RU2266326C1 - Штамм "ленинградский" вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней для изготовления диагностических и вакцинных препаратов - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Штамм вируса ТГЭС (авторское наименование "Ленинградский") выделен и получен последовательными пассажами на культурах клеток СП и СПЭВ. Штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов ВНГКИ под регистрационным наименованием "Ленинградский - ВНИИЗЖ-ДЕП". Вирус штамма "Ленинградский" наиболее эффективно размножается в 3-4/суточном монослое клеток СПЭВ, полученном на роллерных сосудах, достигая через 24-30 часов культивирования уровня инфекционной активности 7,0-8,0 Ig ТЦД₅₀/см³. Сохраняет исходные характеристики в течение 18 месяцев хранения и в течение 9-10 пассажей на культуре клеток СПЭВ (срок наблюдения). Технический результат: изобретение расширяет арсенал производственных штаммов вируса ТГЭС, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и пригодных для изготовления высокоспецифических и чувствительных диагностикумов и высокоиммуногенных и безвредных инактивированных вакцинных препаратов. 7 табл.

Description

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств диагностики и профилактики трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГЭС).

Трансмиссивный гастроэнтерит свиней (инфекционный гастроэнтерит свиней, болезнь Дойла и Хатчингса) - инфекционная высококонтагиозная болезнь, главным образом поросят до 3-недельного возраста, характеризующаяся катарально-геморрагическим гастроэнтеритом, рвотой, профузной диареей, дегидратацией организма и сопровождающаяся атрофией ворсинок верхнего отдела тонкого кишечника и высокой смертностью (часто до 100%) среди поросят первой недели жизни.

Заболевание широко распространено в большинстве стран мира с развитым свиноводством, в том числе в государствах СНГ, и наносит весьма значительный экономический ущерб. Он складывается из высокой смертности новорожденных поросят, низкой эффективности профилактики и лечения, а также сложности предупреждения заноса инфекции.

Возбудитель ТГЭС имеет вирусную этиологию. Его вирусную этиологию подтвердили американские исследователи Дойл и Хатчингс (1946), когда они описали фильтруемость этиологического агента ТГЭС. Вирус ТГЭС впервые выделил и описал японский исследователь Тайама (1970). Вирус ТГЭС относится к семейству Coronaviridae, роду Coronavirus.

К настоящему времени в различных регионах мира выделено большое количество изолятов вируса ТГЭС, которые не имеют серотипических различий, и по результатам реакции нейтрализации (РН) отнесены к одному серотипу. Выделенные изоляты вызывают сходную клиническую картину при заражении восприимчивых поросят 1-10-дневного возраста, полученных от неиммунных к вирусу ТГЭС свиноматок.

Выделенные изоляты вируса ТГЭС используют для изготовления вакцин, действие которых основано на том, что вируснейтрализующие колостральные антитела, вырабатываемые организмом свиноматок в ответ на введение им вакцинного вируса, обеспечивают защиту подсосных поросят от заражения вирулентным вирусом ТГЭС.

Для профилактики ТГЭС в России и за рубежом получили распространение живые и инактивированные вакцины из аттенуированного или убитого вируса ТГЭС различных штаммов (1).

Известен штамм V-52 вируса ТГЭС для изготовления вакцинных препаратов (2).

Известен штамм "№5 ВГНКИ" вируса ТГЭС для изготовления вакцинных препаратов (3).

Известен штамм "МК-25" вируса ТГЭС для изготовления вакцинных препаратов (4).

Известен штамм "ЛУК" респираторного коронавируса свиней (РКВС) для изготовления вакцинных препаратов против ТГЭС (5).

Известен штамм CAPM-V355 РКВС для изготовления вакцинных препаратов против ТГЭС (6).

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм "№1941 ВНИИВВиМ" вируса ТГЭС для изготовления вакцинных препаратов (7).

Недостатки известных штаммов, в том числе и штамма-прототипа, состоят:

1) в их остаточной вирулентности и низкой иммуногенной активности;

2) в непригодности для изготовления инактивированных вакцин.

В задачу создания настоящего изобретения входило получение нового производственного штамма вируса ТГЭС, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и обеспечивающего изготовление высокоспецифичных и чувствительных диагностикумов и высокоиммуногенных и безвредных инактивированных вакцинных препаратов.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала производственных штаммов вируса ТГЭС, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и пригодных для изготовления высокоспецифичных и чувствительных диагностикумов и высокоиммуногенных и безвредных инактивированных вакцинных препаратов.

Указанный технический результат достигнут получением штамма "Ленинградский" вируса ТГЭС (авторское наименование).

Штамм "Ленинградский" выделен в 1995 году из тонкого отдела кишечника больных поросят-сосунов, принадлежащих свинокомплексу ГПЗ "Восточный" Тосненского района Ленинградской области, серийными пассажами на первичной культуре клеток почки свиньи (СП) и адаптирован на 12 пассаже к перевиваемой монослойной культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) с титром, по меньшей мере, 7,5 Ig ТЦД₅₀/см³. Вирус штамма "Ленинградский" является слабовирулентным для свиней.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) МСХ РФ 27 апреля 2001 года под регистрационным наименованием "вирулентный эпителиотропный культуральный штамм "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ТГЭС.

По сравнению с прототипом штамм "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ТГЭС обладает более высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления диагностических препаратов и инактивированной вакцины против ТГЭС, обеспечивающей защиту восприимчивых животных против возбудителя заболевания, циркулирующего на территории России.

Штамм "Ленинградский ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ТГЭС характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

При электронномикроскопическом исследовании вируссодержащего материала установлено, что вирус штамма "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП" является оболочечным, плеоморфным, диаметром 80-150 нм, имеет один слой булавообразных отростков на поверхности проекции длиной 12-25 нм, т.е. штамм морфологически тождественен представителям сем. Coronaviridae, рода Coronavirus.

Антигенные свойства

Штамм "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ТГЭС индуцирует синтез вируснейтрализующих и преципитирующих антител к вирусу ТГЭС в организме свиней и кроликов. Его антигенное родство изучали в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН). Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности).

Биотехнологические характеристики

Штамм "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП" является слабовирулентным, эпителиотропным, культуральным. Наиболее эффективно размножается в перевиваемой культуре клеток СПЭВ с выраженным ЦПД, проявляющемся в округлении и гибели клеток с последующей деструкцией монослоя через 24-30 часов после его заражения.

Оптимальными условиями выращивания вируса ТГЭС в культуре клеток СПЭВ являются заражение 3-4-суточного монослоя, полученного на роллерных сосудах, в дозе 0,1 ТЦД₅₀/кл и снятие урожая чрез 24-30 часов после инфицирования.

Титр вируса в указанной культуре клеток достигает 8,0 Ig ТЦД₅₀/см³. При титровании вирусной суспензии обнаружилось, что при 70-80% ЦПД титр вируса на 0,5-1,25 Ig ТЦД₅₀/см³ выше, чем при 90-100% поражения монослоя. Результаты адаптации предлагаемого штамма к перевиваемым культурам клеток, изучения динамики накопления вируса в клеточной культуре СПЭВ в зависимости от возраста монослоя, времени культивирования и дозы заражения культуры клеток вирусом приведены в таблицах 1, 2, 3 и 4.

Хемо- и генотаксономическая характеристика

Штамм "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП" является РНК-содержащим вирусом. Вирус содержит одну большую полиаденилированную плюс РНК (>23кД). РНК, экстрагированная из вирионов, обладает инфекционностью. Вирус был исследован методом ПЦР и в пробе подтверждено наличие только геномной РНК.

В процессе репликации вируса синтезируется 5-7 субгеномных мРНК с общими 3'-концами для продукции вирусных белков. Определена нуклеотидная последовательность по 3'-концу генома, соответствующая мРНК. Плавучая плотность вирионов в градиенте сахарозы составляет 1,18-1,20 г/см³. Фосфо- и гликолипиды, инкорпорированные в оболочку, имеют клеточное происхождение, т.е. оболочка вириона является клеточнозависимой. Вирус содержит 3 главных структурных белка: нуклеокапсидный белок (N), мелкий оболочечный гликопротеин (М) и большой гликопротеин пепломеров (S).

В зрелом вирионе N-протеин "вплетен" в вирусную РНК, образуя рибонуклеопротеидный комплекс.

Гетерофильный N-конец гликопротеина М выступает из вириона, имеет единственный доступный гликопротеиновый сайт и обеспечивает индукцию комплементсвязывающих и вируснейтрализующих антител, а также интерферона. Гликопротеин S (или пепломерный белок) мол.массы 195-220 кД смотрится на электронограммах как корона вируса. Он отвечает за прикрепление вируса к клетке, расплавление мембраны и индукцию комплементнезависимых вируснейтрализующих антител. Очищенный S-гликопротеин индуцирует образование вируснейтрализующих антител, которые нейтрализуют репликацию вируса на всех стадиях. Определен 3' участок генома вируса. Этот участок содержит 3 главных структурных гена с согласованностью коронавирусной ориентации 5'-S-M-N-3' и 4 больших открытых рамки считывания, которые кодируют потенциальные вирусные протеины.

5' часть генома кодирует вирусную репликазу/транскриптазу.

Вирулентные свойства

Штамм "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП" является слабовирулентным для свиней.

Иммуногенные свойства

При введении лабораторным животных (кролики, морские свинки) и поросятам-сосунам вызывает образование специфических антител и устойчивость поросят-сосунов к прямому заражению вирулентными штаммами вируса ТГЭС.

Устойчивость к внешним факторам

Вирус штамма "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП" чувствителен к эфиру, хлороформу и дезоксихолату натрия, устойчив к трипсину. Не подавляется ДНК ингибиторами. Инактивируется 0,03% раствором формалина, 1% Lysovet (смесь фенола и альдегида), 0,01% раствором β-пропиолактона, гипохлорита натрия, едкого натра, йода. Вирус устойчив к замораживанию. В замороженном виде вируссодержащий материал сохраняется 5-8 недель, при -18°С до 18 месяцев, при -20, -40 или -80°С не менее 365 дней. При нагревании до 56°С инактивируется за 30 минут и до 50°С в присутствии 1 М MgCl₂ - за 1 час. При 37°С полная потеря инфекционности наступила через 4 дня. Устойчив к рН (4-9). Амантадин и пуромицин тормозят репродукцию вируса. Вирус стабилен в желчи поросят при рН 3,0, сохраняющую его инфекционность в тонком кишечнике.

Условия хранения

Штамм хранится в нативном состоянии при температуре -70°С, рН среды 7,2-7,4. Допустимая длительность хранения без освежения 18 месяцев.

Стабильность основных свойств штамма

В течение 18 месяцев хранения не снижает титр инфекционной активности, сохраняет антигенную (в РМН) и иммуногенную активность, а также стабильность генетических свойств как в период хранения, так и в пассажах на СПЭВ (9-10 пассажей).

Дополнительные сведения о штамме

Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами, грибами и другими вирусами.

На основании полученных данных можно утверждать, что штамм "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП" по антигенному и иммуногенному спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным изолятом вируса ТГЭС.

По мнению заявителя, предлагаемый штамм соответствует установленным Патентным законом России условиям патентоспособности "новизна" и "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования.

Пример 1.

Исходный вирус для получения штамма "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП" выделен в 1995 году из тонкого отдела кишечника больных поросят-сосунов, принадлежащих свинокомплексу ГПЗ "Восточный" Тосненского района Ленинградской области, серийными пассажами на первичной культуре клеток СП.

Вакцинный штамм получен в ФГУ ВНИИЗЖ путем адаптации к перевиваемой культуре клеток СПЭВ. Штамм является слабовирулентным для свиней.

Результаты исследований по адаптации вируса ТГЭС штамма "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП" к перевиваемым культурам клеток представлены в таблице 1.

Полученный вирус был подвергнут всестороннему контролю в соответствии с руководством МЭБ по стандартным диагностическим методам и вакцинам (1996) и на уровне 12 пассажа в культуре клеток СПЭВ заложен на хранение в качестве матровой расплодки. Вирус матровой расплодки с титром инфекционной активности, по меньшей мере 7,5 Ig ТЦД₅₀/см³ представлен в виде нативной суспензии культуральной жидкости и пораженного монослоя, хранится при температуре -70°С.

Полученному штамму вируса ТГЭС присвоено авторское наименование "Ленинградский". Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ под регистрационным наименованием "вирулентный эпителиотропный культуральный штамм "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ТГЭС.

Пример 2.

Вирулентные свойства штамма "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП" изучены на "домолозивных" поросятах.

Для сравнения в опытах использовали также суспензию из "фарша", используемого в хозяйствах для изготовления "тканевой" вакцины для иммунизации свиноматок против ТГЭС, и аттенуированные штаммы "Purdue" (эталонный) и "№5 ВГНКИ". Последний используется для производства вирусвакцины на Омском биокомбинате.

Каждую зараженную и контрольную группу животных содержали изолированно. Клинические наблюдения вели в течение 48 часов. Результаты этих опытов приведены в таблице 5.

Согласно данным таблицы 5 штаммы "Purdue" и "№5 ВГНКИ" являются авирулентными, так как все зараженные ими поросята оставались клинически здоровыми за период наблюдения.

Поросята, зараженные вирусом штамма "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП", заболели через 24 часа с проявлением типичной клинической картины ТГЭС: у них отмечали диарею, поросята сильно исхудали и из десяти инфицированных три поросенка пали в течение 48 часов после заражения.

Все поросята, зараженные суспензией из "фарша", заболели через 18 часов с проявлением характерной клинической картины ТГЭС: диарея у всех зараженных поросят, шерстный покров на всей поверхности имел грязно-желтый цвет, западение глазного яблока, взъерошенность шерстного покрова, шаткость походки, гибель поросят через 24-48 часов. Контрольные, т.е. не зараженные поросята оставались клинически здоровыми в течение 48 часов (срок наблюдений).

Таким образом, вирус штамма "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП" обладает слабой вирулентностью для "домолозивных" поросят.

Пример 3.

Проведены сравнительные испытания антигенных свойств штаммов "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП" и "Purdue" вируса ТГЭС. Для этого на них были получены гипериммунные сыворотки от взрослых кроликов. В опытах использовали очищенные антигены с инфекционной активностью, по меньшей мере, 7,5 Ig ТЦД₅₀/см³, которые смешивали с масляным адъювантом Montanide ISA-70 в соотношении 1:1,5, получая водно-масляную эмульсию. Полученные препараты вводили кроликам внутримышечно в объеме 2,0 см³ двукратно с интервалом в 14 дней. Пробы крови от кроликов отбирали до и через 14-30 дней после иммунизации и сыворотки исследовали в РМН на наличие антител против эталонного штамма "Miller" вируса ТГЭС. Результаты исследований представлены в таблице 6.

Из данных, представленных в таблице 6, видно, что на 14 день после иммунизации против испытуемых штаммов в сыворотках крови кроликов образовались специфические вируснейтрализующие антитела. После повторной иммунизации уровень антител во всех группах повысился, при этом средний уровень антител в группе животных, иммунизированных эмульсионным препаратом из штамма "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП", составил 6,5±0,25 log₂, который практически не отличается от среднего уровня антител в 6,66±0,31 log₂ в группе животных, иммунизированных эмульсионным препаратом из штамма "Purdue".

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что предлагаемый штамм обладает высокой антигенной активностью и пригоден для изготовления диагностических препаратов.

Пример 4.

Инактивированную эмульсионную вакцину против ТГЭС из штамма "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП" получают следующим образом.

Для изготовления вакцины используют выращенную в роллерных сосудах культуру клеток СПЭВ с хорошим монослоем 3-4-суточного возраста. В качестве ростовой используют среду ПСП с добавлением сыворотки. Для изготовления 20 литров вируссодержащей суспензии вируса ТГЭС берут от 90 до 100 роллерных сосудов с культурой клеток емкостью 3,0 дм³ каждый. После слива ростовой среды клеточный монослой промывают раствором Хенкса или фосфатно-буферным раствором с рН 7,2-7,4, затем в роллерные сосуды вносят по 3-5 см³ вируса ТГЭС матриксной серии. После 40-60 минут инкубирования при температуре 37±2°C в роллерные сосуды вносят по 250-300 см³ поддерживающей среды (без сыворотки КРС).

Зараженные роллерные сосуды помещают в термальную комнату на вращающиеся роллерные установки для культивирования при 37±2°C.

Срок культивирования от 24 до 28 часов. Для контроля незараженными оставляют 2 роллерных сосуда, в которых ростовую среду меняют на 300 см³ поддерживающей среды. Начиная с 18 часа инкубирования, инфицированные и контрольные роллерные сосуды периодически микроскопируют. Роллерные сосуды, в которых наблюдаются цитопатические изменения с поражением до 70% клеточного монослоя (обычно через 24-28 часов) собирают и 3-кратно замораживают при температуре -20°С и оттаивают. После этого содержимое роллерных сосудов сливают в одну емкость и охлажденную вируссодержащую суспензию, соблюдая стерильные условия, освобождают от клеточного детрита центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин. Очищенная от детрита суспензия имеет вид прозрачной жидкости розовато-вишневого цвета. В очищенную суспензию вносят гентамицин (50 мкг/см³) и перемешивают 20 мин. Затем из емкости отбирают пробу для лабораторно-производственного контроля на стерильность и инфекционную активность вируса. Производственная серия ТГЭС должна иметь инфекционную активность, по меньшей мере, 6,5 Ig ТЦД₅₀/см³. Полученный вирус подвергают инактивации. Для этого в вируссодержащую суспензию, нагретую до 26-28°С, вносят при постоянном перемешивании 25-32% раствор аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) до конечной концентрации 0,008% и устанавливают значение рН 7,2-7,6. Инактивацию ведут при 37±2°C в течение 22-24 часов с периодическим перемешиванием. По окончании инактивации суспензию охлаждают до 4-6°С, поддерживая рН на уровне 7,2-7,6. Затем отбирают пробы антигенного материала для проверки его на стерильность и авирулентность.

Антиген из культурального вируса ТГЭС считают пригодным для составления вакцины, если:

- грибково-бактериальная микрофлора отсутствует;

- антиген ТГЭС на СПЭВ не вызывает ЦПД.

Эмульсионную вакцину готовят путем диспергирования смеси антигенного материала с масляным адъювантом Montanide ISA-70 (фирма Seppic, Франция). Для этого 2 части антигена и 3 части масляного адъюванта пропускают через коллоидные мельницы в течение 5-10 минут и готовую инактивированную эмульсионную вакцину собирают в одну стерильную емкость. Вакцину расфасовывают по 10, 50, 100 и 200 см³ в стерильные стеклянные флаконы, которые закрывают стерильными резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками.

Готовая вакцина представляет собой эмульсию бело-розового цвета. При хранении вакцины возможно образование белого или бело-розового неплотного осадка, устраняющегося при встряхивании.

Полученную вакцину подвергают контролю на содержание водородных ионов (рН) в пределах 7,3±0,3, стерильность, стабильность, вязкость (55±20 мм²/с), полноту инактивации, безвредность и иммуногенную активность.

Вакцина предназначена для профилактической иммунизации свиней против ТГЭС.

Пример 5.

Проведены испытания иммуногенной активности инактивированной эмульсионной вакцины против ТГЭС из штамма "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП", изготовленной так, как описано в примере 1.

Оценку проводили по результатам исследования в РМН против штамма "№5 ВНГКИ" вируса ТГЭС сывороток крови и молозива от вакцинированных свиноматок и поросят, полученных от них. Результаты этих исследований приведены в таблице 7.

В таблице 7 представлены убедительные доказательства того, что предлагаемый штамм обладает высокой иммуногенной активностью, безвредностью и пригоден для изготовления вакцинных препаратов.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:

- штамм "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП", воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;

- для предлагаемого изобретения в том виде как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- штамм "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП", полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, пригоден для изготовления высокоспецифичных и чувствительных диагностикумов и высокоиммуногенных и безвредных вакцинных препаратов и расширяет арсенал новых производственных штаммов вируса ТГЭС. Следовательно, предлагаемый штамм соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации

1. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. и др. Вирусные болезни животных. - М., ВНИТИБП, 1998. - С.165-183.

2. Патент США №4046875, 424-89, 1977 г.

3. Авт. свид. СССР №734279; С 12 N 7/00, 5/00; 15.05.80 г.

4. Авт. свид. СССР №1238294, А 61 К 39/225, 20.10.95 г.

5. Сергеев В.А., Рухадзе Г.Г. и Алипер Т.И. Респираторный коронавирус свиней. Вестник с.-х. науки, 1989, 8 (396). - С.96-100.

6. Авт. свид. СССР №1731812, С 12 N 7/00; 07.05.92 г.

7. Патент РФ №2140982; С 12 N 7/00, А 61 К 39/255; 10.11.99 г. (прототип).

Таблица 1
Результаты адаптации эпизоотического изолята "Ленинградский" вируса ТГЭС к перевиваемым культурам клеток
Изолят	Культура клеток	№№ пассажей	Титр вируса, Ig ТЦД50/см3
"Ленинградский"	ППК	9	6,0±0,12
	ПСГК-30	8	5,5±0,25
	РК-15	9	5,25±0,5
		3	2,0±0,15
	СПЭВ	6	4,5+0,5
		12	8,0±0,25

Таблица 2
Результаты накопления вируса ТГЭС штамма "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП" в клеточной культуре СПЭВ в зависимости от возраста монослоя
Возраст монослоя, (сутки)	Титр вируса, Ig ТЦД50/см3
2	6,5±0,25
3	8,0±0,15
4	7,5±0,25
5	6,75±0,15

Таблица 3
Результаты изучения динамики накопления вируса ТГЭС штамма "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП" в культуре клеток СПЭВ
Время культивирования	Титр вируса, Ig ТЦД50/см3	ЦПД, %
24	7,5±0,15	75
26	8,0±0,15	75
28	8,0±0,15	80
30	7,75±0,15	95
32	7,5±0,25	100
44	7,5±0,15	100

Таблица 4
Результаты изучения влияния дозы заражения и сроков культивирования на уровень накопления вируса ТГЭС штамма "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП" в культуре клеток СПЭВ
Опыт	Доза заражения, ТЦД50/Кл	Время репродукции вируса, (при ЦПД 70-80%), час	Уровень накопления вируса, Ig ТЦД50/кл
1	1,0	27	7,0±0,15
	0,1	30	7,75±0,25
	0,01	36	7,0±0,2
2	1,0	27	6,75±0,15
	0,1	29	7,5±0,25
	0,01	36	7,0±0,3
3	1,0	24	6,5±0,2
	0,1	26	8,0±0,15
	0,01	29	7,0±0,15
4	1,0	23	6,75±0,15
	0,1	24	8,0±0,25
	0,01	30	7,0±0,2

Таблица 5
Результаты заражения "домолозивных" поросят разными штаммами вируса ТГЭС
Штаммы, изоляты	Характеристика вируса	Кол-во поросят в опыте	Результаты опыта
			Заболело, гол.	Пало, гол.
"Ленинградский"	12 пассаж	10	10	3
"№5 ВГНКИ"	8 пассаж	5	0	0
"Purdue"	14 пассаж	5	0	0
Контрольные поросята	не зараженные	3	0	0
	нативный вирус в виде "фарша" из ОАО "Ильиногорское"	3	3	3

Таблица 6
Результаты изучения вируснейтрализующей активности сыворотки крови кроликов, иммунизированных разными штаммами вируса ТГЭС
Штаммы	Кол-во кроликов		Средние титры антител к вирусу ТГЭС (log2) через дней
			0 дней (до иммунизации)			14 дней	30 дней
"Ленинградский"	3		<2,0			5,66±0,43	6,5±0,25
"Purdue"	7		<2,0			5,83±0,29	6,66±0,31
Таблица 7
Результаты изучения иммуногенной активности инактивированной эмульсионной вакцины против ТГЭС из штамма "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП"
Вакцина		Титры антител, log2
		Свиноматки			Поросята
		Кровь		Молозиво	Домолозивные			2-дневные
Из штамма		n=6		n=6	n=4			n=6
"Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП"		9,2±0,45		10,8±0,25	<2,0			8,75±0,32

Claims (1)

1. Штамм "Ленинградский" вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, семейства Coronaviridae, рода Coronavirus, коллекция ВГНКИ "Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП", для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.