JPS6168428A - 牛アデノウイルス７型ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は、牛アデノウィルス７型ウィルスを山羊由来の
組織培養細胞で増殖させる方法、並びに得られたウィル
ス浮遊液を用いて調製されたワクチンに関し、さらに詳
しくは、牛アデノウィルス７型ウィルスを山羊由来の肺
、肝、牌、腎、精巣。

胸腺、甲状腺、その他の組織由来の培養細胞に接種し、
３０〜３７℃で培養又は継代順化させることによシ、牛
由来の組織培養細胞と同程度にウィルスを増殖させ、得
られたウィルス浮遊液を原材料として調製された生ワク
チン又は不活化ワクチンに関するものである。

〔発明の背景〕

牛アデノウィルス７型ウィルスは牛アデノウィルスの多
くの型（９型以上）の中で牛に対する病原性がもっとも
強く、牛に感染すると２〜３日の潜伏期で４１〜４２℃
の発熱がみられ、５〜７日間持続し、鼻汁、流涙、咳等
の呼吸器症状、又は発熱末期にかけて激しい下痢をとも
なった消化器症状を発症させる。幼牛はこれらの呼吸器
症状及び消化器症状を同時に発現する場合が多く、この
ような場合の死亡率は高い。近年、乳用ホルスタイン種
雄子牛の集団的な肉用肥育が行われるようになり、大き
な被害がみられている。本ウィルスは妊娠中に感染する
と胎児感染を起し、流産又は虚弱子症候群の原因ともな
っている。さらに、本ウィルスはしばしば他のウィルス
、例えば、牛の・セラインフルエンザウィルス３型、ア
ールニスウィルス、レオウィルス、ライノウィルス、牛
伝染性鼻気管炎ウィルス、牛ウィルス性下痢・粘膜病ウ
ィルス、牛、／＃ルボウイルス、牛コロナウィルス。

牛ロタウィルス等との２種又は３種以上のウィルスとの
混合感染を起すことがあシ、このような場合の被害はさ
らに大きくなる。このような状況のなかで本ウィルス感
染症に対する有効なワクチンの開発が急務とされている
。言うまでもなく、ワクチンの製造については、宿主動
物に対する外来の病原ウィルスの混入のない動物材料又
は培養細胞を用い、ウィルスを高度に増殖させる必要が
あるが、本ウィルスを牛以外の動物又は培養細胞で高度
に増殖させる方法はこれまでに提案されていない・した
がって、野外からのウィルス分離や分離ウィルスの弱毒
化には、もっばら子牛精巣培養細胞が用いられており、
ワクチンの製造に適する動物材料又は培養細胞の開発が
望まれている。

〔発明の目的〕 本発明はかかる観点から、牛以外の動物由来の培養細胞
を用いて高度に牛アデノウィルスを増殖させることので
きる培養法の提供を目的としてなされたものである。

また本発明の他の目的は、かかる培養法によって増殖さ
れたウィルスよシ製造されたワクチンを提供するところ
にある。

〔発明の概要〕

前記した目的に従って、本発明翳は牛以外の動物、すな
わち、モルモット、ハムスター、豚、サル及び山羊由来
の培養細胞を用いて、本ウィルスの増殖性を検討した。

これによると、モルモット。

ハムスター及びサル由来の培養細胞では、いずれも良好
な成績は得られず、豚の精巣初代培養細胞では少量のウ
ィルス増殖がみられたが、継代順化によってもウィルス
の増殖性を高めることには成功していない。これに対し
、山羊由来の培養細胞では非常に良好な結果が得られる
ことを知見した。

かかる観点から、本発明者は牛以外の動物として山羊を
選び、得られた組織から培養細胞を調製し、同培養細胞
での本ウィルスの増殖性を検討したところ、本ウィルス
が牛由来の培養細胞と同程度に増殖すること、さらには
本培養細胞から得られたウィルス浮遊液から調製した生
ワクチン及び不活化ワクチンが十由来の培養細胞から得
られたワクチンと同程度の有効性を保持していることを
見い出し本発明をなすに至ったものである。

以下本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、
本発明は実施例のみに限定されるものではない。

（１）山羊由来組繊細胞の培養 各種動物のπ■織由来の細胞培養法は、一般的には細胞
を消化剤で単離させ、その単離細胞を細胞培養液に浮遊
させ、宿主動物の体温に近い温度（３６〜３７℃）で培
養し、細胞層を形成させる単層培養法が用いられ、他に
、組織を可能な限シ細切し、その組織由来の性状を保持
させた状態で培養液に浮遊させ、宿主動物の体温に近い
温度で培養する器官培養法が用いられる。単層培養法に
は静置培養法、低速回転培養法、マイクロキャリアー培
養法、多重層培養法等の応用が可能である。

本発明ではこれらの各培養法が適用可能であるが、本例
では単層培養法の静置培養法を行なった。

細胞培養用の山羊組織は胎児又は生後３０日以内の子山
羊から得たものが、よシ良好な結果が得られる。各組織
を無菌的に採取し、細切した後、約２００倍量の０．Ｏ
ＩＭＩＪン酸緩衝食塩液（以下ＰＢＳという）に浮遊さ
せ、軽く撹拌しながら組織を洗浄し、適当な遠心沈殿管
に入れ、５００〜８００ｒｐｍで２分間遠心分離し、沈
殿に集められた組織を約２００倍量の０．２５％）リグ
シンＰＢＳ溶液、又は０．０１％ディスパーゼＰＢＳ溶
液中に浮遊させ、７〜１０℃又は３０〜３２℃でスター
ラー撹拌しながら細胞をばらばらに消化単離させる。単
離細胞浮遊液を適当な沈殿管に入れ、８００〜１１００
０ｒｐで２分間遠心分離し、沈殿に集められた単離細胞
を、約１００倍量の牛アデノウィルス７型つィルス抗体
陰性の山羊血清を５％の割合に含む平衡リン酸緩衝食塩
液に浮遊させ、撹拌洗浄後、８００〜１１０００ｒｐで
２分間遠心分離するつ沈殿に集められだ単離細胞を上記
同様にして洗浄する。

この操作は軽遠心した上清かほとんど透明になるまでく
りかえす。ついで、沈殿に集められた単離細胞をＳ胞増
殖用培養液（牛アデノウィルス７型つィルス抗体陰性の
山羊血清１０チ、ＴＰＢ　（Ｔｒｙｐｔｏａ。

Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｒｏｔｈ　）　０．２９５％及
び７％ＮａＨＣＯｓ溶液１％を含むイーグルＭＥＭ（Ｍ
ｉｎｉｍｕｍ　ＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）溶液
）に１１ｎｌ当たり５〜８×１０５個になるように浮遊
し、細胞培養びんの容量にしたがって規定量ずつ分注し
、３７℃で４〜５日間静置培養して細胞層を形成させる
。細胞の継代及び凍結保存は常法によって行う。通常こ
れらの培養細胞は５代以上の継代が可能である。

（２）ウィルスの山羊由来培養細胞での培養実施例１　
弱毒ウィルスの培養 生後７日の子山羊から肺、肝、牌、腎、胸腺及び精巣を
採取し、前記の細胞培養法で各培養細胞を調製し、試験
ては２００ＷＬｔ容量の培養びんに１０４ずつ分注し、
３７℃で４日間培養した継代２伏目の細胞を用いた。又
、ウィルス増殖用の対照培養細胞として子牛精巣培養細
胞を用いた。ウィルス株は子牛精巣培養細胞に３００の
低温培養法で継代順化された弱毒ウィルスＢＴ−３株（
農林水産省家畜試験場より分与）を用いた。ウィルス接
種は各培養細胞の培養液を除去し、ＰＢＳで細胞表面を
１回洗浄後、１０”　ＴＣＩＤ５ｏ／ｍｌ　（ｌ　ｒｎ
ｌ中の５０チ組織培養感染ウィルス量）のウィルス浮遊
液を１　ｍｌずつ接種°し、３７℃で６０分間感作して
ウィルスを吸着させた後、接種材料を除去し、細胞維持
用培養液（牛アデノウィルス７型つィルス抗体陰性の山
羊血清２チ、ＴＰＢ　Ｏ，２９５％及び７％ＮａＨＣＯ
ｓ溶液２チを含むイーグルＭＥＭ溶液）をＬｏｎ／ずつ
注加後、３７℃と３０℃で静置培養しながらＣＰＥ　（
Ｃｙｔｏ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｌｃ　Ｅｆｆｅｃｔ　：細
胞変性効果）出現状況を観察した。又、３７℃では培養
７日目に、３０℃では培養１４４日目培養液を採取し、
子牛精巣培養細胞を用いてウィルス含有量を測定した。

対照培養細胞として用いた子牛精巣培養細胞は３７℃で
は７日目、３０℃では１２２日目培養液を採取した。結
果は下記表１にみられるように、３７℃培養ではウィル
ス接種後７日目にはすべての培養細胞に２０〜５０％以
上のＣＰＥが出現し、その培養液１．　ｍｌ中のウィル
ス含有量は、２０％程度のＣＰＥを示した肝、牌、腎で
はそれぞれ１０５°８．１０６−０．１０５°’　ＴＣ
ＩＤ　　　５０％以上のＣＰＥを示した肺、胸腺、精巣
ではそれぞれ１０７”８゜１０’−８，１０”６ＴＣＩ
Ｄ５ｏであった。対照培養細胞のＣＰＥは８０％以上で
、その培養液１ｄ中のウィルス含有量は１０乙８ＴＣ■
Ｄ５ｏであった。３０℃培養では培饗１４日目では肺、
胸腺、精巣に２０〜５゜チのＣＰＥが出現したが、その
他の培養細胞ではＣＰＥが出現しなかった。これらの培
養液１　ｎＬｔ当たりのウィルス含有量は、ｃｐｇの出
現した肺、胸腺。

精巣ではそれぞれ１０’−２，１０”　、　１い０ＴＣ
ＩＤ５〇− ＣＰＥの出現しなかった肝、牌、腎ではそれぞれ１　（
）５．５　、１０４°０，１０ＴｃＩＤ５ｏテあった。

３０℃対照培養細胞のＣＰＥは１２２日目８０チ以上と
なり、その培養液ＩＭ当たりのウィルス含有量は１０６
・４ＴＣＩＤ５ｏであった。以上の成績は本ウィルスが
山羊由来の培養細胞で牛由来の培養細胞と同程度に増殖
することを示している。

表１　山羊由来培養細胞での弱毒ウィルスの培養※Ｉ　
ＣＰＥ　ニー陰性、＋２０％以下、＋５０％。

−１＋１７０％　、＋））８０％以上 ※２ウィルス含有量：　ｌｏｇ　１０ＴＣＩＤ５ｏ／ｍ
Ｉ！　。

子牛精巣培養細胞で測定 実施例２　残害ウィルスの培養 生後３日の子山羊から肺、腎、甲状腺、胸腺及び精巣を
採取し、前記の細胞培養法で各培養細胞を調製し、試験
には５００ゴ容量の培養びんに３０ｍ１ずつ分注し、３
７℃で４日間培養した継代２伏目の細胞を用いた。又、
ウィルス増殖用の対照培養細胞として子牛精巣培養細胞
を用いた。ウィルス株は牛に病原性を示す残雪な袋井法
（農林水産省家畜試験場より分与）を用いた。ウィルス
接種は各培養細胞の培養液を除去し、ＰＢＳで細胞表面
を１回洗浄後、１０５゛０ＴＣより５ｏ／ゴのウィルス
浮遊液を５ｄずつ接種し、３７℃で６０分間感作してウ
ィルスを吸着させた後、接種材料を除去し、細胞維持用
培養液を５０ゴずり注加後、３７℃で・静置培養しなか
らＣＰＥ出現状況を観察した。又、培養液の一部をウィ
ルス接種後５日、８日及び１００日目抜き取り、そのウ
ィルス含有量を子牛精巣培養を用いて測定した。結果は
下記表２にみられるように、　ＣＰＥの出現は胸腺細胞
で４日目から、肺及び甲状腺細胞で７日目から認められ
たが、腎及び精巣細胞では培養１００日目で認められな
かった。ウィルス増殖のピークは大部分の培養゛細胞で
５日目前後とみられ、７日目以降ｃｐＦＪの認められた
肺、甲状腺、胸腺由来の培養液１ｄ当たりのウィルス含
有量は５日目でそれぞれ１０　　　。

１０５−０．１０’°８ＴＣより５ｏで、１００日目は
それぞれ１０”８゜１０５°３．１０”８ＴＣＩＤ５ｏ
であった。ＣＰＥの出現しなかった腎及び精巣細胞の培
養液では１００日目１０５・０゜１０６°０ＴＣより５
ｏ〜の値を示した。対照として用いた子牛精巣培養細胞
ではウィルス接種後３日目からＣＰＥが出現し、８日目
には８０％以上となり、その培養液１−当たシのウィル
ス含有量は１０８・０ＴＣＩＤ５ｏであった。以上の成
績は、牛アデノウィルス７型強毒ウィルス袋井株が山羊
由来の培養細胞で増殖することを示しているが、その程
度は牛由来の培養細胞に若干劣ることが示されている。

実施例３　残置ウィルスの継代順化 実施例２において、山羊由来の培養細胞では残雪つィル
ス袋井株の増殖が牛由来の培養細胞の場合よりも劣る傾
向が示されたので、本ウィルスの山羊由来培養細胞への
継代順化を試みた。試験に用いた培養細胞は実施例２に
用いた子山羊の肺。

胸腺及び精巣細胞の継代４〜８代のものを用いた。

ウィルスは実施例２の培養１０日目に採取した各培養細
胞系のものを用いた。ウィルスの継代は１０４°７〜１
０５°３ＴＣＩＤ５ｏ／ｍのウィルス浮遊液を、実施例
２と同様の方法で接稲し、吸着させた後培養液を加え、
３７℃で７日間培養する方法で７〜１０代行った。その
結果、下記表３にみられるようにいずれの培養細胞でも
培養７日目までのＣＰＥは、ウィルスの継代が進むにつ
れてその程度が強く現れるようになり、肺培養細胞では
継代３代目から５０％、８代目から８０％以上、胸腺培
養細胞では２代目から５０％、６代目から８０％以上、
精巣培養細胞では２代目まではＣＰＥが出現しなかった
が、３代目で２０％、６代目で５０％　、８代目で８０
チ以上となった。培養液中のウィルス含有量はＣＰＥの
程度が強く現れるのに平行して増加し、肺培養細胞では
継代７代以降、胸腺培養細胞では継代４代以降、精巣培
養細胞では継代７代以降いずれも１０　　ＴＣＩＤ５ｏ
／ｍＪ以上となり、その最高値は胸腺培養縄胞継代５伏
目の１０８°０ＴＣＩＤ５ｏ／ｍｌ！であった。以上の
成績は残雪つィルス袋井株が山羊由来の培養細胞に順化
し、牛由来の培養細胞の場合と同程度に増殖することを
示している。

（３）ワクチンの調製 ワクチンには、対象動物に病原性を示さないように弱毒
化された生きたウィルスを用いた生ワクチンと、弱毒ウ
ィルス又は残雪ウィルスを薬剤又はその他の方法で殺し
、免疫原性のみを保持させた不活化ワクチンとがあり、
以下これらの各実施例について示す。

実施例４　生ワクチンの調製及び牛への応用生ワクチン
の調製 暗合１３７日の山羊胎児から肺、肝、牌、腎。

胸腺、筋肉、皮膚の各組織を採取し、前記（１）の細胞
培！法によって各培養細胞を調製した。試験には５００
Ｍ容量の培養びんに３０Ｍずつ分注し、３７℃で４日間
培養した継代３伏目の各細胞を用いた。ウィルス株は弱
毒ウィルスＢＴ−３株を山羊胸腺培養細胞で３代限界希
釈継代したクローンを同培饗細胞でさらに２伏縫代増殖
させたＢＴ−３−ＧＴｈ　５株を用いた。ウィルス接種
は各培養細胞の培養液を除去し、細胞表面をＰＢＳで１
回洗浄後、１０５°５ＴＣより５０／Ｔｎｌ！のウィル
ス浮遊液を５Ｍずツ接ｉし、３７℃で６０分間感作して
ウィルスを吸着させた後、接種材料を除去し、細胞維持
用培養液５０−ずつを注加し、３２〜３４℃で静置培養
した。培養７日目には２０〜８０％のＣＰＥが出現した
ので、各培養細胞ごとに培養液を採取混合した。

各培養液１４当たりのウィルス含有量は、ＣＰＥが２０
〜５０％であった肝、牌、腎の各培養細胞由来では、そ
れぞれ１０５°０　、１０５．８　、１０５°５ＴＣＩ
Ｄ５ｏでありたが、ＣＰＥが８０％以上を示したその他
４種の培養細胞由来では１０７・５〜１０７°７の高い
値が得られた。高い値の得られた前記４種の細胞培養液
を混合し、軽遠心した上液をワクチン調製用のウィルス
浮遊液とし、これを２分し、その一方にはへ安定剤（乳
糖１０％及びポリビニールピロＩＪ）’：１０．３チ溶
液）を、他方には−Ｂ安定剤（ペプトン１０％及びポリ
ビニールピロリドン０．３％溶液）を等量加え、１０ｄ
容量のバイアルに１ｒｎｌずつ分注し、凍結乾燥後、減
圧下で封じ、前者をＬｏｔＡｌ、後者をＬｏｔＡ２とし
、２０ツトの生ワクチンを調整した。本ワクチンを１０
ｄずつの溶解用液（Ｑ、ＯＩＭ平衡平衡リン酸緩衝液塩
液溶解し、子牛精巣培養細胞を用いてウィルス含有量を
測定した結果、ＬｏｔＡｌでは１０５゛５ＴＣＩＤ５ｏ
／コ、ＬｏｔＡ２では１０５°６ＴＣＩＤ５ｏ／ｍ７で
あった。この成績は、弱毒ウィルスの約１０３゛０ＴＣ
より５ｏを牛に注射すると十分な免疫が付与されること
から、山羊由来培養細胞で得られたウィルス浮遊液から
高力価の生ワクチン製造が可能なことを示している。

生ワクチンの安全性 前記により調整した生ワクチンＬｏｔＡ１及び２の各２
本ずつを２　ｍｌの溶解用液で溶解（含有ウィルス量１
０６．８及び１０６°９Ｔｃより５ｏ）シ、これを体重
１７８〜１９３ゆのアデノウィルス７型ウィルス抗体陰
性の子牛１頭ずつに皮下注射し、１頭を非注射対照牛と
して同居させた。これらの子牛は毎日元気・食欲の異常
、鼻汁及び下痢の有無等の臨床症状の観察、体温及び白
血球数の計測を１４日間、血液、糞便及び鼻汁からのワ
クチンウィルスの回収を１０日間実施した。又、ワクチ
ン注射後７日、１４日、２１日目に血清中の牛赤血球凝
集抑制（ＨＩ−）抗体価を測定した。その結果、試験牛
は観察期間中まったく異常を示さず経過し、体温及び白
血球数にも異常が認められなかった。又、血液。

糞便及び鼻汁からのウィルス回収もすべて陰性であった
。ＨＩ抗体はワクチン注射牛では７日目から検出され、
その値は２０倍と４０倍、１４日目には４０倍と８０倍
、２１日目にはいずれも１６０倍となった。一方、同居
牛は同居２１日後においてもＨＥ抗体は検出されなかっ
た。以上の結果は下記表４に示した通りであυ、本ワク
チンウィルスが有効量（１０３゛０ＴＣｒＤ５ｏ）の約
５０００倍量を子牛に注射しても安全であることを示し
ている。

生ワクチンの免疫原性 前記生ワクチンＬｏｔ　Ａ　１及び２を１０１ｎｌの溶
解用液で溶解し、さらに溶解用液を用いて２００倍に希
釈してＩＷｌｌ当たシのウィルス含有量がＬｏｔＡｌで
は１０”２ＴＣＩＤ！、０　、Ｌｏｔ　Ａ　２では１０
３−’　ＴＣＩＤ５ｏになるように調整したものを注射
材料とした。供試牛は体重１６７〜２３５鞄の牛アデノ
ウィルス７型つィルス抗体陰性の子牛５頭を選出した。

２頭にはＬｏｔＡ１希釈ワクチンの１　ａｔずつを、２
頭にはＬｏｔＡ２希釈ワクチンの１ゴずつを、それぞれ
皮下注射し、１頭は残置ウィルス攻撃対照として、ワク
チン注射中に同居させた。これらの子牛は毎日元気・食
欲の異常、鼻汁及び下痢の有無等の臨床症状の観察、体
温及び白血球数の計測を１４日間行うとともに、７日ご
とに２８８日目でＨＩ及び中和抗体価を測定した。さら
に、これらの試験中はワクチン注射後２８日目に残置つ
ィルス袋井株の１０７°０ＴＣＩＤ５ｏを皮下注射する
方法で攻撃し、臨床症状の観察、体温及び白血球数の計
測、血中からの攻撃ウィルスの回収を１４日間行うとと
もに攻撃後７日目及び１４４日目ＨＩ及び中和抗体価を
測定した。結果は表５にみられるように、ワクチン注射
による臨床症状２体温及び白血球数の異常はいずれの牛
にも認められなかった。Ｔ（Ｉ及び中和抗体応答はワク
チン注射後７臼目には４頭中３頭（７５％）に、１４４
日目は金側に認められ、強含ウィルス攻撃時（ワクチン
注射後２８日目）にはＨＩ抗体で４０〜８０倍、中和抗
体で１６〜６４倍の値が検出された。これらのワクチン
注射中は残雪ウィルス攻撃後も臨床症状１体温及び白血
球数の異常をまったく示さず経過し、血中ウィルスの検
出も陰憔てあり、さらに攻撃後の抗体上昇がまったく認
メラレず、１０乙０Ｔｃより５ｏの攻撃ウィルスに対シ
完全な防御を示した。一方、ワクチン非注射対照牛は典
型的なアデノウィルス７型感染症の症状を示して耐過し
、血清中には高いＨＩ及び中和抗体が産生された。以上
の成績は、山羊由来の培養細胞を宿主として作出された
生ワクチンは１０’°０ＴｃＩＤ５゜前後の注射ウィル
ス量で約１カ月後には野外の残置ウィルスの感染を防御
することを示している。

実施例５　不活化ワクチンの調製及び牛への応用不活化
ワクチンの調製 ３０日令の子山羊から肺、胸腺及び精巣の各組織を採取
し、前記（１）の細胞培養法によって各培養細胞を調製
した。試験には５００ｄ容量の培養びんに３０ｍ１ずつ
分注し、３７℃で５日間培養した継代３伏目の細胞を用
いた。ウィルス株は残置つィルス袋井株の山羊精巣培養
細胞継代７伏目のウィルスを用いた。ウィルス接種は各
培養細胞の培養液を除去し、細胞表面をＰＢＳで１回洗
浄後、１０５゛５ＴＣＩＤ、、ｏ／ｒｎｌのウイ、Ｉ＋
／ス浮遊液を５ｒＬｌずつ接種し、３７℃で６０分間感
作してウィルスを吸着させた後、接種材料を除去し、細
胞維持用培養液５０ゴずつを加え、３７℃で静置培養し
、ウィルス接種後７日目に各培養細胞ごとに培養液を採
取混合した。ついで軽遠心後、その上液の一部はウィル
ス含有量測定用とし、残部にはホルマリンを０．２％の
割合に添加し４℃で７日間不活化した。

不活化ウィルス浮遊液に１／１０量のリン酸アルミニウ
ムグルを添加し、２目抜３ＯＮ容量のバイアルに３０ｄ
ずつ分注後封栓し、肺、胸腺及び精巣培養細胞由来の順
にＬｏｔＡｌ、２．３とし、３０ツトの不活化ワクチン
を調製した。これらの不活化ワクチン調製用ウィルス浮
遊液の不活化前のウィルス含有量１ｄ、ツレツレ１ｏ乙
５．１ｏ８°０．１ｏ８゛０ＴｃＩＤ５゜でありた。以
上の成績は本不活化ワクチン中に十分な抗原量が含有さ
れていることを示している。

また、この他に山羊由来の肝、牌、筋肉、皮膚の各組織
を用いて調整した不活化ワクチンについても、十分な抗
原量の含有されていることが確認された。

不活化ワクチンの安全性 前項鵞＼（至）で試作した不活化ワクチン３０ツトを、
体重２１０〜２３０ｋｇの牛アデノウィルス７型つィル
ス抗体陰性の子牛１頭ずつに、それぞれ１０ｄずつ頚部
筋肉内に注射し、元気・食欲の異常、鼻汁及び下痢の有
無等の臨床症状の観察と体温測定を１４日間行うととも
に、ワクチン注射後７日、１４日及び２１日目にＨＩ抗
体価を測定した。その結果は下記表６に示す通シであり
、試験牛は観察期間中まったく異常を示さず経過した。

血清中のＨＩ抗体はワクチン注射後１４回圧までは検出
されなかったが、２１日回圧金側に２０〜８０倍の値が
検出された。この成績は、本不活化ワクチン中の装置ウ
ィルスが完全に不活化され、子牛に対して安全なことを
示している。

不活化ワクチンの免疫原性 前項２−　（１）で試作した不活化ワクチン３０ツトを
、体重１７８〜２１３ｋｇの牛アデノウィルス７型つィ
ルス抗体陰性の子牛２頭ずつに、それぞれ３ｄずつ２８
日間隔で２回頚部筋肉内に注射し、元気・食欲の異常、
鼻汁及び下痢の有無等の臨床症状の観察と体温測定をワ
クチン注射後１４日間実施するとともに、ワクチン第１
回注射直前、第１回注射直前及び第２回注射後１４日目
に血清中のＨＩ及び中和抗体を測定した。結果は表７に
みられるようだ、試験中は観察期間中まったく異常を示
さず経過し、ワクチン第２回注射直前にはいずれも１０
〜４０倍のＨＩ抗体及び２〜１６倍の中和抗体が検出さ
れた。これらのＨＩ及び中和抗体価はワクチンの第２回
注射後１４日目にはさらに上昇し、ＨＩ抗体は４０〜３
２０倍、中和抗体は３２〜２５６倍の値を示した。以上
の成績は、本不活化ワクチンが有効な免疫原性を保持し
ていることを示している。

〔発明の効果〕

本発明によって、牛アデノウィルス７型ウィルスを山羊
由来の組繊細胞によって培養増殖させることが実現され
、これによって本ウィルス感染症に対する有効なワクチ
ンを初めて提供することができるものとなったものであ
り、その有用性は極めて犬なるものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　牛アデノウイルス７型のウイルスを山羊由来の組織
   培養細胞を用いて増殖させることを特徴とするウイルス
   の培養法。 ２　牛アデノウイルス７型のウイルスを山羊由来の組織
   培養細胞を用いて増殖させ、得られたウイルス浮遊液を
   出発材料として調製されたことを特徴とするワクチン。