된 바와 같은 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 각각의 실시예(표 11에 열거된 바와 같음)에 사용된 적절한 완충액으로 완충액 교환하였다. 접선 유동 여과는 표 12에 열거된 장비를 사용하여 수행하였다: 완충액 교환 공정은 실온 약 25℃에서 수행되었다.
| 장비 | 제조업체/공급업체 |
| TFF 시스템 | Spectrum Labs KR2i |
| 메인 펌프 | Spectrum Labs 900-1893 |
| 보조 펌프 | Spectrum Labs 708-13683-000 |
| 발란스(투과 및 공급) | Spectrum Labs |
| 자동 배압 제어 밸브 | Spectrum Labs |
| KR2i 데이터 수집 소프트웨어 | Spectrum Labs |
| 메인 펌프 | Spectrum Labs 900-1893 |
| MicroKros 중공사 필터 모듈(mPES/100 kD) | Spectrum Labs C02 E100 05 -N |
| 프로세스 리저버 코니칼 버텀(Process reservoir conical bottom) 15 ml | Spectrum Labs ACBT-015-C1N |
| Pharmapure 튜브 팩 크기 13 | Spectrum Labs ACTU-P13-25N |
| 압력 변환기 | Spectrum Labs ACPM-799-01N |
| 피팅 키트 | Spectrum Labs |
접선 유동 여과(TFF)는 다음 절차를 사용하여 수행되었다.
설정: KR2i TFF 시스템은 제조업체의 지침(KR2i/KMPi TFF Systems 제품 정보 및 작동 지침 2016, http://spectrumlabs.eom/lit/400-12355-000rev02.pdf)에 따라 설정되었다. 여기에는 TFF 컬럼(MicroKros 중공 섬유 필터 모듈(mPES/100kD) Spectrum Labs C02-E100-05-N)을 TFF 시스템에 연결하는 작업이 포함된다. 그 다음, 컬럼을 50 내지 150mL의 물로 세척하고 후속적으로 대략 100mL의 적절한 완충액으로 평형화시켰다. 세척 및 평형 단계 동안 유속은 약 25mL/min으로 유지되었고 총 압력은 어떠한 경우에도 18psi를 초과하지 않았다.
농도: 초기에 5 내지 40mL의 샘플(지카 바이러스 백신 의약물질)을 샘플 저장소에 첨가하고 인자 2에 의해 농축시켰다.
정용여과: 농축 후, 정용여과를 수행하였다. 정용여과란 지카바이러스 백신 의약물질의 샘플을 동시에 희석 및 여과하는 행위이다. 희석은 샘플에 부피를 추가하는 반면 여과는 샘플의 부피를 감소시킨다.
보조 펌프(정용여과용)를 가동하고 정용여과 동안 샘플 부피를 유지하기에 충분한 유속(즉 분당 ~0.5-1.5 mL)을 사용하여 정용여과를 수행하였다.
상기 압력은 배압 제어 밸브를 사용하여 전체적으로 수동으로 제어되었다. 압력은 14-18 psi로 유지되었고, 사용된 시어(sheer)는 5000 이하, 플럭스(flux)는 66-72, 유속(메인 펌프)은 25-28 mL/분, 보조 유속(보조 펌프)은 0.5 내지 1mL/분이었다. 상기 보조 펌프는 희석 속도를 제어한다. 이 속도는 여과 속도와 일치하도록 수동으로 조정된다(그래서 순 샘플 부피가 이 단계 동안 변화되지 않도록). 상기 여과 속도는 여러 요인(주 펌프의 유속, 막횡단 압력, 컬럼 파울링 정도 등)에 의해 결정되고 작동 전반에 걸쳐 속도가 변하기 때문에 복잡하다; 결과적으로 샘플의 부피는 보조 펌프 유속을 수동으로 조절함으로써 제어된다.
완전한 정용여과를 보장하기 위해, 적절한 (새로운) 완충액의 적어도 10 디아볼룸(diav-olume)을 교환하였다(투과액의 축적된 질량에 의해 측정된 바와 같이). 본 실시예에서는 일정 부피 정용여과(연속 정용여과)를 수행하였다. 여기에는 여액이 제거될 때와 동일한 속도로 새 완충액을 추가하여 여과 과정 동안 의약물질(잔류물)의 부피를 일정하게 유지하는 것이 포함된다. 디아볼룸 교환의 수는 다음 방정식을 사용하여 계산할 수 있다.
여기서, 의약물질(잔류물)의 부피는 공정 전반에 걸쳐 일정하게 유지된다.
상기 정용여과 공정은 표 11에 나열된 완충액으로 완충액 교환된 지카 바이러스 백신 의약물질(DS)의 샘플을 제공하였다.
샘플 회수 및 보관: 일부 경우에, 상기 샘플은 정용여과 후에 추가로 농축되었다(최대 약 10배까지). 이것은 보조 펌프를 닫고 계속 여과함으로써 수행되었다(즉, 주 펌프를 켜둔 채로). 정용여과 과정 종료시점에 샘플을 회수하기 위해 공급 및 재순환 라인을 샘플 수준 이상으로 올리고 펌프의 흐름을 역전시켜 잔류 부피(일반적으로 약 1-3mL)를 수집하였다. TFF 후 최종 생산물(완충액 교환된 지카 바이러스 백신 의약물질)에 대해 pH 측정, 삼투율, SEC와 같은 적절한 확인 분석이 후속적으로 수행되었다.
완충액 교환 후 지카 바이러스 백신 의약물질(DS)은 안정성 시험을 수행하기 전에 최대 5일 동안 +5±3℃주변 습도에서 보관되었다.
안정성 시험 절차
각 연구를 시작할 때(실시예 3 A-3F) 완충액 교환 후 지카 바이러스 백신 의약물질(DS) 의 샘플을 개별적인 3mL 바이알에 앨리쿼트하였으며, 각각의 바이알은 각각의 완충액 중에 약 0.67mL의 지카 바이러스 백신 의약물질(DS)을 함유하였다. 그런 다음 바이알을 ETFE 적층 마개로 밀봉하였다.
각각의 다른 완충액에 대해 하나의 앨리쿼트에 상응하는 단일 샘플을 크기 배제 크로마토그래피(하기 개시된 바와 같은 SEC)를 사용하여 즉시 시험하여 연구의 시작 (0 일째/동결-융해 주기 0)시점 에서 피크 면적 (및 따라서 μg/mL단위의 단백질의 양)을 측정하였다.
각각의 완충액에 충분한 지카 바이러스 백신 의약물질(DS) 바이알을 각 연구 시작 시 +5±3℃주변 습도 및 -80℃주변 습도에 두었다. 측정된 각 시점 및 온도 조건에 대한 별도의 바이알을 준비하였다.
-80℃에 보관된 샘플을 -80℃ 챔버에서 동결하였다. 0.67mL 충진 부피로 인해 상기 샘플은 비교적 빠르게 동결되었지만 액체 질소에서 "급속 동결(snap frozen)"되지는 않았다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC) 절차
단일 컬럼을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 안정성 분석을 수행하였다. 크기 배제 크로마토그래피는 분자량을 기준으로 단백질을 분리하는 데 사용되는 기술이다. 단백질 샘플의 분자량이 클수록 용리 시간이 짧아진다. 온전한 지카 바이러스의 경우 약 8분의 머무름 시간(retention time)으로 SEC 트레이스(trace)의 피크가 나타났다. 이 피크의 전체와 참조 샘플의 전체(0일째)를 비교함으로써 보관 기간 후에도 샘플에 온전한 지카 바이러스가 얼마나 남아 있는지 측정할 수 있다.
또한, 더 이른 머무름 시간에 추가 피크가 나타나는지 여부를 확인하여 지카 바이러스가 응집되었는지 여부를 측정할 수 있다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 사용된 장비 및 재료는 하기 표 13에 자세히 기술되어 있다.
| 장비 | 사양 |
| HPLC(고성능 액체 크로마토그래피) 시스템 | Agilent 1100 or 1260 |
| 데이터 시스템 방법 | LP005.M |
| 재처리 방법 | LP005R.M |
| 컬럼 | Superose-6 Increase (GE Healthcare) |
| 이동상 | 1x PBS(10.14mM 인산나트륨, 이염기성; 1.79mM 인산칼륨, 일염기성:, 136.89mM NaCl, 2.68mM KCl, 250ppm NaN3 pH 7.4) |
| 유속(mL/분) | 1.0 |
| UV--VIS 검출기 파장 | 280 nm |
| 컬럼 온도 | RT(규제되지 않음) |
| 자동 샘플러 트레이 온도 | 5°C |
크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 하기에 기술된 절차를 사용하여 수행되었다.
표준 및 테스트 샘플 준비
BSA 참조 표준: 200, 400, 800 및 1,000μg/mL 농도를 갖는 소 혈청 알부민(BSA)의 참조 샘플은 물과 함께 2mg/mL의 잘 정의된 농도를 갖는 BSA 스톡 용액을 희석함으로써 제조되었다. 그런 다음 각 참조 샘플의 앨리쿼트를 라벨된 HPLC 바이알로 옮기고 캡을 씌웠다. 하기 실시예 3A - 3F에 주어진 모든 단백질 농도는 BSA 표준 곡선에 기초한 지카 바이러스 농도에 기초한다.
SEC를 위한 샘플 준비: 테스트된 각각의 특정 시점에서, 필요한 3mL 바이알을 +5±3℃ 또는 -80℃에서의 보관으로부터 해제하였다. -80℃에서 동결된 샘플을 실온에서 해동하였다. 그 다음, 적절한 3mL 바이알로부터 라벨된 HPLC 바이알로 적어도 400μL의 각 테스트 샘플을 옮기고 바이알을 캡핑하여 SEC 샘플을 제조하였다. 그런 다음 HPLC 바이알을 HPLC 자동-샘플러 트레이에 넣었다. 상기 HPLC 자동 샘플러 트레이를 5±3℃에서 냉각시켜 SEC를 수행하기 전에 모든 SEC 샘플을 5 ± 3℃로 냉각시키는 것을 보장하였다.
측정: 각 SEC 측정은 자동 샘플러/자동 주입기를 사용하여 각 샘플의 100μL 앨리쿼트를 SEC 컬럼을 주입하는 것을 포함하였다.
SEC 크로마토그램으로부터 지카 단백질의 농도를 측정하는 데 사용되는 계산
각각의 SEC 실행에 대해, 소 혈청 알부민(BSA)의 표준 곡선이 생성되었고, 200, 400, 800 및 1,000μg/mL 농도의 표준이 실행되었으며 표준 곡선이 준비되었다(선형 회귀, y=mx + b b=0). 상기 BSA 총 피크 면적은 BSA에 대한 단량체 및 이량체 피크 면적의 합으로 계산되었다.
이 표준 곡선을 사용하여 지카 바이러스 백신 의약물질(DS)의 농도(μg/mL 중 BSA의 농도 측면)를 측정하였다.
이어서 농도에 대한 값은 각각의 샘플(100% 값으로 취함)에 대해 0일째에 취한 측정과 관련하여 노말라이즈(normalize)되었다.
지카 바이러스 백신 의약물질(DS) 피크 면적은 SEC 크로마토그램에서 약 8분의 머무름 시간 후에 용리되는 전체 피크로서 측정되었다. 피크 피팅(peak fitting)은 약 8분에 피크 전후의 기준선을 연결하여 수행하였다. 여기에는 주요 피크와 더 짧은 머무름 시간으로 용출되는 추가 숄더(shoulder)가 포함된다(즉, 피크의 왼쪽). 머무름 시간이 상당히 긴 피크 또는 숄더는 통합에 포함되지 않았다. 이러한 피크들는 지카 바이러스 단백질의 분해 또는 변성에 해당할 가능성이 높기 때문다.
지카 바이러스 백신 의약물질(DS)의 농도 측정: 지카 바이러스 백신 의약물질(DS)의 총 질량은 BSA 보정 곡선을 기반으로 계산되었다. 지카 바이러스 백신 의약물질(DS) 농도는 μg/mL로 보고되며 보정 곡선에서 얻은 질량을 0.1mL로 나누어 계산한다(식 1 참조).
각 실시예에 대해 주어진 결과는 동일한 샘플에 대한 2회의 반복 SEC 판독값의 평균이다.
실시예 3A
실시예 3A에서 샘플의 제조를 상기에 개시된 바와 같이 수행하였다. 지카 바이러스 백신 의약물질을 제조한 다음, 완충액을 하기 표 14a 및 14b에 나열된 각각의 완충액으로 교환하였다. 실시예 3A에서 안정성 테스트는 5±3℃ 및 -80℃ 모두에서 10일 동안 수행되었다.
표 14a 및 14b는 다양한 완충액에서 지카 바이러스 백신 의약물질 샘플에 대해 0일 및 10일 후에 수행된 SEC의 결과를 나타낸다. 이들 실험의 결과는 0일째에 피크의 면적의 백분율로서 10일째 SEC 피크의 면적에 기초하여 백분율로서 주어진다.
[표 14a]
5±3℃에서 실시예 3A에 대한 SEC 결과
[표 14b]
-80℃에서 실시예 3A에 대한 SEC 결과
실시예 3B
실시예 3B에서 샘플의 제조를 상기에 개시된 바와 같이 수행하였다. 지카 바이러스 백신 의약물질을 제조한 다음 완충액을 하기 표에 나열된 각각의 완충액으로 교환하였으며 실시예 3B에서 안정성 시험은 -80℃에서 60일 동안 수행되었다.
표 15는 다양한 완충액에서 지카 바이러스 백신 의약물질 샘플에 대해 0일 및 60일 후에 수행된 SEC의 결과를 나타낸다. 이들 실험의 결과는 0일째에 피크의 면적의 백분율로서 60일째 SEC 피크의 면적에 기초하여 백분율로서 주어진다.
| 피크 면적/BSA 농도 표준으로 노말라이즈[μg/mL] | 60일차에 남은 비율 / % | ||
| 0 일차 | 60 일차 | ||
| 완충액 | |||
| His | 27 | 11 | 41 |
| His+7% 수크로스 | 31 | 20 | 64 |
실시예 3C
실시예 3C에서 샘플의 제조를 상기에 개시된 바와 같이 수행하였다. 지카 바이러스 백신 의약물질을 제조한 다음 완충액을 하기 표에 나열된 각각의 완충액으로 교환하였다. 실시예 3C에서 안정성 시험은 5±3℃ 및 -80℃ 에서 67일 동안 수행되었다.
표 16a 및 16b는 다양한 완충액에서 지카 바이러스 백신 의약물질 샘플에 대해 0일 및 67일 후에 수행된 SEC의 결과를 나타낸다. 이들 실험의 결과는 0일째에 피크의 면적의 백분율로서 67일째 SEC 피크의 면적에 기초하여 백분율로서 주어진다.
[표 16a]
5±3℃에서 실시예 3C에 대한 SEC 결과
[표 16b]
-80℃에서 실시예 3C에 대한 SEC 결과
추가로, 도 14 및 15는 67일 동안 -80℃에서 트리스+7% 수크로스 완충액 및 ZPB 완충액에 보관된 지카 바이러스 백신 약물 물질에 대한 SEC 크로마토그램을 나타낸다. 트리스+7% 수크로스 완충액 중의 의약물질의 경우(도 14) 67일째의 피크 모양은 0일째의 피크 모양과 매우 유사하다. 대조적으로, ZPB의의약물질(그림 15)의 경우 67일째에 크로마토그래피 프로파일이 이동했으며, 특히 주요 피크의 크기가 감소하고 숄더 피크의 크기가 증가하였는데(즉, 숄더 피크가 7.5분 주위에서 기준선으로부터 상승), 이는 응집을 의미한다.
실시예 3D
실시예 3D에서 샘플의 제조를 상기에 개시된 바와 같이 수행하였다. 지카 바이러스 백신 의약물질을 제조한 다음, 완충액을 트리스 및 ZPB(상기 표 11에 나열)완충액으로 교환하였다. 실시예 3D에서 안정성 테스트는 -80℃ 모두에서 3개월 동안 수행되었다.
이 연구에 대한 결과는 도 19에 나타나있다.
실시예 3E
실시예 3E에서 샘플의 제조를 상기에 개시된 바와 같이 수행하였다. 지카 바이러스 백신 의약물질을 제조한 다음 완충액을 하기 표에 나열된 각각의 완충액으로 교환하였다. 실시예 3E에서 안정성 시험은 5±3℃에서 60일 동안 수행되었다.
표 17은 ZPB 및 TBS에서 지카 바이러스 백신 의약물질 샘플에 대해 1, 3, 8, 15, 30 및 60일 후에 수행된 SEC의 결과를 나타낸다. 이들 실험의 결과는 0일째에 피크의 면적의 백분율로서 1, 3, 8, 15, 30 및 60일째 SEC 피크의 면적에 기초하여 백분율로서 주어진다.
| 일째 | 0 | 1 | 3 | 8 | 15 | 30 | 60 | |
| 완충액 | ||||||||
| 피크 면적/BSA로써의 함량[μg/mL] | ZPB | 102 | 96 | 98 | 84 | 86 | 75 | 69 |
| TBS | 99 | 93 | 92 | 87 | 88 | 87 | 83 | |
| 남은 비율 / % | ZPB | - | 94 | 96 | 82 | 84 | 73 | 68 |
| TBS | - | 93 | 92 | 88 | 89 | 88 | 84 |
실시예 3F
실시예 3F에서 샘플의 제조를 상기에 개시된 바와 같이 수행하였다. 지카 바이러스 백신 의약물질을 제조한 다음 완충액을 트리스 완충액으로 교환하였다. 이어서 수쿠로스를 샘플에 첨가하였다(각각 3, 5, 7 및 10% w/v의 총 농도를 갖는 샘플을 달성하기 위해).
표 18은 0, 1, 2, 3 및 4 냉동 융해 주기 후에 수행된 SEC의 결과를 나타낸다.
샘플 트레이를 개별 바이알에 준비하였다. 각 동결 융해 주기에는 실온에서 해동함으로써 트레이(모든 샘플 포함)를 실온(25℃)으로 가온하는 것이 포함되었다. 각 동결 융해 주기 후 분석을 위해 각 조건하에서 단일 바이알을 취하였다.
결과는 1 내지 4회 동결 융해 주기 전후의 SEC 피크 면적을 기준으로 백분율로 제공된다.
| 동결 융해 주기 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | ||
| 완충액 | |||||||
| 피크 면적/BSA로써의 함 량[μg/mL] |
트리스 + | +3% 수크로스 | 288 | 272 | 259 | 252 | 207 |
| 트리스 + | +5% 수크로스 | 286 | 271 | 254 | 244 | 206 | |
| 트리스 + | +7% 수크로스 | 284 | 278 | 267 | 268 | 267 | |
| 트리스 + | +10% 수크로스 | 287 | 280 | 286 | 276 | 272 | |
| 남은 비율 / % |
트리스 + | +3% 수크로스 | - | 95 | 90 | 88 | 72 |
| 트리스 + | +5% 수크로스 | - | 95 | 89 | 85 | 72 | |
| 트리스 + | +7% 수크로스 | 98 | 94 | 94 | 94 | ||
| 트리스 + | +10% 수크로스 | - | 98 | 100 | 96 | 95 | |
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<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 351
<212> PRT
<213> Zika virus
<400> 1
Asp Val Gly Cys Ser Val Asp Phe Ser Lys Lys Glu Thr Arg Cys Gly
1 5 10 15
Thr Gly Val Phe Val Tyr Asn Asp Val Glu Ala Trp Arg Asp Arg Tyr
20 25 30
Lys Tyr His Pro Asp Ser Pro Arg Arg Leu Ala Ala Ala Val Lys Gln
35 40 45
Ala Trp Glu Asp Gly Ile Cys Gly Ile Ser Ser Val Ser Arg Met Glu
50 55 60
Asn Ile Met Trp Arg Ser Val Glu Gly Glu Leu Asn Ala Ile Leu Glu
65 70 75 80
Glu Asn Gly Val Gln Leu Thr Val Val Val Gly Ser Val Lys Asn Pro
85 90 95
Met Trp Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro Val Asn Glu Leu Pro
100 105 110
His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser Tyr Phe Val Arg Ala Ala Lys
115 120 125
Thr Asn Asn Ser Phe Val Val Asp Gly Asp Thr Leu Lys Glu Cys Pro
130 135 140
Leu Lys His Arg Ala Trp Asn Ser Phe Leu Val Glu Asp His Gly Phe
145 150 155 160
Gly Val Phe His Thr Ser Val Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr Ser
165 170 175
Leu Glu Cys Asp Pro Ala Val Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly Lys Glu
180 185 190
Ala Val His Ser Asp Leu Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Asp
195 200 205
Thr Trp Arg Leu Lys Arg Ala His Leu Ile Glu Met Lys Thr Cys Glu
210 215 220
Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Thr Asp Gly Ile Glu Glu Ser Asp
225 230 235 240
Leu Ile Ile Pro Lys Ser Leu Ala Gly Pro Leu Ser His His Asn Thr
245 250 255
Arg Glu Gly Tyr Arg Thr Gln Met Lys Gly Pro Trp His Ser Glu Glu
260 265 270
Leu Glu Ile Arg Phe Glu Glu Cys Pro Gly Thr Lys Val His Val Glu
275 280 285
Glu Thr Cys Gly Thr Arg Gly Pro Ser Leu Arg Ser Thr Thr Ala Ser
290 295 300
Gly Arg Val Ile Glu Glu Trp Cys Cys Arg Glu Cys Thr Met Pro Pro
305 310 315 320
Leu Ser Phe Arg Ala Lys Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg
325 330 335
Pro Arg Lys Glu Pro Glu Ser Asn Leu Val Arg Ser Met Val Thr
340 345 350
<210> 2
<211> 10675
<212> DNA
<213> Zika virus
<400> 2
gttgttgatc tgtgtgaatc agactgcgac agttcgagtt tgaagcgaaa gctagcaaca 60
gtatcaacag gttttatttt ggatttggaa acgagagttt ctggtcatga aaaacccaaa 120
aaagaaatcc ggaggattcc ggattgtcaa tatgctaaaa cgcggagtag cccgtgtgag 180
cccctttggg ggcttgaaga ggctgccagc cggacttctg ctgggtcatg ggcccatcag 240
gatggtcttg gcgattctag cctttttgag attcacggca atcaagccat cactgggtct 300
catcaataga tggggttcag tggggaaaaa agaggctatg gaaacaataa agaagttcaa 360
gaaagatctg gctgccatgc tgagaataat caatgctagg aaggagaaga agagacgagg 420
cgcagatact agtgtcggaa ttgttggcct cctgctgacc acagctatgg cagcggaggt 480
cactagacgt gggagtgcat actatatgta cttggacaga aacgatgctg gggaggccat 540
atcttttcca accacattgg ggatgaataa gtgttatata cagatcatgg atcttggaca 600
catgtgtgat gccaccatga gctatgaatg ccctatgctg gatgaggggg tggaaccaga 660
tgacgtcgat tgttggtgca acacgacgtc aacttgggtt gtgtacggaa cctgccatca 720
caaaaaaggt gaagcacgga gatctagaag agctgtgacg ctcccctccc attccaccag 780
gaagctgcaa acgcggtcgc aaacctggtt ggaatcaaga gaatacacaa agcacttgat 840
tagagtcgaa aattggatat tcaggaaccc tggcttcgcg ttagcagcag ctgccatcgc 900
ttggcttttg ggaagctcaa cgagccaaaa agtcatatac ttggtcatga tactgctgat 960
tgccccggca tacagcatca ggtgcatagg agtcagcaat agggactttg tggaaggtat 1020
gtcaggtggg acttgggttg atgttgtctt ggaacatgga ggttgtgtca ccgtaatggc 1080
acaggacaaa ccgactgtcg acatagagct ggttacaaca acagtcagca acatggcgga 1140
ggtaagatcc tactgctatg aggcatcaat atcagacatg gcttctgaca gccgctgccc 1200
aacacaaggt gaagcctacc ttgacaagca atcagacact caatatgtct gcaaaagaac 1260
gttagtggac agaggctggg gaaatggatg tggacttttt ggcaaaggga gcctggtgac 1320
atgcgctaag tttgcatgct ccaagaaaat gaccgggaag agcatccagc cagagaatct 1380
ggagtaccgg ataatgctgt cagttcatgg ctcccagcac agtgggatga tcgttaatga 1440
cacaggacat gaaactgatg agaatagagc gaaagttgag ataacgccca attcaccgag 1500
agccgaagcc accctggggg gttttggaag cctaggactt gattgtgaac cgaggacagg 1560
ccttgacttt tcagatttgt attacttgac tatgaataac aagcactggt tggttcacaa 1620
ggagtggttc cacgacattc cattaccttg gcacgctggg gcagacaccg gaactccaca 1680
ctggaacaac aaagaagcac tggtagagtt caaggacgca catgccaaaa ggcaaactgt 1740
cgtggttcta gggagtcaag aaggagcagt tcacacggcc cttgctggag ctctggaggc 1800
tgagatggat ggtgcaaagg gaaggctgtc ctctggccac ttgaaatgtc gcctgaaaat 1860
ggataaactt agattgaagg gcgtgtcata ctccttgtgt actgcagcgt tcacattcac 1920
caagatcccg gctgaaacac tgcacgggac agtcacagtg gaggtacagt acgcagggac 1980
agatggacct tgcaaggttc cagctcagat ggcggtggac atgcaaactc tgaccccagt 2040
tgggaggttg ataaccgcta accccgtaat cactgaaagc actgagaact ctaagatgat 2100
gctggaactt gatccaccat ttggggactc ttacattgtc ataggagtcg gggagaagaa 2160
gatcacccac cactggcaca ggagtggcag caccattgga aaagcatttg aagccactgt 2220
gagaggtgcc aagagaatgg cagtcttggg agacacagcc tgggactttg gatcagttgg 2280
aggcgctctc aactcattgg gcaagggcat ccatcaaatt tttggagcag ctttcaaatc 2340
attgtttgga ggaatgtcct ggttctcaca aattctcatt ggaacgttgc tgatgtggtt 2400
gggtctgaac acaaagaatg gatctatttc ccttatgtgc ttggccttag ggggagtgtt 2460
gatcttctta tccacagccg tctctgctga tgtggggtgc tcggtggact tctcaaagaa 2520
ggagacgaga tgcggtacag gggtgttcgt ctataacgac gttgaagcct ggagggacag 2580
gtacaagtac catcctgact ccccccgtag attggcagca gcagtcaagc aagcctggga 2640
agatggtatc tgcgggatct cctctgtttc aagaatggaa aacatcatgt ggagatcagt 2700
agaaggggag ctcaacgcaa tcctggaaga gaatggagtt caactgacgg tcgttgtggg 2760
atctgtaaaa aaccccatgt ggagaggtcc acagagattg cccgtgcctg tgaacgagct 2820
gccccacggc tggaaggctt gggggaaatc gtatttcgtc agagcagcaa agacaaataa 2880
cagctttgtc gtggatggtg acacactgaa ggaatgccca ctcaaacata gagcatggaa 2940
cagctttctt gtggaggatc atgggttcgg ggtatttcac actagtgtct ggctcaaggt 3000
tagagaagat tattcattag agtgtgatcc agccgttatt ggaacagctg ttaagggaaa 3060
ggaggctgta cacagtgatc taggctactg gattgagagt gagaagaatg acacatggag 3120
gctgaagagg gcccatctga tcgagatgaa aacatgtgaa tggccaaagt cccacacatt 3180
gtggacagat ggaatagaag agagtgatct gatcataccc aagtctttag ctgggccact 3240
cagccatcac aataccagag agggctacag gacccaaatg aaagggccat ggcacagtga 3300
agagcttgaa attcggtttg aggaatgccc aggcactaag gtccacgtgg aggaaacatg 3360
tggaacaaga ggaccatctc tgagatcaac cactgcaagc ggaagggtga tcgaggaatg 3420
gtgctgcagg gagtgcacaa tgcccccact gtcgttccgg gctaaagatg gctgttggta 3480
tggaatggag ataaggccca ggaaagaacc agaaagcaac ttagtaaggt caatggtgac 3540
tgcaggatca actgatcaca tggaccactt ctcccttgga gtgcttgtga tcctgctcat 3600
ggtgcaggaa gggctgaaga agagaatgac cacaaagatc atcataagca catcaatggc 3660
agtgctggta gctatgatcc tgggaggatt ttcaatgagt gacctggcta agcttgcaat 3720
tttgatgggt gccaccttcg cggaaatgaa cactggagga gatgtagctc atctggcgct 3780
gatagcggca ttcaaagtca gaccagcgtt gctggtatct ttcatcttca gagctaattg 3840
gacaccccgt gaaagcatgc tgctggcctt ggcctcgtgt cttttgcaaa ctgcgatctc 3900
cgccttggaa ggcgacctga tggttctcat caatggtttt gctttggcct ggttggcaat 3960
acgagcgatg gttgttccac gcactgataa catcaccttg gcaatcctgg ctgctctgac 4020
accactggcc cggggcacac tgcttgtggc gtggagagca ggccttgcta cttgcggggg 4080
gtttatgctc ctctctctga agggaaaagg cagtgtgaag aagaacttac catttgtcat 4140
ggccctggga ctaaccgctg tgaggctggt cgaccccatc aacgtggtgg gactgctgtt 4200
gctcacaagg agtgggaagc ggagctggcc ccctagcgaa gtactcacag ctgttggcct 4260
gatatgcgca ttggctggag ggttcgccaa ggcagatata gagatggctg ggcccatggc 4320
cgcggtcggt ctgctaattg tcagttacgt ggtctcagga aagagtgtgg acatgtacat 4380
tgaaagagca ggtgacatca catgggaaaa agatgcggaa gtcactggaa acagtccccg 4440
gctcgatgtg gcgctagatg agagtggtga tttctccctg gtggaggatg acggtccccc 4500
catgagagag atcatactca aggtggtcct gatgaccatc tgtggcatga acccaatagc 4560
catacccttt gcagctggag cgtggtacgt atacgtgaag actggaaaaa ggagtggtgc 4620
tctatgggat gtgcctgctc ccaaggaagt aaaaaagggg gagaccacag atggagtgta 4680
cagagtaatg actcgtagac tgctaggttc aacacaagtt ggagtgggag ttatgcaaga 4740
gggggtcttt cacactatgt ggcacgtcac aaaaggatcc gcgctgagaa gcggtgaagg 4800
gagacttgat ccatactggg gagatgtcaa gcaggatctg gtgtcatact gtggtccatg 4860
gaagctagat gccgcctggg atgggcacag cgaggtgcag ctcttggccg tgccccccgg 4920
agagagagcg aggaacatcc agactctgcc cggaatattt aagacaaagg atggggacat 4980
tggagcggtt gcgctggatt acccagcagg aacttcagga tctccaatcc tagacaagtg 5040
tgggagagtg ataggacttt atggcaatgg ggtcgtgatc aaaaacggga gttatgttag 5100
tgccatcacc caagggagga gggaggaaga gactcctgtt gagtgcttcg agccctcgat 5160
gctgaagaag aagcagctaa ctgtcttaga cttgcatcct ggagctggga aaaccaggag 5220
agttcttcct gaaatagtcc gtgaagccat aaaaacaaga ctccgtactg tgatcttagc 5280
tccaaccagg gttgtcgctg ctgaaatgga ggaggccctt agagggcttc cagtgcgtta 5340
tatgacaaca gcagtcaatg tcacccactc tggaacagaa atcgtcgact taatgtgcca 5400
tgccaccttc acttcacgtc tactacagcc aatcagagtc cccaactata atctgtatat 5460
tatggatgag gcccacttca cagatccctc aagtatagca gcaagaggat acatttcaac 5520
aagggttgag atgggcgagg cggctgccat cttcatgacc gccacgccac caggaacccg 5580
tgacgcattt ccggactcca actcaccaat tatggacacc gaagtggaag tcccagagag 5640
agcctggagc tcaggctttg attgggtgac ggatcattct ggaaaaacag tttggtttgt 5700
tccaagcgtg aggaacggca atgagatcgc agcttgtctg acaaaggctg gaaaacgggt 5760
catacagctc agcagaaaga cttttgagac agagttccag aaaacaaaac atcaagagtg 5820
ggactttgtc gtgacaactg acatttcaga gatgggcgcc aactttaaag ctgaccgtgt 5880
catagattcc aggagatgcc taaagccggt catacttgat ggcgagagag tcattctggc 5940
tggacccatg cctgtcacac atgccagcgc tgcccagagg agggggcgca taggcaggaa 6000
tcccaacaaa cctggagatg agtatctgta tggaggtggg tgcgcagaga ctgacgaaga 6060
ccatgcacac tggcttgaag caagaatgct ccttgacaat atttacctcc aagatggcct 6120
catagcctcg ctctatcgac ctgaggccga caaagtagca gccattgagg gagagttcaa 6180
gcttaggacg gagcaaagga agacctttgt ggaactcatg aaaagaggag atcttcctgt 6240
ttggctggcc tatcaggttg catctgccgg aataacctac acagatagaa gatggtgctt 6300
tgatggcacg accaacaaca ccataatgga agacagtgtg ccggcagagg tgtggaccag 6360
acacggagag aaaagagtgc tcaaaccgag gtggatggac gccagagttt gttcagatca 6420
tgcggccctg aagtcattca aggagtttgc cgctgggaaa agaggagcgg cttttggagt 6480
gatggaagcc ctgggaacac tgccaggaca catgacagag agattccagg aagccattga 6540
caacctcgct gtgctcatgc gggcagagac tggaagcagg ccttacaaag ccgcggcggc 6600
ccaattgccg gagaccctag agaccataat gcttttgggg ttgctgggaa cagtctcgct 6660
gggaatcttc ttcgtcttga tgaggaacaa gggcataggg aagatgggct ttggaatggt 6720
gactcttggg gccagcgcat ggctcatgtg gctctcggaa attgagccag ccagaattgc 6780
atgtgtcctc attgttgtgt tcctattgct ggtggtgctc atacctgagc cagaaaagca 6840
aagatctccc caggacaacc aaatggcaat catcatcatg gtagcagtag gtcttctggg 6900
cttgattacc gccaatgaac tcggatggtt ggagagaaca aagagtgacc taagccatct 6960
aatgggaagg agagaggagg gggcaaccat aggattctca atggacattg acctgcggcc 7020
agcctcagct tgggccatct atgctgcctt gacaactttc attaccccag ccgtccaaca 7080
tgcagtgacc acctcataca acaactactc cttaatggcg atggccacgc aagctggagt 7140
gttgtttggc atgggcaaag ggatgccatt ctacgcatgg gactttggag tcccgctgct 7200
aatgataggt tgctactcac aattaacacc cctgacccta atagtggcca tcattttgct 7260
cgtggcgcac tacatgtact tgatcccagg gctgcaggca gcagctgcgc gtgctgccca 7320
gaagagaacg gcagctggca tcatgaagaa ccctgttgtg gatggaatag tggtgactga 7380
cattgacaca atgacaattg acccccaagt ggagaaaaag atgggacagg tgctactcat 7440
agcagtagcc gtctccagcg ccatactgtc gcggaccgcc tgggggtggg gggaggctgg 7500
ggctctgatc acagccgcaa cttccacttt gtgggaaggc tctccgaaca agtactggaa 7560
ctcctctaca gccacttcac tgtgtaacat ttttagggga agttacttgg ctggagcttc 7620
tctaatctac acagtaacaa gaaacgctgg cttggtcaag agacgtgggg gtggaacagg 7680
agagaccctg ggagagaaat ggaaggcccg cttgaaccag atgtcggccc tggagttcta 7740
ctcctacaaa aagtcaggca tcaccgaggt gtgcagagaa gaggcccgcc gcgccctcaa 7800
ggacggtgtg gcaacgggag gccatgctgt gtcccgagga agtgcaaagc tgagatggtt 7860
ggtggagcgg ggatacctgc agccctatgg aaaggtcatt gatcttggat gtggcagagg 7920
gggctggagt tactacgtcg ccaccatccg caaagttcaa gaagtgaaag gatacacaaa 7980
aggaggccct ggtcatgaag aacccgtgtt ggtgcaaagc tatgggtgga acatagtccg 8040
tcttaagagt ggggtggacg tctttcatat ggcggctgag ccgtgtgaca cgttgctgtg 8100
tgacataggt gagtcatcat ctagtcctga agtggaagaa gcacggacgc tcagagtcct 8160
ctccatggtg ggggattggc ttgaaaaaag accaggagcc ttttgtataa aagtgttgtg 8220
cccatacacc agcactatga tggaaaccct ggagcgactg cagcgtaggt atgggggagg 8280
actggtcaga gtgccactct cccgcaactc tacacatgag atgtactggg tctctggagc 8340
gaaaagcaac accataaaaa gtgtgtccac cacgagccag ctcctcttgg ggcgcatgga 8400
cgggcctagg aggccagtga aatatgagga ggatgtgaat ctcggctctg gcacgcgggc 8460
tgtggtaagc tgcgctgaag ctcccaacat gaagatcatt ggtaaccgca ttgaaaggat 8520
ccgcagtgag cacgcggaaa cgtggttctt tgacgagaac cacccatata ggacatgggc 8580
ttaccatgga agctatgagg cccccacaca agggtcagcg tcctctctaa taaacggggt 8640
tgtcaggctc ctgtcaaaac cctgggatgt ggtgactgga gtcacaggaa tagccatgac 8700
cgacaccaca ccgtatggtc agcaaagagt tttcaaggaa aaagtggaca ctagggtgcc 8760
agacccccaa gaaggcactc gtcaggttat gagcatggtc tcttcctggt tgtggaaaga 8820
gctaggcaaa cacaaacggc cacgagtctg caccaaagaa gagttcatca acaaggttcg 8880
tagcaatgca gcattagggg caatatttga agaggaaaaa gagtggaaga ctgcagtgga 8940
agctgtgaac gatccaaggt tctgggctct agtggacaag gaaagagagc accacctgag 9000
aggagagtgc cagagctgtg tgtacaacat gatgggaaaa agagaaaaga aacaagggga 9060
atttggaaag gccaagggca gccgcgccat ctggtatatg tggctagggg ctagatttct 9120
agagttcgaa gcccttggat tcttgaacga ggatcactgg atggggagag agaactcagg 9180
aggtggtgtt gaagggctgg gattacaaag actcggatat gtcctagaag agatgagtcg 9240
tataccagga ggaaggatgt atgcagatga cactgctggc tgggacaccc gcattagcag 9300
gtttgatctg gagaatgaag ctctaatcac caaccaaatg gagaaagggc acagggcctt 9360
ggcattggcc ataatcaagt acacatacca aaacaaagtg gtaaaggtcc ttagaccagc 9420
tgaaaaaggg aaaacagtta tggacattat ttcgagacaa gaccaaaggg ggagcggaca 9480
agttgtcact tacgctctta acacatttac caacctagtg gtgcaactca ttcggaatat 9540
ggaggctgag gaagttctag agatgcaaga cttgtggctg ctgcggaggt cagagaaagt 9600
gaccaactgg ttgcagagca acggatggga taggctcaaa cgaatggcag tcagtggaga 9660
tgattgcgtt gtgaagccaa ttgatgatag gtttgcacat gccctcaggt tcttgaatga 9720
tatgggaaaa gttaggaagg acacacaaga gtggaaaccc tcaactggat gggacaactg 9780
ggaagaagtt ccgttttgct cccaccactt caacaagctc catctcaagg acgggaggtc 9840
cattgtggtt ccctgccgcc accaagatga actgattggc cgggcccgcg tctctccagg 9900
ggcgggatgg agcatccggg agactgcttg cctagcaaaa tcatatgcgc aaatgtggca 9960
gctcctttat ttccacagaa gggacctccg actgatggcc aatgccattt gttcatctgt 10020
gccagttgac tgggttccaa ctgggagaac tacctggtca atccatggaa agggagaatg 10080
gatgaccact gaagacatgc ttgtggtgtg gaacagagtg tggattgagg agaacgacca 10140
catggaagac aagaccccag ttacgaaatg gacagacatt ccctatttgg gaaaaaggga 10200
agacttgtgg tgtggatctc tcatagggca cagaccgcgc accacctggg ctgagaacat 10260
taaaaacaca gtcaacatgg tgcgcaggat cataggtgat gaagaaaagt acatggacta 10320
cctatccacc caagttcgct acttgggtga agaagggtct acacctggag tgctgtaagc 10380
accaatctta atgttgtcag gcctgctagt cagccacagc ttggggaaag ctgtgcagcc 10440
tgtgaccccc ccaggagaag ctgggaaacc aagcctatag tcaggccgag aacgccatgg 10500
cacggaagaa gccatgctgc ctgtgagccc ctcagaggac actgagtcaa aaaaccccac 10560
gcgcttggag gcgcaggatg ggaaaagaag gtggcgacct tccccaccct tcaatctggg 10620
gcctgaactg gagatcagct gtggatctcc agaagaggga ctagtggtta gagga 10675
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligo 1 (CpG 1826)
<400> 3
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligo 2 (CpG 1758)
<400> 4
tctcccagcg tgcgccat 18
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligo 3
<400> 5
accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligo 4 (CpG 2006)
<400> 6
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligo 5 (CpG 1668)
<400> 7
tccatgacgt tcctgatgct 20
<210> 8
<211> 31
<212> PRT
<213> Zika virus
<400> 8
Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu
1 5 10 15
Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln
20 25 30
<210> 9
<211> 31
<212> PRT
<213> Zika virus
<400> 9
Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu
1 5 10 15
Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln
20 25 30
<210> 10
<211> 31
<212> PRT
<213> West Nile Virus
<400> 10
Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Leu Glu
1 5 10 15
Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile Ser
20 25 30
<210> 11
<211> 31
<212> PRT
<213> Japanese Encephalitis Virus
<400> 11
Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu
1 5 10 15
Leu Thr Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Val
20 25 30
<210> 12
<211> 31
<212> PRT
<213> Saint Louis Encephalitis Virus
<400> 12
Phe Ser Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Ile Val Glu
1 5 10 15
Leu Gln Tyr Thr Gly Ser Asn Gly Pro Cys Arg Val Pro Ile Ser
20 25 30
<210> 13
<211> 30
<212> PRT
<213> Yellow Fever Virus
<400> 13
Phe Val Lys Asn Pro Thr Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Met Gln
1 5 10 15
Val Lys Val Ser Lys Gly Ala Pro Cys Arg Ile Pro Val Ile
20 25 30
<210> 14
<211> 31
<212> PRT
<213> Dengue virus
<400> 14
Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln
1 5 10 15
Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser
20 25 30
<210> 15
<211> 31
<212> PRT
<213> Dengue virus
<400> 15
Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg
1 5 10 15
Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu
20 25 30
<210> 16
<211> 31
<212> PRT
<213> Dengue virus
<400> 16
Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile Lys
1 5 10 15
Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser
20 25 30
<210> 17
<211> 31
<212> PRT
<213> Dengue virus
<400> 17
Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys
1 5 10 15
Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu
20 25 30
<210> 18
<211> 29
<212> PRT
<213> Zika virus
<400> 18
Ser Val Lys Asn Pro Met Gly Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro
1 5 10 15
Val Asn Glu Leu Pro His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys
20 25
<210> 19
<211> 29
<212> PRT
<213> Zika virus
<400> 19
Ser Val Lys Asn Pro Met Trp Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro
1 5 10 15
Val Asn Glu Leu Pro His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys
20 25
<210> 20
<211> 29
<212> PRT
<213> West Nile Virus
<400> 20
Lys Gln Glu Gly Met Tyr Lys Ser Ala Pro Lys Arg Leu Thr Ala Thr
1 5 10 15
Thr Glu Lys Leu Glu Ile Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys
20 25
<210> 21
<211> 29
<212> PRT
<213> Japanese Encephalitis Virus
<400> 21
Lys Pro Val Gly Arg Tyr Arg Ser Ala Pro Lys Arg Leu Ser Met Thr
1 5 10 15
Gln Glu Lys Phe Glu Met Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys
20 25
<210> 22
<211> 29
<212> PRT
<213> Saint Louis Encephalitis Virus
<400> 22
Glu Asp Pro Lys Tyr Tyr Lys Arg Ala Pro Arg Arg Leu Lys Lys Leu
1 5 10 15
Glu Asp Glu Leu Asn Tyr Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys
20 25
<210> 23
<211> 29
<212> PRT
<213> Yellow Fever Virus
<400> 23
Asp Pro Lys Asn Val Tyr Gln Arg Gly Thr His Pro Phe Ser Arg Ile
1 5 10 15
Arg Asp Gly Leu Gln Tyr Gly Trp Lys Thr Trp Gly Lys
20 25
<210> 24
<211> 29
<212> PRT
<213> Dengue virus
<400> 24
Asp Val Ser Gly Ile Leu Ala Gln Gly Lys Lys Met Ile Arg Pro Gln
1 5 10 15
Pro Met Glu His Lys Tyr Ser Trp Lys Ser Trp Gly Lys
20 25
<210> 25
<211> 29
<212> PRT
<213> Dengue virus
<400> 25
Asp Ile Lys Gly Ile Met Gln Ala Gly Lys Arg Ser Leu Arg Pro Gln
1 5 10 15
Pro Thr Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys
20 25
<210> 26
<211> 29
<212> PRT
<213> Dengue virus
<400> 26
Asp Ile Thr Gly Val Leu Glu Gln Gly Lys Arg Thr Leu Thr Pro Gln
1 5 10 15
Pro Met Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys
20 25
<210> 27
<211> 29
<212> PRT
<213> Dengue virus
<400> 27
Asp Val Lys Gly Val Leu Thr Lys Gly Lys Arg Ala Leu Thr Pro Pro
1 5 10 15
Val Asn Asp Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys
20 25
Claims (69)
- a) 불활성화된 전체 지카 바이러스,
b) 적어도 약 6.5mM의 농도를 갖는 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 완충액, 및
c) 임의적으로 폴리올;을 포함하는 액상 불활성화 바이러스 조성물로서,
상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 바람직하게는 알루미늄 염으로부터 선택되는 보조제를 함유하지 않고, 및
상기 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 완충액은 포스페이트 이온을 포함하지 않는 조성물. - 청구항 1에 있어서,
상기 액상 불활성화 바이러스 조성물 내의 인 이온의 농도는 약 7mM 미만, 또는 약 6mM 미만, 또는 약 5mM 미만, 또는 약 4mM 미만, 또는 약 3mM 미만, 또는 약 2mM 미만, 또는 약 1mM 미만인 조성물. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 단 하나의 약학적으로 허용가능한 완충액을 포함하는 조성물. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 적어도 2개의 다른 약학적으로 허용가능한 완충액를 포함하고, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물에서 2개의 가장 농축된 약학적으로 허용가능한 완충액의 몰비는 1:2 내지 2:1이 아니거나, 1:5 내지 5:1가 아니거나, 8:1 내지 1:8가 아니거나, 10:1 내지 1:10가 아닌 조성물. - 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
상기 액상 불활성화 바이러스 조성물 내의 칼륨 이온의 농도는 약 4mM 미만, 또는 약 3mM 미만, 또는 약 2mM 미만, 또는 약 1.5mM 미만, 또는 약 0.5mM 미만, 또는 약 0.1mM 미만, 또는 약 0mM인 조성물. - 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 프로타민 황산염을 실질적으로 함유하지 않거나 함유하지 않는 조성물. - 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
상기 액상 불활성화 바이러스 조성물의 pH는 상온에서 측정시 약 pH 6.0 내지 약 pH 9.0 또는 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.0, 또는 약 pH 6.8 내지 약 pH 7.8, 또는 약 pH 7.6인 조성물. - 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학적으로 허용가능한 완충액의 농도는 적어도 약 7mM, 또는 적어도 약 7.5mM, 또는 적어도 약 8mM, 또는 적어도 약 8.5mM, 또는 적어도 약 9mM, 또는 적어도 약 10mM인 조성물, - 청구항 8에 있어서,
상기 약학적으로 허용가능한 완충액의 농도는 약 7mM 내지 약 200mM, 또는 약 7.5mM 내지 약 200mM, 또는 약 8mM 내지 약 200mM, 또는 약 8.5mM 내지 약 200mM, 또는 약 9mM 내지 약 100mM, 또는 약 9mM 내지 약 60mM, 또는 약 10mM, 또는 약 20mM, 또는 약 50mM인 조성물. - 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학적으로 허용가능한 완충액은 아미노기-함유 분자를 포함하는 조성물. - 청구항 10에 있어서,
상기 약학적으로 허용가능한 완충액은 트리스 또는 히스티딘 완충액인 조성물. - 청구항 11에 있어서,
상기 약학적으로 허용가능한 완충액은 트리스인 조성물. - 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 적어도 하나의 폴리올을 추가로 포함하는 조성물. - 청구항 13에 있어서,
상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 약 1% w/v 내지 약 60% w/v의 폴리올, 또는 약 6% w/v 내지 약 50% w/v의 폴리올, 또는 약 6% w/v 내지 약 40% w/v의 폴리올, 또는 약 6% w/v 내지 약 35% w/v의 폴리올, 또는 약 6% w/v 내지 약 30% w/v의 폴리올, 또는 폴리올의 약 6% w/v 내지 약 25% w/v의 폴리올, 또는 약 6% w/v 내지 약 20% w/v 폴리올, 또는 약 6% w/v 내지 약 15% w/v의 폴리올, 또는 약 6% w/v 내지 약 12% w/v의 폴리올, 또는 약 7% w/v의 폴리올, 또는 약 10% w/v의 폴리올을 포함하는 조성물. - 청구항 14에 있어서,
상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 아미노기-함유 분자를 포함하는 약학적으로 허용가능한 완충액, 및 약 6% w/v 내지 약 15% w/v의 폴리올을 포함하는 조성물. - 청구항 15에 있어서,
상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 트리스, 및 약 6% w/v 내지 약 15% w/v의 폴리올을 포함하는 조성물. - 청구항 13 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리올은 당인 조성물. - 청구항 17에 있어서,
상기 당은 이당류인 조성물. - 청구항 18에 있어서,
상기 이당류는 비-환원당인 조성물. - 청구항 19에 있어서,
상기 비-환원당은 수크로스인 조성물. - 청구항 20에 있어서,
상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 약 5% w/v 내지 약 20% w/v의 수크로스, 또는 약 6% w/v 내지 약 15% w/v의 수크로스를 포함하는 조성물. - 청구항 21에 있어서,
상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 약 7% w/v의 수크로스와 같은 약 6% w/v 내지 약 8% w/v의 수크로스를 포함하는 조성물. - 청구항 21에 있어서,
상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 약 8.5 mM 내지 약 50 mM의 트리스 및 약 6% 내지 약 15% w/v의 수크로스를 포함하고, 상기 불활성화 바이러스 조성물의 pH는 상온에서 측정시 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0인 조성물. - 청구항 13에 있어서,
상기 폴리올은 글리세롤인 조성물. - 청구항 24에 있어서,
상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 약 1% v/v 내지 약 60% v/v 의 글리세롤, 또는 약 7% v/v 내지 약 15% v/v의 글리세롤, 또는 약 10% v/v의 글리세롤을 포함하는 조성물. - 청구항 25에 있어서,
상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 약 8.5 mM 내지 약 50 mM의 트리스 및 약 6% w/v 내지 약 15% w/v의 글리세롤을 포함하고, 상기 불활성화 바이러스 조성물의 pH는 상온에서 측정시 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0인 조성물. - 청구항 1 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서,
상기 액상 불활성화 바이러스 조성물은 염화나트륨을 추가로 포함하는 조성물. - 청구항 27에 있어서,
상기 액상 불활성화 바이러스 조성물에서 염화나트륨 농도는 약 5mM 내지 약 500mM의 염화나트륨, 또는 약 10mM 내지 약 200mM의 염화나트륨인 조성물. - 청구항 28에 있어서,
상기 액상 불활성화 바이러스 조성물에서 염화나트륨 농도는 약 10mM 내지 약 40mM, 또는 약 20mM과 같은 약 10mM 내지 약 30mM인 조성물. - 청구항 1 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서,
상기 액상 불활성화 바이러스 조성물의 이온 강도는 약 80mM 미만, 또는 약 70mM 미만, 또는 약 60mM 미만, 또는 약 50mM 미만, 또는 약 40mM 미만, 또는 약 30mM 미만인 조성물 - 청구항 1 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서,
상기 지카 바이러스는 아프리카 계통 바이러스 또는 아시아 계통 바이러스인 조성물. - 청구항 31에 있어서,
상기 지카 바이러스는 아시아 계통 바이러스인 조성물. - 청구항 32에 있어서,
상기 지카 바이러스는 균주 PRVABC59로부터 유래되는 조성물 - 청구항 33에 있어서,
균주 PRVABC59는 서열번호 2에 따른 게놈 서열을 포함하는 조성물 - 청구항 1 내지 청구항 34 중 어느 한 항에 있어서,
상기 지카 바이러스는 서열번호 1의 위치 98, 또는 서열번호 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 갖는 조성물 - 청구항 35에 있어서,
상기 돌연변이는 서열번호 1에서 Trp98Gly 돌연변이인 조성물. - 청구항 1 내지 청구항 36 중 어느 한 항에 있어서,
상기 지카 바이러스는 외피 단백질(Env)에서 돌연변이를 포함하지 않는 조성물. - 청구항 1 내지 청구항 37 중 어느 한 항에 있어서,
상기 외피 단백질을 인코딩하는 서열은 서열번호 2에서의 상응하는 서열과 동일하거나, 상기 외피 단백질의 서열은 서열번호 2에서의 서열과 적어도 99% 동일성, 또는 적어도 95% 동일성, 또는 적어도 90% 동일성, 또는 적어도 85% 동일성을 나타내는 조성물. - 청구항 1 내지 청구항 38 중 어느 한 항에 있어서,
상기 지카 바이러스는 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선아래의 총 면적의 85%를 초과하는 크기 배제 크로마토그래피에서 정제된 지카 바이러스의 주 피크에 의해 결정된 바와 같은 적어도 85%의 순도인 조성물. - 청구항 1 내지 청구항 39 중 어느 한 항에 있어서,
상기 지카 바이러스는 화학적으로 불활성화된 조성물. - 청구항 40에 있어서,
상기 지카 바이러스는 세제, 포름알데히드, 과산화수소, 베타-프로피오락톤(BPL), 바이너리 에틸아민(BEI), 아세틸 에틸렌이민, 메틸렌 블루, 및 소랄렌 중 하나 이상으로 불활성화된 조성물. - 청구항 41에 있어서,
상기 지카 바이러스는 포름알데히드로 불활성화된 조성물. - 청구항 42에 있어서,
상기 지카 바이러스는 지카 바이러스를 약 15℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도에서 5 내지 15일 동안 약 0.001% w/v 내지 약 3.0% w/v 범위의 양으로 포름알데히드로 처리하는 방법으로부터 얻을 수 있는 불활성화된 전체 바이러스인 조성물 - 청구항 43에 있어서,
상기 지카 바이러스는 약 0.005% w/v 내지 약 0.02% w/v의 포름알데히드로 전체 살아있는 지카 바이러스를 처리함으로써 얻을 수 있는 불활성화된 전체 바이러스인 조성물. - 청구항 44에 있어서,
상기 지카 바이러스는 약 0.015% w/v 미만의 포름알데히드로 전체 살아있는 지카 바이러스를 처리함으로써 얻을 수 있는 불활성화된 전체 바이러스인 조성물. - a) 청구항 1 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 따른 불활성화 바이러스 조성물, 및
b) 수산화알루미늄과 같은 보조제를 포함하는 액상 백신. - 청구항 46에 있어서,
상기 액상 백신에서 염화나트륨 농도는 약 50mM 내지 약 200mM, 또는 약 84mM과 같은 약 60mM 내지 약 150mM인 액상 백신. - 청구항 47에 있어서,
상기 액상 백신은 약 8.5 mM 내지 약 80 mM의 트리스 및 약 60mM 내지 약 150mM의 NaCl을 포함하고, 상기 액상 불활성화 바이러스 조성물의 pH는 상온에서 측정시 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0인 액상 백신. - 청구항 48에 있어서,
상기 액상 백신은 약 0.4%(w/v) 내지 4.7%(w/v)의 수크로스를 포함하는 액상 백신. - 청구항 49에 있어서,
원소 알루미늄을 기준으로 100μg/ml 내지 800μg/ml의 수산화알루미늄, 또는 200μg/ml 내지 600μg/ml의 수산화알루미늄, 또는 300μg/ml 내지 500μg/ml의 수산화알루미늄, 또는 약 400μg/ml의 수산화알루미늄을 포함하는 액상 백신. - 청구항 46 내지 청구항 50 중 어느 한 항에 따른 단위 투여량의 액상 백신.
- 청구항 51에 있어서,
약 1μg 내지 약 15μg의 불활성화된 전체 지카 바이러스를 포함하는 단위 투여량의 백신. - 청구항 52에 있어서,
약 2μg의 불활성화된 전체 지카 바이러스를 포함하는 단위 투여량의 백신. - 청구항 52에 있어서,
약 5μg의 불활성화된 전체 지카 바이러스를 포함하는 단위 투여량의 백신. - 청구항 52에 있어서,
약 10μg의 불활성화된 전체 지카 바이러스를 포함하는 단위 투여량의 백신. - 청구항 51 내지 청구항 55항 중 어느 한 항에 있어서,
약 0.4 mL 내지 약 0.8 mL의 약학적으로 허용가능한 액상으로 제공되는 단위 투여량의 백신. - a) 불활성화된 전체 지카 바이러스,
b) 적어도 약 6.5mM의 농도를 갖는 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 완충액, 및
c) 임의적으로 폴리올을 포함하는 불활성화 바이러스 조성물의 용도로서,
상기 불활성화 바이러스 조성물은 알루미늄 염으로부터 선택되는 보조제를 함유하지 않고, 상기 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 완충액은 불활성화된 전체 지카 바이러스를 안정화시키기 위해 포스페이트 이온을 포함하지 않는 용도. - 청구항 57에 있어서,
5±3℃에서 적어도 10일 동안 보관하는 동안 상기 불활성화된 전체 지카 바이러스를 안정화시키기 위한 용도. - 청구항 57에 있어서,
-80℃에서 적어도 10일 동안 보관하는 동안 상기 불활성화된 전체 지카 바이러스를 안정화시키기 위한 용도. - 청구항 59에 있어서,
-80℃에서 적어도 6개월 동안 보관하는 동안 상기 불활성화된 전체 지카 바이러스를 안정화시키기 위한 용도. - 청구항 60에 있어서,
-80℃에서 적어도 12개월 동안 보관하는 동안 상기 불활성화된 전체 지카 바이러스를 안정화시키기 위한 용도. - 청구항 57 내지 청구항 61에 있어서,
적어도 2 동결 융해 주기, 또는 적어도 4 동결 융해 주기와 같은 하나 또는 다수의 동결 융해 주기 동안 상기 불활성화된 전체 지카 바이러스를 안정화시키기 위한 용도. - 청구항 51 내지 청구항 56 중 어느 한 항의 단위 투여량의 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 특히 이를 필요로 하는 인간 대상체에서 지카 바이러스 감염을 예방하는 치료 또는 예방 방법.
- 청구항 51 내지 청구항 56 중 어느 한 항에 있어서,
특히 이를 필요로 하는 인간 대상체에서 지카 바이러스 감염을 예방하는데 사용하기 위한, 치료 또는 예방에 사용하기 위한 단위 투여량의 백신. - 이를 필요로 하는 인간 대상체에서 지카 바이러스 감염을 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서의 청구항 51 내지 청구항 56 중 어느 한 항에 따른 단위 투여량의 백신의 용도.
- a) 불활성화된 전체 지카 바이러스;
b) 약학적으로 허용가능한 완충액; 및
c) 임의적으로 폴리올;을 포함하는 액상 불활성화 바이러스 조성물의 제조 방법으로서,
상기 완충액은 포스페이트 완충액이 아니고, 상기 완충액의 농도는 적어도 6.5mM이며,
상기 불활성화 바이러스 조성물은 바람직하게는 알루미늄 염으로부터 선택되는 보조제를 함유하지 않고, 상기 방법은
단계 1. 하나 이상의 비-인간 세포로부터 얻은 상등액으로부터 지카 바이러스 제제를 분리하는 단계,
단계 2. 상기 지카 바이러스 제제를 정제하는 단계,
단계 3. 상기 바이러스 제제를 불활성화하는 단계,
단계 4. 상기 지카 바이러스 제제를 약학적으로 허용가능한 완충액으로 옮겨 불활성화 지카 바이러스 조성물을 얻는 단계를 포함하는 방법. - 단계 1. 청구항 1 내지 청구항 45의 불활성화 바이러스 조성물을 제공하는 단계,
단계 2. 보조제, 바람직하게는 알루미늄 염 및 임의로 추가의 약학적으로 허용가능한 완충액을 상기 불활성화 바이러스 조성물에 첨가하는 단계를 포함하는 액상 백신의 제조 방법. - 청구항 67에 있어서,
단계 2에서 상기 추가의 약학적으로 허용가능한 완충액은 상기 불활성화 바이러스 조성물에서 가장 높은 농도를 갖는 완충액과 동일한 완충액을 포함하는 방법. - 청구항 66 내지 청구항 68 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 생산물.
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