JP2022533550A - 不活化ウイルス組成物及びジカワクチン製剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、液体不活化ウイルス組成物であって、不活化全粒子ジカウイルスと、少なくとも約６．５ｍＭの濃度の少なくとも１つの薬学的に許容される緩衝液と、任意選択により、ポリオールと、を含み、当該少なくとも１つの薬学的に許容される緩衝液は、リン酸イオンを含まない、当該組成物、及びそれに由来するワクチンに関する。【選択図】図１

Description

本開示は、不活化全粒子ジカウイルスを含む不活化ウイルス組成物及びその製剤、製造の方法、及びその使用ならびにそれに由来するワクチンに関する。

ジカウイルスは、他の蚊媒介性ウイルス（例えば、黄熱ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、及び日本脳炎ウイルス）とともにフラビウイルス科内のフラビウイルス属に分類され、２０１３年にブラジルにウイルスが持ち込まれて以来、地球半球全体に急速に蔓延している。ウイルスは、アメリカ合衆国の領土を含む中央アメリカ及び北アメリカに達し、結果として、現在、アメリカ大陸を脅かしている。実際、ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９は、２０１５年にプエルトリコを旅行した人の血清から分離された。この株のゲノム配列は、少なくとも３回決定されている（Ｌａｎｃｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０１６ Ｍａｙ；２２（５）：９３３－５及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＵ５０１２１５．１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＸ０８７１０１．３；ならびにＹｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎｎｏｕｎｃ．２０１６ Ａｕｇ １８；４（４）及びＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号ＡＮＫ５７８９７．１参照）。

ジカウイルスは、１９４７年にウガンダで最初に分離され、１９５２年にヒト疾患にはじめて関連付けられ、アフリカ及び東南アジアで軽度の自己限定性熱性疾患の原因として散発的に認められてきた（Ｗｅａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．１３０：６９－８０；Ｆａｒｉａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ．３５２（６２８３）：３４５－３４９）。しかしながら、２００７年に、北太平洋のヤップ島でアウトブレイクが発生し、太平洋の島から島へと伝播した。これが、２０１３～２０１４年のフランス領ポリネシアでの広範な流行につながり、その後、ニューカレドニア、クック諸島、そして最終的にはイースター島へと広がった。その後、アジア系統ウイルスが西半球に移動したが、経路は未だ判明していない（Ｆａｒｉａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ．３５２（６２８３）：３４５－３４９）。ウイルスは、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（ネッタイシマ蚊）、Ａ．ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（ヒトスジシマ蚊）によって、また、おそらくはＡ．ｈｅｎｓｉｌｌｉ及びＡ．ｐｏｌｙｎｉｅｓｅｉｎｓｉｓによって、人畜共通感染する可能性がある（Ｗｅａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．１３０：６９－８０）。更に、ウイルスを運ぶ他の媒介動物が存在する可能性があり、輸血、経胎盤、及び／または性的感染によりウイルスが伝染し得ると考えられている。

２０１５年後半には、ジカウイルス感染症が広まった地域で胎児異常（例えば、小頭症）及びギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）が大幅に増加したことから、ジカウイルスが当初考えていたよりもはるかに悪性であり得るという警告が発せられ、世界保健機関（ＷＨＯ）が「国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態（ＰＨＥＩＣ）」を宣言するに至った（Ｈｅｙｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｌａｎｃｅｔ ３８７（１００２０）：７１９－２１）。ジカウイルスは、公衆衛生上の大きな脅威であるが、ＦＤＡに承認されたワクチンまたは治療は、現在のところ存在せず、蚊集団を管理することでジカウイルスを制御する予防的措置があるのみである。

ワクチン候補の開発のための組み換えジカウイルスを特徴付ける最近の取り組みでは、位置３３０のウイルスエンベロープタンパク質に変異を有する非ヒト細胞適応化ジカウイルスが特定された（Ｗｅｇｅｒ－Ｌｕｃａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）。この研究の著者らは、ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９の全長感染性ｃＤＮＡクローンが、クローニングにおける増幅時に遺伝的に不安定であることを認め、この観察された不安定性に対処するために、ウイルスゲノムを分割することを選択し、２つのプラスミド系を開発して適用した。しかしながら、ジカワクチンの開発に２つのプラスミド系はあまり望ましくない。このように、遺伝的に安定なジカウイルスを利用した、ジカウイルス感染症を治療及び／または予防するためのワクチンを開発する必要がある。

不活化ウイルス組成物は、良好な安定性を示すことが望ましく、特に、ワクチンの製造にあたり、既に精製及び不活化され、通常「原薬」と呼ばれる中間生成物である不活化ウイルス組成物は、輸送及び長期間保存することができ、最終生成物、すなわち、ワクチンに製剤化されるまでの時間、その活性を失わないことが必要である。例えば、不活化ウイルス組成物は、凍結され得（例えば、－８０℃などで）、それにより、長期間保存することができる。そのため、不活化ウイルス組成物は、－８０℃での保管中に安定であることが重要である。更に、不活化ウイルス組成物は、温度変化に耐え得ることが重要である。特に、不活化ウイルス組成物は、１回または複数回の凍結融解サイクルが生じる凍結及び融解の結果として活性を失わないことが大切である。１回または複数回の凍結融解サイクルに対する耐性はまた、生産プロセス中に原薬材料を凍結することが可能であることを意味する。

本発明の目的は、不活化全粒子ジカウイルスが保管中に安定している、不活化ウイルス組成物を提供することである。特に、本発明の目的は、不活化全粒子ジカウイルスが－８０℃での長期間の保管、例えば、少なくとも１０日間から６ヶ月または１年までの保管中に安定している、不活化ウイルス組成物を提供することである。一般的に凍結保管することが目的とされているそのような組成物は、ミョウバン／水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩などのアルミニウム系アジュバントを（まだ）含有しておらず、所望であれば、そのようなアルミニウム系アジュバントは、凍結保管が予定されていない場合、後から加えることができる。

本発明の更なる目的は、１回または複数回の凍結融解サイクル中に不活化全粒子ジカウイルスを安定化することができる不活化ウイルス組成物を提供することである。

上記の目的は、本明細書に記載及び特許請求される本発明の実施形態によって達成される。

したがって、本発明は、液体不活化ウイルス組成物であって、
ａ）不活化全粒子ジカウイルスと、
ｂ）少なくとも約６．５ｍＭの濃度の少なくとも１つの薬学的に許容される緩衝液と、
ｃ）任意選択により、ポリオールと、を含み、
当該液体不活化ウイルス組成物は、好ましくは、アルミニウム塩から選択されるアジュバントを含有せず、当該少なくとも１つの薬学的に許容される緩衝液は、リン酸イオンを含まない、当該液体不活化ウイルス組成物を目的とする。

特定の態様では、液体不活化ウイルス組成物中のリン酸イオンの濃度は、約７ｍＭ未満、または約６ｍＭ未満、または約５ｍＭ未満、または約４ｍＭ未満、または約３ｍＭ未満、または約２ｍＭ未満、または約１ｍＭ未満である。

本発明はまた、不活化ウイルス組成物の使用であって、
ａ）不活化全粒子ジカウイルスと、
ｂ）少なくとも約６．５ｍＭの濃度の少なくとも１つの薬学的に許容される緩衝液と、
ｃ）任意選択により、ポリオールと、を含み、
当該液体不活化ウイルス組成物は、好ましくは、アルミニウム塩から選択されるアジュバントを含有せず、
当該少なくとも１つの薬学的に許容される緩衝液は、リン酸イオンを含まない、不活化全粒子ジカウイルスを安定化するための当該使用を目的とする。

本発明は、更に、液体不活化ウイルス組成物を調製する方法であって、
ａ）不活化全粒子ジカウイルスと、
ｂ）薬学的に許容される緩衝液であって、当該緩衝液は、リン酸緩衝液ではなく、当該緩衝液の濃度は、少なくとも６．５ｍＭである、緩衝液と、
ｃ）任意選択により、ポリオールと、を含み、
当該不活化ウイルス組成物は、アルミニウム塩から選択されるアジュバントを含有せず、当該方法は、次のステップ：
ステップ１．１つ以上の非ヒト細胞から得られた上清からジカウイルス調製物を分離すること、
ステップ２．ジカウイルス調製物を精製すること、
ステップ３．ウイルス調製物を不活化すること、
ステップ４．ジカウイルス調製物を薬学的に許容される緩衝液に移してジカウイルス原薬を得ること、を含む、当該方法を目的とする。

本発明は、更に、
ａ）本発明に係る不活化ウイルス組成物と、
ｂ）水酸化アルミニウムなどのアジュバントと、
を含む、液体ワクチンに関する。

特定の態様では、液体ワクチンは、約５０ｍＭ～約２００ｍＭのＮａＣｌ、約８．５ｍＭ～約８０ｍＭのＴｒｉｓ及び約０．４％ｗ／ｖ～約４．７％ｗ／ｖのスクロースを含む。

本発明はまた、ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、当該対象に、上記の本発明に係る液体ワクチンの単位用量を投与することを含む、方法に関する。

本発明は、更に、液体ワクチンを調製する方法であって、次のステップ：
ステップ１．上記の本発明に係る不活化ウイルス組成物を提供すること、
ステップ２．不活化ウイルス組成物に、アジュバントであって、好ましくはアルミニウム塩であるアジュバントと、任意選択により更なる薬学的に許容される緩衝液とを添加することを含む、方法を目的とする。

本発明はまた、上記の方法によって得ることができる製品に関する。

モック感染したＶｅｒｏ細胞単層（上）またはＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９株に感染したＶｅｒｏ細胞単層（下）の明視野顕微鏡画像を示す。 ＴＣＩＤ_５０によって決定した、Ｖｅｒｏ細胞単層上でのＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ１の成長速度を示す。 ジカウイルスＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ５クローンａ～ｆの効力アッセイ試験（ＴＣＩＤ_５０）を示す。 Ｖｅｒｏ細胞単層上でのジカウイルスＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６クローンａ～ｆの成長の細胞変性効果（ＣＰＥ）を表す明視野顕微鏡画像を示す。 ジカウイルスＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６クローンａ～ｆの効力アッセイ試験（ＴＣＩＤ_５０）を示す。 ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６ｅ（配列番号８）及びＰＲＶＡＢＣ５９（配列番号９）に由来する、残基３３０付近のジカウイルスのエンベロープ糖タンパク質配列をいくつかの他のフラビウイルス（ＷＮＶ（配列番号１０）；ＪＥＶ（配列番号１１）；ＳＬＥＶ（配列番号１２）；ＹＦＶ（配列番号１３）；ＤＥＮＶ １ １６００７（配列番号１４）；ＤＥＮＶ ２ １６６８１（配列番号１５）；ＤＥＮＶ ３ １６５６２（配列番号１６）；及びＤＥＮＶ ４ １０３６（配列番号１７））と比較したアミノ酸配列アラインメントを示す。 ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６ｅ（配列番号１８）及びＰＲＶＡＢＣ５９（配列番号１９）に由来する、残基９８付近のジカウイルスのＮＳ１タンパク質配列をいくつかの他のフラビウイルス（ＷＮＶ（配列番号２０）；ＪＥＶ（配列番号２１）；ＳＬＥＶ（配列番号２２）；ＹＦＶ（配列番号２３）；ＤＥＮＶ １ １６００７（配列番号２４）；ＤＥＮＶ ２ １６６８１（配列番号２５）；ＤＥＮＶ ３ １６５６２（配列番号２６）；及びＤＥＮＶ ４ １０３６（配列番号２７））と比較したアミノ酸配列アラインメントを示す。 ＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ１ウイルスと比較した、ＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６ウイルスクローンａ～ｆのプラーク表現型を示す。 ＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ１ウイルスと比較した、ＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６ウイルスクローンの平均プラークサイズを示す。 無血清成長条件下でのＶｅｒｏ細胞におけるＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６クローンａ～ｆの成長速度を示す。 編集した不活化の動態データを示す。データは、４つの毒性学ロットからのサンプルの感染力（ＴＣＩＤ５０）をＲＮＡコピー及び不活化の完全性（ＣＯＩ）と比較する。これらのデータは、ＣＯＩアッセイの感度がＴＣＩＤ５０よりも大きいことを示している。 ０．３１ ＴＣＩＤ５０の入力ウイルス力価で示した場合のアッセイにおけるＣ６／３６とＶｅｒｏの感度の比較を示す。 ０．０１ ＴＣＩＤ５０／ウェルの目標値前後に９９％信頼区間を含むＣ６／３６細胞箇所を使用したＣＰＥ対ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０の回帰分析を示す（－２ ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ウェル）；モデルは、ウェルの０．８５％が陽性になることを予測している。 －８０℃で６７日間保管した後のＴｒｉｓ＋７％スクロース緩衝液中のジカウイルスワクチン原薬のＳＥＣクロマトグラムにおけるインタクトなジカウイルス（保持時間約８分）に対応するピーク（このピークは、実施例３Ｃ表１６ｂに対応する）。 －８０℃で６７日間保管した後のＺＰＢ緩衝液中のジカウイルスワクチン原薬のＳＥＣクロマトグラムにおけるインタクトなジカウイルス（保持時間約８分）に対応するピーク（このピークは、実施例３Ｃ表１６ｂに対応する）。 ５±３℃及び－８０℃で１０日間保管した後のインタクトなジカウイルスの残存パーセンテージ（ＳＥＣによる測定）（実施例３Ａに対応する）。 －８０℃で６０日間保管した後のインタクトなジカウイルスの残存パーセンテージ（ＳＥＣによる測定）（実施例３Ｂに対応する）。 ５±３℃及び－８０℃で６７日間保管した後のインタクトなジカウイルスの残存パーセンテージ（ＳＥＣによる測定）（実施例３Ｃに対応する）。 －８０℃で３ヶ月間保管した後のＺＰＢ及びＴｒｉｓ＋スクロース中のジカワクチン原薬のインタクトなジカウイルスの残存パーセンテージ（ＳＥＣによる測定）（実施例３Ｄに対応する）。 ５±３℃で０～６０日間保管した後のＺＰＢ及びＴＢＳ中のジカワクチン原薬のインタクトなジカウイルスの残存パーセンテージ（ＳＥＣによる測定）（実施例３Ｅに対応する）。 凍結融解サイクルを繰り返した後のインタクトなジカウイルスの残存パーセンテージ（ＳＥＣによる測定）（実施例３Ｆに対応）。

定義
別段の定義のない限り、本明細書で用いられる全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の任意の方法及び材料を本発明の検証の実施に使用することができるが、好ましい材料及び方法が本明細書に記載される。本発明を記載及び特許請求するにあたり、以下の用語が以下に示される定義に従って使用される。

特に明示されない限り、「ａ」、「ａｎ」などの用語の使用は、１つ以上を指す。

本明細書で使用される「不活化ジカウイルス」という用語は、有効量のホルムアルデヒドによる処理などの不活性化方法で処理されたジカウイルスを含むことが意図される。

本明細書で使用される「不活化全粒子ジカウイルス」という用語は、有効量のホルマリンによる処理などの不活性化方法で処理されたジカウイルスを含むことが意図される。そのような処理は、ウイルスの構造を破壊しないものと考えられ、すなわち、ウイルスの二次、三次または四次構造及び免疫原性エピトープを破壊せず、不活化ジカウイルスは、不活化されていないジカウイルスに感染し得る宿主細胞に感染する可能性はもはやない。一実施形態では、不活化ジカウイルスは、もはやＶＥＲＯ細胞に感染することができず、ＶＥＲＯ細胞に細胞変性効果を及ぼすこともない。特に、不活化（全粒子）ジカウイルスは、当該ジカウイルスが約０．０１％ｗ／ｖの量のホルムアルデヒドにより、２０℃～２４℃の温度で、１０日間処理される方法から得ることができる／得られるものであり得る。全粒子ジカウイルスのサンプルは、サイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下総面積の少なくとも８５％のメインピークをもたらし得る。

「ポリオール」という用語は、本発明の目的上、複数のヒドロキシル基を含む物質を指すように定義され、糖（還元及び非還元糖）、糖アルコール及び糖酸を含む。ポリオールの別の例は、グリセロールである。任意選択により、本明細書に定義されるポリオールは、約６００Ｄａ未満（例えば、約１２０～約４００Ｄａの範囲内）である分子量を有する。

「アミノ基含有分子」という用語は、本発明の目的上、一級、二級、三級及び四級アミン基（ＲＮＨ_２、Ｒ_２ＮＨ、Ｒ_３Ｎ、Ｒ_４Ｎ＋）含有分子を含むように定義される。Ｒ基は、一般に、環式または非環式の炭化水素である。アミノ基含有分子は、アミノ酸（例えば、ヒスチジンなど）、Ｔｒｉｓ、ＡＣＥＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、トリシン、及びＡＤＡを含む（緩衝液のそれぞれの略語の全ては、当該技術分野において一般に知られているのと同じ意味を有する）。

「室温」という用語は、本発明の目的上、通常の室温、例えば、約２５℃などを指すように定義される。

本発明の意味において、「不活化ウイルス組成物」または「液体不活化ウイルス組成物」という用語は、一般に、液体形態または凍結した液体の形態の組成物を指す。そのような組成物は、不活化ウイルスを含む中間組成物であり、これは、多くの場合、凍結状態で保存され、次いで、少なくとも更にアジュバントを添加することによって、最終的にワクチン／医薬品を調製するために使用される。

Ｔｒｉｓは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液を指す。

特に指示がない場合、「％」は、「体積あたりの重量（ｗ／ｖ）」を指す。

一般技法
従来の方法論、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（２００３））；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ.Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ），ｅｄ．，１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；及びＴｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）に記載されている、当業者によって広く利用されている方法論などを使用する本明細書に記載または参照される技術及び手順は、一般によく理解され、広く採用されている。

不活化ウイルス組成物
本発明は、液体不活化ウイルス組成物であって、
ａ）不活化全粒子ジカウイルスと、
ｂ）少なくとも約６．５ｍＭの濃度の少なくとも１つの薬学的に許容される緩衝液と、
ｃ）任意選択により、ポリオールと、を含み、
当該少なくとも１つの薬学的に許容される緩衝液は、リン酸イオンを含まない、液体不活化ウイルス組成物に関する。

特定のそのような実施形態では、液体不活化ウイルス組成物は、アルミニウム塩から選択されるアジュバントを含有しない。特に、アルミニウム塩は、ミョウバン（水酸化アルミニウムなど）、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムの群から選択され得る。特定のそのような実施形態では、液体不活化ウイルス組成物は、不活化全粒子ジカウイルスが吸着し得るアジュバントを含有しない。特定のそのような実施形態では、液体不活化ウイルス組成物は、アルミニウム塩、リン酸カルシウム、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、ＭＬＡ誘導体、合成リピドＡ、リピドＡミメティックまたはアナログ、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、乳剤（油乳剤）、キトサン、ビタミンＤ、ステアリルまたはオクタデシルチロシン、ビロソーム、コクリエート、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）から選択されるアジュバントを含有しない。特定のそのような実施形態では、液体不活化ウイルス組成物は、アジュバント、すなわち、当業者に知られている任意のアジュバント化合物を含有しない。

特定の実施形態では、液体不活化ウイルス組成物中のリン酸イオンの濃度は、約７ｍＭ未満、または約６ｍＭ未満、または約５ｍＭ未満、または約４ｍＭ未満、または約３ｍＭ未満、または約２ｍＭ未満、または約１ｍＭ未満である。リン酸イオンを含む液体は、例えば、液体中にリン酸二ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）及び／またはリン酸一カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）を溶解または分散させることによって得られる。リン酸二ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）及びリン酸一カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）が特定の比で水性液体中に溶解される場合、これにより、リン酸緩衝液が生じる。

特定の実施形態では、液体不活化ウイルス組成物中の当該少なくとも１つの薬学的に許容される緩衝液の濃度は、少なくとも約７ｍＭ、または少なくとも約７．５ｍＭ、または少なくとも約８ｍＭ、または少なくとも約８．５ｍＭ、または少なくとも約９ｍＭ、または少なくとも約１０ｍＭである。特定のそのような実施形態では、液体不活化ウイルス組成物中の少なくとも１つの薬学的に許容される緩衝液の濃度は、約７ｍＭ～約２００ｍＭ、または約７．５ｍＭ～約２００ｍＭ、または約８ｍＭ～約２００ｍＭ、または約８．５ｍＭ～約２００ｍＭ、または約９ｍＭ～約１００ｍＭ、または約９ｍＭ～約６０ｍＭ、または９ｍＭ～約３０ｍＭまたは約９ｍＭ～約１１ｍＭまたは約１０ｍＭ、または約２０ｍＭ、または約５０ｍＭである。

特定の実施形態では、液体不活化ウイルス組成物は、１つのみの薬学的に許容される緩衝液を含む。更に、特定の実施形態では、液体不活化ウイルス組成物は、実質的に１つのみの薬学的に許容される緩衝液と、２ｍＭ未満、または１．５ｍＭ未満、または１ｍＭ未満または０．９ｍＭ未満、または０．５ｍＭ未満、または０．２ｍＭ未満の濃度である残留量のみの追加の緩衝液の成分と、を含み得る。

特定の実施形態では、液体不活化ウイルス組成物は、少なくとも２つの異なる薬学的に許容される緩衝液を含み、液体不活化ウイルス組成物中で最も濃度が高い２つの薬学的に許容される緩衝液のモル比は、１：２～２：１、または１：５～５：１、または８：１～１：８、または１０：１～１：１０の間ではない。

特定の実施形態では、液体不活化ウイルス組成物中のカリウムイオンの濃度は、約４ｍＭ未満、または約３ｍＭ未満、または約２ｍＭ未満、または約１．５ｍＭ未満、または約０．５ｍＭ未満、または約０．１ｍＭ未満、または約０ｍＭ（すなわち、カリウムイオンを実質的に含まない）である。

特定の実施形態では、液体不活化ウイルス組成物は、プロタミン硫酸塩を実質的に含まないか、または含まない。

特定の実施形態では、液体不活化ウイルス組成物のｐＨは、室温で決定される場合、ｐＨ約６．０～ｐＨ約９．０またはｐＨ約６．５～ｐＨ約８．０、またはｐＨ約６．８～ｐＨ約７．８、ｐＨ約７．４またはｐＨ約７．６である。

緩衝液
特定の実施形態では、本発明に係る液体不活化ウイルス組成物は、
ａ）不活化全粒子ジカウイルスと、
ｂ）少なくとも約６．５ｍＭの濃度の少なくとも１つの薬学的に許容される緩衝液と、
ｃ）任意選択により、ポリオールと、を含み、
当該液体不活化ウイルス組成物は、アルミニウム塩から選択されるアジュバントを含有せず、
当該少なくとも１つの薬学的に許容される緩衝液は、アミノ基含有分子を含み、リン酸イオンを含まない。

アミノ基含有分子を含む緩衝液は、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、Ｔｒｉｓ、ＡＣＥＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、トリシン、及びＡＤＡからなる群から選択することができる。特定の好ましい実施形態では、薬学的に許容される緩衝液は、Ｔｒｉｓまたはヒスチジン（Ｈｉｓ）緩衝液、好ましくは、Ｔｒｉｓ緩衝液である。

ポリオール
特定の実施形態では、液体不活化ウイルス組成物は、少なくとも１つのポリオールを更に含む。

特定のそのような実施形態では、液体不活化ウイルス組成物は、約１％ｗ／ｖ～約６０％ｗ／ｖのポリオール、または約６％ｗ／ｖ～約５０％ｗ／ｖのポリオール、または約６％ｗ／ｖ～約４０％ｗ／ｖのポリオール、または約６％ｗ／ｖ～約３５％ｗ／ｖのポリオール、または約６％ｗ／ｖ～約３０％ｗ／ｖのポリオール、または約６％ｗ／ｖ～約２５％ｗ／ｖのポリオール、または約６％ｗ／ｖ～約２０％ｗ／ｖのポリオール、または約６％ｗ／ｖ～約１５％ｗ／ｖのポリオール、または約６％ｗ／ｖ～約１２％ｗ／ｖのポリオール、または約７％ｗ／ｖのポリオールまたは約１０％ｗ／ｖのポリオールを含む。

特定の好ましい実施形態では、液体不活化ウイルス組成物は、アミノ基含有分子を含む薬学的に許容される緩衝液と、約６％ｗ／ｖ～約１５％ｗ／ｖのポリオールと、を含む。特定のそのような実施形態では、液体不活化ウイルス組成物は、Ｔｒｉｓと、約６％ｗ／ｖ～約１５％ｗ／ｖのポリオールと、を含む。

特定の実施形態では、ポリオールは、糖である。特定のそのような実施形態では、糖は、二糖である。特定のそのような実施形態では、二糖は、非還元糖である。特定のそのような実施形態では、非還元糖は、スクロースである。

特定のそのような実施形態では、液体不活化ウイルス組成物は、約５％ｗ／ｖ～約２０％ｗ／ｖのスクロース、または約６％ｗ／ｖ～約１５％ｗ／ｖのスクロースを含む。特定のそのような実施形態では、液体不活化ウイルス組成物は、約６％ｗ／ｖ～約８％ｗ／ｖのスクロース、例えば、約７％ｗ／ｖのスクロースを含む。

特定の好ましい態様では、液体不活化ウイルス組成物は、約８．５ｍＭ～約５０ｍＭのＴｒｉｓと、約６％～約１５％ｗ／ｖのスクロースと、を含み、不活化ウイルス組成物のｐＨは、室温で測定したとき、ｐＨ約７．０～ｐＨ約８．０である。

特定の代替的な実施形態では、ポリオールは、グリセロールである。特定のそのような実施形態では、液体不活化ウイルス組成物は、約１％ｖ／ｖ～約６０％ｖ／ｖのグリセロール、または約７％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖのグリセロール、または約１０％ｖ／ｖのグリセロールを含む。

特定の好ましい態様では、不活化ウイルス組成物は、約８．５ｍＭ～約５０ｍＭのＴｒｉｓと、約６％ｖ／ｖ～約１５％のｖ／ｖグリセロールと、を含み、不活化ウイルス組成物のｐＨは、室温で測定したとき、ｐＨ約７．０～ｐＨ約８．０である。

塩化ナトリウム
特定の実施形態では、液体不活化ウイルス組成物は、塩化ナトリウムを更に含む。特定のそのような実施形態では、液体不活化ウイルス組成物は、約約５ｍＭ～約５００ｍＭの塩化ナトリウム、または約１０ｍＭ～約２００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含む。

特定のそのような実施形態では、液体不活化ウイルス組成物は、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、または約１０ｍＭ～約３０ｍＭの濃度の塩化ナトリウム、例えば、約２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。特定の好ましい態様では、液体不活化ウイルス組成物は、約８．５ｍＭ～約８０ｍＭのＴｒｉｓ、約１０ｍＭ～約３０ｍＭの塩化ナトリウム、約６％～約１５％ｗ／ｖのスクロースを含み、液体不活化ウイルス組成物のｐＨは、室温で測定したとき、ｐＨ約７．０～ｐＨ約８．０である。特定の好ましい態様では、液体不活化ウイルス組成物は、約８．５ｍＭ～約１５ｍＭのＴｒｉｓ、約１０ｍＭ～約２５ｍＭの塩化ナトリウム、約６％～約１０％ｗ／ｖのスクロースを含み、液体不活化ウイルス組成物のｐＨは、室温で測定したとき、ｐＨ約７．０～ｐＨ約８．０である。

特定の代替的な実施形態では、液体不活化ウイルス組成物は、約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、または約１４０ｍＭ～約１６０ｍＭ、例えば、約１５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含む。特定のそのような実施形態では、液体不活化ウイルス組成物は、約８．５ｍＭ～約８０ｍＭのＴｒｉｓと、約１４０ｍＭ～約１６０ｍＭのＮａＣｌと、を含み、液体不活化ウイルス組成物のｐＨは、室温で測定したとき、ｐＨ約７．０～ｐＨ約８．０である。特定のそのような実施形態では、液体不活化ウイルス組成物は、約８．５ｍＭ～約１５ｍＭのＴｒｉｓと、約１４０ｍＭ～約１６０ｍＭのＮａＣｌと、を含み、液体不活化ウイルス組成物のｐＨは、室温で測定したとき、ｐＨ約７．０～ｐＨ約８．０である。

特定の実施形態では、液体不活化ウイルス組成物のイオン強度は、約８０ｍＭ未満、または約７０ｍＭ未満、または約６０ｍＭ未満、または約５０ｍＭ未満、または約４０ｍＭ未満、または約３０ｍＭ未満である。イオン強度という用語は、次の式で定義される：

式中、Ｃ_ｉはイオンＩのモル濃度であり、Ｚ_ｉはそのイオンの電荷数であり、溶液中の全てのイオンについて合計を取る。

ジカウイルス
本発明は、不活化全粒子ジカウイルスを含む不活化ウイルス組成物に関する。本発明の特定の態様では、不活化全粒子ジカウイルスは、ジカウイルスの集団からプラーク精製によって分離された、精製された不活化全粒子ジカウイルスを指し得る。本発明は、任意の種類の不活化全粒子ジカウイルスに関する。以下に、一例として、具体的なジカウイルスについて記載される。

ジカウイルス（ＺＩＫＶ）は、１９４７年にウガンダのジカ森のアカゲザル歩哨動物からはじめて分離された蚊媒介性フラビウイルスである。それ以降、アフリカとアジアの両方、より最近では、アメリカ大陸で、ヒトから分離されている。ＺＩＫＶは、アフリカ系統（おそらく東アフリカ系統と西アフリカ系統とに分かれる）とアジア系統の２つ（おそらくは３つ）の系統で見つかっている。したがって、本開示の好適なジカウイルスの例は、限定するものではないが、アフリカ及び／またはアジア系統に由来するウイルスを含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、アフリカ系統ウイルスである。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、アジア系統ウイルスである。更に、ジカウイルスのアフリカ系統及びアジア系統内の複数の株がこれまでに特定されている。当該技術分野において知られているジカウイルスの任意の１つ以上の好適な株を本開示で使用することができ、例えば、Ｍｒ ７６６、ＡｒＤ ４１５１９、ＩｂＨ ３０６５６、Ｐ６－７４０、ＥＣ Ｙａｐ、ＦＳＳ１３０２５、ＡｒＤ ７１１７、ＡｒＤ ９９５７、ＡｒＤ ３０１０１、ＡｒＤ ３０１５６、ＡｒＤ ３０３３２、ＨＤ ７８７８８、ＡｒＤ １２７７０７、ＡｒＤ １２７７１０、ＡｒＤ １２７９８４、ＡｒＤ １２７９８８、ＡｒＤ １２７９９４、ＡｒＤ １２８０００、ＡｒＤ １３２９１２、１３２９１５、ＡｒＤ １４１１７０、ＡｒＤ １４２６２３、ＡｒＤ １４９９１７、ＡｒＤ １４９８１０、ＡｒＤ １４９９３８、ＡｒＤ １５７９９５、ＡｒＤ １５８０８４、ＡｒＤ １６５５２２、ＡｒＤ １６５５３１、ＡｒＡ １４６５、ＡｒＡ ２７１０１、ＡｒＡ ２７２９０、ＡｒＡ ２７１０６、ＡｒＡ ２７０９６、ＡｒＡ ２７４０７、ＡｒＡ ２７４３３、ＡｒＡ ５０６／９６、ＡｒＡ ９７５－９９、Ａｒａ ９８２－９９、ＡｒＡ ９８６－９９、ＡｒＡ ２７１８、ＡｒＢ １３６２、Ｎｉｇｅｒｉａ６８、Ｍａｌａｙｓｉａ６６、Ｋｅｄｏｕｇｏｕ８４、Ｓｕｒｉｎａｍｅ、ＭＲ１４２９、ＰＲＶＡＢＣ５９、ＥＣＭＮ２００７、ＤａｋＡｒ４１５２４、Ｈ／ＰＦ／２０１３、Ｒ１０３４５１、１０３３４４、８３７５、ＪＭＢ－１８５、ＺＩＫＶ／Ｈ、ｓａｐｉｅｎｓ／Ｂｒａｚｉｌ／Ｎａｔａｌ／２０１５、ＳＰＨ２０１５、ＺＩＫＶ／Ｈｕ／Ｃｈｉｂａ／Ｓ３６／２０１６、及び／またはＣｕｂａ２０１７の株が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＲＶＡＢＣ５９株が本開示に使用される。

いくつかの実施形態では、ジカウイルスゲノム配列の例は、配列番号２として以下に記載される：

いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＵ５０１２１５．１のゲノム配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株由来である。いくつかの実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＵ５０１２１５．１のゲノム配列は、配列番号２の配列を含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号２の配列と、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％，少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％，少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するゲノム配列を含み得る。

いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号２の配列によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号２の配列によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％，少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含み得る。

したがって、いくつかの実施形態では、本開示の不活化ジカウイルスは、本明細書で開示される不活化ウイルス組成物のいずれかにおいて使用され得る。例えば、本開示の不活化ジカウイルスは、ジカウイルス感染症を治療もしくは予防することを、それを必要とする対象において行うこと、及び／またはジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答を誘導することを、それを必要とする対象において行うことに有用な１つ以上の抗原を提供するために使用され得る。

本開示に使用されるジカウイルスは、細胞培養中の１つ以上の細胞から得ることができる（例えば、プラーク精製を介して）。当該技術分野において知られている、ジカウイルスの生産に任意の好適な細胞を使用することができ、例えば、昆虫細胞（例えば、ＣＣＬ－１２５細胞、Ａａｇ－２細胞、ＲＭＬ－１２細胞、Ｃ６／３６細胞、Ｃ７－１０細胞、ＡＰ－６１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－２細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－３細胞、ＵＭ－ＡＶＥ１細胞、Ｍｏｓ．５５細胞、Ｓｕａ１Ｂ細胞、４ａ－３Ｂ細胞、Ｍｏｓ．４２細胞、ＭＳＱ４３細胞、ＬＳＢ－ＡＡ６９５ＢＢ細胞、ＮＩＩＤ－ＣＴＲ細胞、ＴＲＡ－１７１細胞などの蚊細胞、ならびにＡｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ、Ａｅｄｅｓ ｐｓｅｕｄｏｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｓ、Ａｅｄｅｓ ｔｒｉｓｅｒｉａｔｕｓ、Ａｅｄｅｓ ｖｅｘａｎｓ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ａｌｂｉｍｕｓ、Ｃｕｌｅｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ、Ｃｕｌｅｘ ｔｈｅｉｌｅｒｉ、Ｃｕｌｅｘ ｔｒｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ、Ｃｕｌｅｘ ｂｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ、及び／またはＴｏｘｏｒｈｙｎｃｈｉｔｅｓ ａｍｂｏｉｎｅｎｓｉｓなどの蚊種に由来する更なる細胞もしくは細胞株）、及び哺乳動物細胞（例えば、ＶＥＲＯ細胞（サル腎臓由来）、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞（サル腎臓由来）、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４ ＭＤＣＫ （ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載の受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１－Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）が含まれる。いくつかの実施形態では、ジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン分離株）は、非ヒト細胞から生産される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン分離株）は、昆虫細胞から生産される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン分離株）は、蚊細胞から生産される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン分離株）は、哺乳動物細胞から生産される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン分離株）は、Ｖｅｒｏ細胞から生産される。

ジカウイルスは、構造ポリペプチド及び非構造ポリペプチドの両方をコードする一本鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムを持つ。ゲノムはまた、５’末端と３’末端の両方の領域に、ウイルス複製の役割を担う非コーディング配列を含有する。これらのウイルスによってコードされる構造ポリペプチドには、限定するものではないが、カプシド（Ｃ）、前駆体膜（ｐｒＭ）、及びエンベロープ（Ｅ）が含まれる。これらのウイルスによってコードされる非構造（ＮＳ）ポリペプチドには、限定するものではないが、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ５が含まれる。

特定の実施形態では、ジカウイルスは、ジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）に変異を含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含有する。

いくつかの実施形態では、変異は、ＮＳ１ポリペプチド内にある。例示的なジカウイルス株に由来する野生型ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のように示される：

いくつかの実施形態では、ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１の配列と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％，少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％，少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＵ５０１２１５．１の配列（配列番号２）によってコードされるアミノ酸配列であり得る。いくつかの実施形態では、ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＵ５０１２１５．１の配列によってコードされるアミノ酸配列のアミノ酸位置７９５～１１４５であり得る。いくつかの実施形態では、ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９に由来し得る。

「配列同一性」、「％配列同一性」、「％同一性」、「％同一」または「配列アラインメント」は、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との比較または第１の核酸配列と第２の核酸配列との比較を意味し、この比較に基づくパーセンテージとして計算される。この計算の結果は、「同一パーセント」または「ＩＤパーセント」として記載することができる。

一般に、２つの異なるアプローチのうちの１つによって配列同一性を計算するために、配列アラインメントを使用することができる。第１のアプローチでは、単一の位置でのミスマッチと単一の位置でのギャップの両方が、最終的な配列同一性の計算で非同一位置としてカウントされる。第２のアプローチでは、単一の位置でのミスマッチは、最終的な配列同一性の計算で非同一位置としてカウントされるが、単一の位置でのギャップは、最終的な配列同一性の計算で非同一位置としてカウントされない（無視される）。言い換えると、第２のアプローチでは、ギャップは、最終的な配列同一性の計算において無視される。これらの２つのアプローチの違い、すなわち、単一の位置でのギャップを非同一位置としてカウントするか、単一の位置でのギャップを無視するかということは、２つの配列間の配列同一性の値に変動性をもたらし得る。

いくつかの実施形態では、配列同一性は、アラインメントを生成し、最終的な配列同一性の計算で単一の位置でのミスマッチと単一の位置でのギャップの両方を非同一位置としてカウントして同一性を計算するプログラムによって決定される。例えば、Ｎｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳ）は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を実装しており、最初に第１の配列と第２の配列との間のアラインメントを生成し、次いで、アラインメント長にわたって同一である位置の数をカウントし、次いで、同一残基数をアラインメント長で割り、次いで、この数に１００を掛けて％配列同一性を生成することによって、デフォルト設定に従って配列同一性を計算する［％配列同一性＝（同一残基数／アラインメント長）×１００）］。

配列同一性は、両方の配列を全長にわたって示し、そのため、第１の配列と第２の配列が全長で示される、ペアワイズアラインメントから計算することができる（「グローバル配列同一性」）。例えば、Ｎｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ）は、そのようなアラインメントを生成する；％配列同一性＝（同一残基数／アラインメント長）×１００）］。

配列同一性は、第１の配列または第２の配列のローカル領域のみを示すペアワイズアラインメントから計算することができる（「ローカル同一性」）。例えば、Ｂｌａｓｔプログラム（ＮＣＢＩ）は、そのようなアラインメントを生成する；％配列同一性＝（同一残基数／アラインメント長）×１００）］。

配列アラインメントは、好ましくは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７９）４８，ｐ．４４３－４５３）を使用して生成される。好ましくは、「ＮＥＥＤＬＥ」プログラム（Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＯＳＳ））をプログラムのデフォルトパラメーターで使用する（ギャップ開始＝１０．０、ギャップ伸長＝０．５及びタンパク質のマトリックス＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２及びヌクレオチドのマトリックス＝ＥＤＮＡＦＵＬＬ）。次いで、両方の配列を全長にわたって示し、そのため、第１の配列と第２の配列が全長で示される、アラインメントから配列同一性を計算することができる（「グローバル配列同一性」）。例えば、％配列同一性＝（同一残基数／アラインメント長）×１００）］。

いくつかの実施形態では、変異は、ＮＳ１ポリペプチド内の１つ以上のアミノ酸位置に生じる。いくつかの実施形態では、変異は、配列番号１の位置９８、またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１に対してアラインメントした場合、配列番号１の位置９８に対応する位置に生じる。いくつかの実施形態では、位置９８の変異は、トリプトファンからグリシンへの置換である。

いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置に変異を含む。配列番号１の位置９８に対応する位置は、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して、ＮＳ１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に対してアラインメントすることによって、決定され得る。配列番号１の位置９８にあるトリプトファン残基に対応する、ジカウイルス以外のウイルスのアミノ酸残基を本出願の図７に示し、当該残基を四角で囲む。いくつかの実施形態では、位置９８の変異は、トリプトファンからグリシンへの置換である。いくつかの実施形態では、位置９８の変異は、配列番号１の位置９８のトリプトファンからグリシンへの置換である。いくつかの実施形態では、位置９８の変異は、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１に対してアラインメントした場合、配列番号１の位置９８に対応する位置でのトリプトファンからグリシンへの置換である。

いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、ＮＳ１タンパク質内に変異を含有し、Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ５ウイルスタンパク質のうちの１つ以上に少なくとも１つの変異を含有する。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、ＮＳ１タンパク質内に１つ以上の変異を含有し、Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ５ウイルスタンパク質のうちの１つ以上に少なくとも１つの変異を含有しない。いくつかの実施形態では、ジカウイルスＮＳ１タンパク質内に変異を含有し、エンベロープタンパク質Ｅ内に少なくとも１つの変異を含有しない。いくつかの実施形態では、全粒子不活化ウイルスは、ジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）に少なくとも１つの変異を含有し、ジカウイルスエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）に変異を含まない。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置に変異を含有するが、エンベロープタンパク質Ｅ内にはいかなる変異も含有しない。いくつかの実施形態では、全粒子不活化ジカウイルスは、配列番号１の位置９８、もしくは配列番号１の位置９８に対応する位置に変異を含有し、及び／またはジカウイルスエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）に変異を含まない。いくつかの実施形態では、全粒子不活化ウイルスは、ジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）に少なくとも１つの変異を含有し、エンベロープタンパク質をコードする配列は、配列番号２中の対応する配列と同じである。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置に変異を含有し、エンベロープタンパク質をコードする配列は、配列番号２中の対応する配列と同じである。いくつかの実施形態では、全粒子不活化ジカウイルスは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置に変異を含有し、エンベロープタンパク質をコードする配列は、配列番号２中の対応する配列と同じである。いくつかの実施形態では、全粒子不活化ジカウイルスは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換を含有し、エンベロープタンパク質をコードする配列は、配列番号２中の対応する配列と同じである。

いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、少なくとも１つの変異を欠くジカウイルスと比較して、遺伝的安定性を増大させる少なくとも１つの変異を含有する。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、少なくとも１つの変異を欠くジカウイルスと比較して、ウイルス複製を増大させる少なくとも１つの変異を含有する。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、ジカウイルスのエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）内などにおける望ましくない変異の発生を減少または阻害する少なくとも１つの変異を含有する。

本開示の上記の実施形態では、例示的なペアワイズアラインメントアルゴリズムは、デフォルトのパラメーターを使用するＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムである（例えば、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用して、ギャップ開始ペナルティ＝１０．０、及びギャップ伸長ペナルティ＝０．５）。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅツールに簡便に実装される。

いくつかの実施形態では、不活化ジカウイルスは、不活化ウイルス組成物に使用され得る。例えば、不活化ジカウイルスは、ジカウイルス感染症を治療もしくは予防することを、それを必要とする対象において行うこと、及び／またはジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答を誘導することを、それを必要とする対象において行うことに有用であり得る。

不活化ウイルス組成物の生産
本開示の他の態様は、本明細書に記載される配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換である変異を含むジカウイルスなどの精製された不活化全粒子ウイルスを含有する、ジカウイルス不活化ウイルス組成物に関する。いくつかの実施形態では、不活化ウイルス組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製された不活化全粒子ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。いくつかの実施形態では、不活化ウイルス組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製された不活化全粒子ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、配列番号２に従うゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。一実施形態では、不活化ウイルス組成物は、プラーク精製されたクローンジカウイルス分離株を含有する。

本開示の不活化ウイルス組成物の生産は、ジカウイルスの成長を含む。細胞培養での成長は、本開示の不活化ウイルス組成物を調製するための方法である。ウイルスを成長させるための細胞は、懸濁液中または接着条件下で培養することができる。

本開示の少なくとも１つのウイルスの成長に好適な細胞株には、限定するものではないが、昆虫細胞（例えば、本明細書に記載される蚊細胞、ＶＥＲＯ細胞（サル腎臓由来）、ウマ、ウシ（例えば、ＭＤＢＫ細胞）、ヒツジ、イヌ（例えば、イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４ ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）またはＷＯ９７／３７００１に記載のＭＤＣＫ ３３０１６、受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９）、ネコ、及び齧歯類（例えば、ハムスター細胞、例えば、ＢＨＫ２１－Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞））が含まれ、例えば、成体期、新生児期、胎児期、及び胚芽期を含む、多種多様な発達段階から得ることができる。特定の実施形態では、細胞は不死化される（例えば、ＷＯ０１／３８３６２及びＷＯ０２／４０６６５に記載され、ＥＣＡＣＣ受託番号９６０２２９４０として受託されているようなＰＥＲＣ．６細胞）。好ましい実施形態では、哺乳動物細胞が利用され、次の非限定的な細胞種：線維芽細胞（例えば、真皮、肺）、内皮細胞（例えば、大動脈、冠状動脈、肺、血管、皮膚微小血管、臍）、肝細胞、ケラチノサイト、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ、樹状細胞）、乳腺細胞（例えば、上皮）、平滑筋細胞（例えば、血管、大動脈、冠状動脈、動脈、子宮、気管支、頸部、網膜周皮細胞）、メラノサイト、神経系細胞（例えば、アストロサイト）、前立腺細胞（例えば、上皮、平滑筋）、腎臓細胞（例えば、上皮、メサンギウム、近位尿細管）、骨格細胞（例えば、軟骨細胞、破骨細胞、造骨細胞）、筋肉細胞（例えば、筋芽細胞、骨格、平滑、気管支）、肝臓細胞、網膜芽細胞、及び間質細胞のうちの１つ以上から選択され、及び／またはこれらに由来し得る。ＷＯ９７／３７０００及びＷＯ９７／３７００１は、懸濁液及び無血清培地で成長することが可能な動物細胞及び細胞株の生産が記載されており、ウイルスの生産及び複製に有用である。一実施形態では、少なくとも１つのウイルスの成長に使用される細胞は、Ｖｅｒｏ細胞である。

上記細胞種の培養条件は、知られており、様々な公開物に記載されている。あるいは、培地、添加物、及び条件は、例えば、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｅａｓｔ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，Ｎ．Ｊ．）のカタログ及び更なる参考文献に記載されているように、商業的に購入することができる。

特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される細胞は、無血清培地及び／またはタンパク質不含培地で培養される。培地は、本開示の文脈において、ヒトまたは動物起源の血清に由来するいかなる添加物も含有しない場合、無血清培地と呼ばれる。タンパク質不含は、トリプシンまたはウイルス成長に必要とされ得る他のプロテアーゼなどのタンパクを任意選択により含み得るが、タンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物及び非血清タンパク質を含むことなく、細胞の増殖が生じる培養を意味するものと理解される。そのような培養で成長する細胞は、それ自体が天然にタンパク質を含有している。

既知の無血清培地には、イスコフ培地、Ｕｌｔｒａ－ＣＨＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）またはＥＸ－ＣＥＬＬ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が含まれる。通常の血清含有培地には、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）または最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｅａｇｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９））またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭまたはＥＤＭ）が含まれ、通常、最大１０％のウシ胎児血清または類似の添加物が使用される。必要に応じて、最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｅａｇｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９））またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭまたはＥＤＭ）を、血清を含有するいずれの添加物も用いることなく使用してもよい。ＰＦ－ＣＨＯ（ＪＨＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）などのタンパク質不含培地、ＰｒｏＣＨＯ ４ＣＤＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）またはＳＭＩＦ ７（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの化学的に成分が明らかな培地、及びＰｒｉｍａｃｔｏｎｅ、ＰｅｐｔｉｃａｓｅもしくはＨｙＰｅｐ．（商標）（全てＱｕｅｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）またはラクトアルブミン加水分解物（Ｇｉｂｃｏ及び他の製造者）などのマイトジェンペプチドも従来技術において十分に知られている。植物加水分解物をベースにした培地添加物は、ウイルス、マイコプラズマまたは未知の感染因子によるコンタミネーションを排除することができるという点で特に利点がある。

細胞培養条件（温度、細胞密度、ｐＨ値など）は、本開示に従って採用される細胞株の適合性によって、広範囲にわたって変化し、具体的なウイルス株の要件に適合させることができる。

培養細胞においてウイルスを増殖させる方法は、一般に、培養細胞に培養する株を接種する工程と、感染細胞をウイルス培養に望ましい時間、例えば、ウイルス価または抗原発現によって決定される時間（例えば、接種後２４及び１６８時間）培養する工程と、増殖したウイルスを回収する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは、プラーク精製を介して回収される。培養細胞は、１：５００～１：１、好ましくは、１：１００～１：５の細胞比まで、ウイルスが接種される（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０によって測定）。ウイルスは、細胞の懸濁液に加えられるか、または細胞の単層にアプライし、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、少なくとも６０分間、ただし、通常３００分を超えない間、２５℃～４０℃、好ましくは、２８℃～３８℃で、ウイルスを細胞上に吸着させる。感染した細胞培養物（例えば、単層）は、回収される培養上清のウイルス含量を高めるために、上清（細胞不含）を回収して凍結融解することまたは酵素作用のいずれかで除去され得る。回収した液体は、その後、不活化または凍結保存される。培養細胞は、約０．０００１～１０、好ましくは、０．００２～５、より好ましくは、０．００１～２の多重感染度（「ＭＯＩ」）で感染させ得る。更により好ましくは、細胞は、約０．０１のＭＯＩで感染させる。感染中、細胞培養容器の面積に対する培地の比率は、細胞の培養中よりも低くなり得る。この比率を低く維持することで、ウイルスが細胞に感染する可能性を最大限に高められる。感染細胞の上清は、感染から３０～６０時間後、または感染から３～１０日後に回収され得る。特定の好ましい実施形態では、感染細胞の上清は、感染から３～７日後に回収される。より好ましくは、感染細胞の上清は、感染から３～５日後に回収される。いくつかの実施形態では、ウイルスを放出させるために、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）が細胞培養中に添加されてもよく、プロテアーゼは、培養中の任意の好適な段階で添加され得る。あるいは、特定の実施形態では、感染細胞培養物の上清が回収され得、その上清からウイルスが分離または精製されてもよい。

ウイルス接種物及びウイルス培養物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、リノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、及び／またはパルボウイルス（ＷＯ２００６／０２７６９８）を含まない（すなわち、これらによるコンタミネーションについての試験が行われ、陰性結果が出ている）。

ウイルスが細胞株上で成長したら、宿主細胞ＤＮＡの腫瘍形成活性を最小限に抑えるために、最終液体不活化ウイルス組成物中に残存する細胞株ＤＮＡの量を最小限に抑えることが定石である。混入ＤＮＡは、標準的な精製手順、例えば、クロマトグラフィーなどを使用して、液体不活化ウイルス組成物調製中に取り除くことができる。残存する宿主細胞ＤＮＡの除去は、ヌクレアーゼ処理によって、例えば、ＤＮａｓｅを使用することによって、向上させることができる。参考文献に開示されている宿主細胞ＤＮＡ汚染を減少させるための簡便な方法（Ｌｕｎｄｂｌａｄ（２００１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１９５－１９７，Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ）Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＣＶＭ）Ｍａｙ ２００１．）は、まず、ウイルス成長中に使用することができるＤＮａｓｅ（例えば、ベンゾナーゼ）を使用し、次いで、ウイルス破壊中に使用することができるカチオン系界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）を使用する、２工程の処理を含む。β－プロピオラクトン処理による除去もまた、使用することができる。一実施形態では、汚染ＤＮＡは、培養上清のベンゾナーゼ処理によって除去される。

抗原の生産
ジカウイルスは、当該技術分野において知られている任意の好適な方法によって、生産及び／または精製もしくは分離され得る。一実施形態では、本開示の抗原は、精製された不活化全粒子ジカウイルスである。

いくつかの実施形態では、不活化ウイルスは、「不活化ウイルス組成物の生産」という題の上記セクションに記載されているように生産することができる。

特定の実施形態では、本開示のジカウイルスは、非ヒトを培養することによって、生産され得る。本開示のジカウイルスの生産に好適な細胞株は、昆虫細胞（例えば、本明細書に記載される蚊細胞のいずれか）を含み得る。本開示のジカウイルスの生産に好適な細胞株はまた、哺乳動物起源の細胞であり得、また、限定するものではないが、ＶＥＲＯ細胞（サル腎臓由来）、ウマ、ウシ（例えば、ＭＤＢＫ細胞）、ヒツジ、イヌ（例えば、イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４ ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）またはＷＯ９７／３７００１に記載のＭＤＣＫ ３３０１６、受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９）、ネコ、及び齧歯類（例えば、ハムスター細胞、例えば、ＢＨＫ２１－Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞））が含まれ、例えば、成体期、新生児期、胎児期、及び胚芽期を含む、多種多様な発達段階から得ることができる。特定の実施形態では、細胞は不死化される（例えば、ＷＯ０１／３８３６２及びＷＯ０２／４０６６５に記載され、ＥＣＡＣＣ受託番号９６０２２９４０として受託されているようなＰＥＲＣ．６細胞）。好ましい実施形態では、哺乳動物細胞が利用され、次の非限定的な細胞種：線維芽細胞（例えば、真皮、肺）、内皮細胞（例えば、大動脈、冠状動脈、肺、血管、皮膚微小血管、臍）、肝細胞、ケラチノサイト、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ、樹状細胞）、乳腺細胞（例えば、上皮）、平滑筋細胞（例えば、血管、大動脈、冠状動脈、動脈、子宮、気管支、頸部、網膜周皮細胞）、メラノサイト、神経系細胞（例えば、アストロサイト）、前立腺細胞（例えば、上皮、平滑筋）、腎臓細胞（例えば、上皮、メサンギウム、近位尿細管）、骨格細胞（例えば、軟骨細胞、破骨細胞、造骨細胞）、筋肉細胞（例えば、筋芽細胞、骨格、平滑、気管支）、肝臓細胞、網膜芽細胞、及び間質細胞のうちの１つ以上から選択され、及び／またはこれらに由来し得る。ＷＯ９７／３７０００及びＷＯ９７／３７００１は、懸濁液及び無血清培地で成長することが可能な動物細胞及び細胞株の生産が記載されており、ウイルス抗原の生産に有用である。特定の実施形態では、非ヒト細胞は、無血清培地で培養される。特定の実施形態では、本開示のジカウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞培養することによって、生産され得る。

ウイルス不活化
本発明に係る液体不活化ウイルス組成物は、不活化全粒子ジカウイルスを含む。

哺乳動物細胞への感染能力を破壊しつつも、ウイルスの二次、三次もしくは四次構造及び免疫原性エピトープを破壊しないようにウイルスを不活化または殺傷する方法は、当該技術分野において知られている。そのような方法は、化学的手段と物理的手段の両方を含む。ウイルスを不活化するのに好適な手段には、限定するものではないが、界面活性剤、ホルマリン（本明細書中「ホルムアルデヒド」とも呼ばれる）、過酸化水素、β－プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、熱、電磁放射線照射、Ｘ線照射、ガンマ線照射、紫外線照射（ＵＶ照射）、ＵＶ－Ａ照射、ＵＶ－Ｂ照射、ＵＶ－Ｃ照射、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ_６０）、過酸化水素及びそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上の有効量の剤による処理が含まれる。既に上記したように、本出願の目的上、「ホルマリン」及び「ホルムアルデヒド」という用語は、区別なく使用される。本明細書でホルムアルデヒドの濃度に言及する場合、それは、ホルムアルデヒドの濃度を指し、ホルマリンの濃度ではない。したがって、「０．０１％のホルムアルデヒド濃度（ｗ／ｖ）」は、０．０１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドを指し、この濃度をホルマリン原液（典型的に３７質量％のホルムアルデヒドを含有する）中のホルムアルデヒド濃度に対して更に補正する必要はない。例えば、ウイルス調製物中のそのようなホルムアルデヒド濃度は、１．８５％（ｗ／ｖ）のホルムアルデヒド含量を有する作業溶液にホルマリンを希釈し、次いで、それを、ジカウイルス調製物などのウイルス調製物と混合するときに必要な濃度に更に希釈することによって、得ることができる。

本開示の特定の実施形態では、少なくとも１つの（ジカ）ウイルスは、化学的に不活化される。化学的不活化のための剤及び化学的不活化の方法は、当該技術分野において知られており、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのウイルスは、ＢＰＬ、過酸化水素、ホルマリン、またはＢＥＩのうちの１つ以上で化学的に不活化される。少なくとも１つのウイルスがＢＰＬで化学的に不活化される特定の実施形態では、ウイルスは、１つ以上の修飾を含有し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、修飾された核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾された核酸は、アルキル化核酸である。他の実施形態では、１つ以上の修飾は、修飾されたポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、修飾されたポリペプチドは、修飾されたシステイン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、リシン、セリン、及びトレオニンのうちの１つ以上を含む、修飾されたアミノ酸残基を含有する。

特定の実施形態では、少なくとも１つの（ジカ）ウイルスは、ホルムアルデヒドで不活化される。

少なくとも１つのウイルスがホルマリン（ホルムアルデヒド）で化学的に不活化される特定の実施形態では、不活化ウイルスは、１つ以上の修飾を含有し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、修飾されたポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、架橋ポリペプチドを含み得る。少なくとも１つのウイルスがホルマリンで化学的に不活化されるいくつかの実施形態では、液体不活化ウイルス組成物は、ホルマリンを更に含む。少なくとも１つのウイルスがＢＥＩで化学的に不活化される特定の実施形態では、ウイルスは、１つ以上の修飾を含有し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、修飾された核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾された核酸は、アルキル化核酸である。

少なくとも１つのウイルスがホルマリンで化学的に不活化されるいくつかの実施形態では、任意の未反応の残留ホルマリンをメタ重亜硫酸ナトリウムで中和し、透析し、及び／または緩衝液交換することで、未反応の残留ホルマリンを除去することができる。いくつかの実施形態では、メタ重亜硫酸ナトリウムは、過剰に添加される。いくつかの実施形態では、溶液は、インラインスタティックミキサーなどのミキサーを使用して混合され、その後、濾過または更に精製され得る（例えば、クロスフロー濾過システムの使用による）。

いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度は、０．００５％（ｗ／ｖ）～０．０２％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度は、０．００７５％（ｗ／ｖ）～０．０１５％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒド濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）である。

いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、当該ジカウイルスが約０．００１％ｗ／ｖ～約３．０％ｗ／ｖの範囲の量のホルムアルデヒドにより、約１５℃～約３７℃の範囲の温度で、５～１５日間処理される方法によって得られる／得ることができる不活化全粒子ウイルスである。特定のそのような実施形態では、ジカウイルスは、全粒子生ジカウイルスを０．００５％～０．０２％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することによって得られる／得ることができる不活化全粒子ウイルスである。特定のそのような実施形態では、ジカウイルスは、全粒子生ジカウイルスを０．０１５％ｗ／ｖ未満のホルムアルデヒドで処理することによって得られる／得ることができる不活化全粒子ウイルスである。

特定の実施形態では、不活化全粒子ジカウイルスは、当該ジカウイルスが約０．０２％ｗ／ｖの範囲の量のホルムアルデヒドにより、２２℃の温度で、１４日間処理される方法から得ることができる／得られるものとみなされる。いくつかの実施形態では、不活化全粒子ジカウイルス調製物は、当該ジカウイルスが約０．０１％ｗ／ｖの量のホルムアルデヒドにより、２２℃の温度で、１０日間処理される方法から得ることができる／得られるものとみなされる。

ジカウイルス純度
ジカウイルスの純度は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定することができる。本開示の特定の実施形態は、サイズ排除クロマトグラフィーにおけるジカウイルスのメインピークが曲線下総面積の８５％を超えることによって決定される、少なくとも８５％の純度の不活化全粒子ジカウイルスを含む、不活化ウイルス組成物に関する。特定のそのような実施形態では、ジカウイルスは、サイズ排除クロマトグラフィーにおけるジカウイルスのメインピークが曲線下総面積の９０％を超えることによって決定される、９０％の純度であり得る。特定のそのような実施形態では、ジカウイルスは、サイズ排除クロマトグラフィーにおけるジカウイルスのメインピークが曲線下総面積の９５％を超えることによって決定される、９５％の純度であり得る。

使用
特定の実施形態では、本発明は、不活化ウイルス組成物の使用であって、
ａ）不活化全粒子ジカウイルスと、
ｂ）少なくとも約６．５ｍＭの濃度の少なくとも１つの薬学的に許容される緩衝液と、
ｃ）任意選択により、ポリオールと、を含み、
当該不活化ウイルス組成物は、アルミニウム塩から選択されるアジュバントを含有せず、当該少なくとも１つの薬学的に許容される緩衝液は、リン酸イオンを含まない、不活化全粒子ジカウイルスを安定化させるための方法に関する。

特定の実施形態では、本発明は、不活化全粒子ジカウイルスを安定化させるための本発明に係る不活化ウイルス組成物（上記のもの）の使用に関する。

特定のそのような実施形態では、本発明は、５±３℃で少なくとも１０日間の保管中、不活化全粒子ジカウイルスを安定化させるための不活化ウイルス組成物の使用に関する。

特定の実施形態では、本発明は、－８０℃で少なくとも１０日間の保管中、不活化全粒子ジカウイルスを安定化させるための不活化ウイルス組成物の使用に関する。特定のそのような実施形態では、本発明は、－８０℃で少なくとも６ヶ月間の保管中、不活化全粒子ジカウイルスを安定化させるための不活化ウイルス組成物の使用に関する。特定のそのような実施形態では、本発明は、－８０℃で少なくとも１２ヶ月間の保管中、不活化全粒子ジカウイルスを安定化させるための不活化ウイルス組成物の使用に関する。

特定のそのような実施形態では、本発明は、１回または複数回の凍結融解サイクル、例えば、少なくとも４回の凍結融解サイクル中、不活化全粒子ジカウイルスを安定化させるための不活化ウイルス組成物の使用に関する。

不活化ウイルス組成物の製造方法
特定の実施形態では、本発明は、不活化ウイルス組成物を調製する方法であって、
ａ）不活化全粒子ジカウイルスと、
ｂ）薬学的に許容される緩衝液であって、当該緩衝液は、リン酸緩衝液ではなく、当該緩衝液の濃度は、少なくとも６．５ｍＭである、緩衝液と、
ｃ）任意選択により、ポリオールと、を含み、
当該不活化ウイルス組成物は、アルミニウム塩から選択されるアジュバントを含有せず、次のステップ：
ステップ１．１つ以上の非ヒト細胞から得られた上清からジカウイルス調製物を分離すること、
ステップ２．ジカウイルス調製物を精製すること、
ステップ３．ウイルス調製物を不活化すること、
ステップ４．ジカウイルス調製物を薬学的に許容される緩衝液に移してジカウイルス原薬を得ることを含む、方法に関する。

いくつかの実施形態では、ステップ１で使用される細胞は、非ヒト細胞である。好適な非ヒト哺乳動物細胞には、ＶＥＲＯ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４ ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載の寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１－Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、Ｖｅｒｏ細胞である。

ステップ２において、ジカウイルスの分離には、当該技術分野において知られているウイルス調製物を精製する任意の方法が採用され得、限定するものではないが、クロスフロー濾過（ＣＦＦ）、マルチモードクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、及び／または陰イオン交換クロマトグラフィーを使用することを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス調製物は、クロスフロー濾過（ＣＦＦ）によって分離される。いくつかの実施形態では、ウイルス調製物は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上の量まで高度に精製される。

ステップ３では、ジカウイルス調製物は、０．００５～０．０２％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１５℃～３０℃の温度で、８～１２日間処理されることによって、不活化され得る。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００５～０．０２％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１５℃～３０℃の温度で、９～１１日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００５～０．０２％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１５℃～３０℃の温度で、１０日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００８～０．０１５％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１５℃～３０℃の温度で、８～１２日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００８～０．０１５％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１５℃～３０℃の温度で、９～１１日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．００８～０．０１５％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１５℃～３０℃の温度で、１０日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．０１％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１５℃～３０℃の温度で、８～１２日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．０１％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１５℃～３０℃の温度で、９～１１日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．０１％（ｗ／ｖ）ホルマリンにより、１５℃～３０℃の温度で、１０日間処理される。

いくつかの実施形態では、ステップ３は、未反応ホルマリンを有効量のメタ重亜硫酸ナトリウムで中和することを更に含む。

特定の実施形態では、本発明はまた、上記の方法によって得ることができる製品（不活化ウイルス組成物など）に関する。

ジカウイルスワクチン
本発明に係る不活化ウイルス組成物は、一般に、ワクチンの製造に使用される中間組成物を指す。本発明の特定の更なる態様は、上記の不活化ウイルス組成物から得られる／得ることができる液体ワクチン（または疾患もしくは状態の治療もしくは予防における使用に好適な組成物、特にジカウイルス感染症の治療もしくは予防における使用に好適な組成物）に関する。ワクチンは、アジュバントを含有し、不活化ウイルス組成物とは異なる緩衝液及び賦形剤の濃度を有し得る。

特定のそのような実施形態では、本発明は、
ａ）先行請求項のいずれか１項に記載の不活化ウイルス組成物と、
ｂ）水酸化アルミニウムなどのアジュバントと、
を含む、液体ワクチンに関する。

特定のそのような実施形態では、本発明は、不活化ジカウイルスを含む液体ワクチンに関し、液体ワクチン中の塩化ナトリウムの濃度は、約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、または約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ、例えば、約８４ｍＭである。特定のそのような実施形態では、本発明は、液体ワクチンに関し、液体ワクチンは、約８．５ｍＭ～約８０ｍＭのＴｒｉｓと、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭのＮａＣｌと、を含み、液体ワクチンのｐＨは、室温で測定したとき、ｐＨ約７．０～ｐＨ約８．０である。

特定のそのような実施形態では、液体ワクチン中のＴｒｉｓの濃度は、約９ｍＭ～約８０ｍＭ、または約９ｍＭ～約６０ｍＭ、または９ｍＭ～約３０ｍＭ、または約９ｍＭ～約１１ｍＭまたは約１０ｍＭである。

特定の実施形態では、本発明は、液体ワクチンに関し、液体ワクチンは、約０．４％（ｗ／ｖ）～４．７％（ｗ／ｖ）のスクロースを含む。

特定の実施形態では、液体ワクチンのオスモル濃度は、約３００±５０ｍＯｓｍ／ｋｇである。オスモル濃度は、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＯｓｍｏＰＲＯ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ－Ｓａｍｐｌｅ Ｍｉｃｒｏ－Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）において、製造元の説明書に従い、その校正液及び参照液を使用した、凝固点降下を介して決定される。

アジュバント
本発明に係るワクチンは、１つ以上のアジュバントと組み合わせた、少なくとも１つのジカウイルスに由来する１つ以上の抗原を含む。

ワクチンに対してアジュバント効果を達成するには、様々な方法が知られており、本明細書で開示されるジカウイルスワクチンとともに使用され得る。一般的な原則及び方法は、“Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ”，１９９５，Ｄｕｎｃａｎ Ｅ．Ｓ．Ｓｔｅｗａｒｔ－Ｔｕｌｌ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ，ＩＳＢＮ ０－４７１－９５１７０－６、及び“Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ”，１９９５，Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ Ｇ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＩＳＢＮ ０－３０６－４５２８３－９に詳細に記載されている。

例示的なアジュバントには、アルミニウム塩、リン酸カルシウム、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、ＭＬＡ誘導体、合成リピドＡ、リピドＡミメティックまたはアナログ、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、乳剤（油乳剤）、キトサン、ビタミンＤ、ステアリルまたはオクタデシルチロシン、ビロソーム、コクリエート、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アジュバントは、アルミニウム塩である。

いくつかの実施形態では、アジュバントは、ミョウバン（水酸化アルミニウムなど）、リン酸アルミニウム、水酸化酸化アルミニウム、水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウム沈殿物、硫酸アルミニウムカリウム、及びゲル状水酸化アルミニウム、例えば、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ ８５などのうちの少なくとも１つを含む。以後、特にアジュバントとして使用される、薬学的に許容される形態の水酸化酸化アルミニウム、水酸化アルミニウム及び沈殿及び／またはゲル状水酸化アルミニウムは、総称して、「水酸化アルミニウム」とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、本開示のアルミニウム塩アジュバントは、本開示のジカウイルスワクチンの抗原の吸着を増大させることが見出された。したがって、いくつかの実施形態では、抗原の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％がアルミニウム塩アジュバントに吸着される。

本開示の特定の実施形態は、アジュバント化されたジカウイルスワクチンを調製する方法を含み、（ａ）ワクチンをアルミニウム塩アジュバントと混合することであって、ワクチンは、本明細書に記載される少なくとも１つのジカウイルスに由来する１つ以上の抗原を含む、混合することと、（ｂ）好適な条件下で、約１時間～約２４時間（例えば、約１６時間～約２４時間）の範囲の期間、混合物をインキュベートすることであって、抗原の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％は、アルミニウム塩アジュバントに吸着される、インキュベートすることと、を含む。方法の特定の実施形態では、少なくとも１つのジカウイルスは、非ヒト細胞適応変異（例えば、Ｔｒｐ９８Ｇｌｙ変異などのタンパク質ＮＳ１中の非ヒト細胞適応変異）を含む、ジカウイルスである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのジカウイルスは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製された不活化全粒子ジカウイルスであり、ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製された不活化全粒子ジカウイルスであり、ジカウイルスは、配列番号２に従うゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。

いずれの理論によっても拘束されることを望むものではないが、ジカウイルス抗原（不活化全粒子ジカウイルス）をアルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム／ミョウバンなど）に吸着させることは、ジカウイルス抗原の安定性を増大させ得る。

特定の好ましい実施形態では、アジュバントは、水酸化アルミニウムである。

特定の実施形態では、本発明は、アルミニウム元素に基づいて、１００μｇ／ｍｌ～８００μｇ／ｍｌの水酸化アルミニウム、または２００μｇ／ｍｌ～６００μｇ／ｍｌの水酸化アルミニウム、または３００μｇ／ｍｌ～５００μｇ／ｍｌの水酸化アルミニウム、または約４００μｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムを含む、液体ワクチンに関する。

特定のそのような実施形態では、本発明は、液体ワクチンに関し、液体ワクチンは、約８．５ｍＭ～約５０ｍＭのＴｒｉｓと、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭのＮａＣｌと、アルミニウム元素に基づいて３００μｇ／ｍｌ～約５００μｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムと、を含み、液体ワクチンのｐＨは、室温で測定したとき、約ｐＨ７．０～約ｐＨ８．０である。

用量
特定の実施形態では、本発明は、本発明に係る液体ワクチンの単位用量に関する。

特定のそのような実施形態では、液体ワクチンの単位用量は、約１μｇ～約１５μｇの用量の不活化全粒子ジカウイルスを含む。特定のそのような実施形態では、ワクチンの単位用量は、約２μｇの用量の不活化全粒子ジカウイルスを含む。特定のそのような実施形態では、ワクチンの単位用量は、約５μｇの用量の不活化全粒子ジカウイルスを含む。特定のそのような実施形態では、ワクチンの単位用量は、約１０μｇの用量の不活化全粒子ジカウイルスを含む。

特定の実施形態では、ワクチンの単位用量は、約０．４ｍＬ～約０．８ｍＬの薬学的に許容される液体として提供される。

特定のそのような実施形態では、液体ワクチンの単位用量は、アルミニウム元素に基づいて、約１００μｇ～約３００μｇの水酸化アルミニウム、例えば、約２００μｇの水酸化アルミニウムを含む。当業者によく知られているように、「アルミニウム元素に基づいて」という文言は、ワクチン製剤のアルミニウム含量を特定する方法を指す。組成物のアルミニウム含量を示すためには、水の量の変化ならびに（水和した）水酸化アルミニウム、水酸化酸化アルミニウム及び関連するアルミニウム化合物の複雑な化学量論から、標準化された方法が必要である。このため、典型的に、「アルミニウム元素」として表されるアルミニウムイオンの量が示される。したがって、例えば、「アルミニウム元素に基づいて、１００μｇ／ｍｌの水酸化アルミニウム」を含有すると述べられる組成物（または、短い形式でよく認められるように、「１００μｇ／ｍｌの水酸化アルミニウム」を含有すると述べられる組成物）は、１００μｇ／ｍｌのアルミニウムイオンを含有する。

治療方法
特定の実施形態では、本発明は、ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、当該ヒト対象に、本発明に係るワクチンの単位用量を投与することを含む、方法に関する。

特定の実施形態では、本発明は、ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象集団において行う方法であって、当該ヒト対象集団の個々のヒト対象に、本発明に係るワクチンの単位用量を投与することを含む、方法に関する。

特定の実施形態では、本発明は、ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象において行うことにおいて使用するための本発明に係るワクチンの単位用量に関する。

特定の実施形態では、本発明は、ジカウイルス感染症を予防することを、それを必要とするヒト対象において行うための薬剤の製造における、本発明に係るワクチンの単位用量の使用に関する。

いくつかの実施形態では、本開示は、本発明に係るワクチンの治療上有効な量をヒト対象に投与することによって、ジカウイルスに対する免疫応答を誘導することを、それを必要とする対象において行うための方法に関する。いくつかの実施形態では、投与ステップは、対象において、ジカウイルスに対する防御免疫応答を誘導する。

特定のそのような実施形態では、対象は、女性対象である。いくつかの実施形態では、対象は、妊娠しているか、または妊娠する意志がある。

本開示の方法は、本開示のジカウイルスワクチンの治療上有効な量または免疫原性量の投与を含む。治療上有効な量または免疫原性量は、本開示のワクチンが投与される、非感染、感染、または非曝露の対象において防御免疫応答を誘導する、本開示のワクチンの量であり得る。そのような応答は、一般に、対象における、ワクチンに対する分泌性、細胞性及び／または抗体媒介性の免疫応答の発生による。通常、そのような応答には、限定するものではないが、以下の作用のうちの１つ以上が含まれる：免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭなどの免疫学的クラスのいずれかに由来する抗体の産生；Ｂ及びＴリンパ球の増殖；免疫細胞に対する活性化、成長及び分化シグナルの提供；ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、及び／または細胞傷害性Ｔ細胞の拡大。

好ましくは、治療上有効な量または免疫原性量は、疾患の症状の治療または予防をもたらすのに十分である。正確な必要量は、他の要因のなかでも、治療される対象；治療される対象の年齢及び全般的な状態；抗体を合成する対象の免疫系の能力；所望される保護の程度、治療される状態の重症度；選択される特定のジカウイルス抗原ならびにその投与様式に応じて変わる。適切な治療上有効な量または免疫原性量は、当業者によって容易に決定され得る。治療上有効な量または免疫原性量は、日常的な試験により決定され得る比較的広い範囲になる。

典型的に、本開示のワクチンは、溶液または懸濁液のいずれかの注射剤として調製される。

ワクチンは、従来通り、非経口的に、例えば、皮下、経皮、皮内、真皮下または筋肉内のいずれかの注射により、投与され得る。他の投与様式に好適な更なる製剤には、坐剤が含まれ、ある場合には、経口、経口的、鼻腔内、口腔粘膜、舌下、腹腔内、膣内、肛門及び頭蓋内の製剤が含まれる。坐剤の場合、従来の結合剤及び担体には、例えば、ポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドが含まれ得、そのような坐剤は、活性成分を０．５％～１０％、または更には１～２％の範囲で含有する混合物から形成され得る。特定の実施形態では、脂肪酸グリセリドまたはカカオ脂の混合物などの低融点ワックスを最初に溶かし、本明細書に記載されるジカウイルスワクチンを、例えば、攪拌によって、均一に分散させる。次いで、溶融した均一な混合物を、簡便な大きさの型に注入し、冷却して固化させる。

本開示のワクチンは、剤形に適合した様式で、また治療上有効で免疫原性のある量で投与され得る。投与される量は、治療される対象に依存し、例えば、免疫応答をもたらす個体の免疫系の能力、及び所望される保護の程度を含む。好適な投薬量範囲は、例えば、約０．１μｇ～約１００μｇの精製された不活化全粒子ジカウイルスを挙げることができる。

初回投与及びブースト注射の好適なレジメンも変わり得るが、初回投与にその後の接種または他の投与が続くのが典型的である。

ワクチンの製造方法
特定の実施形態では、本発明はまた、液体ワクチンを調製する方法であって、次のステップ：
ステップ１．本発明に係る不活化ウイルス組成物を提供すること、
ステップ２．不活化ウイルス組成物に、アジュバント、好ましくはアルミニウム塩と、任意選択により更なる薬学的に許容される緩衝液とを添加すること、
を含む、方法に関する。

特定のそのような実施形態では、ステップ２において、更なる薬学的に許容される緩衝液は、不活化ウイルス組成物中で最も濃度が高い緩衝液と同じ緩衝液を含む。

特定の実施形態では、本発明は、上記の方法によって得ることができる製品に関する。

以下の実施例は、特許請求の範囲に記載される本発明の特定の態様及び実施形態を示すために含まれる。しかしながら、以下の説明は例示にすぎず、本発明を制限するものとして解釈されるべきではないことを、当業者は理解されたい。

実施例１：クローンジカウイルス株の生成
この実施例は、既知の研究歴のある、ジカウイルス（ＺＩＫＡＶ）株の生産を記載する。

材料及び方法
Ｖｅｒｏ細胞の維持
１バイアルのＷＨＯ Ｖｅｒｏ１０－８７細胞を水浴中で迅速に融解し、Ｔ－７５ｃｍ^２フラスコで、ペニシリン－ストレプトマイシン、Ｌ－グルタミン４０ｍＭ、及び１０％ＦＢＳを含有する、予め温めておいた１９ｍＬのＤＭＥＭ（ダルベッコ改変最小必須培地）中に３６℃＋／２℃、５％ＣＯ_２で直接接種した。細胞をコンフルエントになるまで成長させ、ＴｒｙｐｌＥを使用して継代培養した。このフラスコを２つのＴ－１８５ｃｍ^２フラスコに拡張し、コンフルエントになるまで成長させ、３１×Ｔ－１８５ｃｍ^２フラスコまで継代培養し、細胞が１００％コンフルエントになるまで成長させた。トリプシン処理によって細胞を回収し、８００×ｇで１０分間遠心分離にかけ、１０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ中に、１．９×１０^７細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。上記のように、１バイアルのＶｅｒｏ細胞を迅速に解凍し、Ｔ－７５ｃｍ^２フラスコ内で蘇生させた。これらを２回継代培養して、１３×Ｔ－１８５ｃｍ^２フラスコの細胞バンクを作製した。トリプシン処理後、細胞を８００×ｇで遠心分離にかけ、凍結培地（１０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ）中に、４．６８×１０^５細胞／ｍＬの濃度で、再懸濁した。この細胞バンクをクライオバイアルに等分した。

Ｖｅｒｏ細胞を、ペニシリン－ストレプトマイシン、Ｌ－グルタミン及び１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ（ｃＤＭＥＭ－１０％－ＦＢＳ）中で成長させ、維持した。ＴｒｙｐｌＥｘｐｒｅｓｓを使用して、細胞を維持し、トリプシン処理した。ウイルス吸着の２日前に、６ウェルプレートで３ｍＬのｃＤＭＥＭ－１０％－ＦＢＳ中に４～５×１０^５細胞／ウェル、またはＴ－２５ｃｍ^２フラスコで５ｍＬのｃＤＭＥＭ－１０％－ＦＢＳ中に７×１０^５細胞、または９６ウェルプレートで０．１ｍＬのｃＤＭＥＭ－１０％－ＦＢＳ中に１×１０^４細胞／ウェルを播種した。インキュベータを毎日モニタリングして、指定温度を維持した。Ｖｅｒｏ細胞株は、液体窒素中に保存した。

プラークアッセイ
６ウェルプレートで成長させたＶｅｒｏ細胞の新鮮なコンフルエント単層のウイルス力価をプラーク滴定により決定した。凍結アリコートを解凍し、９６ウェルプレートでアリコートの１０倍希釈系列をｃＤＭＥＭ－０％－ＦＢＳで作製した。希釈したウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞単層の接種前まで、氷上に維持した。アッセイ時に、６ウェルプレートから成長培地を吸引し、各ウイルス希釈液１００μＬをウェルに加えた。細胞シートの乾燥を防ぐために、プレートを頻繁に（１０分ごとに）揺らしながら、ウイルスを３６℃±２℃、５％ＣＯ_２で６０分間吸着させた。ウイルス吸着後、４０～４１℃に維持した第１のアガロースオーバーレイ（１Ｘ ｃＤＭＥＭ－２％－ＦＢＳ＋０．８％アガロース）４ｍＬを各ウェルに加えた。アガロースを室温で３０分間固化させ、次いで、プレートを上下逆さまにして３６℃＋／２℃、５％ＣＯ_２で、４～６日間インキュベートした。１６０μｇ／ｍＬのニュートラルレッド生体染色色素を含有する第２のアガロースオーバーレイ２ｍＬを４日目に加えた。プラークを５日目及び６日目に可視化した。

ＴＣＩＤ５０アッセイによるウイルスの定量
９６ウェルプレートで成長させたＶｅｒｏ細胞の新鮮なコンフルエント単層でのウイルス力価も滴定により決定した。凍結アリコートを解凍し、９６ウェルプレートでアリコートの１０倍希釈系列をｃＤＭＥＭ－２％－ＦＢＳ希釈液で作製した。希釈したウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞単層の接種前まで、氷上に維持した。アッセイ時に、９６ウェルプレートから成長培地を吸引し、各ウイルス希釈液１００μＬをウェルに加えた。プレートを３６℃＋／２℃、５％ＣＯ_２で５日間インキュベートした。５０％組織培養物感染量（ＴＣＩＤ５０）の力価をＲｅｅｄ／Ｍｕｅｎｃｈ計算表の使用により算出した。

試験物品
ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９（ドライアイス上の０．５ｍＬバイアル１本）を疾病予防管理センター（ＣＤＣ）から受領し、ジカウイルスの同定をＲＴ－ＰＣＲによって確認した。この株を試験すると、ＰＣＲによるＡｌｐｈａｖｉｒｕｓ及びマイコプラズマ汚染は陰性であった。この情報を表１にまとめる。

シークエンシング
ＱＩＡａｍｐＶｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎキットを製造元のプロトコルに従って使用して、各分離株の安定化されたウイルス回収物からＲＮＡを抽出した。各分離株から抽出したＲＮＡを使用して、全ジカウイルスゲノムを包含する６つのｃＤＮＡフラグメントを作製し、増幅した。増幅したｃＤＮＡフラグメントのサイズ及び純度を１％アガロース／ＴＢＥゲルで分析し、その後、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してゲル精製した。ＡＢＩ ３１３０ＸＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンサーを使用して自動シークエンシング反応を行った。Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ＳｅｑＭａｎソフトウェアを使用してシークエンシングデータを解析した。

結果
アメリカにおける現在のＺＩＫＡＶアウトブレイクに関連し、既知の研究歴のあるＺＩＫＡＶ株が必要とされた。このため、ＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９株が選択された。Ｖｅｒｏ細胞での成長に適合した十分に特徴付けされたウイルスを生成するために、ＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９を最初にＶｅｒｏ細胞で増幅させた（Ｐ１）。

フラスコ（Ｔ－１７５ｃｍ^２）の１００％コンフルエントのＶｅｒｏ細胞を、４ｍＬのｃＤＭＥＭ－０％－ＦＢＳ中、０．０１のＭＯＩで感染させた。ウイルスを単層に３６℃±２℃、５％ＣＯ_２で６０分間吸着させ、次いで、２０ｍＬのｃＤＭＥＭ－０％－ＦＢＳをアプライし、３６℃±２℃、５％ＣＯ_２でウイルス増幅した。接種後の細胞変性効果（ＣＰＥ）について、細胞層を毎日モニタリングした（図１）。９６時間後、培地を収集することによって、上清を回収し、遠心分離（６００×ｇ、４℃、１０分）によって清澄化した。トレハロースを１８％ｗ／ｖの最終濃度まで加えることによって、回収物を安定化した。バルクを０．５ｍＬクライオバイアルに等分し、－８０℃で保存した。

ＴＣＩＤ５０アッセイにより、Ｖｅｒｏ細胞単層上の感染性ウイルスの存在について、安定化したＰ１回収物を分析した。０時間から毎日アリコートを採取することによって、成長速度をモニタリングした。７２時間までにピーク力価に到達した（図２）。

Ｐ１材料は、Ｖｅｒｏ細胞の６ウェル単層で３日目の回収物を滴定することによって、プラーク精製した。６日目のプラークを可視化し、プラスチック製プレートの底部に、独立した別個のプラークの周りに円を描くことによって、分離する１０個のプラークを特定した。滅菌ワイドボアピペットを使用して、ウェルの底部を掻き取りながら、アガロースプラグを抽出し、ｃＤＭＥＭ－１０％－ＦＢＳですすぐことによって、プラークを採取した。アガロースプラグを０．５ｍＬのｃＤＭＥＭ－１０％－ＦＢＳに加え、ボルテックス処理し、ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ２ａ～ｊのラベルを付け、インキュベータ内に３６℃±２℃、５％ＣＯ_２で一晩置いた。

３つのプラーク（ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ２ａ～ｃ）を追加の精製に進めた。各分離株を、新鮮な６ウェルＶｅｒｏ細胞単層上にデュプリケートでそのまま播種した。このＰ２／Ｐ３移行物をプラーク精製し、ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ３ａ～ｊのラベルを付けた。

６つのプラーク（ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ３ａ～ｆ）を最終精製ラウンドに進めた。各分離株を、新鮮な６ウェルＶｅｒｏ細胞単層上にデュプリケートでそのまま播種した。このＰ３／Ｐ４移行物をプラーク精製し、ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ４ａ～ｊのラベルを付けた。

Ｐ４プラーク精製からの６つのプラーク（ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ４ａ～ｆ）を、Ｔ－２５ｃｍ^２フラスコで、Ｖｅｒｏ細胞の単層上でブラインド継代した。各プラーク採取物を２ｍＬのｃＤＭＥＭ－０％－ＦＢＳ中に希釈し、１ｍＬを３６℃±２℃、５％ＣＯ_２で１時間吸着させ、もう１つの１ｍＬをトレハロース（最終１８％ｖ／ｖ）で安定化し、－６０℃未満で保存した。ウイルス吸着後、各フラスコにｃＤＭＥＭ－０％－ＦＢＳを加え、３６℃±２℃、５％ＣＯ_２で４日間成長させた。ウイルス上清を回収し、遠心分離（６００×ｇ、４Ｃ、１０分）によって清澄化し、１８％トレハロースで安定化し、等分して、－６０℃未満で保存した。このＰ５シードのジカウイルス効力について、ＴＣＩＤ５０によって試験した（図３）。

Ｔ－１７５ｃｍ^２フラスコのＶｅｒｏ細胞のコンフルエント単層に、ＰＲＶＡＢＣ５９の６つのクローン（Ｐ５ａ～ｆ）のそれぞれを、４ｍＬのｃＤＭＥＭ－０％－ＦＢＳ中、０．０１のＭＯＩで感染させた。ウイルスを３６℃＋／２℃、５％ＣＯ_２で６０分間吸着させ、その後、各フラスコに２０ｍＬのｃＤＭＥＭ－０％－ＦＢＳを加え、３６℃＋／２℃、５％ＣＯ_２で成長させた。Ｖｅｒｏ細胞単層の健全さ及びＣＰＥを毎日モニタリングした。ウイルスを指示されているように３日目及び５日目に回収した（図４）。３日目及び５日目のＰ６株の回収物をプールし、１８％トレハロースで安定化し、等分し、－６０℃未満で保存した。

ＰＲＶＡＢＣ５９の６つのクローン（Ｐ６ａ～ｆ）のそれぞれのジカウイルスｉｎ ｖｉｔｒｏ効力について試験した（図５）。効力は、２つの異なる方法、ＴＣＩＤ５０及びプラーク滴定によって決定した。ＴＣＩＤ５０は、ＣＰＥの目視検査（顕微鏡）と、ＣＰＥ（黄色）を示すウェルと赤（ＣＰＥなし）とを比較した吸光度の差（Ａ５６０－Ａ４２０）を測定することによって、算出した。プレートをプレートリーダーで読み取り、顕微鏡で読み取ったプレートと同じ計算表を適用した（吸光度）。２つの評価技術間のＴＣＩＤ５０の値は、極めて似ているが、プラーク滴定によって得た値のほうが低かった。

Ｐ６ウイルス生産及び特性評価の概要を以下の表２に示す。

フラビウイルスのエンベロープタンパク質がウイルスの主な免疫原性部分であるので、元の分離株のエンベロープ糖タンパク質配列によく似た分離ジカウイルスクローンを探した。ＰＲＶＡＢＣ５９クローンＰ６ａ、Ｐ６ｃ、Ｐ６ｄ及びＰ６ｆは、エンベロープ領域（Ｇ９９０Ｔ）のヌクレオチド９９０にＧ→Ｔ変異を含有し、エンベロープ残基３３０にＶａｌ→Ｌｅｕのアミノ酸変異をもたらしたが、ＰＲＶＡＢＣ５９クローンＰ６ｂ及びＰ６ｅのエンベロープ遺伝子は、参照株（ＧｅｎＢａｎｋ ｒｅｆ ＫＵ５０１２１５．１）に対して同一であった（表３及び図６）。

次いで、ジカエンベロープ配列に変異を持たない２つのクローンを全ゲノムシークエンシングにかけた。シークエンシング結果を上の表３にまとめる。配列解析により、両クローンのＮＳ１領域のヌクレオチド２９２におけるＴ→Ｇ置換が明らかになり、ＮＳ１残基９８にＴｒｐ→Ｇｌｙ変異が生じた。この変異は、その後のディープシークエンシングによっても確認された。ＮＳ１ Ｗ９８Ｇ変異は、膜会合、エンベロープタンパク質との相互作用、及び潜在的な六量体ＮＳ１形成に関与している、ＺＩＫＡＶ ＮＳ１のウイングドメインの絡み合ったループに位置する。他のトリプトファン残基（Ｗ１１５、Ｗ１１８）は、フラビウイルスで高度に保存されているが、Ｗ９８はそうではない（図７）。しかしながら、興味深いことに、Ｗ９８残基の１００％の保存が、アフリカ系統及びアジア系統に由来する株を含む、１１の異なるＺＩＫＡＶ株で観察されている。各株で特定された変異を表４にまとめる。

ＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６ストックの表現型解析を実施して、ＺＩＫＡＶクローンの特性評価を行った。図８に示し、図９に定量するように、各クローン分離株は、大きなプラークと小さなプラークの混合集団を有するＰ１ウイルスと比較すると、比較的均一な大型プラークの集団からなる。これらのデータは、単一ＺＩＫＡＶクローンの分離が成功したことを示唆している。

次に、ＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６クローンのＶｅｒｏ細胞における成長速度解析を行った。Ｖｅｒｏ細胞に、無血清成長培地中、０．０１ＴＣＩＤ５０／細胞の各ＺＩＫＡＶ Ｐ６クローンを感染させた。ウイルス上清サンプルを毎日採取し、ＴＣＩＤ５０アッセイによって感染力価を同時にアッセイした。Ｐ６クローンの全てで、３日目～４日目の間にピーク力価が生じた（約９．０ ｌｏｇ_１０ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）。様々なＰ６クローンの成長速度に有意差はなかった（図１０）。

まとめると、これらの結果は、ジカウイルスシードの作製が成功したことを示している。このシード選択には、ウイルスの成長履歴、速度、収量、遺伝子型、及び表現型の理解を要した。重要なことに、ジカウイルス株のクローン分離により、汚染物質（例えば、親ヒト分離株中に存在し得る外来性感染性因子）からウイルスを首尾良く精製することができた。興味深いことに、連続３回のプラーク精製により、Ｖｅｒｏ細胞適応化ウイルス（Ｐ６ａ～ｆ株）を素早く選択することに成功した。これらの株は、無血清Ｖｅｒｏ細胞培養で良好に複製することができ、Ｐ６ａ、ｃ、ｄ、及びｆ株は、ウイルスエンベロープタンパク質に変異を有するのに対し、ｐ６ｂ及びｐ６ｅ株は、ウイルスＮＳ１タンパク質に変異を得た（ウイルスエンベロープに改変なし）。更に、Ｖｅｒｏ適応化株は、これらの株から増殖した後続のウイルス継代の効率的かつ再現可能な成長及び製造が可能であった。理論に束縛されることを望むものではないが、Ｐ６ａ、ｃ、ｄ、及びｆ株に観察されたＥｎｖ－Ｖ３３０Ｌ変異は、Ｖｅｒｏ細胞の継代時にもＥｎｖ ３３０の変異が観察されたことから、ｉｎ ｖｉｔｒｏ適応の結果である可能性があり得る（Ｗｅｇｅｒ－Ｌｕｃａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）。エンベロープタンパク質がジカウイルスの主な免疫原性エピトープであるので、ＥｎｖにＶｅｒｏ適応変異を含有する株は、ワクチン免疫原性に悪影響を及ぼし得る。理論に束縛されることを望むものではないが、タンパク質ＮＳ１の適応変異は、ウイルス複製を増大させるだけでなく、ジカウイルスのエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）などにおける望ましくない変異の発生を減少または阻害し得ると思われる。加えて、ＮＳ１は、ウイルスの生活環中にエンベロープタンパク質に結合することが知られ得る。この変異（ＮＳ１ Ｗ９８Ｇ）は、下流プロセシング中に、ＮＳ１がウイルスと会合し、場合により共精製する能力の変化と関係し得る。ＮＳ１はまた、免疫原性であることが知られており、ワクチンに対する免疫応答に関係し得る。

実施例２：不活化の有効性を決定するための不活化アッセイの完全性
不活化（ＣＯＩ）アッセイの完全性とも呼ばれる二重感染力アッセイを開発して、ホルムアルデヒド不活化（０．０１％ホルムアルデヒド）の有効性と、精製された不活化ジカウイルス（ＰＩＺＶ）バルク原薬（ＢＤＳ）の潜在的な残留感染性ウイルス活性を決定した。

サンプル調製：上記のクローンｅの精製された不活化ジカワクチン（ＰＩＺＶ）ロットを、Ｖｅｒｏ細胞における成長により、４つ製造した（Ｔｏｘロット１～４）。毎日の４回の採取物（合計約４０００ｍＬ）から上清をクロマトグラフィーによって精製し、続いて、最終濃度０．０１％ｗ／ｖまでホルムアルデヒドを加えた。不活化を２２℃で１０日間進行させた。不活化中に、特性評価及び解析のために、工程内管理（ＩＰＣ）サンプルをバルク原薬（ＢＤＳ）から毎日取り出した。日々のＩＰＣサンプルをメタ重亜硫酸ナトリウムで中和し、ＤＭＥＭ（ウイルス成長培地）に透析した。サンプルは、精製された不活化ジカウイルスを含有する。不活化の最終日に、残量のＢＤＳサンプルは、中和せずに、ＴＦＦで処理してホルムアルデヒドを除去し、ＰＢＳに緩衝液交換した。

不活化アッセイ（ＣＯＩ）の完全性：日々のＩＰＣサンプルにおける不活化の有効性を分析して、不活化の動態、及び最終ＢＤＳを理解するために、ＣＯＩアッセイを使用した。最大の感度を得るために、このアッセイでは、２つの細胞株Ｖｅｒｏ及びＣ６／３６をまず利用して、ＩＰＣ及びＤＳサンプル中で生きている可能性のあるウイルスを検出した。フェノールレッドを含有する成長培地の存在下でジカウイルスをＶｅｒｏ細胞に感染させると、死細胞の副産物によってｐＨが低下する。その結果として、培地の色が赤／ピンクから黄色に変化し、これは、培地のｐＨが酸性にシフトしたことを示す。この現象は、アポトーシス及び細胞変性効果（ＣＰＥ）によって生じ、ＣＰＥは、ウイルスの侵入、感染、及びウイルス複製中の細胞からの出芽によって生じる宿主細胞の細胞構造に変化が観察されたことを示す。最終的には、Ｃ６／３６蚊細胞及びＶｅｒｏ細胞の両方は、感染に対して許容細胞株であるが、ジカウイルス感染は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＶｅｒｏ細胞のみを殺傷する。したがって、Ｖｅｒｏ細胞をアッセイの指標細胞株として使用した。対照的に、ジカウイルスの天然宿主ベクターに由来するＣ６／３６細胞は、ジカ感染時にＣＰＥを示さず、溶解しない。培地の色は変化せず、Ｃ６／３６細胞の生存率は変化しない。

そのため、アッセイは２部に分かれる。アッセイの第１部では、２つの感受性細胞株の９６ウェルプレートで、生きている可能性のあるウイルス粒子を並行して６日間増幅させる。アッセイの第２の工程は、９６ウェルプレートの上清（場合により増幅した粒子を含む）をＶｅｒｏ細胞の単層を含有する６ウェルプレートに移し、更に８日間インキュベーションして、ウイルス感染させ、Ｖｅｒｏ細胞に細胞変性効果を発現させることを含む。観察されたＣＰＥは全て光学顕微鏡を使用して確認した。

アッセイの第１部、すなわち、Ｃ６／３６細胞の培養での９６ウェルプレートの使用、及びアッセイの第２部、すなわち、細胞変性効果を観察するためのＶｅｒｏ細胞の培養での６ウェルプレートの使用に関して詳述したが、アッセイは、以下の表５に示されるように容易にスケールアップすることができる。

スケールアップ中、容器１ｃｍ^２当たりのサンプル量は、第１部で一定に維持され、第２部では同じウイルス感染条件が維持されることは明らかである。

ＣＯＩアッセイコントロール：このアッセイの力価及び逆滴定コントロールは、Ｖｅｒｏ指標細胞を使用して実施し、ＴＣＩＤ５０ ９６ウェルフォーマットで評価した。ウェルは、細胞死の代替、またはＣＰＥの存在である、ピンクから黄色への培地の色の変化に基づき、陽性と評価した。

ウイルス力価コントロール試験：既知の力価を有する対照ウイルス（ＰＲＶＡＢＣ５９）の２つの独立したレプリケートを２％ＦＢＳ含有培地で１０倍希釈系列にし、１００μＬの各希釈液をＶｅｒｏ細胞を含有する９６ウェルプレートの４ウェルに加えた。プレートを５日間インキュベートし、次いで、ＣＰＥ含有ウェルを記録し、Ｒｅｅｄ－Ｍｅｕｎｃｈ計算表を使用して、ウイルス力価を算出した。

ウイルス逆滴定コントロール試験：既知の力価を有する対照ウイルスを２００ ＴＣＩＤ５０に段階希釈した。２００ ＴＣＩＤ５０対照ウイルスの２つの独立したレプリケートを２％ＦＢＳ含有培地で２倍希釈系列にし、１００μＬの各希釈液をＶｅｒｏ細胞を含有する９６ウェルプレートの４ウェルに加えた。細胞を５日間インキュベートし、次いで、ＣＰＥ含有ウェルを記録し、Ｒｅｅｄ－Ｍｅｕｎｃｈ計算表を使用して、ウイルス力価を算出した。

ＣＯＩプロトコルの詳細：
１．アッセイの第１部：サンプル添加の２日前に、Ｖｅｒｏ（１．４Ｅ＋０５細胞／ｍＬ）細胞及びネッタイシマ蚊Ｃ６／３６（４Ｅ＋０５細胞／ｍＬ）細胞を９６ウェルプレートに播種した。Ｖｅｒｏ細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％最終ＦＢＳ＋２％Ｌ－グルタミン＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中、３７℃で培養した。Ｃ６／３６細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋２％Ｌ－グルタミン＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン＋１％非必須アミノ酸中、２８℃で培養した。
２．２００ ＴＣＩＤ５０対照ウイルス（ウイルス逆滴定コントロール試験で調製）またはＤＳサンプルの３つの独立したレプリケートを２％ＦＢＳ含有培地に希釈した（５倍及び１０倍希釈）。
３．９６ウェルプレート中の細胞にサンプルを接種した。サンプルは、９６ウェルプレートの細胞単層への感染前に、ボルテックス処理をし、存在し得るあらゆる凝集を解いた。１００μＬの各希釈液をそれぞれＶｅｒｏ及びＣ６／３６細胞を含有する２つの別個の９６ウェルプレートの５つのウェルのそれぞれにアプライした。
４．各細胞種の別のウェルには、陰性ＣＰＥ対照として、培地のみを含めた。
５．プレートを細胞株に適した温度で６日間インキュベートした。
６．アッセイの第２部：許容細胞株において、生きているウイルスを更に増幅し、ＣＰＥによって可視化するために、Ｖｅｒｏ及びＣ６／３６細胞の両方から、各９６ウェル上清の全量をＶｅｒｏ細胞の６ウェルプレートの個々のウェルに移した。１５分間隔で揺らしながら、接種を９０分間進行させた。
７．２％ＦＢＳ含有培地をウェルに加え、プレートを更に８日間インキュベートし、その後、ＣＰＥに関して増幅サンプルの検出を行った。不活化は、ＤＳのレプリケートのいずれかが８日目の終わりにＣＰＥを示した場合、不完全であるとみなした。
７．生きている／複製するビリオンの存在を、６ウェルプレートに移し、８日間インキュベーションして、ウイルスを複製させた後の感受性細胞単層上のプラークまたはＣＰＥの形成によって可視化した。アッセイ終了時の６ウェルプレートの％ＣＰＥ評価は、次のように算出した：
Ｖｅｒｏ細胞の各６ウェルプレートを比色変化の可視化によってＣＰＥについて試験し、続いて、倒立光学顕微鏡での検査によってＣＰＥを確認した。
各６ウェルプレートは、上記の５倍及び１０倍希釈で調製されたＤＳ希釈液のレプリケートの１つであった（５つのウェル＋培地のみを含有するウェル１つ）。
したがって、各レプリケートの％ＣＰＥは、１サンプル当たり合計５ウェルのうち、ＣＰＥを有するウェルの数を反映するものであった（アッセイごとに合計１２０個のウェルを使用）。平均％ＣＰＥ及び標準偏差は、各希釈液の３つのレプリケートに基づいて算出した。
結果：以下の表６～９に示すようにＴｏｘロット＃１～４のそれぞれで日々のサンプルを分析した。

編集した不活化の動態データ：４つの毒性学ロットからのサンプルのＣＯＩデータを、上記のように決定された感染力（ＴＣＩＤ５０）及びＲＮＡコピーと比較した。ＲＮＡコピーは、サンプルから核酸を精製し、ＲＴ－ＰＣＲキットを使用して血清型特異的プライマーによりジカＲＮＡを増幅させることによって、決定した。図１１に示す結果は、ＣＯＩアッセイの感度がＴＣＩＤ５０の感度よりも大幅に高いことを示す。

ＣＯＩアッセイの分析能パラメーター－真度：標的希釈（ＴＣＩＤ５０／ウェル）及びＣＰＥのそれぞれの比率を使用して、相対真度を決定した。Ｖｅｒｏ細胞の場合、陽性ＣＰＥについて観察された割合と予想された割合の間には、統計的に有意な線形関係があった。観察結果と予想結果を関連付ける線の傾きは、０．９２であり、１と重なると１００％真度を示す９５％信頼区間（ＣＩ）は、０．８３～１．０１である。Ｃ６／３６細胞の場合、陽性ＣＰＥについて観察された割合と予想された割合の間には、統計的に有意な線形関係がある。観察結果と予想結果を関連付ける線の傾きは、０．８８であり、９５％信頼区間（ＣＩ）は、０．８０～０．９５である。これは、この細胞株では、わずかな偏り（５～２０％）が見られたことを示している。細胞株はいずれも満足のいく真度（相対）を示している。

ＣＯＩアッセイの分析能パラメーター－検出限界（ＬｏＤ）：アッセイの感度は、Ｃ６／３６からＶｅｒｏへのプレートとＶｅｒｏからＶｅｒｏへのプレートの両方で評価した。上記のように、データのフィッティングは、１０．００ ＴＣＩＤ５０／ウェルから０．０８ ＴＣＩＤ５０の低い力価まで播種した力価の希釈で播種した全てのウェルで観察されたＣＰＥ陽性の割合の最小２乗回帰を使用して行った。更に、プレートの各希釈について、陰性対照（０．００ ＴＣＩＤ５０／ウェル）を含めた。ＣＰＥの評価は、Ｃ６／３６からＶｅｒｏへのプレート及びＶｅｒｏからＶｅｒｏへのプレートの両方で、各希釈ごとに実施した。ＣＰＥとｌｏｇ入力ウイルス力価との間に明らかな関係が認められた。これは、ＴＣＩＤ５０／ウェルのｌｏｇ_１０濃度に対するＣＰＥ陽性ウェルの割合のロジスティック（シグモイド）関係を示し、９９％信頼限界の下限値及び上限値を有する。－２ ｌｏｇ_１０濃度（＝０．０１ ＴＣＩＤ５０／ウェル）では、適格性評価データの全ての固定及びランダム変動源に基づいた、またこれらを考慮したモデルによると、０．８５％、または０．０１ ＴＣＩＤ５０／ウェルに切り上げた場合、０．０１が予測され、下限の９９％信頼限界は０．４２％である。９９％信頼限界の下限値はゼロを含まないので、０ ＴＣＩＤ５０／ウェルから０．８５％ＣＰＥウェルが生じ得る可能性を定量化できる（＜１％）見込みは極めて小さい（すなわち、ノイズに起因する）。これにより、少なくとも０．０１ ＴＣＩＤ５０／ウェルがアッセイの検出限界であることが確立される（すなわち、検出することができるサンプル中で生きているジカ粒子の最低量）。すなわち、６０ウェル中の１つがＣＰＥ陽性または所与のこれらのパラメーターであるとき、端数を切り上げると、６０ウェルで検出することができるＣＰＥ陽性の最低理論割合は、１．６７％、または０．０１６７である。

細胞の種類（Ｃ３６３及びＶｅｒｏ）を相対感度について比較した。図１２に示されるように、Ｃ６／３６は、Ｖｅｒｏ細胞と比較して、より低い希釈のウイルス力価を検出することができることを示しており、同じウイルス入力レベル（０．３１ ＴＣＩＤ５０）では、ＣＰＥ陽性ウェルの割合は、Ｖｅｒｏ細胞に比べてＣ６／３６でより高い。

このアッセイの適格性評価中に使用された最低ウイルス入力値は、０．０２ ＴＣＩＤ５０（－１．６１ ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０）であった。Ｃ６／３６細胞の近似曲線を使用すると、ＣＰＥ陽性と評価されるウェルは０．０３５または３．５％（２８ウェル中１つ）となる。曲線を０．１６７または１．６％の最低実用レベルに外挿すると、０．０１５ ＴＣＩＤ５０（－１．８２ ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０）のウイルス入力レベルに相当する。しかしながら、ＣＰＥ陽性結果に反映される検出することができる感染性ウイルスの最低レベルを決定する場合、伝達されるアッセイ変動の影響を考慮する必要がある。このノイズは、入力ウイルスの作業ストックの作製から発生する。目標ＴＣＩＤ５０と逆滴定の計算を比較すると、作業ストックウイルスのＴＣＩＤ５０は、８５ ＴＣＩＤ５０／ｍＬの標準偏差（ＳＤ）を示し、これは、２００のストックのＴＣＩＤ５０／ｍＬ濃度を目標にしたとき、２１３の平均から得られた。％ＣＶを計算すると、約４０％であり、偏りは約＋７％である。このノイズをロジスティック回帰モデルに組み込み、ウイルス希釈の目標値の前後に信頼区間を生成した。０．０１ ＴＣＩＤ５０／ウェルの目標値では、２箇所にわたる適格性評価データの全ての固定及びランダム変動源に基づいた、またこれらを考慮したモデルによると、ウェルの０．８６％がＣＰＥ陽性になることが予想される（６０ウェル中１つ）。９９％信頼限界の下限値はゼロを含まないので、０ ＴＣＩＤ５０／ウェルから０．８５％ＣＰＥ陽性ウェルがノイズに起因して生じ得る可能性を定量化できる（＜１％）見込みは極めて小さい（図１３）。これにより、アッセイの検出限界が確立される：０．０１ ＴＣＩＤ５０／ウェルが、検出することができるサンプル中で生きているジカ粒子の最低量である。

ＣＯＩアッセイの分析能パラメーター－範囲：アッセイの範囲は、０．０１ ＴＣＩＤ５０／ウェル～４．５ ＴＣＩＤ５０／ウェルであり、０％を超えるが１００％未満であるＣＰＥ陽性割合の評価をもたらす入力ウイルスの範囲と定義される。

結果：４つのＴｏｘロットの分析により、０．０１％ホルムアルデヒド中、室温で１０日間インキュベーションした後に、不活化が完全であったことが明らかになった。ＣＯＩアッセイによって測定すると、不活化は、生産した全てのロットで、３～４日までに達成された。ＣＯＩアッセイは、ＴＣＩＤ５０効力またはＲＮＡ測定よりも感度が高く、この感度の向上は、ＬｏＤによっても観察されている。

実施例３：不活化ウイルス組成物の製剤
実施例３では、「ジカウイルスワクチン原薬」という用語は、ジカワクチンの生産の中間体である不活化ウイルス組成物を指すために使用される。
必要品

使用される緩衝液及びその略語は、表１１に列挙される。

ジカワクチン原薬の製造
精製された不活化ジカワクチン原薬を、上記のとおり、Ｖｅｒｏ細胞における成長によって製造した。毎日の採取を３～９日目に実施し、これらをプールしてから、精製及び不活化した。毎日の採取物から上清を濾過及びクロマトグラフィーによって精製し、濃縮し、ホルムアルデヒドを０．０１％の最終濃度まで加えることによって不活化した。不活化を２２℃で１０日間進行させた後、サンプルをメタ重亜硫酸ナトリウムで中和し、次いで、ジカリン酸緩衝液（６．４６ｍＭのリン酸二ナトリウム、１．４７ｍＭのリン酸二カリウム、１３７ｍＭのＮａＣｌ、６％スクロース、ｐＨ７．４）に緩衝液交換した。

緩衝液交換
製造したら、ジカウイルスワクチン原薬を＋５±３℃／周囲湿度で最大６ヶ月間保存した。

次いで、ジカウイルスワクチン原薬を、後述されるタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）を使用して、実施例のそれぞれに使用される適切な緩衝液（表１１に列挙）に緩衝液交換した。タンジェンシャルフロー濾過は、表１２に列挙される装置を使用して実施した。緩衝液交換プロセスは、室温約２５℃で実施した。

タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）は、以下の手順を使用して実施した。

セットアップ：製造元の説明書（ＫＲ２ｉ／ＫＭＰｉ ＴＦＦシステム製品情報及び操作説明書２０１６、ｈｔｔｐ：／／ｓｐｅｃｔｒｕｍｌａｂｓ．ｃｏｍ／ｌｉｔ／４００－１２３５５－０００ｒｅｖ０２．ｐｄｆ）に従って、ＫＲ２ｉ ＴＦＦシステムを設定した。これは、ＴＦＦカラム（ＭｉｃｒｏＫｒｏｓ中空繊維フィルターモジュール（ｍＰＥＳ／１００ｋＤ）Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ Ｃ０２－Ｅ１００－０５－Ｎ）をＴＦＦシステムに接続することを伴う。次いで、カラムを５０～１５０ｍＬの水で洗浄し、その後、約１００ｍＬの適切な緩衝液で平衡させた。洗浄及び平衡ステップの間、流速は約２５ｍＬ／分に維持し、全圧力はいかなる時点でも１８ｐｓｉ．を超えないようにした。

濃縮：まず、５～４０ｍＬのサンプル（ジカウイルスワクチン原薬）をサンプルリザーバーに加え、倍率２で濃縮した。

ダイアフィルトレーション：濃縮後、ダイアフィルトレーションを実施した。ダイアフィルトレーションは、ジカウイルスワクチン原薬のサンプルを同時に希釈し濾過する行為である。希釈はサンプルの体積を増やすが、濾過はサンプルの体積を減らす。

ダイアフィルトレーションは、補助ポンプ（ダイアフィルトレーション用）を始動させ、ダイアフィルトレーション中のサンプル量を維持するのに十分な流速、すなわち、約０．５～１．５ｍＬ／分を使用して実施した。圧力は、背圧調整弁を使用して、終始手動で調整した。圧力は１４～１８ｐｓｉ．に維持し、使用されるせん断速度は５０００以下であり、流束は６６～７２、流速（メインポンプ）は２５～２８ｍＬ／分、補助流速（補助ポンプ）は０．５～１ｍＬ／分であった。補助ポンプは、希釈速度を調整するものである。この速度は、濾過速度に合わせて手動で調節される（それにより、このステップ中、正味のサンプル量は変化しない）。濾過速度は、多くの因子（メインポンプの流速、膜間差圧、カラムのファウリングの程度など）によって決定され、実施全体を通して変化するため、複雑である。そのため、サンプルの量は、補助ポンプの流速を手動で調節することによって制御される。

完全なダイアフィルトレーションを確実にするために、適切な（新しい）緩衝液の少なくとも１０濾過透析量（透過液の累積質量によって測定）を交換した。本実施例では、一定－液量ダイアフィルトレーション（連続的なダイアフィルトレーション）を実施した。これは、濾液が除去されるのと同じ速度で新しい緩衝液を加えることによって、濾過プロセス中の原薬（保持液）の量を一定に保つことを伴う。濾過透析交換量の数は、次式を使用して算出することができる：

ここで、原薬（保持液）の量は、プロセスを通して一定に保持される。

ダイアフィルトレーションプロセスにより、表１１に列挙される緩衝液に緩衝液交換されたジカウイルスワクチン原薬（ＤＳ）のサンプルが得られた。

サンプル回収及び保管：場合により、ダイアフィルトレーション後、更にサンプルを濃縮した（最大およそ１０倍）。これは、補助ポンプを閉じ、濾過を継続することによって実施した（すなわち、メインポンプのスイッチを入れたままにする）。ダイアフィルトレーションプロセスの最後にサンプルを回収するために、供給ライン及び再循環ラインをサンプルの高さよりも高くし、ポンプの流れを逆にして残留量（一般に約１～３ｍＬ）を回収した。その後、ＴＦＦ後の最終製品（緩衝液交換したジカウイルスワクチン原薬）について、ｐＨ決定、オスモル濃度、及びＳＥＣなどの適切な確認アッセイを実施した。

次いで、緩衝液交換後のジカウイルスワクチン原薬（ＤＳ）を＋５±３℃／周囲湿度で最大５日間保存した後、安定性試験を実施した。

安定性試験の手順
各試験（実施例３Ａ～３Ｆ）のはじめに、緩衝液交換後のジカウイルスワクチン原薬（ＤＳ）のサンプルを個々の３ｍＬバイアルに分注した。各バイアルは、それぞれの緩衝液中におよそ０．６７ｍＬのジカウイルスワクチン原薬（ＤＳ）を含有した。次いで、バイアルをＥＴＦＥラミネートゴム栓で密封した。

次いで、それぞれ異なる緩衝液の１つのアリコートに対応する１つのサンプルを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ、後述）を使用して直ちに試験して、試験開始時（０日目／凍結融解サイクル０）におけるピーク面積（したがって、μｇ／ｍＬ単位でのタンパク質の量）を決定した。

それぞれの各緩衝液中のジカウイルスワクチン原薬（ＤＳ）の十分なバイアルを、各試験の開始時に＋５±３℃の周囲湿度及び－８０℃の周囲湿度に置いた。それぞれの測定時点及び温度条件ごとに、個別のバイアルを準備した。

－８０℃で保存するサンプルは、－８０℃のチャンバー内で凍結した。充填量が０．６７ｍＬのため、サンプルは、比較的急速に凍結したが、液体窒素では「スナップ凍結」しなかった。

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の手順
シングルカラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、安定性の分析を実施した。サイズ排除クロマトグラフィーは、分子量に基づいてタンパク質を分離するのに使用される技術である。タンパク質サンプルの分子量が大きければ大きいほど溶出時間が短くなる。インタクトなジカウイルスでは、８分前後の保持時間でＳＥＣトレースのピークが見られた。このピークの積分と参照サンプル（０日目）の積分を比較することによって、保管期間後のサンプル中にインタクトなジカウイルスがどの程度存在しているかを決定することができる。更に、より早い保持時間に何らかの更なるピークが現れるかどうかに注目することによって、ジカウイルスが凝集しているかどうかも決定することができる。

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に使用される装置及び材料を以下の表１３に詳述する。

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、以下に詳述される手順を使用して実施した。

スタンダード及び試験サンプルの調製
ＢＳＡ参照スタンダード：２ｍｇ／ｍＬの明確に定義された濃度を有するＢＳＡ原液を水で希釈することによって、２００、４００、８００、及び１，０００μｇ／ｍＬの濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の参照サンプルを調製した。次いで、各参照サンプルのアリコートをラベル付きＨＰＬＣバイアルに移し、栓をした。以下の実施例３Ａ～３Ｆに示される全てのタンパク質濃度は、ＢＳＡ標準曲線に基づいたジカウイルスの濃度に基づく。

ＳＥＣ用サンプルの調製：特定の各試験時点で、必要な３ｍＬバイアルを＋５±３℃または－８０℃の保管場所から取り出した。－８０℃で凍結させたサンプルを室温で解凍した。次いで、適切な３ｍＬバイアルから少なくとも４００μＬの各試験サンプルをラベル付きＨＰＬＣバイアルに移し、バイアルに栓をすることによって、ＳＥＣサンプルを調製した。次いで、ＨＰＬＣバイアルをＨＰＬＣオートサンプラートレイに置いた。ＨＰＬＣオートサンプラートレイを５±３℃に冷却し、確実に全てのＳＥＣサンプルが５±３℃まで冷却されてからＳＥＣを実施した。

測定：各ＳＥＣ測定は、オートサンプラー／オートインジェクターを使用して、各サンプルの１００μＬアリコートをＳＥＣカラムに注入することを伴った。

ＳＥＣクロマトグラムからジカタンパク質の濃度を決定するために使用される算出方法
ＳＥＣの実施ごとに、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の標準曲線を作成し、２００、４００、８００、及び１，０００μｇ／ｍＬの濃度のスタンダードを流し、標準曲線を作成した（線形回帰、ｙ＝ｍｘ＋ｂであり、ｂ＝０）。ＢＳＡの単量体及び二量体のピーク面積の合計として、ＢＳＡのピーク総面積を算出した。

この標準曲線を使用して、ジカウイルスワクチン原薬（ＤＳ）の濃度を決定した（ＢＳＡの濃度を基準としたμｇ／ｍＬ単位）。

次いで、濃度の値を、各サンプルの０日目の測定値（１００％の値とする）に対して正規化したに。

ジカウイルスワクチン原薬（ＤＳ）のピーク面積は、ＳＥＣクロマトグラムで保持時間およそ８分の後に溶出するピーク全体として決定した。ピークフィッティングは、８分前後のピーク前後のベースラインをつなぐことによって行った。これは、メインピークと、それより短い保持時間で溶出する任意の更なるショルダー（すなわち、ピークの左側）を含む。保持時間が大幅に長いピークまたはショルダーは、これらのピークが分解または変性したジカウイルスタンパク質に対応する可能性が高いため、積分に含めなかった。

ジカウイルスワクチン原薬（ＤＳ）の濃度決定：ジカウイルスワクチン原薬（ＤＳ）の総質量をＢＳＡ検量線に基づいて算出した。ジカウイルスワクチン原薬（ＤＳ）の濃度は、μｇ／ｍＬの単位で報告し、検量線から得られた質量を０．１ｍＬで除算することによって算出する（式１参照）。

各実施例で得られた結果は、同じサンプルについて２回繰り返したＳＥＣ読み取り値の平均である。

実施例３Ａ
実施例３Ａのサンプルの調製は、上記のとおり実施した。ジカウイルスワクチン原薬を調製し、次いで、以下の表１４ａ及び１４ｂに列挙されるそれぞれの各緩衝液に緩衝液交換した。実施例３Ａでは、５±３℃と－８０℃の両方で１０日間の安定性試験を実施した。

表１４ａ及び１４ｂは、いくつかの異なる緩衝液中のジカウイルスワクチン原薬サンプルについて、０日及び１０日後に実施したＳＥＣの結果を示す。これらの実験の結果は、パーセンテージで示され、１０日目のＳＥＣピーク面積の０日目のピーク面積に対するパーセンテージに基づく。

実施例３Ｂ
実施例３Ｂのサンプルの調製は、上記のとおり実施した。ジカウイルスワクチン原薬を調製し、次いで、以下の表に列挙されるそれぞれの各緩衝液に緩衝液交換した。実施例３Ｂでは、－８０℃で６０日間の安定性試験を実施した。

表１５は、いくつかの異なる緩衝液中のジカウイルスワクチン原薬サンプルについて、０日及び６０日後に実施したＳＥＣの結果を示す。これらの実験の結果は、パーセンテージで示され、６０日目のＳＥＣピーク面積の０日目のピーク面積に対するパーセンテージに基づく。

実施例３Ｃ
実施例３Ｃのサンプルの調製は、上記のとおり実施した。ジカウイルスワクチン原薬を調製し、次いで、以下の表に列挙されるそれぞれの各緩衝液に緩衝液交換した。実施例３Ｃでは、５±３℃と－８０℃の両方で６７日間の安定性試験を実施した。

表１６ａ及び１６ｂは、いくつかの異なる緩衝液中のジカウイルスワクチン原薬サンプルについて、０日及び６７日後に実施したＳＥＣの結果を示す。これらの実験の結果は、パーセンテージで示され、６７日目のＳＥＣピーク面積の０日目のピーク面積に対するパーセンテージに基づく。

更に、図１４及び図１５は、Ｔｒｉｓ＋７％スクロース緩衝液及びＺＰＢ緩衝液中、－８０℃で６７日間保存したジカウイルスワクチン原薬のＳＥＣクロマトグラムを示す。Ｔｒｉｓ＋７％スクロース緩衝液中の原薬（図１４）では、６７日目のピーク形状は、０日目のピーク形状と極めて類似している。対照的に、ＺＰＢ中の原薬（図１５）では、６７日目にクロマトグラフィーのプロファイルが変化しており、特にメインピークの大きさが減少し、ショルダーピークの大きさが大きくなっている（すなわち、ショルダーピークが７．５分前後でベースラインから外れている）ことから、凝集が示唆される。

実施例３Ｄ
実施例３Ｄのサンプルの調製は、上記のとおり実施した。ジカウイルスワクチン原薬のサンプルを調製し、次いで、Ｔｒｉｓ緩衝液及びＺＰＢ緩衝液（上の表１１に列挙されるもの）に緩衝液交換した。実施例３Ｄでは、－８０℃で３ヶ月間の安定性試験を実施した。

本試験の結果を図１９に示す。

実施例３Ｅ
実施例３Ｅのサンプルの調製は、上記のとおり実施した。ジカウイルスワクチン原薬を調製し、次いで、以下の表に列挙されるそれぞれの各緩衝液に緩衝液交換した。実施例３Ｅでは、５±３℃で６０日間の安定性試験を実施した。

表１７は、ＺＰＢ及びＴＢＳ中のジカウイルスワクチン原薬サンプルについて、１、３、８、１５、３０及び６０日後に実施したＳＥＣの結果を示す。これらの実験の結果は、パーセンテージで示され、１、３、８、１５、３０及び６０日目のＳＥＣピーク面積の０日目のピーク面積に対するパーセンテージに基づく。

実施例３Ｆ
実施例３Ｆのサンプルの調製は、上記のとおり実施した。ジカウイルスワクチン原薬を調製し、次いで、Ｔｒｉｓ緩衝液に緩衝液交換した。その後、サンプルにスクロースを加えた（合計濃度がそれぞれ３、５、７及び１０％ｗ／ｖのサンプルになるように）。

表１８は、０、１、２、３、及び４回の凍結融解サイクル後に実施したＳＥＣの結果を示す。

サンプルのトレイは、個々のバイアルに準備した。それぞれの凍結融解サイクルは、トレイ（全てのサンプルが収容されている）を室温で解凍することによって、室温（２５℃）まで温めた。それぞれの凍結融解サイクル後、分析のために、それぞれの条件下で１本のバイアルを取り出した。

結果は、凍結融解サイクルの前及び１～４サイクル後のＳＥＣピークの面積に基づいたパーセンテージとして示される。

Claims (69)

1. 液体不活化ウイルス組成物であって、
   ａ）不活化全粒子ジカウイルスと、
   ｂ）少なくとも約６．５ｍＭの濃度の少なくとも１つの薬学的に許容される緩衝液と、
   ｃ）任意選択により、ポリオールと、を含み、
   前記液体不活化ウイルス組成物は、好ましくは、アルミニウム塩から選択されるアジュバントを含有せず、
   前記少なくとも１つの薬学的に許容される緩衝液は、リン酸イオンを含まない、
   前記液体不活化ウイルス組成物。
2. 前記液体不活化ウイルス組成物中のリン酸イオンの濃度が、約７ｍＭ未満、または約６ｍＭ未満、または約５ｍＭ未満、または約４ｍＭ未満、または約３ｍＭ未満、または約２ｍＭ未満、または約１ｍＭ未満である、請求項１に記載の液体不活化ウイルス組成物。
3. 前記液体不活化ウイルス組成物が、１つのみの薬学的に許容される緩衝液を含む、請求項１または２に記載の液体不活化ウイルス組成物。
4. 前記液体不活化ウイルス組成物が、少なくとも２つの異なる薬学的に許容される緩衝液を含み、前記液体不活化ウイルス組成物中で最も濃度が高い２つの薬学的に許容される緩衝液のモル比は、１：２～２：１、または１：５～５：１、または８：１～１：８、または１０：１～１：１０の間ではない、請求項１または２に記載の液体不活化ウイルス組成物。
5. 前記液体不活化ウイルス組成物中のカリウムイオンの濃度が、約４ｍＭ未満、または約３ｍＭ未満、または約２ｍＭ未満、または約１．５ｍＭ未満、または約０．５ｍＭ未満、または約０．１ｍＭ未満、または約０ｍＭである、先行請求項のいずれか１項に記載の液体不活化ウイルス組成物。
6. 前記液体不活化ウイルス組成物が、プロタミン硫酸塩を実質的に含まないか、または含まない、先行請求項のいずれか１項に記載の液体不活化ウイルス組成物。
7. 前記液体不活化ウイルス組成物のｐＨが、室温で決定される場合、ｐＨ約６．０～ｐＨ約９．０またはｐＨ約６．５～ｐＨ約８．０、またはｐＨ約６．８～ｐＨ約７．８、またはｐＨ約７．６である、先行請求項のいずれか１項に記載の液体不活化ウイルス組成物。
8. 前記薬学的に許容される緩衝液の濃度が、少なくとも約７ｍＭ、または少なくとも約７．５ｍＭ、または少なくとも約８ｍＭ、または少なくとも約８．５ｍＭ、または少なくとも約９ｍＭ、または少なくとも約１０ｍＭである、先行請求項のいずれか１項に記載の液体不活化ウイルス組成物。
9. 前記薬学的に許容される緩衝液の濃度が、約７ｍＭ～約２００ｍＭ、または約７．５ｍＭ～約２００ｍＭ、または約８ｍＭ～約２００ｍＭ、または約８．５ｍＭ～約２００ｍＭ、または約９ｍＭ～約１００ｍＭ、または約９ｍＭ～約６０ｍＭ、または約１０ｍＭ、または約２０ｍＭ、または約５０ｍＭである、請求項８に記載の液体不活化ウイルス組成物。
10. 前記薬学的に許容される緩衝液が、アミノ基含有分子を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の液体不活化ウイルス組成物。
11. 前記薬学的に許容される緩衝液が、Ｔｒｉｓまたはヒスチジン緩衝液である、請求項１０に記載の液体不活化ウイルス組成物。
12. 前記薬学的に許容される緩衝液が、Ｔｒｉｓである、請求項１１に記載の液体不活化ウイルス組成物。
13. 前記組成物が、少なくとも１つのポリオールを更に含む、先行請求項のいずれか１項に記載の液体不活化ウイルス組成物。
14. 前記液体不活化ウイルス組成物が、約１％ｗ／ｖ～約６０％ｗ／ｖの前記ポリオール、または約６％ｗ／ｖ～約５０％ｗ／ｖの前記ポリオール、または約６％ｗ／ｖ～約４０％ｗ／ｖの前記ポリオール、または約６％ｗ／ｖ～約３５％ｗ／ｖの前記ポリオール、または約６％ｗ／ｖ～約３０％ｗ／ｖの前記ポリオール、または約６％ｗ／ｖ～約２５％ｗ／ｖの前記ポリオール、または約６％ｗ／ｖ～約２０％ｗ／ｖのポ前記リオール、または約６％ｗ／ｖ～約１５％ｗ／ｖの前記ポリオール、または約６％ｗ／ｖ～約１２％ｗ／ｖの前記ポリオール、または約７％ｗ／ｖの前記ポリオール、または約１０％ｗ／ｖの前記ポリオールを含む、請求項１３に記載の液体不活化ウイルス組成物。
15. 前記液体不活化ウイルス組成物が、アミノ基含有分子を含む薬学的に許容される緩衝液と、約６％ｗ／ｖ～約１５％ｗ／ｖのポリオールと、を含む、請求項１４に記載の液体不活化ウイルス組成物。
16. 前記液体不活化ウイルス組成物が、Ｔｒｉｓと、約６％ｗ／ｖ～約１５％ｗ／ｖのポリオールと、を含む、請求項１５に記載の液体不活化ウイルス組成物。
17. 前記ポリオールが、糖である、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の液体不活化ウイルス組成物。
18. 前記糖が、二糖である、請求項１７に記載の液体不活化ウイルス組成物。
19. 前記二糖が、非還元糖である、請求項１８に記載の液体不活化ウイルス組成物。
20. 前記非還元糖が、スクロースである、請求項１９に記載の液体不活化ウイルス組成物。
21. 前記液体不活化ウイルス組成物が、約５％ｗ／ｖ～約２０％ｗ／ｖのスクロース、または約６％ｗ／ｖ～約１５％ｗ／ｖのスクロースを含む、請求項２０に記載の液体不活化ウイルス組成物。
22. 前記液体不活化ウイルス組成物が、約６％ｗ／ｖ～約８％ｗ／ｖのスクロース、例えば、約７％ｗ／ｖのスクロースを含む、請求項２１に記載の液体不活化ウイルス組成物。
23. 前記液体不活化ウイルス組成物が、約８．５ｍＭ～約５０ｍＭのＴｒｉｓと、約６％～約１５％ｗ／ｖのスクロースと、を含み、前記不活化ウイルス組成物のｐＨは、室温で測定したとき、ｐＨ約７．０～ｐＨ約８．０である、請求項２１に記載の液体不活化ウイルス組成物。
24. 前記ポリオールが、グリセロールである、請求項１３に記載の液体不活化ウイルス組成物。
25. 前記液体不活化ウイルス組成物が、約１％ｖ／ｖ～約６０％ｖ／ｖのグリセロール、または約７％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖのグリセロール、または約１０％ｖ／ｖのグリセロールを含む、請求項２４に記載の液体不活化ウイルス組成物。
26. 前記不活化ウイルス組成物が、約８．５ｍＭ～約５０ｍＭのＴｒｉｓと、約６％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖのグリセロールと、を含み、前記不活化ウイルス組成物のｐＨは、室温で測定したとき、ｐＨ約７．０～ｐＨ約８．０である、請求項２５に記載の液体不活化ウイルス組成物。
27. 前記液体不活化ウイルス組成物が、塩化ナトリウムを更に含む、先行請求項のいずれか１項に記載の液体不活化ウイルス組成物。
28. 前記液体不活化ウイルス組成物中の塩化ナトリウムの濃度が、約５ｍＭ～約５００ｍＭの塩化ナトリウム、または約１０ｍＭ～約２００ｍＭの塩化ナトリウムである、請求項２７に記載の液体不活化ウイルス組成物。
29. 前記液体不活化ウイルス組成物中の塩化ナトリウムの濃度が、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、または約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、例えば、約２０ｍＭである、請求項２８に記載の液体不活化ウイルス組成物。
30. 前記液体不活化ウイルス組成物のイオン強度が、約８０ｍＭ未満、または約７０ｍＭ未満、または約６０ｍＭ未満、または約５０ｍＭ未満、または約４０ｍＭ未満、または約３０ｍＭ未満である、先行請求項のいずれか１項に記載の液体不活化ウイルス組成物。
31. 前記ジカウイルスが、アフリカ系統ウイルスまたはアジア系統ウイルスである、先行請求項のいずれか１項に記載の液体不活化ウイルス組成物。
32. 前記ジカウイルスが、アジア系統ウイルスである、請求項３１に記載の液体不活化ウイルス組成物。
33. 前記ジカウイルスが、ＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する、請求項３２に記載の液体不活化ウイルス組成物。
34. ＰＲＶＡＢＣ５９株が、配列番号２に従うゲノム配列を含む、請求項３３に記載の液体不活化ウイルス組成物。
35. 前記ジカウイルスが、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置に変異を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の液体不活化ウイルス組成物。
36. 前記変異が、配列番号１におけるＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異である、請求項３５に記載の液体不活化ウイルス組成物。
37. 前記ジカウイルスが、エンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）に変異を含まない、先行請求項のいずれか１項に記載の液体不活化ウイルス組成物。
38. 前記エンベロープタンパク質をコードする配列が、配列番号２中の対応する配列と同じであるか、または前記エンベロープタンパク質の配列が、配列番号２中の配列と少なくとも９９％の同一性、または少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９０％の同一性、または少なくとも８５％の同一性を示す、先行請求項のいずれか１項に記載の液体不活化ウイルス組成物。
39. 前記ジカウイルスが、サイズ排除クロマトグラフィーにおける精製されたジカウイルスのメインピークが前記サイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下総面積の８５％を超えることによって決定される、少なくとも８５％の純度である、先行請求項のいずれか１項に記載の液体不活化ウイルス組成物。
40. 前記ジカウイルスが、化学的に不活化される、先行請求項のいずれか１項に記載の液体不活化ウイルス組成物。
41. 前記ジカウイルスが、界面活性剤、ホルムアルデヒド、過酸化水素、β－プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、メチレンブルー、及びソラレンのうちの１つ以上で不活化される、請求項４０に記載の液体不活化ウイルス組成物。
42. 前記ジカウイルスが、ホルムアルデヒドで不活化される、請求項４１に記載の液体不活化ウイルス組成物。
43. 前記ジカウイルスが、約０．００１％ｗ／ｖ～約３．０％ｗ／ｖの範囲の量のホルムアルデヒドにより、約１５℃～約３７℃の範囲の温度で、５～１５日間処理される方法から得ることができる不活化全粒子ウイルスである、請求項４２に記載の液体不活化ウイルス組成物。
44. 前記ジカウイルスが、全粒子生ジカウイルスを０．００５％～０．０２％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することによって得ることができる不活化全粒子ウイルスである、請求項４３に記載の液体不活化ウイルス組成物。
45. 前記ジカウイルスが、全粒子生ジカウイルスを０．０１５％ｗ／ｖ未満のホルムアルデヒドで処理することによって得ることができる不活化全粒子ウイルスである、請求項４４に記載の液体不活化ウイルス組成物。
46. ａ）先行請求項のいずれか１項に記載の不活化ウイルス組成物と、
    ｂ）水酸化アルミニウムなどのアジュバントと、
    を含む、液体ワクチン。
47. 前記液体ワクチン中の塩化ナトリウムの濃度が、約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、または約６０ｍＭ～約１５０ｍＭ、例えば、約８４ｍＭである、請求項４６に記載の液体ワクチン。
48. 前記液体ワクチンが、約８．５ｍＭ～約８０ｍＭのＴｒｉｓと、約６０ｍＭ～約１５０ｍＭのＮａＣｌと、を含み、前記液体不活化ウイルス組成物のｐＨは、室温で測定したとき、ｐＨ約７．０～ｐＨ約８．０である、請求項４７に記載の液体ワクチン。
49. 前記液体ワクチンが、約０．４％（ｗ／ｖ）～４．７％（ｗ／ｖ）のスクロースを含む、請求項４８に記載の液体ワクチン。
50. アルミニウム元素に基づいて、１００μｇ／ｍｌ～８００μｇ／ｍｌの水酸化アルミニウム、または２００μｇ／ｍｌ～６００μｇ／ｍｌの水酸化アルミニウム、または３００μｇ／ｍｌ～５００μｇ／ｍｌの水酸化アルミニウム、または約４００μｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムを含む、請求項４９に記載の液体ワクチン。
51. 請求項４６～５０のいずれか１項に記載の液体ワクチンの単位用量。
52. 約１μｇ～約１５μｇの前記不活化全粒子ジカウイルスを含む、請求項５１に記載のワクチンの単位用量。
53. 約２μｇの前記不活化全粒子ジカウイルスを含む、請求項５２に記載のワクチンの単位用量。
54. 約５μｇの前記不活化全粒子ジカウイルスを含む、請求項５２に記載のワクチンの単位用量。
55. 約１０μｇの前記不活化全粒子ジカウイルスを含む、請求項５２に記載のワクチンの単位用量。
56. 約０．４ｍＬ～約０．８ｍＬの薬学的に許容される液体として提供される、請求項５１～５５のいずれか１項に記載のワクチンの単位用量。
57. 不活化ウイルス組成物の使用であって、
    ａ）不活化全粒子ジカウイルスと、
    ａ）少なくとも約６．５ｍＭの濃度の少なくとも１つの薬学的に許容される緩衝液と、
    ｂ）任意選択により、ポリオールと、を含み、
    前記不活化ウイルス組成物は、アルミニウム塩から選択されるアジュバントを含有せず、前記少なくとも１つの薬学的に許容される緩衝液は、リン酸イオンを含まない、
    前記不活化全粒子ジカウイルスを安定化させるための、前記方法。
58. ５±３℃で少なくとも１０日間の保管中、前記不活化全粒子ジカウイルスを安定化させるための請求項５７に記載の使用。
59. －８０℃で少なくとも１０日間の保管中、前記不活化全粒子ジカウイルスを安定化させるための請求項５７に記載の使用。
60. －８０℃で少なくとも６ヶ月間の保管中、前記不活化全粒子ジカウイルスを安定化させるための請求項５９に記載の使用。
61. －８０℃で少なくとも１２ヶ月間の保管中、前記不活化全粒子ジカウイルスを安定化させるための請求項６０に記載の使用。
62. １回または複数回の凍結融解サイクル、例えば、少なくとも２回の凍結融解サイクル、または少なくとも４回の凍結融解サイクル中、前記不活化全粒子ジカウイルスを安定化させるための請求項５７～６１のいずれか１項に記載の使用。
63. ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記対象に、請求項５１～５６のいずれか１項に記載のワクチンの単位用量を投与することを含む、前記方法。
64. ジカウイルス感染症を治療または予防すること、特に予防することを、それを必要とするヒト対象において行うことにおいて使用するための請求項５１～５６のいずれか１項に記載のワクチンの単位用量。
65. ジカウイルス感染症を予防することを、それを必要とするヒト対象において行うための薬剤の製造における、請求項５１～５６のいずれか１項に記載のワクチンの単位用量の使用。
66. 液体不活化ウイルス組成物を調製する方法であって、
    ａ）不活化全粒子ジカウイルスと、
    ｂ）薬学的に許容される緩衝液であって、前記緩衝液は、リン酸緩衝液ではなく、前記緩衝液の濃度は、少なくとも６．５ｍＭである、前記緩衝液と、
    ｃ）任意選択により、ポリオールと、を含み、
    前記不活化ウイルス組成物は、好ましくはアルミニウム塩から選択されるアジュバントを含有せず、次のステップ：
    ステップ１．１つ以上の非ヒト細胞から得られた上清からジカウイルス調製物を単離すること、
    ステップ２．前記ジカウイルス調製物を精製すること、
    ステップ３．前記ウイルス調製物を不活化すること、
    ステップ４．前記ジカウイルス調製物を薬学的に許容される緩衝液に移して前記不活化ウイルス組成物を得ることを含む、
    前記方法。
67. 液体ワクチンを調製する方法であって、次のステップ：
    ステップ１．請求項１～４５のいずれか１項に記載の不活化ウイルス組成物を提供すること、
    ステップ２．前記不活化ウイルス組成物に、アジュバント、好ましくはアルミニウム塩と、任意選択により、更なる薬学的に許容される緩衝液を加えることを含む、前記方法。
68. ステップ２において、前記更なる薬学的に許容される緩衝液が、前記不活化ウイルス組成物中で最も濃度が高い前記緩衝液と同じ緩衝液を含む、請求項６７に記載の方法。
69. 請求項６６～６８のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる製品。
    

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