DE60017234T3 - Vakzinproduktion - Google Patents

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Alphonsus Gerardus Cornelius Maria Uytdehaag
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Description

  • BEREICH DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung bezieht sich auf die Entwicklung und Erzeugung von Impfstoffen. Im speziellen bezieht sich die Erfindung auf den Bereich der Herstellung von viralen Proteinen und/oder Viren, spezieller auf die Verwendung von Zellen, welche von einem menschlichen embryonalen Retinoblasten abgeleitet sind, für die Produktion von Viren, die in eukaryontischen, vorzugsweise Säugetier-, und im speziellen humanen Zellen wachsen. Die Erfindung ist besonders nützlich für die Herstellung von Impfstoffen, um den Schutz gegen virale Pathogene für Wirbeltiere, im speziellen Säugetiere und besonders Menschen, zu unterstützen. Somit bezieht sich die Erfindung auf die Ausführungsformen, die in den Ansprüchen gekennzeichnet sind.
  • Mittel und Verfahren zur Herstellung eines Virus und/oder viralen Proteins in einer (humanen) Zelle, vorzugsweise unter Verwendung eines definierten, synthetischen Mediums, und zur Aufreinigung des Virus und/oder der Bestandteile davon aus der Zelle und/oder dem Kulturmedium sind hierin offenbart. Pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend Virus oder seine Bestandteile, und Verfahren zur Herstellung und dessen Gewinnung und/oder Aufreinigung werden bereitgestellt.
  • HINTERGRUND
  • Impfung ist der wichtigste Weg, um mit viralen Infektionen fertig zu werden. Obwohl eine Anzahl von antiviralen Stoffen verfügbar ist, haben diese Stoffe typischer Weise limitierte Wirksamkeit. Verabreichung von Antikörpern gegen ein Virus kann ein guter Weg der Behandlung von viralen Infektionen sein, sobald ein Individuum infiziert ist (passive Immunisierung), und typischer Weise scheinen humane oder humanisierte Antikörper vielversprechend für die Behandlung einer Anzahl von viralen Infektionen zu sein, aber der wirksamste und sicherste Weg der Behandlung einer Virus-Infektion ist und wahrscheinlich wird bleiben Prophylaxe durch aktive Immunisierung. Aktive Immunisierung wird im Allgemeinen als Impfung bezeichnet, und Impfstoffe umfassen mindestens eine antigene Determinante von typischer Weise einem Virus, vorzugsweise eine Zahl von unterschiedlichen antigenen Determinanten von mindestens einem Virus oder anderem Pathogen, z. B. durch Einbringen von mindestens einem (viralen) Polypeptid oder Protein, das von einem Virus abstammt (Untereinheits-Impfstoffe), in den Impfstoff. Typischer Weise schließen die bis jetzt erwähnten Formen Adjuvantien ein, um eine Immunantwort zu verstärken. Dies ist auch möglich für Impfstoffe, basierend auf ganzem Virus (Pathogen), z. B. in einer inaktivierten Form. Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung von lebenden, aber attenuierten Formen des pathogenen Virus. Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung von Wildtyp-Virus, z. B. in Fällen, wo erwachsene Individuen durch die Infektion nicht in Gefahr sind, aber Kinder durch maternale Antikörper und dergleichen geschützt sind und sein können. Die Herstellung von Impfstoffen ist nicht immer ein einfaches Verfahren. In manchen Fällen findet die Herstellung von viralem Material in Eiern statt, was zu Schwierigkeiten in der Aufreinigung des Materials und beträchtlichen Sicherheitsmaßnahmen gegen Kontamination, etc. führt. Auch die Herstellung in Bakterien und/oder Hefen, was manchmal aber nicht immer eine Alternative für Eier ist, benötigt viele Aufreinigungs- und Sicherheitsschritte. Herstellung in Säugetier-Zellen würde eine Alternative sein, aber Säugetier-Zellen, die bis jetzt verwendet worden sind, benötigen alle zum Beispiel die Anwesenheit von Serum und/oder Anhaftung an einen festen Träger zum Wachstum. Im ersten Fall werden wieder Aufreinigung und Sicherheit und z. B. der Bedarf von Proteasen, um die Replikation von einigen Viren zu unterstützen, ein Problem. Im zweiten Fall werden hohe Erträge und Einfachheit der Herstellung ein weiteres Problem. Die vorliegende Erfindung überwindet zumindest eine Reihe der Probleme, die mit den Herstellungssystemen zur Herstellung von Viren und/oder viralen Proteinen zu Impfstoff-Zwecken der Systeme des Stands der Technik einhergehen.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Die vorliegende Erfindung offenbart eine neue immortalisierte humane Zelllinie zum Zweck der Vermehrung und Ernte von Virus für die Herstellung des Virus. PER.C6-Zellen ( WO 97/00326 ) wurden durch Transfektion von primären humanen embryonischen Retina-Zellen unter Verwendung eines Plasmids erzeugt, das die Ad-Serotyp-5 (Ad5)-E1A- und -E1B-codierenden Sequenzen (Ad5-Nucleotide 459-3510) unter der Kontrolle des humanen Phosphoglycerat-Kinase (PGK)-Promotors enthielt.
  • Die folgenden Merkmale machen PER.C6 oder ein Derivat besonders nützlich als einen Wirt zur Virus-Produktion: es ist eine vollständig charakterisierte, humane Zelllinie, sie wurde in Einhaltung der GLP entwickelt, sie kann als Suspensions-Kulturen in definiertem Serum-freien Medium ohne jegliche menschliche oder tierische Serumproteine gezüchtet werden; ihr Wachstum ist kompatibel mit Roller-Flaschen, Schüttet-Flaschen, Dreh-Flaschen und Bioreaktoren, mit Verdopplungszeiten von etwa 35 h.
  • Influenza-Epidemiologie
  • Influenzaviren, Mitglieder der Familie der Orthomyxoviridae, sind die Verursacher von jährlichen Epidemien einer akuten, respiratorischen Erkrankung. In den Vereinigten Staaten alleine bekommen 50 Millionen Amerikaner jedes Jahr die Grippe. Geschätzte Todesfälle weltweit (1972–1992) sind 60 000 (CDC-Statistik). Es gab 3 wesentliche Fälle von pandemischen Ausbrüchen von Influenza, nämlich 1918 (Spanische Grippe, geschätzte 40 Millionen Todesfälle), 1957 (Asiatische Grippe, geschätzte 1 Million Todesfälle) und 1968 (Hong-Kong-Grippe, geschätzte 70000 Todesfälle). Infektionen mit Influenzaviren sind mit einem breiten Spektrum an Erkrankungen und Komplikationen assoziiert, die in beträchtlicher weltweiter Morbidität und Mortalität resultieren, besonders bei älteren Leuten und Patienten mit chronischen Erkrankungen. Impfung gegen Influenza ist am effektivsten für die Vermeidung der oft fatalen Komplikationen, die mit dieser Infektion assoziiert sind (Murphy, B. R. und R. G. Webster 1996). Die Produktion von Influenzavirus auf der diploiden, humanen Zeltlinie MRC-5 wurde berichtet (Herrero-Euribe L et al 1983). Die Titer von Influenzavirus sind jedoch verhindernd niedrig.
  • Stämme von Influenzavirus
  • Heutige Grippe-Impfstoffe enthalten aufgereinigtes Hämagglutinin und Neuraminidase von Influenzavirus-A und -B. Die 3 Viren, die epidemiologisch wichtige Stämme darstellen, sind Influenza-A (H1N1), Influenza-A (H3N2) und Influenza-B. Die Unterteilung in A- und B-Typen basiert auf antigenen Unterschieden zwischen deren Nucleoprotein (NP)- und Matrix (M)-Proteinantigen. Das Influenza-A-Virus wird weiter unterteilt in Untertypen, basierend auf der antigenen Zusammensetzung (Sequenz) von Hämagglutinin (H1–H15)- und Neuraminidase (N1–N9)-Molekülen. Vertreter jeder dieser Unterarten sind von Wasservögeln isoliert worden, die wahrscheinlich das ursprüngliche Reservoir von allen Influenzaviren für Vogel- und Säugetierarten sind. Übertragung wurde zwischen Schweinen und Menschen und vor kurzem (H5N1) zwischen Vögeln und Menschen gezeigt.
  • Influenza-Impfstoffe
  • Drei Arten von inaktiviertem Influenza-Impfstoff werden derzeit auf der Welt verwendet: ganzes Virus, Spaltungsprodukt und Oberflächenantigen- oder Untereinheits-Impfstoffe. All diese Impfstoffe enthalten Oberflächenglycoproteine, Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) der Influenzavirus-Stämme, von denen erwartet wird, dass sie in der menschlichen Bevölkerung in der kommenden Saison zirkulieren. Diese Stämme, die in den Impfstoff inkorporiert sind, werden in embryonierten Hühnereiern gezüchtet, und die viralen Partikel werden in der Folge vor weiterer Bearbeitung aufgereinigt. Der Bedarf für die jährliche Anpassung von Influenza-Impfstoffen besteht auf Grund von Antigenvariation, verursacht durch Vorgänge, die bekannt sind als ,antigene Abweichung' und ,antigene Verlagerung'.
  • ,Antigene Abweichung' erfolgt durch die Akkumulierung einer Serie von Punktmutationen in entweder dem H- oder N-Protein eines Virus, resultierend in Aminosäure-Substitutionen. Diese Substitutionen verhindern die Bindung von neutralisierenden Antikörpern, induziert durch vorherige Infektion, und die neue Variante kann den Wirt infizieren.
  • ,Antigene Verlagerung' ist das Auftreten eines neuen Untertyps durch genetische Umsortierung zwischen tierischen und humanen Influenza-A-Viren. Die pandemischen Stämme von 1957 (H2N2) und 1968 (H3N2) sind Beispiele von umsortierten Viren, durch die Vogel-H- und oder -N-Gene in zirkulierende humane Viren eingebracht wurden, die sich in der Folge unter der menschlichen Bevölkerung ausbreiten konnten.
  • Basierend auf den epidemiologischen Umfragen durch über hundert nationale Influenza-Zentren weltweit empfiehlt die Weltgesundheitsorganisation (WHO) jährlich die Zusammensetzung des Influenza-Impfstoffes, gewöhnlich im Februar für die nördliche Hemisphäre und im September für die südliche Hemisphäre. Diese Praxis limitiert die Zeitspanne zur Produktion und Standardisierung des Impfstoffes auf ein Maximum von 9 Monaten. Im Fall eines dringenden Bedarfs von vielen Dosen von Impfstoff, zum Beispiel wenn ein neuer Untertyp von Influenza-A-Virus durch antigene Abweichung und antigene Verlagerung auftritt, kann limitierte Verfügbarkeit von Eiern die schnelle Produktion von Impfstoff behindern. Weitere Nachteile dieses Produktionssystems sind das Fehlen von Flexibilität, das Risiko der Anwesenheit von Toxinen und die Risiken von Nebenviren, im speziellen Retroviren, und Bedenken über Sterilität. Dies stellt ein ernstes Problem in der heutigen Praxis der Influenza-Impfstoff-Produktion in embryonisierten Hühnereiern dar.
  • Daher würde die Verwendung eines Zellkultursystems zur Influenza-Impfstoff-Herstellung eine attraktive Alternative darstellen. Influenzaviren können auf einer Anzahl von primären Zellen gezüchtet werden, einschließlich Affenniere, Kälberniere, Hamsterniere und Hühnerniere. Dennoch ist deren Verwendung zur Impfstoff-Herstellung nicht praktikabel, auf Grund der Erfordernis, Kulturen von diesen primären Zellen für jede Präparation eines Impfstoffes zu re-etablieren. Daher ist die Verwendung von kontinuierlich immortalisierten Zelllinien zur Influenza-Impfstoff-Produktion eine attraktive Alternative.
  • Die Verwendung von Kultursystemen wurde durch die Erkenntnis ermöglicht, dass die proteolytische Spaltung von HA in seine zwei Untereinheiten (HA1 und HA2) nötig ist für die Influenzavirus-Infektiosität, und durch die Zugabe von Trypsin erreicht werden kann. Einbeziehen von Trypsin erlaubt Replikation und Plaque-Bildung in Madin-Darby-Hundenieren (MDCK)-Zellen (Tobita et al 1975).
  • Für die MDCK-Zelllinie wurde kürzlich gezeigt, dass sie das Wachstum von Influenzavirus für Impfstoff-Produktion unterstützt (Brand et al 1996 und 1997, Palache et al 1997). Die Verwendung von Trypsin erfordert Wachstum der MDCK-Zellen in Serum-freiem Gewebekultur-Medium (MDCK-SF1). MDCK-Zellen sind jedoch derzeit nicht als ein Substrat zur Herstellung von Influenzavirus genehmigt.
  • Wichtig ist, dass jedes nicht-menschliche System zur Herstellung von Influenza-Impfstoffen einen inhärenten Nachteil hat, bekannt als ,Adaptierung'. Sowohl humanes Influenza-A- als auch -B-Virus tragen Mutationen in dem HA auf Grund von Adaptierung in embryonisierten Hühnereiern. Diese Mutationen resultieren in veränderter Antigenität (Newman et al 1993, Williams und Robertson 1993, Robertson et al 1994, Gubareva et al 1994, Schild et al 1993, Robertson et al 1987, Kodihalli et al 1995). Bei Menschen induziert Immunisierung mit Impfstoffen, die HA enthalten und eine Ei-Adaptierungs-Mutation enthalten, weniger neutralisierenden Antikörper als Virus, das ein nicht-Ei-adaptiertes HA enthält (Newman et al 1993).
  • Humane Influenzaviren, die in Hundezellen wie MDCK-Zellen vermehrt wurden, zeigen auch Adaptierung, wenn auch in einem geringeren Ausmaß. Solche Viren ähneln den originalen, menschlichen Isolierungen genauer als Ei-abgeleitete Viren (Robertson et al 1990).
  • Darüber hinaus gibt es Anzeichen, dass Wirts-spezifische Änderungen in NA und Wirts-spezifische Phosphorylierungsmuster von NA die Replikation von Influenzaviren beeinflussen können (Schulman und Palese 1977; Sugiara und Ueda 1980; Kistner et al 1976).
  • Daher würde es deutlich vorteilhaft sein, Adaptierung oder andere Wirts-induzierte Änderungen von Influenzavirus zu vermeiden. Es kann in einer homogeneren Population von Viren resultieren und den endgültigen Impfstoff effektiver machen.
  • Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, humane Zellen als ein Substrat zur Herstellung von hohen Titern von Influenzavirus, das geeignet ist für die Entwicklung von Impfstoffen, zu liefern.
  • Rotavirus und Rota-Impfstoffe
  • Rotaviren sind die wichtigste Ursache von schwerer dehydrierender Gastroenteritis in jungen Kindern weltweit. In Entwicklungsländern führen Infektionen mit Rotaviren zu über 800 000 Todesfällen jährlich. In den Vereinigten Staaten überschreiten die geschätzten Kosten im Gesundheitswesen auf Grund von Rotavirus-Infektionen 1 Milliarde US-Dollar pro Jahr.
  • Rotaviren, Mitglieder der Familie der Reoviridae, sind doppelsträngige RNA-Viren, bestehend aus 11 RNA-Segmenten, jedes codierend für ein strukturelles oder nicht-strukturelles virales Protein (VP). Dieser innere Kern des Virus umfasst vier VP's: VP1, 2, 3 und 6. Das VP bestimmt die drei antigenen Haupteigenschaften von HRV-Gruppe, -Untergruppe und -Serotyp. Sieben antigenetisch eindeutige Gruppen (A–G) wurden identifiziert, die durch das VP6 codiert werden. Infektion mit humanem Rotavirus (HRV) wird vorwiegend durch Gruppe A-Rotaviren verursacht, wobei Serotypen 1–4 95% der klinischen Erkrankungen verursachen. Natürlicher Erkrankungsschutz ist Serotyp-spezifisch. Gruppe A wird weiter in Subgruppe I und II klassifiziert.
  • Die Doppelschicht-Außenhülle, die das virale Capsid bildet, besteht aus zwei viralen Proteinen, VP4 und VP7, die die Neutralisations-Antigene sind, involviert in protektive Immunität, und die den Serotyp bestimmen, obwohl das VP4 eine geringe Rolle in der Serotyp-Bestimmung spielt. Während Co-Infektion mit unterschiedlichen Serotypen unterliegen die segmentierten Genome leicht genetischer Umsortierung, eine Eigenschaft, die verwendet wurde, um einen Impfstoff zu entwickeln (Marsha et al 1999).
  • Nimmt man die weltweite Prävalenz von Rotavirus-assoziierter Kinder-Morbidität und -Mortalität, wird Impfung in großem Umfang gegen Rotavirus als der effektivste Weg, dieses Virus zu bekämpfen, angesehen. Das Ziel der Impfung würde nicht sein, die Krankheit zu verhindern, sondern ihre Schwere und Komplikation zu reduzieren, besonders während den ersten paar Jahren des Lebens.
  • Der derzeit einzige effektive, verfügbare Impfstoff ist ein attenuierter, oral verabreichter Lebendimpfstoff, basierend auf der Umsortierung von RNA-Segmenten von humanen Rotaviren, codierend VP7's der Serotypen 1, 2 und 4 in einem Rhesus-Rotavirus, das den attenuierten Hintergrund zusammen mit dem VP7 von Serotyp 3 bereitstellt. Impfung mit diesem humanen Rhesus-umsortierten, tetravalenten Impfstoff (RRV-TV), obwohl hoch-effektiv in der Verhinderung von schwerer Gastroenteritis, ist assoziiert mit Intussuception, einer Darmverschluss-Erkrankung. Aus diesem Grund ist dieser Impfstoff nicht länger in Verwendung.
  • BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung eines Virus und/oder von viralen Proteinen, die von Adenovirus oder adenoviralen Proteinen verschieden sind, zur Verwendung als ein Impfstoff, umfassend das Einbringen von mindestens einer Sequenz, codierend mindestens ein Genprodukt des E1-Gens oder ein funktionelles Derivat davon eines Adenovirus in eine Zelle, das Einbringen einer Nucleinsäure, die das Virus codiert, in die Zelle, Kultivieren der Zelle in einem geeigneten Medium und Ermöglichen der Vermehrung des Virus und Ernten des Virus und/oder der viralen Proteine aus dem Medium und/oder der Zelle, wobei die Zelle von einem menschlichen embryonalen Retinoblasten abgeleitet ist.
  • Bis zur vorliegenden Erfindung gibt es wenige, wenn überhaupt (humane) Zellen, die als geeignet befunden wurden, um Viren und/oder virale Proteine zur Verwendung als Impfstoffe in jeglicher reproduzierbaren und skalierbaren Weise und/oder ausreichend hohen Erträgen und/oder leicht aufreinigbar herzustellen. Wir haben jetzt gefunden, dass Zellen, die von einem menschlichen embryonalen Retinoblasten abgeleitet sind, die adenovirale E1-Sequenzen vorzugsweise in ihrem Genom umfassen, fähig sind zur anhaltenden Vermehrung von Viren in signifikanten Mengen.
  • Die Zelle gemäß der Erfindung ist abgeleitet von einer humanen primären Zelle, vorzugsweise einer Zelle, die durch ein Genprodukt von dem E1-Gen immortalisiert wurde. Um fähig zu sein, eine primäre Zelle zu züchten, muss sie natürlich immortalisiert werden. Die Zelle ist eine, die von einem humanen embryonischen Retinoblasten abgeleitet ist.
  • In Zellen gemäß der Erfindung ist es wichtig, dass die E1-Gensequenzen während des Zellzyklus nicht verloren gehen. Daher ist es bevorzugt, dass die Sequenz, codierend mindestens ein Genprodukt des E1-Gens, im Genom der (humanen) Zelle vorhanden ist. Aus Gründen von Sicherheit wird am besten darauf geachtet, dass unnötige adenovirale Sequenzen in den Zellen gemäß der Erfindung vermieden werden. Es ist daher eine andere Ausführungsform der Erfindung, Zellen bereit zu stellen, die keine adenoviralen Strukturproteine herstellen. Um (kontinuierliche) Virusproduktion in großen Rahmen durch Zellkultur zu erzielen, ist es dennoch bevorzugt, Zellen zu haben, die fähig sind zu wachsen, ohne Verankerung zu benötigen. Die Zellen der vorliegenden Erfindung haben diese Fähigkeit. Um ein sauberes und sicheres Produktionssystem zu haben, von dem es leicht ist, das Virus zu gewinnen und gegebenenfalls aufzureinigen, ist es bevorzugt, ein Verfahren gemäß der Erfindung zu haben, worin die humane Zelle keine anderen adenoviralen Sequenzen umfasst. Die am meisten bevorzugte Zelle für die Verfahren und Verwendungen der Erfindung ist PER.C6, wie hinterlegt unter ECACC-Nummer 96022940, oder ein Derivat davon.
  • Daher liefert die Erfindung ein Verfahren unter Verwendung einer Zelle gemäß der Erfindung, worin die Zelle darüber hinaus eine Sequenz umfasst, die E2A oder ein funktionelles Derivat oder Analogon oder Fragment davon codiert, vorzugsweise eine Zelle, worin die Sequenz, codierend E2A oder ein funktionelles Derivat oder Analogon oder Fragment davon, im Genom der humanen Zelle vorhanden ist, und am meisten bevorzugt eine Zelle, worin die E2A-codierende Sequenz ein temperaturempfindliches mutantes E2A codiert.
  • Darüber hinaus, wie erwähnt, liefert die Erfindung auch ein Verfahren gemäß der Erfindung, worin die (humane) Zelle in Suspension wachsen kann.
  • Die Erfindung liefert auch ein Verfahren, in dem die humane Zelle in Abwesenheit von Serum kultiviert werden kann. Die Zellen gemäß der Erfindung, im besonderen PER.C6 haben den zusätzlichen Vorteil, dass sie in der Abwesenheit von Serum oder Serumkomponenten kultiviert werden können. Daher ist die Isolierung einfach, Sicherheit ist verstärkt und die Zuverlässigkeit des Systems ist gut (synthetische Medien sind am besten im Bezug auf Reproduzierbarkeit). Die humanen Zellen der Erfindung sind fähig zu normalen post- und peritranslationalen Modifikationen und Zusammenbau. Das bedeutet, dass sie sehr geeignet sind zur Herstellung von viralen Proteinen und Viren zur Verwendung in Impfstoffen.
  • Daher liefert die Erfindung ein Verfahren gemäß der Erfindung, in dem das Virus und/oder die viralen Proteine ein Protein umfassen, das posttranslationalen und/oder peritranslationalen Modifikationen unterliegt, besonders in dem die Modifikationen Glycosylierung umfassen. Ein gutes Beispiel für einen viralen Impfstoff, der mühsam in einer zuverlässigen Weise zu produzieren war, ist Influenza-Impfstoff. Die Erfindung liefert ein Verfahren, in dem die viralen Proteine zumindest eine der Influenzavirus-Neuraminidase und/oder ein Hämagglutinin umfassen. Andere virale Proteine (Untereinheiten) und Viren (Wildtyp oder solche, die inaktiviert werden sollen) oder attenuierte Viren, die in den Verfahren gemäß der Erfindung hergestellt werden können, umfassen ein Enterovirus, wie Rhinovirus, Aphtovirus oder Poliomyelitisvirus, Herpesvirus, wie Herpes-simplex-Virus, Pseudorabiesvirus oder Rinderherpesvirus, Orthomyxovirus, wie Influenzavirus, ein Paramyxovirus, wie Newcastle-Virus, Respiratory-Syncytial-Virus, Mumpsvirus oder ein Masernvirus, Retrovirus, wie humanes Immunschwächevirus oder ein Parvovirus oder ein Papovavirus, Rotavirus oder ein Coronavirus, wie übertragbares Gastroenteritisvirus oder ein Flavivirus, wie Zeckenencephalitisvirus oder Gelbfiebervirus, ein Togavirus, wie Rubellavirus oder östliches, Westliches oder Venezuelanisches Pferde-Encephalomyelitisvirus, ein Hepatitisverursachendes Virus, wie Hepatitis-A- oder Hepatitis-B-Virus, ein Pestivirus, wie Schweinepestvirus oder ein Rhabdovirus, wie Rabiesvirus, ein Bunyaviridae-Virus, wie Hantavirus.
  • In einer Ausführungsform ist eine Zelle der Erfindung nützlich in der Erzeugung eines Influenzavirus-Stammes, der nicht sehr effizient auf embryonalen Eiern wächst.
  • Die Erfindung liefert auch die Verwendung einer humanen Zelle, die eine Sequenz, die mindestens ein E1-Protein eines Adenovirus oder ein funktionelles Derivat, Homolog oder Fragment davon codiert, in seinem Genom aufweist, wobei die Zelle keine strukturellen adenoviralen Proteine für die Produktion eines nicht-adenoviralen Virus zur Verwendung in einem Impfstoff erzeugt, wobei die menschliche Zelle von einem menschlichen embryonalen Retinoblasten abgeleitet ist. Natürlich sind für solch eine Verwendung die Zellen, die in den Verfahren gemäß der Erfindung bevorzugt sind, auch bevorzugt. Die Erfindung liefert auch die Produkte, die aus den Verfahren und Verwendungen gemäß der Erfindung resultieren, besonders virale Proteine und Viren, erhältlich gemäß jenen Verwendungen und/oder Verfahren, besonders wenn sie in ein Arzneimittel, umfassend geeignete Exzipienten, und in machen Formen (inaktivierte Viren, Untereinheiten) Adjuvantien, überführt werden. Dosierung und Wege der Verabreichung können durch normale klinische Untersuchung, so weit sie noch nicht durch die bereits registrierten Impfstoffe erhältlich sind, herausgefunden werden.
  • Daher liefert die Erfindung auch ein Virus oder ein virales Protein zur Verwendung in einem Impfstoff, der erhältlich ist durch ein Verfahren oder eine Verwendung gemäß der Erfindung, wobei das Virus oder virale Protein frei ist von jeglichem nicht-humanen proteinösen Säugetier-Material, und ein Arzneimittel, umfassend solch ein Virus und/oder virales Protein.
  • Darüber hinaus liefert die Erfindung eine humane Zelle, die eine Sequenz, codierend mindestens ein E1-Protein eines Adenovirus oder ein funktionelles Derivat, Homolog oder Fragment davon, in ihrem Genom aufweist, wobei die Zelle keine strukturellen adenoviralen Proteine produziert, und eine Nucleinsäure aufweist, die ein nicht-adenovirales Virus codiert. Diese Zelle ist von einem menschlichen embryonalen Retinoblasten abgeleitet und kann in einem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung liefert Influenzavirus, erhältlich durch ein Verfahren gemäß der Erfindung oder durch eine Verwendung gemäß der Erfindung. Eine andere Ausführungsform der Erfindung liefert Influenza-Impfstoffe, erhältlich durch ein Verfahren gemäß der Erfindung oder durch eine Verwendung gemäß der Erfindung.
  • Influenzavirus-Präparate, die von embryonalen Eiern geerntet werden, müssen typischerweise für die Herstellung eines Impfstoffes aufgereinigt werden. Aufreinigung bedingt typischerweise mindestens einen Konzentrationsschritt des Virus. Derzeitige Methoden zur Konzentration von Influenzavirus aus solchen relativ rohen Präparaten von Influenzavirus sind mühsam.
  • Ein Derivat eines infektiösen Influenzavirus der Erfindung ist typischerweise ein Virus, Viruspartikel oder virales Protein oder ein Teil davon, welches zur Immunisierungs-Zwecken verwendet werden kann. Typischerweise bedingt dies einen Virus-Infektiositäts-Inaktivierungs-Schritt.
  • BEISPIELE
  • Um die Erfindung zu veranschaulichen, werden die folgenden Beispiele geliefert, die den Rahmen der Erfindung nicht limitieren sollen.
  • Beispiel 1
  • MATERIAL UND METHODEN
  • PER.C6- und MDCK-Zellkultur
  • Madin Darby Hundenieren (MDCK)-Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM, Life Technologies Breda, Niederlande), enthaltend 10% Hitze-inaktiviertes fetales Rinderserum und 1 × L-Glutamin (Gibco-BRL), bei 37°C und 10% CO2 kultiviert. Suspensionskulturen von PER.C6 wurden in ExCell 525 (JHR Biosciences), angereichert mit 1 × L-Glutamin, bei 37°C und 10% CO2 in stationären Kulturen in Platten mit 6 Vertiefungen (Greiner) oder in 490 cm2-Gewebekultur-Rollerflaschen (Cornig Costar Corporation) während kontinuierlicher Rotation bei 1 Upm kultiviert.
  • Immunfluoreszenz-Test
  • Direkte Immunfluoreszenz-Assays für den Nachweis von Influenzavirus-Infektion wurden unter Verwendung des IMAGENTM-Influenzavirus-A- und -B-Kits (Dako) gemäß dem Standardprotokoll des Anbieters ausgeführt. Proben wurden mikroskopisch unter Verwendung von Epifluoreszenz-Beleuchtung betrachtet. Infizierte Zellen waren durch eine helle, apfelgrüne Fluoreszenz charakterisiert.
  • Propidiumiodid-Färbung
  • Zell-Pellets wurden in 300 μl kaltem PBS/0,5% BSA + 5 μl Propidiumiodid (Konzentration: 50 μg/ml) in PBS/FCS/Azid-Lösung, die Fachleuten bekannt ist, resuspendiert. Lebensfähige und tote Zellen wurden dann durch Durchfluss-cytofluorometrische Analyse nachgewiesen.
  • Hämagglutinations-Assay
  • Im Allgemeinen wurden Hämagglutinations-Assays für Influenzavirus-Titer gemäß den Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, durchgeführt. Hier wurden 50 μl einer zweifach verdünnten Viruslösung in PBS zu 25 μl PBS und 25 μl einer 1%igen Suspension von Puten-Erythrozyten (Biotrading Benelux B. V.) in PBS hinzugefügt und in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen bei 4°C für 1 h inkubiert. Das Hämagglutinations-Muster wurde untersucht und bewertet und als Hämagglutinations-Einheiten (HAU's) ausgedrückt. Die Anzahl von HAU's entsprach dem reziproken Wert der höchsten Virusverdünnung, die komplette Hämagglutination zeigte.
  • Western Blot-Analyse des Influenza-HA-Proteins
  • Im Allgemeinen wurden die erhaltenen Influenzaviren in einem Laemmli-Puffer gemäß Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, gespalten, und unterschiedliche Volumen von erhaltenen Proteingemischen wurden unter Verwendung von 10%igen SDS/PAGE-Gelen aufgetrennt. Kurz, die Blots wurden für 30 min bei Raumtemperatur mit Blockierlösung (5% Magermilchpulver (Biorad) in TEST, angereichert mit 1% Kaninchenserum (Rockland)) geblockt, gefolgt von 3 Waschschritten mit TEST. Dann wurden die Blots mit dem Anti-A/Sydney/5/97-HA-Antiserum (98/768 NIBSC, verdünnt 1/500 in 1% BSA/TBST mit 5% Kaninchenserum (Rockland) über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Blots wurden wieder 8 mal mit TEST gewaschen. Schließlich wurden die Blots mit dem Kaninchen-Anti-Schaf-Antiserum (HRP-markiert, Rockland), 1/6000 in Blockierlösung verdünnt, für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 8 Waschschritten mit TEST wurde der Protein-Konjugat-Komplex mit ECL (Amersham Pharmacia Biotech) visualisiert, und Filme (Hyperfilm, Amersham Life Science) wurden belichtet. Die Antiseren wurden von der NIBSC (UK) erhalten, und in den Verdünnungen, die von der NIBSC empfohlen werden, angewendet.
  • Einfach-radialer Immundiffusions (SRID)-Assay
  • Die Konzentration von Hämagglutinin in Überständen, abgeleitet von Influenzavirus-infizierten PER.C6-Zellen, wurde durch den einfach-radialen Immundiffusions (SRID)-Test nachgewiesen, wie früher beschrieben (Wood et al 1977). Der Assay wurde unter Verwendung von Standard-NIBSC (UK)-Antigen- und Antiseren-Reagenzien durchgeführt.
  • Plaque-Assay
  • Ein Gesamtvolumen von 1 ml von 10-fach Serien-verdünnten viralen Überständen wurde auf MDCK-Zellen überimpft, die bis 95% Konfluenz in Platten mit 6 Vertiefungen gezüchtet wurden. Nach 1 h bei 35°C wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und mit 3 ml eines Agarose-Gemisches (1,2 ml 2,5%ige Agarose, 1,5 ml 2 × MEM, 30 μl 200 mM L-Glutamin, 24 μl Trypsin-EDTA, 250 μl PBS) überschichtet. Die Zellen wurden dann in einer feuchten, 10%igen CO2-Atmosphäre bei 35°C für ungefähr 3 Tage inkubiert und virale Plaques wurden visuell beurteilt.
  • Virus-Infektiositäts-Assay (TCID50)
  • Titration von infektiösem Virus wurde auf MDCK-Zellen durchgeführt. Kurz, Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen in einer Dichte von 4 × 104 Zellen/Vertiefung in DMEM, angereichert mit 2 mM L-Glutamin, ausgesät. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Zellen mit 100 μl von zehnfach Serien-verdünnten Kulturüberstanden in vierfacher Ausführung in Medium, enthaltend Trypsin-EDTA in der Konzentration von 4 μl/ml, infiziert. Zwei Stunden nach der Infektion wurden Zell-Monolager zweimal mit PBS gewaschen und in Medium, enthaltend Trypsin, für 7 Tage bei 35°C inkubiert. Überstände von diesen Kulturen wurden dann in einem HA-Assay getestet. TCID50-Titer wurden gemäß dem Verfahren von Karber (1931) berechnet.
  • β-Propiolacton-Influenzavirus-Inaktivierung
  • Zur Inaktivierung der Viren, umgesamt-inaktiviertes Virus für die Herstellung von Impfstoffen zu erhalten, die von PER.C6 abgeleitet sind, wurde ein Mutations-Protokoll, das Fachleuten bekannt ist, unter Verwendung von β-Propiolacton durchgeführt. β-Propiolacton ist ein sehr effektiver Stoff, der weithin für die Inaktivierung von Viren verwendet wird und auf dem Fachgebiet auf Grund seiner mutierenden Effekte wohlbekannt ist. Es modifiziert Nucleinsäure-Basen des viralen Genoms und des Wirtszell-Genoms und blockiert danach Replikation. Einem etablierten Protokoll folgend, das verwendet wird, um den gesamt-inaktivierten Influenza-Impfstoff, der auf embryonierten Eiern hergestellt wurde, herzustellen, wurde die Menge an Virus, entsprechend ungefähr 400 μg an HA pro Stamm, inaktiviert und für das endgültige Impfstoff-Präparat verwendet. Kurz, ein Volumen von 0,3 M Natriumphosphat-Puffer wurde zu 9 Volumen einer Influenzavirus-Präparation hinzugefügt. Inaktivierung der Viren wurde durch Zugabe eines Volumens von 10%igem β-Propiolacton (Newall Design, UK) zu 100 Volumen einer Phosphatgepufferten Virus-Präparation durchgeführt und bei 20°C für 24 h inkubiert. Inaktivierung der Viren wurde durch Plaque-Assay überprüft, und für keine der inaktivierten Chargen wurden Plaques nachgewiesen (Daten nicht gezeigt).
  • Beispiel 2A
  • PER.C6-Zeltbanken und -Vorkultur
  • Zelllinie PER.C6 (hinterlegt unter Nr. 96022940 bei der European Collection of Animal Cell Cultures am Centre for Applied Microbiology and Research) oder Derivate davon wurden verwendet (beschrieben in WO 97/00326 ). Zelllinien wurden in einem Zwei-Gruppen Zellbank-System hinterlegt. Die selektierte Zelllinie wurde in einer Forschungs-Stammzellbank (rMCB) hinterlegt, die an unterschiedlichen Stellen gelagert wurde. Aus dieser rMCB wurden Arbeits-Zellbanken (rWCB) wie folgt hergestellt: eine Ampulle der rMCB wurde aufgetaut, und Zellen wurden vermehrt, bis genug Zellen vorhanden sind, um die Zellen unter Verwendung von Trockeneis einzufrieren. Bis zu 500 Ampullen, enthaltend 1 ml (1–2 × 106 Zellen/ml) von rWCB wurden in der Gasphase eines Flüssig-N2-Gefrierschranks gelagert. Eine Ampulle, enthaltend 5 × 106 PER.C6-Zellen der WCB, wurde in einem Wasserbad bei 37°C aufgetaut. Zellen wurden schnell in ein 50 ml-Röhrchen transferiert und durch Zugabe von 9 ml des Suspensionsmediums ExCell 525 (JRH Biosciences), angereichert mit 1 × L-Glutamin, resuspendiert. Nach 3 min Zentrifugation bei 1000 Upm in einer Tischzentrifuge wurden Zellen in einer endgültigen Konzentration von 3 × 105 Zellen/ml resuspendiert und in einer T80-Gewebekultur-Flasche bei 37°C, 10% CO2 kultiviert. Zwei bis drei Tage später wurden die Zellen in 490 cm2 Gewebekultur-Rollerflaschen (Cornig Costar Corporation) in einer Dichte von 3 × 105 pro ml ausgesät und unter kontinuierlicher Rotation bei 1 Upm kultiviert.
  • Beispiel 2B
  • PER.C6-Zellen als tolerante Zelllinie für Influenza-A-Virus
  • PER.C6 als eine humane Zelle war nicht bekannt für ihre Fähigkeit, Influenzavirus-Infektion und -Replikation zu stützen. Es wurde daher nachgeprüft, ob PER.C6-Zellen tolerant sind für Influenzavirus- Infektion im Vergleich mit der Hunde-Zelllinie Madin Darby Canine Kidney (MDCK), die als eine Positivkontrolle diente.
  • Am Tag vor der Infektion wurden 2 × 105 MDCK-Zellen pro Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen ausgesät. Vierundzwanzig Stunden später wurden 4 × 105 ausgesäte PER.C6- und MDCK-Zellen pro Vertiefung mit dem H1N1-Stamm A/Puerto Rico/8/34 (Titer 3,6 × 107 pfu/ml) (erhalten von Dr. E. Claas, Leiden University Medical Center, Niederlande) infiziert. Infektion wurde in unterschiedlichen Vielzahlen der Infektion (moi's) im Bereich von 0,1 bis 10 pfu/Zelle durchgeführt. Nach etwa 2 Stunden Inkubation bei 37°C wurde das Inoculum entfernt und durch frisches Kulturmedium ersetzt. Ein direkter Immunfluoreszenz-Assay zum Nachweis einer Influenzavirus-Infektion wurde 24 und 48 h nach der Infektion durchgeführt. Das Experiment zeigte Toleranz von PER.C6 für Influenza-Infektion, mit Prozentsätzen von positiven Zellen, moi-abhängig und vergleichbar mit MDCK (1).
  • Beispiel 3
  • PER.C6, verwendet für Influenza-A-Virus-Vermehrung
  • Es wurde überprüft, ob Replikation und Vermehrung von Influenzavirus durch PER.C6 unterstützt werden konnte. Am Tag der Infektion wurden PER.C6-Zellen in 490 cm2 Gewebekultur-Rollerflaschen in der Dichte von 2 × 105 Zellen/ml in einem endgültigen Volumen von 40 ml in der Anwesenheit von 5 μg/ml Trypsin/EDTA (Gibco-BRL) ausgesät. Zellen wurden entweder pseudo-beimpft oder mit dem H3N2-Stamm A/Shenzhen/227/95 (Titer 1,5 × 106 pfu/ml) (erhalten von Dr. E. Claas, Leiden University Medical Center, Niederlande) infiziert. Infektionen wurden bei moi 10–4 und 10–3 pfu/Zelle durchgeführt. Nach 1 h Inkubation bei 37°C wurde das Inoculum durch Abzentrifugieren der Zellen bei 1500 Upm und Resuspendieren der Zellen in frischem Kulturmedium +5 μg/ml Trypsin-EDTA entfernt. Ernten von 1,3 ml einer Zellsuspension wurde jeden Tag durchgeführt, von Tag 1 bis Tag 6 nach der Infektion. Überstände wurden bei –80°C gelagert und für Hämagglutinations-Assays verwendet. Zellpellets wurden für direkte Immunfluoreszenz-Tests und zur Propidiumiodid-Färbung verwendet.
  • Beispiel 4
  • Toleranz von PER.C6 für unterschiedliche Influenza-Stämme
  • Um die Toleranz von PER.C6 für Vermehrung von verschiedenen Virus-Stämmen weiter zu untersuchen, wurde eine Infektion durch die Verwendung des H1N1-Impfstoff-Stamms A/Beijing/262/95 und seine Umsortierung X-127, erhalten vom National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC, UK) durchgeführt. Am Tag der Infektion wurden PER.C6-Zellen in 490 cm2 Gewebekultur-Rollerflaschen in einer Dichte von ungefähr 1 × 106 Zellen/ml in einem endgültigen Volumen von 50 ml ausgesät. Zellen wurden mit 5 μl (10–4 Verdünnung) und 50 μl (10–3 Verdünnung) Virus in der Anwesenheit von 5 μg/ml Trypsin-EDTA beimpft. Um zu etablieren, ob Trypsin tatsächlich benötigt wurde, wurde eine weitere Infektion durch Beimpfen mit 5 μl von Stamm A/Beijing/262/95 in der Abwesenheit der Protease durchgeführt. Nach ungefähr 1 h Inkubation bei 37°C wurde das Inoculum durch Abzentrifugieren der Zellen bei 1500 Upm und Resuspendieren von ihnen in frischem Kulturmedium ±5 ug/ml Trypsin-EDTA entfernt. Am Tag 2 und Tag 4 nach der Infektion wurde mehr Trypsin zu den Proben zugefügt. Ernten von 1,3 ml der Zellsuspension wurde von Tag 1 bis Tag 6 nach der Infektion durchgeführt. Überstände wurden bei –80°C gelagert und für Hämagglutinations-Assays und weitere Infektionen verwendet; Zellpellets wurden für direkte Immunfluoreszenz-Tests verwendet. Ergebnisse, die mit den oben erwähnten Immunfluoreszenz- und Hämagglutinations-Assays erhalten wurden, sind in 4, beziehungsweise 5 gezeigt, und veranschaulichen die effiziente Replikation und Freigabe der Viren.
  • Beispiel 5
  • Infektiosität von Virus, vermehrt auf PER.C6
  • Es wurde überprüft, ob die Viren, die in PER.C6 gezüchtet wurden, infektiös waren, und ob Adaptierung an die Zelllinie Virus-Erträge steigern könnte. Virus-Überstände, abgeleitet von PER.C6, die mit den Stämmen A/Beijing/262/95 und seiner Umsortierung X-127 (verd. 10-3) infiziert wurden und am Tag 6 nach der Infektion geerntet wurden, wurden verwendet. Am Tag der Infektion wurden PER.C6 in 490 cm2 Gewebekultur-Rollerflaschen in der Dichte von ungefähr 1 × 106 Zellen/ml in einem endgültigen Volumen von 50 ml ausgesät. Zellen wurden mit 100 μl und 1 ml des Virus-Überstandes in der Anwesenheit von 5 μg/ml Trypsin-EDTA beimpft. Um zu etablieren, ob Trypsin noch immer benötigt. wurde, wurde eine weitere Infektion durch Beimpfen mit 100 μl von Stamm A/Beijing/262/95 in der Abwesenheit der Protease durchgeführt. Nach ungefähr 1 h Inkubation bei 37°C wurde das Inoculum durch Abzentrifugieren der Zellen bei 1500 Upm und deren Resuspendieren in frischem Kulturmedium ±5 μg/ml Trypsin-EDTA entfernt. Am Tag 2 und Tag 4 nach der Infektion wurde mehr Trypsin zu den Proben zugefügt. Ernten von 1,3 ml der Zellsuspension wurde von Tag 1 bis Tag 6 nach der Infektion durchgeführt. Überstände wurden bei –80°C gelagert und für Hämagglutinations-Assays und weitere Infektionen verwendet; Zellpellets wurden für direkte Immunfluoreszenz-Tests verwendet. Ergebnisse, die mit den oben erwähnten Immunfluoreszenz- und Hämagglutinations-Assays erhalten wurden, sind in 6 und 7 gezeigt. Daten, die mit dem vorliegenden Experiment erhalten wurden, zeigten Infektiosität der Viren, die in PER.C6 gezüchtet wurden, sowie eine Steigerung der Virus-Erträge.
  • Beispiel 6
  • Die Anwesenheit von Zelloberflächen-Rezeptoren für Influenzavirus auf PER.C6
  • Vermehrung von humanen Influenza-A- und -B-Stämmen in embryonierten Hühnereiern führt immer zu einer Selektion von Rezeptor-bindenden Varianten, die Aminosäure-Substitutionen am distalen Teil des HA-kugelförmigen-Kopfes in den exponierten und funktionell wichtigen Regionen des Moleküls tragen. Auf Grund dieser Mutationen können die Ei-adaptierten Stämme sich von den ursprünglichen humanen Viren in ihren antigenen und immunogenen Aktivitäten, sowie in ihrer Virulenz unterscheiden. Humane Influenzaviren, isoliert von MDCK-Zellen, zeigen gewöhnlich ein HA-Protein, das identisch ist mit dem HA-Protein, das auf dem Virus der ursprünglichen klinischen Probe vorhanden ist. Eine kürzliche Studie (Govorkova 1999) klärte die molekulare Basis für die Selektion von Varianten in Hühnereiern und die Abwesenheit dieses Varianten-Selektions-Phänomens in MDCK-Zellen. Für alle humanen Influenza-A- und -B-Stämme, isoliert von MDCK-Zellen, wurde herausgefunden, dass sie mit hoher Affinität und Spezifität für alpha2,6-Sialinsäure-Galactose-Bindungen, die in Oligosachariden, vorhanden in Zelloberflächen-Rezeptoren, vorhanden sind, binden, wohingegen deren Ei-gezüchteten Gegenstücke eine erhöhte Affinität für die alpha2,3-Sialinsäure-Galactose-Bindungen in Zelloberflächen-Rezeptoren tragenden Oligosachariden (Sia2-3Gal) zeigen. Unter Verwendung spezifischer Lectine wurde gezeigt, dass nur Sia2-3Gal-enthaltende Rezeptoren auf der Oberfläche von embryonischen Hühnerzellen vorhanden waren, wohingegen MDCK-Zellen sowohl Sia2-6Gal und Sia2-3Gal exprimierten. Die Expression der Sia2-3Gal- und Sia2-6Gal-Einheiten auf. der Oberfläche von PER.C6-Zellen wurde durch FACS-Analyse unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Digoxigenin (DIG)-markierten Lectinen untersucht: Sambuca nigra-Agglutinin (SNA), das spezifisch Sia2-6Gal-Bindungen erkennt, und das Maackia amurensis-Agglutinin (MAA), das spezifisch Sia2-3Gal-Bindungen erkennt. 8A zeigt die Erkennung der SNA- und MAA-Lectine und deren Bindung an die Glycosylierungs-Stellen. Darüber hinaus zeigt 8A die schematische Interaktion zwischen dem FITC-markierten Anti-DIG-Antikörper und dem DIG-markierten Lectin, das die spezifische Sialin-Bindung im Glycosylierungs-Rückgrat des Rezeptors, der auf der Zelloberfläche vorhanden ist, erkennt. Beide Lectine wurden vom Glycan-Differenzierungs-Kit (Boehringer-La Roche) genommen.
  • Das Experiment wurde auf PER.C6-Zellen in Suspension und adhärenten MDCK- und CHO-Zellen durchgeführt. MDCK- und CHO-Zellen wurden vom festen Träger unter Verwendung von Trypsin-EDTA (Gibco-BRL) gelöst. Die Zellsuspensionen wurden dann einmal mit Mem-5% FBS gewaschen und in diesem Medium für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS (Gibco-BRL) wurden die Zellen zu einer Konzentration von ungefähr 106 Zellen/ml in Bindungsmedium (Tris-gepufferte Salzlösung, pH 7,5, 0,5% BSA und 1 mM von MgCl2, MnCl und CaCl2) resuspendiert. Zell-Aliquots wurden für 1 h bei Raumtemperatur mit den DIG-markierten Lectinen SNA und MAA inkubiert. Nach 1 h wurden Lectin-behandelte Zellen mit PBS gewaschen und für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur mit FITC-markiertem Anti-DIG-Antikörper (Boehringer-Mannheim) inkubiert. Schließlich wurden die Zellen mit PBS gewaschen und durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung unter Verwendung eines FAC-Sort-Apparats (Becton Dickinson) analysiert. Die Ergebnisse, gezeigt in 8B, zeigen, dass PER.C6-Zellen durch beide Lectine gefärbt wurden, was die Anwesenheit des Sia2-6Gal- so wie des Sia2-3Gal-Rezeptors zeigt.
  • Im gleichen Experiment wurden MDCK-Zellen als Positivkontrolle für beide sialinierten Rezeptoren verwendet, wohingegen CHO-Zellen auf Grund der Abwesenheit des alpha-2-6-Sialyltransferase-Glycosylierungs-Enzyms in diesen Hamsterzellen eine Negativkontrolle für die Sia2-6Gal-Einheit darstellten. Die oberen Felder zeigen Ergebnisse mit dem SNA-Lectin, und die unteren Felder zeigen Ergebnisse mit dem MAA-Lectin. Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass PER.C6 Zelloberflächen-Proteine exprimiert, die sowohl Sia2-3Gal- als auch Sia2-6Gal-Bindungen in ihren Oligosacharid-Ketten aufweisen.
  • Beispiel 7
  • Effekt von unterschiedlichen Konzentrationen von Trypsin-EDTA auf die Lebensfähigkeit von PER.C6-Zellen, auf die Influenzavirus-Produktion in PER.C6-Zellen und auf das HA-Protein, das davon abgeleitet ist.
  • Auf Grund des absoluten Trypsin-Bedarfes für die Vermehrung von Influenzaviren in Zellkulturen, wurden die Effekte von unterschiedlichen Konzentrationen von Trypsin-EDTA auf PER.C6-Zell-Lebensfähigkeit und Virusreplikationen in PER.C6-Zellen nach Infektion unter Verwendung mehrerer Influenza-Stämme untersucht.
  • Infektion mit Influenzavirus-Stamm A/Sydney/5/97 in der Anwesenheit von niedrigen Konzentrationen von Trypsin
  • Am Tag der Infektion wurden PER.C6-Zellen in 490 cm2 Gewebekultur-Rollerflaschen in einer Dichte von 1 × 106 Zellen/ml in der Anwesenheit von Trypsin-EDTA in endgültigen Konzentrationen von 0,5, 1, 2, 3 und 5 μg/ml ausgesät. Diese Trypsin-Konzentrationen behinderten die Wachstums-Charakteristika der Zellen und deren Lebensfähigkeit nicht (Daten nicht gezeigt). Zellen wurden entweder pseudo-infiziert oder mit auf PER.C6-gezüchtetem Influenzavirus-A/Sydney/5/97 in einer moi von 10–4 pfu/Zelle infiziert. Die virale Produktion wurde durch direkte Immunfluoreszenz (Daten nicht gezeigt), Hämagglutinations-Assays, einzel-radiale Immundiffusion (SRID) und Plaque-Assays, alle wie oben beschrieben, überwacht. Ergebnisse von diesem Experiment sind in 9 dargestellt und zeigen, dass der HA-Gehalt, gemessen durch SRID, sowie die biologische Aktivität des Virus, ausgedrückt in HAU, am höchsten waren, wenn eine Trypsin-Konzentration von 1 μg/ml verwendet wurde. 9 zeigt auch, dass durch Verwendung eines Plaque-Assays die höchste Zahl an Plaque-bildenden Einheiten (pfu) pro ml in der Probe beobachtet wurde, die Zellen entsprach, die in Medium, enthaltend 2 μg/ml Trypsin, gezüchtet wurden.
  • Infektion mit Influenzavirus-Stamm B/Harbin/7/94
  • Am Tag der Infektion wurden PER.C6-Zellen in 490 cm2 Gewebekultur-Rollerflaschen in einer Dichte von 1 × 106 Zellen/ml in der Anwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen Trypsin-EDTA im Bereich von 1 bis 5 μg/ml ausgesät. Zellen wurden mit auf PER.C6-gezüchtetem Virus-B/Harbin/7/94 in einer moi von 10–3 pfu/Zelle infiziert. Produktion des Virus wurde durch direkte Immunfluoreszenz, Hämagglutinations- und Plaque-Assays, wie in 10 gezeigt, überwacht. Die Infektiosität von PER.C6 am Tag 2 erhöhte sich mit der Konzentration von Trypsin. Am Tag 3 wurden jedoch kein signifikanter Unterschied im Prozentsatz von infizierten Zellen beobachtet, wenn 1, 2,5 oder 5 μg/ml Trypsin vorhanden war. In der Abwesenheit von Trypsin (0 μg/ml) wurde keine Influenzavirus-Infektion nachgewiesen. Am Tag der letzten Ernte (Tag 4 nach der Infektion) unterschied sich die biologische Aktivität des Virus, gemessen durch Hämagglutinations-Assay, nicht signifikant. Interessanterweise zeigte der Infektiositäts-Assay, der in Proben durchgeführt wurde, die am Tag 3 und 4 nach Infektion genommen wurden, einen Unterschied in der Produktion des Virus. Die höchsten Titer wurden am Tag 3 und Tag 4 erhalten, wenn eine Trypsin-Konzentration von 2,5 bis 5 (Tag 3) und 1 μg/ml (Tag 4) verwendet wurde.
  • Infektion mit Influenzavirus-Umsortierung X-127
  • Am Tag der Infektion wurden PER.C6-Zellen in T25 Gewebekultur-Flaschen in einer Dichte von 1 × 106 Zellen/ml in der Anwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen Trypsin-EDTA im Bereich von 0 bis 7,5 μg/ml ausgesät. Zellen wurden mit auf PER.C6-gezüchtetem Virus X-127 (Ei-Umsortierung für den Stamm A/Beijing/262/95) in einer moi von 10–4 und 10–3 pfu/Zelle infiziert. Virales Wachstum wurde durch direkte Immunfluoreszenz, Hämagglutinations- und Plaque-Assays überwacht. Wie in 11 und 12 gezeigt, waren HAU-Titer zwischen den Proben identisch, unabhängig von der Trypsin-Konzentration und der anfänglichen moi, die verwendet wurde. Darüber hinaus wurden keine signifikanten Unterschiede in den Infektiositäts-Titern, gemessen durch Plaque-Assay, beobachtet.
  • Infektion von PER.C6 mit Influenzavirus-Stamm A/Sydney/5/97 in der Anwesenheit von hohen Konzentrationen von Trypsin
  • Um den Effekt von steigenden Konzentrationen von Trypsin auf die Lebensfähigkeit der Zellen und Virusreplikation zu testen, wurden PER.C6-Zellen in Rollerflaschen in einer Dichte von 1 × 106 Zellen/ml in der Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen Trypsin-ETDA im Bereich von 0 bis 12,5 μg/ml ausgesät. Zellen wurden entweder pseudo-infiziert oder mit auf PER.C6-gezüchtetem Virus A/Sydney/5/97 in einer moi von 4 × 10–5 pfu/Zelle infiziert. HAU's, die in den erhaltenen Chargen vorhanden waren, wurden wie beschrieben nachgewiesen. Wichtig ist, dass die Daten, dargestellt in 13, deutlich zeigen, dass Trypsin-Konzentrationen bis zu 10 μg/ml die Zell-Lebensfähigkeit nicht stören. Darüber hinaus war die biologische Aktivität des Virus, erhalten am Tag 4 nach Infektion, gemessen durch HAU, höher, wenn eine Trypsin-Konzentration von 2,5 bis 5 μg/ml verwendet wurde. Darüber hinaus wurde die TCID50 gemessen (14A), und Plaque-Assays wurden durchgeführt (Daten nicht gezeigt). Keine relevanten Unterschiede wurden in diesen Plaque-Assays, in den Infektiositäts-Titern (TCID50), in der HA-Spaltung und -Quantität (ungefähr 10 μg/ml), nachgewiesen durch Western Blot-Analyse, gezeigt in 14B, gefunden.
  • Beispiel 8
  • Influenzavirus-Produktion auf PER.C6-Zellen in einem Hohlfaser-Perfusions-Bioreaktor-System
  • Die Skalierbarkeit von Influenzavirus-Produktion in Suspensions-gezüchteten PER.C6-Zellen wurde durch Verwendung von 3 Liter (Gesamtvolumen)-Bioreaktoren, enthaltend 2 Liter Zell-Zell-Suspensionsvolumen in Serum-freiem Medium, das auch frei ist von Tier- oder Menschen-abgeleiteten Proteinen (ExCell 525, JRH Biosciences), untersucht.
  • Influenza-Infektion wurde in einer Zelldichte von ungefähr 3 × 106 Zellen/ml durchgeführt. Zellen wurden mit auf PER.C6-gezüchtetem A/Sydney/5/97-Virus in einer moi von 10–4 pfu/Zelle beimpft. Proben von 5 bis 10 ml der Zellsuspension wurden jeden Tag genommen, um allgemeine Zell-Zählungen durchzuführen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen, für Glucose-Konzentrations-Messungen, für direkte Immunfluoreszenz, für Hämagglutinations- und für Infektiositäts-Assays. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 15 gezeigt.
  • Um die Anwesenheit und den Status des HA-Proteins zu untersuchen, wurden Western-Blots unter Verwendung von zwei unterschiedlichen anti-HA-Antikörpern, erhalten von NIBSC, verwendet. SRID-Assays, wie oben beschrieben, wurden auch durchgeführt. Die Ergebnisse, dargestellt in den zwei Western-Blots in 16, zeigen, dass die Influenzavirus-Charge, produziert in diesem Bioreaktor, einen HA-Gehalt in einer geschätzten Konzentration von 15 μg/ml erbrachte, was durch SRID-Assays bestätigt wurde. Das produzierte HA ist vergleichbar mit Referenz-NIBSC-HA in Bezug auf Untereinheits-Zusammensetzung und Immunreaktivität mit den Referenz-Untereinheits-spezifischen Antiseren.
  • Beispiel 9
  • Infektion von PER.C6 mit A/Sydney/5/97 in einem 15 Liter-Bioreaktor, gefolgt von einem spezifischen Down-Stream-Vorgang (DSP)
  • Suspensions-kultivierte PER.C6-Zellen wurden bei 37°C in einem 15 Liter-Bioreaktor-Hohlfaser-Perfusionssystem mit einem Zellsuspensions-Volumen von 10 Litern in Serum-freiem ExCell 525-Medium (JRH Biosciences) inkubiert. Influenza-Infektion wurde bei 35°C in einer zellulären Dichte von ungefähr 3,3 × 106 Zellen/ml in Medium, enthaltend 5 μg/ml Trypsin-EDTA (Life Technologies) durchgeführt. Zellen wurden mit auf PER.C6-gezüchtetem A/Sydney/5/97-Virus (Passage Nummer 3) in einer moi von 10–4 pfu/Zelle beimpft. Perfusion mit Serum-freiem ExCell 525-Medium, enthaltend Trypsin-EDTA, wurde während der ersten 24 h nach der Infektion fortgeführt. Zwei Tage nach der Infektion wurden Zellen mit einer gefütterten-Charge-Lösung, enthaltend Glucose, essenzielle Aminosäuren und Extra-Glutamin, gefüttert: 82 ml pro Liter Suspension, enthaltend 50 m/v% Glucose (NPBI-Niederlande), 50 × essenzielle Aminosäuren ohne Gln (Gibco-BRL-Life Technologies) und 200 mM Glutamin (Gibco-BRL-Life Technologies). Zellsuspensions-Proben von 10 ml wurden jeden Tag genommen, um Standard-Zellzählungen (Ergebnisse gezeigt in 17, linke Graphik), Glucosekonzentrations-Messungen (Ergebnisse gezeigt in 17, rechte Graphik), direkte Immunfluoreszenz (18), Hämagglutinations- (19) und Infektiositäts-Assays (Daten nicht gezeigt) durchzuführen. Darüber hinaus wurde das HA-Protein durch Western Blot-Analyse untersucht und mit einer NIBSC-Standard-HA-Kontrolle verglichen (20). Am Tag der finalen Ernte der gesamten Zellsuspension (92 h post Infektion) wurde eine Zelltrümmer-Klärung in einem kontinuierlichen Durchfluss bei 20 000 g unter Verwendung des PowerfugeTM-Separationssystems (Carr, JM Separations) gemäß den Protokollen, die vom Hersteller zur Verfügung gestellt wurden, durchgeführt. Geklärter Überstand wurde dann zwanzigfach unter Verwendung einer Hohlfaser-Membran-Patrone mit einer 500 kD-Abgrenzung (A/G Technology, JM Separations) konzentriert. Die in 21 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die quantitative Ausbeute von lebendem Influenzavirus nach Konzentration durch Hohlfaser, gemessen durch Hämagglutinations- und Infektiositäts-Assays, sehr signifikant ist.
  • Beispiel 10
  • Die Immunogenität von auf PER.C6-gezüchteten Influenzaviren und Impfstoffen, die davon abgeleitet wurden.
  • Um die Immunogenität von auf PER.C6-gezüchteten Influenzaviren zu bestimmen, wurde eine in vivo-Studie und ein anspruchsvolles Modell in Frettchen entwickelt. Zwei Chargen von trivalentem gesamt-inaktivierten Influenza-Impfstoff (zusammengesetzt aus A/Sydney/5/97, A/Beijing/262/95 und B/Harbin/7/94), enthaltend 15 μg HA von jedem der drei Stämme, wurden verwendet. Die erste Charge wurde von fertilen Hühnereiern erhalten, und die zweite wurde von PER.C6-Zellen erhalten. Produktion, Aufreinigung, Inaktivierung und Bildung der trivalenten gesamt-inaktivierten PER.C6-abgeleiteten Influenza-Impfstoffe wurden wie unten beschrieben durchgeführt.
  • Züchtung von A/Sydney/5/97-, A/Beijing/262/95- und B/Harbin/7/94-Influenza-Stämmen auf PER.C6
  • Produktion von allen drei Influenza-viralen Chargen wurden in drei getrennten 3 Liter-Hohlfaser-Fed-batch-Bioreaktor-Systemen mit Zellsuspensions-Volumen von 2 Litern durchgeführt. Die Fed-batch-Kultur wurde mit der Zugabe der folgenden Lösung durchgeführt: Ein Gesamtvolumen von 96 ml, enthaltend 50 m/v% Glucose (NPBI), 50 × essenzielle Aminosäuren ohne Gln (Gibco-BRL-Live Technologies), 200 mM Glutamin (Gibco-BRL-Life Technologies) und 7,5 m/v% NaHCO3 (Merck) wurde einmal zugefügt. Influenza-Infektionen wurden bei Zell-Dichten im Bereich von 1,8 × 106 bis 2,6 × 106 lebensfähigen Zellen/ml in ExCell 525 Serum-freiem Medium, enthaltend 5 μg/ml Trypsin-EDTA, durchgeführt. PER.C6-Zellen wurden mit den auf PER.C6-gezüchteten A/Sydney/5/97-, A/Beijing/262/95- und B/Harbin/7/94-Virus-Chargen in unterschiedlichen moi's beimpft: 10–4 (A/Sydney/5/97) oder 10–3 (A/Beijing/262/95 und B/Harbin/7/94) pfu/Zelle. Während der Virusproduktions-Dauer wurden jeden Tag Proben von 10 ml genommen, um Standard-Zell- und Lebensfähigkeits-Zählungen, Glucosekonzentrations-Messungen, direkte Immunfluoreszenz- und Hämagglutinations-Assays durchzuführen. 22 (Ergebnisse der A/Sydney/5/97-infizierten PER.C6-Zellen) zeigt die gesamt- und Lebensfähigkeits-Zellzählungen nach Infektion mit dem Virus (oberes linkes Feld), die Glucose-Aufnahme (oberes rechtes Feld), den Prozentsatz von positiven Zellen im direkten Immunfluoreszenz-Nachweis (unteres linkes Feld) und die HAU's (unteres rechtes Feld). 23 (Ergebnisse der A/Beijing/262/95-infizierten PER.C6-Zellen) zeigt die gesamt- und Lebensfähigkeits-Zellzählungen nach Infektion mit dem Virus (oberes linkes Feld), die Glucose-Aufnahme (oberes rechtes Feld), den Prozentsatz von positiven Zellen im direkten Immunfluoreszenz-Nachweis (unteres linkes Feld) und die HAU's (unteres rechtes Feld). 24 (Ergebnisse der B/Harbin/7/94-infizierten PER.C6-Zellen) zeigt die gesamt- und Lebensfähigkeits-Zellzählungen nach Infektion mit dem Virus (oberes linkes Feld), die Glucose-Aufnahme (oberes rechtes Feld), den Prozentsatz von positiven Zellen im direkten Immunfluoreszenz-Nachweis (unteres linkes Feld) und die HAU's (unteres rechtes Feld). Virus-enthaltende Konzentrate wurden bei –80°C bis DSP gelagert.
  • In allen drei Fällen waren die Glucose-Aufnahme und Lebensfähigkeits- und Gesamt-Zellzählungen der PER.C6-Zellen vergleichbar. Auch die Produktions-Höhen der drei Viren, gemessen durch direkte Immunfluoreszenz, waren ähnlich. Obwohl die HAU- und Infektiositäts-Titer sich zwischen unterschiedlichen Stämmen unterschieden, erhielt PER.C6 Replikation von allen Influenzaviren, die hier getestet wurden, aufrecht.
  • Am Tag der Ernte der gesamten Charge (entweder am Tag 3 oder am Tag 4 nach der Infektion) wurden virale Überstände durch Zentrifugation bei 2000 rpm in einer Tischzentrifuge geklärt und zehnfach konzentriert durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Hohlfaser-Membran-Patrone mit 750 kD Abgrenzung (A/G Technology, JM Separations), folgend den Protokollen, die vom Hersteller zur Verfügung gestellt wurden. Influenzaviren wurden von den konzentrierten Überständen durch zwei aufeinanderfolgende Dichte-Zentrifugationsschritte aufgereinigt: ein 25–70% Stufen-Saccharose-Gradient (1,5 h bei 27K), gefolgt von einem kontinuierlichen 25–70% Saccharose-Gradient (4 h bei 23K). Virale Banden wurden in ungefähr 50 ml eines Phosphat-Puffers verdünnt und schließlich bei 24 000 Upm in einer Ultrazentrifuge pelletiert. Virale Pellets wurden in 1,5 bis 2,3 ml eines Phosphats-Puffers gelöst, aliquotiert und bei –80°C gefroren. Die Bildung von inaktivierten Influenza-Impfstoffen basiert auf der Menge (in Mikrogramm) des ,immunologisch aktiven' HA-Proteins, gemessen durch den SRID-Assay (Wood et al 1977). Der Test wurde durchgeführt, um den HA-Gehalt der Chargen zu charakterisieren. Zur gleichen Zeit wurde die Gesamtmenge von Proteinen unter Verwendung des Lowry-basierenden DC-Protein-Assay-Kits (Biorad), folgend den Methoden, die vom Hersteller empfohlen wurden, gemessen. Es wurde gefunden, dass HA etwa 20 bis 30% des Gesamtprotein-Gehalts der Virus-Präparation ausmacht.
  • Beispiel 11
  • In vivo-Immunogenität von inaktivierten Impfstoffen, produziert in Eiern und auf PER.C6
  • Frettchen und Mäuse stellen zwei gut etablierte Tiermodelle dar, um Influenza-Infektion zu untersuchen, und wurden verwendet, um die Wirksamkeit und Immunogenität von Influenza-Impfstoffen zu bestimmen. Unter Verwendung des Mausmodel-Testsystems wurde die Immunogenität, erzeugt durch die PER.C6- und Ei-abgeleiteten, trivalenten Impfstoffe, enthaltend A/Sydney/5/97, A/Beijing/262/95 und B/Harbin/7/94, durch Analyse der Seren von geimpften Tieren mittels Hämagglutinations-Inhibitions-Assay verglichen. Unter Verwendung des Frettchen-Infektionsmodells folgt der Immunisierung eine Herausforderung mit A/Sydney/5/97. Virus-Gewinnung auf MDCK-Zellen und Hämagglutinations-Inhibitions-Assay, die an den Seren durchgeführt wurden, wurden verwendet, um die Immunogenität und Wirksamkeit der zwei Impfstoffe zu vergleichen.
  • In vivo-Untersuchung in Mäusen
  • Neunzig weibliche Balb/C-Mäuse werden in neun Gruppen von zehn Mäusen unterteilt. Am Tag 0 wird bis zu 100 μl Blut genommen. Das Serum wird separiert und bei –20°C gelagert. Jede Maus wird dann mit dem geeigneten Impfstoff gemäß dem Plan in Tabelle I geimpft. Am Tag 28 werden weitere 100 μl Blut genommen. Serum wird bei –20°C gelagert. Jede Maus wird wieder gemäß dem Plan in Tabelle geimpft. Am Tag 42 wird eine 100 μl-Blutprobe genommen und alle Mäuse werden getötet. Serum wird separiert und bei –20°C gefroren. Hämagglutinations-Inhibitions (HI)-Assays werden an Serumproben von Tag 0, 28 und 42 durchgeführt. Alle diese Assays werden parallel für jeden Tag für Ei- und Zellgezüchtete Viren durchgeführt. Tabelle I Immunogenitäts-Test an Mäusen
    GRUPPEN NUMMER ANTIGEN TYP IMMUNISIERUNGS-VOLUMEN (ml) IMPFWEG GESAMT μg HA PRO DOSIS
    1 Ei-trivalentes Gesamt-Virion 0,5 s. c. 9,0
    2 Ei-trivalentes Gesamt-Virion 0,5 s. c. 3,0
    3 Ei-trivalentes Gesamt-Virion 0,5 s. c. 1,5
    4 Ei-trivalentes Gesamt-Virion 0,5 s. c. 0,15
    5 PER.C6-trivalentes Gesamt-Virion 0,5 s. c. 9,0
    6 PER.C6-trivalentes Gesamt-Virion 0,5 s. c. 3,0
    7 PER.C6-trivalentes Gesamt-Virion 0,5 s. c. 1,5
    8 PER.C6-trivalentes Gesamt-Virion 0,5 s. c. 0,15
    9 PBS 0,5 s. c. 0
  • In vivo-Untersuchung in Frettchen
  • Achtzehn erwachsene weibliche Frettchen (Albino oder Iltis) wurden in drei Gruppen von sechs wie folgt unterteilt: Gruppe 1 erhielt den Ei-abgeleiteten Test-Impfstoff intramuskulär (IM), den Tieren wurde A/Sydney/5/97 verabreicht. Gruppe 2 erhielt den PER.C6-abgeleiteten Test-Impfstoff IM, den Tieren wurde A/Sydney/5/97 verabreicht. Gruppe 3 erhielt nur die Test-Impfstoff-Verdünnungslösung und es wurde A/Sydney/5/97 verabreicht. An den Tagen 0 und 28 wurden die Test-Impfstoffe verabreicht. Am Tag 56 wurden alle Frettchen intra-nasal mit 0,5 ml des A/Sydney/5/97-Virus bei TCID50 103 infiziert. Nasale Waschungen wurden durchgeführt und Entzündungszelt-Zählungen, Temperatur und Gewichte der Frettchen wurden einmal täglich von Tag 57 bis 63 überwacht. Alle Tiere wurden am Tag 63 getötet. Serum wurde separiert und bei –20°C gelagert. Die Proben der nasalen Waschungen wurden auf Eis gelagert und eine Zählung der gewonnenen Zellen von nasalen Waschungen wurde unter Verwendung des Trypan-Blau-Ausschluss-Assays durchgeführt.
  • Der Titer des Virus, das von den Proben der nasalen Waschungen erhalten wurde, wurde durch Messung der Virus-Gewinnung auf MDCK-Zellen bestimmt. Die Spearman und Karber (1931)-Berechnung wurde verwendet, um TCID50-Werte zu berechnen. Hämagglutinations-Inhibitions-Analyse wurde an Serumproben, genommen am Tag 0, 28, 56 und 63, durchgeführt. Aus diesem Versuch wurde geschlossen, dass der PER.C6-abgeleitete Test-Impfstoff wirksam war.
  • Beispiel 12
  • Charakterisierung von HA-Protein, abgeleitet von Influenzavirus, hergestellt auf PER.C6.
  • Um die Glykosylierung von HA in PER.C6-Zellen zu untersuchen, wurde eine Charge von ungeteiltem HA (HA0) erzeugt. PER.C6-Zellen wurden mit Virus A/Sydney/5/97 (Passage Nummer 5 auf PER.C6) in moi's von 1, 0,1 und 0,01 pfu/Zelle in ExCell 525-Medium, enthaltend Trypsin-EDTA in der Endkonzentration von 5 μg/ml, infiziert. Nach 1 h Inkubation bei 35°C wurden die Zellen zwei mal mit PBS gewaschen, um Trypsin zu entfernen, und über Nacht bei 35°C und 10% CO2 in der Abwesenheit von Trypsin inkubiert. Am Tag danach wurden Zellsuspensionen geerntet und zentrifugiert (500 g), und Zell-Pellets wurden zweimal mit Medium gewaschen. Virale Überstände wurden bei –80°C gefroren und Proben davon wurden in Western Blot-Assays wie beschrieben verwendet, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von ungeteiltem HA-Protein zu untersuchen.
  • Ungeteiltes HA-Protein (HA0) besteht aus den zwei Untereinheiten: HA1 und HA2, die durch eine Disulfidbindung verbunden sind. Da diese Disulfidbindung durch Reduktion mit DTT gespalten werden kann, können HA1 und HA2 aufgetrennt und auf einem reduzierenden Gel, gefolgt von Western-Blots unter Verwendung von Antiseren, die die Untereinheiten erkennen, visualisiert werden. Wenn das HA-Protein nur aus HA0 besteht, wird eine Bande sichtbar, die im Vergleich zu der HA1-Untereinheit und der am schnellsten wandernden HA2-Untereinheit langsamer durch ein SDS/PAGE-Gel wandert. Die in 25 gezeigten Ergebnisse weisen auf die Anwesenheit von vorwiegend ungeteiltem HA0 von PER.C6-Infektionen hin, im Vergleich zu der Ei-abgeleiteten Positivkontrolle, die vom NIBSC (UK) erhalten wurde. Um zu bestätigen, dass die nachgewiesene Bande tatsächlich nicht gespaltenes Hämagglutinin war, wurde eine verdaute HA0-Probe mit unterschiedlichen Konzentrationen von Trypsin im Bereich von 2,5 bis 10 μg/ml in Medium über Nacht bei 37°C verdaut. Die verdauten Proteine wurden dann unter reduzierenden Bedingungen auf ein SDS-PAGE-Gel geladen, gefolgt von Western Blot-Analyse unter Verwendung der gleichen Antiseren, wie für 14 beschrieben. Wie in 26A gezeigt, konnte Spaltung der HA0 erzielt werden, was die Erzeugung von nicht gespaltenem HA-Protein auf PER.C6 bestätigt.
  • Beispiel 13
  • Verdau von HA0 mit N-Glykosidase F
  • Das Influenzavirus-HA-Protein ist ein Glykoprotein, das 3 bis 9 N-verknüpfte Glycosylierungs-Oligosacharid-Stellen enthält. Die Anzahl der Stellen ist abhängig vom Virusstamm. Die Lokalisierung dieser Stellen wird durch die Nucleotidsequenz des HA-Gens bestimmt, und da das virale Genom von Influenza durch eine Fehler-anfällige RNA-Polymerase repliziert wird, kommen Mutationen, die die Addition oder das Entfernen von Glykosylierungs-Stellen hervorrufen, sehr häufig vor. Die Zusammensetzung und Struktur der Oligosacharid-Ketten, die auf dem HA vorhanden sind, wird dann durch die Anordnung von biosynthetischen und kürzenden Glykosylierungs-Enzymen, die von der Wirtszelle geliefert werden, bestimmt. Da Glykosylierung von HA eine wichtige Rolle in der Virulenz und Impfstoff-Wirksamkeit spielt, wurden die Eigenschaften von HA, produziert auf Influenza-infizierten PER.C6, untersucht. Ein Verdau von A/Sydney/5/97-ungeteiltem HA0-Protein mit dem N-Glykosidase F-Enzym wurde unter Verwendung von Protokollen, die vom Hersteller zur Verfügung gestellt wurden, durchgeführt, um die sieben Oligosacharide zu entfernen, von denen erwartet wird, dass sie auf dem A/Sydney/5/97-HA-Polypeptid vorhanden sind. Influenza-A/Sydney/5/97 wurde mit 1% Triton X-100 (Merck) lysiert. Protease-Inhibitor wurde zu einem Aliquot dieses lysierten Virus, entsprechend 68 ng HA, zu einer Endkonzentration von 1 × (Kompletter Protease-Inhibitor-Cocktail Boehringer Mannheim) hinzugefügt. Diese Probe wurde in der Anwesenheit von 100 mM NaPO4, pH 7, 10 mM EDTA (J. T. Baker), 1% SDS (J. T. Baker) und 1% B-Mercaptoethanol (Merck) inkubiert. Dies wurde für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Probe wurde 5fach in mM NaPO4, pH 7, 10 mM EDTA (J. T. Baker), 0,625% NP-40 und 1% B-Mercaptoethanol (Merck) verdünnt. Davon wurden 40 μl für den Glyko-F-Verdau verwendet. Dafür wurden 2 μl zu 10/μl Glyko-F (N-Glykosidase F, Boehringer) zugefügt und für mindestens 16 h bei 37°C inkubiert. Dann wurde 3 × Laemmli-Puffer mit 150 mM DTT (Fluke) zu einer Endkonzentration von 1 × zugefügt. Die Proben wurden auf einem 7,5%igen SDS/PAGE-Gel laufen gelassen. Das SDS-PAGE und der Western-Blot wurden wie folgt durchgeführt. Kurz, der Blot wurde für 30 min bei Raumtemperatur mit Blockier-Lösung (5% Magermilchpulver, Biorad in TEST, angereichert mit 1% Kaninchenserum (Rockland), blockiert, gefolgt von 3 Waschschritten mit TEST. Dann wurde der Blot mit dem Anti-A/Sydney/5/97-HA-Antiserum (98/768 NIBSC), 1/500 verdünnt in 1% BSA/TBST mit 5% Kaninchenserum (Rockland), über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Der Blot wurde wieder 8 mal mit TEST gewaschen. Schließlich wurde der Blot mit dem Kaninchen-Anti-Schaf-Antiserum-HRP-markiert (Rockland), 1/6000 verdünnt in Blockierlösung, für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 8 Waschschritten mit TEST wurde der Protein-Konjugat-Komplex mit ECL (Amersham Pharmacia Biotech) visualisiert, und Filme (Hyperfilm, Amersham Life Science) wurden belichtet. Wie in 27 gezeigt, reduzierte Behandlung mit dem Glykosidase F-Enzym die Größe des Proteins mit ungefähr 28–30 kD deutlich, was ungefähr der vorhergesagte Verlust von etwa 4 kD pro Oligosacharid ist. Die Protein-Bande, gezeigt mit einem Stern (*), ist das de-glykosylierte HA0, das ähnlich dem HA1-Untereinheits-Produkt, erhalten nach Spaltung von HA0 in HA1- und HA2-Untereinheiten (rechte Spalte), wandert.
  • Beispiel 14
  • Spaltung von HA0 mit Accutase.
  • Die Möglichkeit, Säugetier-abgeleitetes Trypsin-EDTA mit nicht-Säugetier- oder rekombinanten Proteinen zu ersetzen, wurde untersucht. Kürzlich wurde ein Gemisch von proteolytischen und kollagenolytischen Enzymen (AccutaseTM, PAA) von nicht-Wirbeltier-Spezies für Routine-Zellkultur erhältlich. Auf Grund seiner nicht-Säugetier-Herkunft ist Accutase frei von Prionen, Parvovirus und anderen Komponenten, die potentiell Trypsin-EDTA-Lösungen kontaminieren können. Bis jetzt konnte keine Information in Bezug auf die Art von Proteasen, die in Accutase vorhanden sind, erhalten werden. Die Spaltung von HA0 wurde unter Verwendung von Western Blot-Analyse untersucht. Eine konstante Menge von HA0-Protein, erhalten von PER.C6, infiziert mit A/Sydney/5/97 in einer moi von 1 pfu pro Zelle ohne Trypsin, wurde mit Serien-Verdünnungen von Accutase über Nacht bei 37°C verdaut. Als eine Positivkontrolle wurde die gleiche Menge von HA0, verdaut mit 100 ng Trypsin-EDTA, verwendet. Die verdauten Proteine wurden dann auf ein 10% SDS-PAGE-Gel unter reduzierenden Bedingungen für Western Blot-Analyse geladen. Wie in 28 gezeigt, resultierte Verdau mit 2 μl Accutase-Behandlung in vollkommener Spaltung von HA0; teilweise Spaltung wurde bei Verwendung von 0,2 μl beobachtet.
  • Diese Ergebnisse legen nahe, dass Behandlung mit Accutase während Influenza-Replikation und -Produktion Trypsin-EDTA während Influenza-Infektionen auf PER.C6 ersetzen kann.
  • Beispiel 15
  • Elektronenmikroskopische Analyse von Influenzaviren auf PER.C6-Zellen.
  • Transmissions-Elektronenmikroskop-Untersuchungen wurden an PER.C6-Zellen durchgeführt, die mit dem Influenzastamm A/Sydney/5/97 infiziert wurden, sowie an viral-enthaltenden Überständen und Saccharose-aufgereinigtem Material, um den Phänotyp dieses Influenzavirus, produziert auf PER.C6, festzustellen. Alle Verfahren, die verwendet wurden, sind Fachleuten wohlbekannt. 29 zeigt, dass sich die letzten Stadien des Virus-Lebenszyklus durch Knospung und Freigabe von umhüllten Virionen von der Zytoplasma-Membran darstellen. Fortsätze (Spikes), die den HA- und NA-viralen Proteinen entsprechen, wurden nachgewiesen, die die Peripherie der Virion-Partikel besetzen. Die Figur zeigt auch den charakteristischen Pleomorphismus von Influenzaviren.
  • Beispiel 16
  • Infektion von PER.C6 mit einer großen Vielzahl von Influenza-A- und -B-Virusstämmen
  • Die Verwendung von PER.C6 als eine Plattform-Technologie für die Produktion von Influenza-Impfstoff erfordert PER.C6, um das Wachstum eines weiten Bereichs von Stämmen von unterschiedlichen Influenza-Untertypen zu fördern.
  • Statische Suspensionskulturen von PER.C6-Zellen, die in T25 Flaschen und/oder in Platten mit 6 Vertiefungen in ExCell 525-Medium gezüchtet wurden, wurden in einer Zelldichte von 106 Zellen/ml mit 16 unterschiedlichen Stämmen von Influenzaviren, gezeigt in 30A, infiziert. Diese Stämme umfassten einige H3N2-, H1N1-, B-Typ- und Gefügel-Stämme. Infektionen wurden in der Anwesenheit von 5 μg/ml Trypsin durchgeführt. Die Viren wurden von NIBSC (UK) als Ei-passagierte Wildtyp- oder umsortiere Stämme erhalten. Infektion wurde mit einer Virus-Verdünnung, die von NIBSC in den Produkt-Beipacktexten empfohlen werden, die mit den unterschiedlichen Stämmen geliefert wurden, durchgeführt.
  • Alle getesteten Viren waren fähig zur Vermehrung auf PER.C6, wie durch Immunfluoreszenz (Daten nicht gezeigt) und Titration der Überstandsflüssigkeiten im pfu-Assay (30B) veranschaulicht wurde.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass sogar Influenzastämme (dargestellt durch einen Stern) wie A/Johannesburg/33/94, B/Beijing/184/93 und A/Duck/Singapore-Q/F119-3/97, die normalerweise sehr schwer auf embryonierten Eiern zu produzieren sind, auf den humanen PER.C6-Zellen replizieren und produziert werden können.
  • Beispiel 17
  • Herstellung von Herpes simplex-Typ 1 (HSV-1)-Virus, Herpes simplex-Typ 2 (HSV-2)-Virus und Masernvirus auf PER.C6.
  • Es wurde getestet, ob andere Viren als Influenzavirus und Adenovirus, wie Herpes simplex-Virus-Typ 1 und 2 und Masernvirus auch auf PER.C6 replizieren können. Impfstoffe, die von diesen auf PER.C6-gezüchteten Viren abgeleitet werden, und die neutralisierende Effekte in Menschen zum Schutz gegen Wildtyp-Infektionen induzieren, werden von den auf PER.C6-gezüchteten Virus-Chargen hergestellt. Die Stämme, die von ATCC erhalten und für Infektion von PER.C6-Zellen verwendet wurden, sind in Tabelle II dargestellt. Tabelle II Herpes simplex-Virus- und Masern-Stämme, die von ATCC erhalten wurden, und die für Infektion von PER.C6-Zellen verwendet wurden.
    Virus Stamm ATCC Kat.-Nr. Lot-Nr. Passage-Geschichte Titer
    Herpes simplex-Typ 1 Macintyre VR-539 1327850 y. s./12, PR RabK/5, Mb/1, PrRabK/5, Vero/4, Vero (ATCC CC1-81)/1 106,75 TCID50/200 μl
    Herpes simplex-Typ 2 MS VR-540 216463 Schaf-Choroidea-Geflecht/?, HeLa/?, PrRabK/7, Vero (ATCC CC1-81)/3 107,5 TCID50/200 μl
    Masern Edmonston VR-24 215236 HK/24, HuAm/40, MRC-5/1, MRC-5 (ATCC CCL-171)/1 104 TCID50/ml
  • Um zu testen, ob HSV-1- und HSV-2- und Masernviren, erhalten von ATCC, auf PER.C6 replizieren und produziert werden können, wurden Passage-Nummer 46-Zellen in Labtek-Kammern, beschichtet mit Poly-L-Lysin, unter Verwendung von Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, zu 105 Zellen/Vertiefung ausgesät. Von Affen stammende Vero-Zellen (erhalten von ATCC) wurden in Passage-Nummer 137 kultiviert, und wurden als Positivkontrollen verwendet und in einer Dichte von 2,5 × 104 Zellen/Vertiefung ausgesät. Am Tag 0, als Vertiefungen mit PER.C6-Zellen 60% und Vero-Zellen 80% konfluent waren, wurden Zellen mit unterschiedlichen moi's (10–3, 10–2, 10–1 und 1 TCID50 pro Vertiefung) infiziert. In täglichen Intervallen nach der Infektion wurden Zellen fixiert und mit Immunfluoreszenz unter Verwendung von FITC-konjugierten Typ-spezifischen monoclonalen Antikörpern unter Verwendung eines Kits (Imagen Herpes simplex-Virus (HSV)-Typ 1 und 2, (Dako) und FITC-konjugierte Antikörper gegen das HA- und Matrix-Protein von Masernvirus (Masern-IFA-Kit, Light Diagnostics) analysiert, folgend den Vorgehen, die vom Hersteller empfohlen wurden. Die Antiseren sind gegen HSV-1- und -2- und Masernvirus-Antigene gerichtet.
  • Die in 31 zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass PER.C6 tolerant ist für HSV-1- (31D), HSV-2- (31E) und Masernvirus (31A)-Infektionen. Darüber hinaus weisen die Kinetiken darauf hin, dass diese Viren auf PER.C6 in einer moi-abhängigen Weise replizieren.
  • Als nächstes wurde untersucht, ob HSV-1-, -2- und Masernvirus auf PER.C6 vermehrt werden können. Zu diesem Zweck wurden Zellen mit moi von 0,01, 0,1 und 1 TCID50/Zelle für HSV-1 (32C) und HSV-2 (32A) und einer moi von 0,001 TCID50/Zelle für Masernvirus (32B) (Passage-Nummer 1) infiziert. Beim Auftreten von fast vollständiger cpe wurden Zellen und Überstände geerntet, schnell in flüssigem N2 gefroren und aufgetaut. Danach wurden geklärte Überstände blind unter Verwendung von ungefähr 100 μl zu PER.C6 (das ist Passage-Nummer 2) passagiert. Nachdem Erreichen von wieder fast vollständiger cpe wurde eine dritte Passage (Passage-Nummer 3) in ähnlicher Weise durchgeführt. Die moi's der Passage-Nummer 2 und 3 wurden im Nachhinein durch TCID50-Assays bestimmt.
  • Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, dass Herpes simplex-Virus-Typ 1 und 2 und Masernviren auf PER.C6 repliziert werden können, und dass Replikation und Vermehrung sogar erfolgen kann, wenn moi's so niedrig wie 10–7 verwendet werden.
  • Beispiel 18
  • Durchmustern von Rotavirus nach Replikation auf PER.C6
  • Um zu testen, ob PER.C6 auch die Replikation eines Rotavirus fördert, wurden PER.C6-Zellen mit einem Rhesus-Rotavirus (MMU 18006; ATCC#VR-954; Stamm S:USA:79:2; Lot# 2181153) infiziert. PER.C6-Zellen (Passage-Nummer 41) wurden in einer Dichte von 1 × 105 pro ml kultiviert, und Affenabgeleitete Vero-Zellen (erhalten von ATCC, Passage-Nummer 139) wurden in einer Dichte von 2,5 × 104 pro ml kultiviert, und in der Folge in Labtek-Kammern ausgesät, die mit poly-L-Lysin unter Verwendung von Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, vorbeschichtet worden waren. Zellen wurden mit einer moi von 1 TCID50/Zelle von Rhesus-Rotavirus in der Anwesenheit und Abwesenheit von 2 μg/ml Trypsin-EDTA infiziert. Nach 90 min der Infektionen wurden Zellen mit ExCell 525-Medium gewaschen und weiter bei 37°C bei 10% CO2 in einer feuchten Atmosphäre inkubiert. An 5 aufeinander folgenden Tagen folgend der Infektion wurden Proben von Überständen geerntet, von Zellen und Zelltrümmern durch Zentrifugation bei 2000 Upm in einer Tischzentrifuge geklärt und in einem ELISA analysiert, der spezifisch ist für Rotavirus (IDEIA Rotavirus, Dako). Die in 33 dargestellten Ergebnisse zeigen deutlich, dass Rhesus-Rotavirus auf PER.C6 repliziert.
  • LEGENDEN ZU DEN FIGUREN
  • 1. Prozentsatz an infizierten Zellen (positive Zeilen), betrachtet mikroskopisch nach Immunfluoreszenz-Assay, gegen Prozentsatz an toten Zellen, gemessen durch FACS nach Propidiumiodid-Färbung, bei moi's von 10–3 und 10–4. Schwache Lebensfähigkeit der Zellen von Proben, abgeleitet von Infektion bei moi 10–3 ergaben keine verlässlichen Daten.
  • 2. Prozentsatz an infizierten Zellen, betrachtet mikroskopisch nach Immunfluoreszenz-Assay. Proben, abgeleitet von Infektion bei moi 10 und 1 bei 48 h nach Infektion sind auf Grund von völliger CPE nicht gezeigt.
  • 3. Kinetik der Virus-Vermehrung, gemessen in Hämagglutinations-Einheiten (HAU) von Tag 1 bis Tag 6 nach Infektion.
  • 4. Prozentsatz an infizierten Zellen (positive Zellen), betrachtet mikroskopisch nach Immunfluoreszenz-Assay.
  • 5. Kinetik der Virus-Vermehrung, gemessen in Hämagglutinations-Einheiten (HAU) von Tag 1 nach Infektion.
  • 6. Prozentsatz an infizierten Zellen (positive Zellen), betrachtet mikroskopisch nach Immunfluoreszenz-Assay.
  • 7. Kinetik der Virus-Vermehrung, gemessen in Hämagglutinations-Einheiten (HAU) von Tag 2 nach Infektion.
  • 8. Expression von Sia2-3Gal- und Sia2-6Gal-Bindungen auf Zell-Oberflächen-Rezeptoren, vorhanden auf Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen, PER.C6-Zellen und MDCK-Zellen. (A) Schematische Darstellung der Interaktion des Sambuca nigra-Agglutinin (SNA)-Lectins, das spezifisch Sia2-6Gal-Bindungen erkennt, und des Maackia amurensis-Agglutinin (MAA)-Lectins, das spezifisch Sia2-3Gal-Bindungen erkennt. Die schematische Interaktion mit dem FITC-markierten anti-DIG-Antikörper, der das DIG-markierte Lectin, gebunden an die Oligosacharid-Kette auf dem Zelloberflächen-Protein, erkennt, ist auch dargestellt. (B) FACS-Analyse von Zellen, die mit DIG-markierten Lectinen inkubiert wurden. Lectine, angeheftet an die Zellen, wurden mit FITC-markiertem anti-DIG-Antikörper unter Verwendung von Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, nachgewiesen. Zellzahl-Zählungen sind gegen die Fluoreszenz-Intensität von Lectin-gefärbten Zellen (grau) eingezeichnet, verglichen mit Zellen, die nur mit dem FITC-anti-DIG-Antikörper inkubiert wurden (offen). Die oberen Felder zeigen die Verschiebung in der FACS-Analyse, erhalten durch die Verwendung des SNA-Lectins, und die unteren Felder zeigen die Verschiebung in der FACS-Analyse, erhalten durch Verwendung des MAA-Lectins.
  • 9. Infektion mit A/Sydney/5/97 auf PER.C6. (A) Effekt von Trypsin-EDTA auf HAU-Titer. (B) HA-Konzentration in μg/ml und (C) Virus-Infektiositäts-Titer in pfu's/ml, gemessen in viralen Rohüberständen 96 Stunden nach Infektion.
  • 10. Infektion mit B/Harbin/7/94 auf PER.C6. (A) Effekt von unterschiedlichen Konzentrationen von Trypsin-EDTA, anwesend während und nach Virusinfektion, auf Wachstumskinetik, (B) HAU-Titer pro 50 μl und (C) Virusinfektiositäts-Titer in pfu/ml.
  • 11. Infektion mit X-127 unter Verwendung einer moi von 10–3 auf PER.C6. (A) Effekt von Trypsin-EDTA auf HAU, angegeben in HAU/50 μl und (B) Virus-Infektiositäts-Titer in pfu/ml während 5 Tagen nach Infektion.
  • 12. Infektion mit X-127 unter Verwendung einer moi von 10–4 auf PER.C6. (A) Effekt von Trypsin-EDTA auf HAU, angegeben in HAU/50 μl und (B) Virus-Infektiositäts-Titer in pfu/ml während 5 Tagen nach Infektion.
  • 13. Effekt von Trypsin-EDTA auf (A) Lebensfähigkeit von PER.C6-Zellen und (B) biologische Aktivität des Virus. Zell-Lebensfähigkeit wurde nach Trypanblau-Färbung gemessen. HAU-Titer wurden wie beschrieben gemessen und pro 50 μl angegeben.
  • 14. Effekt von Trypsin-EDTA auf Virus-Infektiositäts-Titer und HA-Proteingehalt nach Influenzainfektion auf PER.C6-Zellen mit A/Sydney/5/97. (A) Der Infektiositäts-Assay wurde durch Beimpfen in vierfacher Ausführung von MDCK-Zellen mit einer Gesamtmenge von 100 μl 10-fach Serien-verdünnten Virus-enthaltenden Überständen in Serum-freiem Medium mit Trypsin-EDTA (4 μg/ml) durchgeführt. Nach sieben Tagen wurde der Überstand dieser Kulturen auf HA-Aktivität getestet. Die infektiösen Virustiter wurden gemäß dem Verfahren von Spearman-Karber (1931) berechnet. (B) Western Blot-Analyse des A/Sydney/5/97-HA-Proteins. Ernten von viralen Proteinen wurde durch Spaltung und Denaturierung von Proteinen unter Verwendung eines SDS-enthaftenden Lyse-Puffers durchgeführt. Die Elektrophorese wurde auf einem 10%igen SDS/PAGE-Gel unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt. Aufgetrennte Proteine wurden mit den spezifischen anti-A/Sydney-HA-Antiseren sondiert. Steigende Mengen des Positivkontroll-A/Sydney-HA-Antigens (linke 4 Reihen) und 10 μl PER.C6-Zellen-Überstände der angezeigten Trypsin-inkubierten Proben (rechte 5 Reihen) wurden geladen.
  • 15 Lebensfähigkeit von PER.C6-Zellen, Glukose-Konzentration und Wachstumskinetik von A/Sydney/5/97 in einem Hohlfaser-Perfusions-System.
  • 16. Charakterisierung und Quantifizierung von Influenzavirus-A/Sydney/5/97, vermehrt auf PER.C6 in einem Hohlfaser-Perfusions-System. SDS-PAGE und Western-Blots wurden durchgeführt, wie in der Legende zu 14 für den Schaf-anti-A/Sydney-HA-Antikörper beschrieben. Das monoclonale Antikörper-anti-HA-Kennzeichen (HA-Sonde (F7), Maus-monoclonal, (Santa Cruz) wurde in 1:1000-Verdünnung verwendet. Als ein zweiter Antikörper wurde eine Ziegen-anti-Maus-HRP-konjugierter Antikörper (Biorad) in 1:7500-Verdünnung verwendet.
  • 17. Lebensfähigkeit von PER.C6-Zellen (linkes Feld) und Glukose-Konzentration (rechtes Feld) in einem 12 Liter-Bioreaktor bis zu 92 h nach viraler Infektion unter Verwendung von A/Sydney/5/97-Virus.
  • 18. Infektion von PER.C6 mit A/Sydney/5/97 in einer 10 Liter-Zellsuspension in einem 12 Liter-Bioreaktor. Kinetik von Virus-Replikation, gemessen durch Immunfluoreszenz-Assay, sind in Prozentsätzen von positiv-gefärbten Zellen angegeben.
  • 19. Infektion von PER.C6-Zellen mit A/Sydney/5/97 in einer 10 Liter-Zellsuspension in einem 12 Liter-Bioreaktor. Kinetik der Virus-Replikation, gemessen durch Hämagglutinations-Assay sind in HAU's während einigen Tagen nach viraler Infektion angegeben. Die Säule, die mit einem Stern gekennzeichnet ist, ist die Anzahl der HAU's, erhalten nach PowerfugeTM-Klärung, wie im Text beschrieben.
  • 20. Western-Blot, folgend einer Infektion von PER.C6 mit A/Sydney/5/97-Virus in einer 10 Liter-Zellsuspension in einem 12 Liter-Bioreaktor. Gezeigt ist die Charakterisierung und Quantifizierung des Influenzavirus-A/Sydney/5/97-HA-Polypeptids. SDS/PAGE und Western-Blot wurden wie in Legende zu 14 beschrieben durchgeführt. Die verschiedenen Untereinheiten (HA1 und HA2) und die nicht gespaltenen HA0-Proteine sind durch Pfeilspitzen gekennzeichnet. Das HA, erhalten von NIBSC, diente als eine Positivkontrolle.
  • 21. Bestimmung von HAU's und pfu/ml nach Infektion von PER.C6 mit A/Sydney/5/97 in einer 10 Liter-Zellsuspension in einem 12 Liter-Bioreaktor. Die Infektion wurde von Down-Stream-Processing (DSP) gefolgt. Die Gewinnung von viralen Erträgen nach Hohlfaser-Ultrafiltration (20-fach Konzentration) ist auch gezeigt.
  • 22. Infektion von PER.C6 mit A/Sydney/5/97 in einer 2 Liter-Zellsuspension in einem 3 Liter-Bioreaktor. Lebensfähigkeit von PER.C6-Zellen (oben links), Glukose-Konzentration (oben rechts) und Wachstumskinetik des Virus in Prozent von positiv-gefärbten Zellen (unten links) und HAU's (unten rechts) sind angegeben.
  • 23. Infektion von PER.C6 mit A/Beijing/262/95 in einer 2 Liter-Zellsuspension in einem 3 Liter-Bioreaktor. Lebensfähigkeit von PER.C6-Zellen (oben links), Glukose-Konzentration (oben rechts) und Wachstumskinetik des Virus in Prozent von positiv-gefärbten Zellen (unten links) und HAU's (unten rechts) sind angegeben.
  • 24. Infektion von PER.C6 mit B/Harbin/7/94 in einer 2 Liter-Zellsuspension in einem 3 Liter-Bioreaktor. Lebensfähigkeit von PER.C6-Zellen (oben links), Glukose-Konzentration (oben rechts) und Wachstumskinetik des Virus in Prozent von positiv-gefärbten Zellen (unten links) und HAU's (unten rechts) sind angegeben.
  • 25. Western Blot-Analyse von nicht gespaltenem A/Sydney/5/97-HA0-Protein. Positiv-gefärbte Proteine werden nach Inkubation mit den spezifischen anti-A/Sydney-Antiseren, erhalten von NIBSC und beschrieben in der Legende von 14 und im Text, nachgewiesen.
  • 26. Western Blot-Analyse von A/Sydney/5/97-abgeleitetem HA-Protein, verdaut mit Trypsin. Proteine werden nach Inkubation mit den spezifischen anti-A/Sydney-Antiseren nachgewiesen. Links ein Standard-gespaltenes A/Sydney-HA, rechts HA0, behandelt mit steigender Menge an Trypsin.
  • 27. Western Blot-Analyse von A/Sydney-HA0, verdaut mit N-Glykosidase F. Proteine werden nach Inkubation mit den spezifischen anti-A/Sydney-Antiseren nachgewiesen. Die Protein-Bande, gekennzeichnet mit einem Stern, ist das de-glykosylierte Produkt.
  • 28. Western Blot-Analyse von A/Sydney/5/97-HA nach Accutase-Verdau. Proteine werden nach Inkubation mit den spezifischen polycloalen anti-A/Sydney-HA-Antiseren nachgewiesen. Links, HA0 vor und nach Trypsin-Behandlung, rechts, HA0, verdaut mit abnehmenden Mengen an Accutase.
  • 29. Elektronenmikrographien von Influenza-A/Sydney/5/97. (A) PER.C6-Zellen 72 h nach Infektion. (B und C) Negativ-Färbung von Virus, abgeleitet von infizierten PER.C6. (D und E) Negativ-Färbung von Saccharose-aufgereinigtem Material.
  • 30. (A) Alle verschiedenen Influenza-A- und -B-Stämme, getestet auf PER.C6-Zellen. (B) Infektiositäts-Titer von drei dargestellten A- und B-Typ-Influenzaviren, abgeleitet von infizierten PER.C6-Zellen.
  • 31. Immunfluoreszenz von PER.C6- und Vero-Zellen, infiziert mit Viren, die nicht Influenza sind. (A) Positiv-gefärbte Zellen nach Infektion mit Masernvirus. (B) Positiv-gefärbte Zellen nach Infektion von Vero-Zellen mit HSV-1-Virus. (C) Positiv-gefärbte Zellen nach Infektion von Vero-Zellen mit HSV-2-Virus. (D) Positiv-gefärbte Zellen nach Infektion von PER.C6-Zellen mit HSV-1-Virus. (E) Positiv-gefärbte Zellen nach Infektion von PER.C6-Zellen mit HSV-2-Virus.
  • 32. Infektiositäts-Titer, bestimmt nach Vermehrung von Masernvirus (mittleres Feld), HSV-1-(unteres Feld) und HSV-2- (oberes Feld) Virus auf PER.C6-Zellen.
  • 33. Replikation von Rotavirus nach Infektion von PER.C6- (oberes Feld) und Vero (unteres Feld)-Zellen mit unterschiedlichen moi's, gemessen durch ELISA in Rohüberständen.
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Claims (30)

  1. Verfahren zur Herstellung eines Virus und/oder von viralen Proteinen, die von Adenovirus bzw. adenoviralen Proteinen verschieden sind, zur Verwendung als Impfstoff, umfassend das Versehen einer Zelle, die mit wenigstens einer Sequenz versehen wurde, die wenigstens ein Genprodukt des E1-Gens oder ein funktionelles Derivat davon eines Adenovirus codiert, mit einer Nucleinsäure, die das Virus codiert, das Züchten der Zelle in einem geeigneten Medium und die Ermöglichung der Expression des Virus und das Ernten des Virus und/oder der viralen Proteine aus dem Medium und/oder aus der Zelle, wobei die Zelle immortalisiert ist, um in Kultur zu wachsen, und wobei die Zelle von einem menschlichen embryonalen Retinoblasten abgeleitet ist.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Sequenz, die wenigstens ein Genprodukt des E1-Gens codiert, in dem Genom der menschlichen Zelle vorhanden ist.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Zelle keine adenoviralen Strukturproteine produziert.
  4. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Zelle weiterhin eine Sequenz umfasst, die E2A oder ein funktionelles Derivat oder Analogon oder Fragment davon codiert.
  5. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Sequenz, die E2A oder ein funktionelles Derivat oder Analogon oder Fragment davon codiert, im Genom der menschlichen Zelle vorhanden ist.
  6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 oder 5, wobei die E2A codierende Sequenz eine temperaturempfindliche E2A-Mutante codiert.
  7. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die menschliche Zelle keine weiteren adenoviralen Sequenzen umfasst.
  8. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die menschliche Zelle in Suspension wachsen kann.
  9. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die menschliche Zelle in Abwesenheit von Serum gezüchtet wird.
  10. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die menschliche Zelle eine Zelle wie hinterlegt unter ECACC-Nr. 96022940 oder ein Derivat davon ist.
  11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Virus ein Protein umfasst, das posttranslationalen und/oder peritranslationalen Modifikationen unterliegt.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Modifikationen Glykosylierung umfassen.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 11 oder 12, wobei das virale Protein wenigstens eines von Influenzavirus-Neuraminidase und/oder -Hämagglutinin umfasst.
  14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Virus ein Enterovirus, wie ein Rhinovirus, Aphtovirus oder Poliomyelitisvirus ist.
  15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Virus ein Herpesvirus, wie Herpes-simplex-Virus, Pseudorabiesvirus oder Rinderherpesvirus ist.
  16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Virus ein Orthomyxovirus, wie ein Influenzavirus, ein Paramyxovirus, wie ein Newcastle-Virus, ein Respiratory-Syncytial-Virus, ein Mumpsvirus oder ein Masernvirus ist.
  17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Virus ein Retrovirus, wie ein menschliches Immunschwächevirus (HIV), ist, oder wobei das Virus ein Parvovirus oder ein Papovavirus ist.
  18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Virus ein Rotavirus oder ein Coronavirus, wie ein übertragbares Gastroenteritisvirus, oder ein Flavivirus, wie ein Zeckenencephalitisvirus oder Gelbfiebervirus, ist.
  19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Virus ein Togavirus, wie Rubellavirus oder Östliches, Westliches oder Venezuelanisches Pferde-Encephalomyelitisvirus, ist.
  20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Virus ein Hepatitis verursachendes Virus, wie Hepatitis-A- oder Hepatitis-B-Virus, ist.
  21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Virus ein Pestivirus, wie ein Schweinepestvirus, oder ein Rhabdovirus, wie ein Rabiesvirus, ist.
  22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Virus ein Bunyaviridae-Virus, wie ein Hantavirus, ist.
  23. Verwendung einer immortalisierten menschlichen Zelle, die eine Sequenz, die wenigstens ein E1-Protein eines Adenovirus oder ein funktionelles Derivat, Homolog oder Fragment davon codiert, in ihrem Genom aufweist, wobei die Zelle keine adenoviralen Strukturproteine produziert, für die Produktion eines Nichtadenovirus zur Verwendung in einem Impfstoff, wobei die menschliche Zelle von einem menschlichen embryonalen Retinoblasten abgeleitet ist.
  24. Verwendung gemäß Anspruch 23, wobei die menschliche Zelle eine Zelle wie hinterlegt unter ECACC-Nr. 96022940 oder ein Derivat davon ist.
  25. Verwendung gemäß Anspruch 23 bis 24, wobei die Zelle weiterhin eine Sequenz, die E2A oder ein funktionelles Derivat oder Analogon oder Fragment davon codiert, in ihrem Genom umfasst.
  26. Verwendung gemäß Anspruch 25, wobei das E2A temperaturempfindlich ist.
  27. Menschliche Zelle, die eine Sequenz, die wenigstens ein E1-Protein eines Adenovirus oder ein funktionelles Derivat, Homolog oder Fragment davon codiert, in ihrem Genom aufweist, wobei die Zelle keine adenoviralen Strukturproteine produziert, und eine Nucleinsäure, die ein Nichtadenovirus codiert, wobei die menschliche Zelle von einem menschlichen embryonalen Retinoblasten abgeleitet ist.
  28. Menschliche Zelle gemäß Anspruch 27, die von einer Zelle wie hinterlegt unter ECACC-Nr. 96022940 abgeleitet ist.
  29. Menschliche Zelle gemäß Anspruch 27 bis 28, die weiterhin eine Sequenz, die E2A oder ein funktionelles Derivat oder Analogon oder Fragment davon codiert, in ihrem Genom umfasst.
  30. Menschliche Zelle gemäß Anspruch 29, wobei das E2A temperaturempfindlich ist.
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