CN106619740A - 一种pa动物体内耐药性诱导模型及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明所述的一种铜绿假单胞菌动物体内耐药性诱导模型及其构建方法和应用,通过该方法构建的模型能更好的模拟临床长期应用广谱抗生素的患者呼吸道出现PA感染的现象,可以观察铜绿假单胞菌在小鼠体内耐药性发展变化的规律,以期达到模拟机体中该菌的变化,便于对抗细菌耐药的药物治疗的研究,同时该动物模型采用肺指数评价动物模型更加直观,评价结果精确,造模周期短,效率高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种铜绿假单胞菌(PA)动物体内耐药性诱导模型及其构建方法和应用。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)原称绿脓杆菌,属非发酵革兰阴性杆菌,在正常人的皮肤、呼吸道和肠道以及医院环境中广泛存在。PA感染可引发多种疾病,如引起烧烫伤、败血症、肠道感染、术后伤口的化脓性感染以及引发呼吸道感染性疾病。对于具有基础疾病、长期使用抗生素和抗肿瘤药物的患者,因其自身免疫力弱或者免疫功能受损,更易引发PA感染性肺炎。
PA的感染通常选择抗生素治疗,但随着抗生素的大量使用,PA极易产生耐药,且由于PA自身结构的特殊性,使得其对多数抗菌药物具有天然耐药和极易产生耐药的特点,导致治疗难度极大,严重影响患者的健康与生活。因此,研究人员开始研究铜绿假单胞菌耐药动物模型,以模拟临床长期应用广谱抗生素的患者出现PA感染的现象,为实验研究和治疗因耐药菌引起的感染提供良好的模型。
如“不同方法建立多重耐药铜绿假单胞菌肠道感染动物模型的比较和评价”(韩华中,杨俊,中国实验动物学报,2014年4月第22卷第2期)中公开的采用体外分离的多重耐药铜绿假单胞菌通过三种不同处理方法建立小鼠肠道铜绿假单胞菌感染模型,其中以多重耐药铜绿假单胞菌菌悬液直接灌胃来获得多重耐药铜绿假单胞菌肠道感染动物模型。然而上述的动物模型还存在一定的缺陷:第一,上述动物模型是用于PA肠道感染的模型,并不适用于呼吸道感染PA的模型;第二,上述的动物模型与临床长期应用广谱抗生素的患者出现PA感染有一定的差距,因为上述的动物模型是通过体外分离的耐药菌灌入动物体内,而该体外分离的耐药菌大多是通过在含有多种抗生素的培养基中培养筛选出的具有抗多种抗生素的耐药菌,其培养的环境过于简单,而动物体内的环境又非常复杂,进而该耐药菌的产生耐药性的环境与动物体内的铜绿假单胞菌产生耐药性的环境具有极大的不同,又由于产生耐药性的环境不同,体外分离的耐药菌和在动物体内产生的耐药菌对于动物机体的感染和对治疗药物的反应截然不同,因而使用体外分离的耐药菌来构建多重耐药铜绿假单胞菌肠道感染动物模型不能更好的模拟临床长期应用广谱抗生素的患者出现PA感染的现象,不能较接近的模拟机体中细菌耐药性的发展规律,对于抗细菌耐药的药物治疗的研究有限。第三,该动物模型采用小鼠的体重变化、结肠炎症评分以及炎症因子浓度来评价动物模型,然而小鼠体重每天的变化非常微小,需要长时间的观察,才能够观察出明显的变化,延长了动物造模的周期,效率低,而采用结肠炎症评分,需要对小鼠的结肠组织进行HE染色观察,步骤繁琐,同样延长了动物造模的周期,且采用HE染色观察评分不明显,无法定量,评分结果不精确,而采用炎症因子的浓度来评价动物模型同样不精确,因为在小鼠感染PA后由于免疫力降低,在此期间还可能感染其他病菌或是并发症引发炎症因子浓度的增大,即炎症因子的增大并不一定都是PA引起的,因此采用炎症因子浓度来评价动物模型也是不精确的。为此,本发明提供了一种PA动物体内耐药性诱导模型及其构建方法和应用。
由于现有多采用体外环境中耐药菌研究该菌在动物体内耐药性变化,不能较接近的模拟机体中细菌耐药性的发展规律。鉴于体内研究细菌耐药性变化的方法受限,本发明观察铜绿假单胞菌在小鼠体内耐药性发展变化的规律,以期达到模拟机体中该菌的变化。同时应用该方法,检测本课题组正在研发的芪归银颗粒在该模型中的作用。
发明内容
因此,本发明要解决的技术问题在于现有技术中缺乏铜绿假单胞菌呼吸道感染动物体内模型,不能够模拟机体呼吸道中铜绿假单胞菌耐药性的发展规律,以及模型评价标准不精确的缺陷,从而提供一种PA动物体内耐药性诱导模型及其构建方法和应用。
为此,本发明提供了一种PA动物体内耐药性诱导模型的构建方法,包括如下步骤:
(1)取健康小鼠若干只,雌雄各半,随机分成空白对照组、未诱导耐药模型组A1、未诱导耐药模型给药组A2、诱导耐药模型组B1和诱导耐药模型给药组B2,备用;所述未诱导耐药模型组A1和未诱导耐药模型给药组A2合称为A组,所述诱导耐药模型组B1和诱导耐药模型给药组B2合称为B组;
(2)对所述A组和B组的小鼠以PA敏感菌菌液感染至少一次,备用;
(3)对所述步骤(2)中所述B组第一次感染后,对所述小鼠给予低浓度的左氧氟沙星进行诱导耐药造模,备用;所述空白对照组和A组在所述B组诱导造模期间每天以相同条件下给予蒸馏水,备用;
(4)对步骤(3)中的所述A2组和B2组给予治疗剂量的所述左氧氟沙星进行给药治疗;所述空白对照组、A1组和B1组在上述A2组和B2组给药治疗期间每天以相同条件下给予蒸馏水,备用;
(5)在给药治疗后,分别对步骤(4)中的所述空白对照组、A组和所述B组中的小鼠称重并记录体重,然后处死小鼠进行取材,取肺部称重并记录肺湿重,然后按照下述公式(1)计算小鼠的肺指数,
计算得到所述空白对照组、A组和所述B组的肺指数,采用T值检验法比较所述B1组是否构建成功,包括如下步骤:
S1、采用T值检测法,将所述A1组和B1组分别与所述空白对照组的肺指数进行比较,若两者的P值均为P<0.05,则所述PA敏感菌菌液感染所述A组和B组中的所述健康小鼠;反之,则没有;
S2、采用T值检测法,将所述A2组与所述A1组进行比较,若P<0.05,则所述治疗剂量的所述左氧氟沙星具有治疗PA感染的功效;反之,则没有;
S3、在S1步骤中和S2步骤中的P值均为P<0.05时,采用T值检测法,将所述B1组与所述B2组的肺指数进行比较,若P>0.05,则所述B1组构建成功,即所述PA动物体内耐药性诱导模型构建成功;反之,则没有。
所述的方法,还包括分别将计算得到的所述A组和B组的肺指数代入下述公式(2)中计算得到A2组小鼠的肺指数抑制率和B2组的肺指数抑制率,通过比较不同诱导造模时间的所述A2组小鼠和B2组小鼠的肺指数抑制率,获得所述B2组的PA耐药程度以及PA耐药变化规律,
所述的构建方法,还包括利用小鼠肺组织中外排泵基因mexC表达量来验证所述PA动物体内耐药性诱导模型是否构建成功的步骤:
Q1、采用T值检测法,将所述A1组与所述空白对照组的mexC基因表达量进行比较,若P>0.05,则所述PA敏感菌菌液是敏感菌;反之,则不是;
Q2、在Q1步骤中的P>0.05时,采用T值检测法,将所述B1组与所述A1组的mexC基因表达量进行比较得到P<0.05,且将所述B1组与所述A1组的mexC基因表达量进行比较得到B1/A1>5,则所述B1组构建成功,即所述PA动物体内耐药性诱导模型构建成功;反之,则不成功。
所述的构建方法,所述步骤如下,将所述A组和B组的mexC基因表达量分别代入下述公式(3)计算得到所述A2组小鼠的基因表达量抑制率和所述B2组的基因表达量抑制率,通过比较不同诱导造模时间的所述A2组小鼠和B2组小鼠的所述基因表达量抑制率,获得所述B2组的PA耐药程度以及PA耐药变化规律,
所述构建方法中,采用实时荧光定量RT-PCR检测所述mexC基因表达量的方法包括如下步骤:
1)采集所述小鼠的肺组织并提取RNA,备用;
2)取步骤1)中提取的RNA,采用铜绿假单胞菌mexC基因的特异性上下游引物以及作为内参基因的看家基因rpsL的特异性上下游引物进行一步法实时荧光PCR反应,分析PCR过程各检测样本的Ct值;
所述mexC基因的特异性上下游引物如下:
mexC-F:5′-GTACCGGCGTCATGCAGGGTTC-3′;
mexC-R:5′-TTACTGTTGCGGCGCAGGTGACT-3′;
所述看家基因rpsL的特异性上下游引物如下:
rpsL-F:5′-GCAAGCGCATGGTCGACAAGA-3′
rpsL-R:5′-CGCTGTGCTCTTGCAGGTTGTGA-3′;
3)根据上述CT值计算各检测样本mexC基因的相对表达量和相对表达倍数。
所述实时荧光定量PCR扩增体系如下:
样本RNA,15μg/ml,2μl;
One Step SYBR GREEN,16.4μl;
mexC-F引物液,10pmol,0.8μl;
mexC-R引物液,10pmol,0.8μl;
rpsL-F引物液,10pmol,0.8μl;
rpsL-R引物液,10pmol,0.8μl;
所述扩增体系反应体积为20μl。
所述实时荧光PCR的扩增程序如下:
95℃灭活30sec,95℃变性20sec,60℃退火20sec,72℃延伸30sec,共40个循环。
所述mexC基因的相对表达量的计算方法如下:以rpsL作为内对照,任意选择一个样本Con作为Calibrator,Con△Ct=Con Ct-Con rpsL Ct;样本△Ct=样本Ct-样本rpsLCt;样本△△Ct=样本△Ct-Con△Ct;2-ΔΔCt数值代表样本mexC基因表达相对Calibrator的表达倍数;所述样本mexC基因的相对表达量=2-ΔΔCt×100%。
所述的构建方法,在所述步骤(2)中,对所述A组和B组的小鼠用乙醚麻醉,以1×109cfu/ml浓度的PA敏感菌菌液滴鼻感染麻醉的小鼠,每只50μl,备用;所述诱导耐药组自第一次感染后到取材之前,每隔3天对上述小鼠进行感染一次。
所述的构建方法,在所述步骤(3)中,在所述步骤(2)中所述B组第一次感染1小时后,对每只所述小鼠按照27mg/kg/d的给药量灌胃给予左氧氟沙星进行诱导耐药造模,在诱导造模期间,每天1次。
所述的构建方法,在所述步骤(4)中,对所述步骤(3)中的所述A2组和B2组的每只小鼠按92mg/kg/d的给药量灌胃给予左氧氟沙星进行给药治疗,每天1次,连续3天。
本发明提供了一种由上述的PA动物体内耐药性诱导模型的构建方法构建得到所述的PA动物体内耐药性诱导模型。
本发明提供了一种由所述的PA动物体内耐药性诱导模型构建方法或所述的PA动物体内耐药性诱导模型在筛选具有抗细菌耐药性作用或延缓细菌耐药性作用的药物的应用。
所述的应用,包括所述的PA动物体内耐药性诱导模型在筛选芪归银颗粒是否具有抗细菌耐药性作用或延缓细菌耐药性作用的应用。
本发明还提供了一种利用所述的PA动物体内耐药性诱导模型检测芪归银颗粒抗细菌耐药性的方法,包括如下步骤:
a)按照上述的PA动物体内耐药性诱导模型的构建方法构建待测药物的PA动物体内耐药性诱导模型,构建了空白对照组、未诱导耐药模型组A1、未诱导耐药模型给药组A2、诱导耐药模型组B1、诱导耐药模型给药组B2和所述待测药物的诱导耐药模型给药组C;
b)采用T值检验法,将所述B2组的肺指数和所述的B1组的肺指数比较得到P>0.05,且将所述C组的肺指数和所述的B1组的肺指数比较得到P<0.05,则所述待测药物具有抗细菌耐药性的作用或延缓细菌耐药性作用;反之,则没有。
所述的方法,在所述PA动物体内耐药性诱导模型的构建方法的所述步骤(3)中,对所述C组诱导造模时,对所述小鼠给予低浓度左氧氟沙星后,同时给予所述待测药物。
所述的方法,还包括通过小鼠肺组织中外排泵基因mexC表达量来验证所述待测药物是否具有抗细菌耐药性作用或延缓细菌耐药性作用的步骤:
采用T值检测法,将所述B1组与所述B2组的mexC基因表达量进行比较得到P>0.05时,然后采用T值检测法,将所述C组与所述B1组的mexC基因表达量进行比较得到P<0.05,且将所述C组与所述A1组的mexC基因表达量进行比较得到C/A1<5,则所述待测药物具有抗细菌耐药性的作用或延缓细菌耐药性作用;若以上任一条件未满足,则没有。
还包括将所述A组肺指数代入上述公式(2)中计算得到所述A2组小鼠的肺指数抑制率,将所述B1组和C组的肺指数代入上述公式(2)中计算得到所述C组小鼠的肺指数抑制率,通过比较不同诱导造模时间的所述A2组小鼠和C组小鼠的所述肺指数抑制率,获得所述C组的PA耐药程度以及PA耐药变化规律。
所述的方法,还包括将所述A组mexC基因表达量分别代入上述公式(3)中计算得到所述A2组小鼠的基因表达量抑制率,将所述B1组和C组的mexC基因表达量代入上述公式(3)中计算得到所述C组小鼠的基因表达量抑制率,通过比较不同诱导造模时间的所述A2组小鼠和C组小鼠的所述基因表达量抑制率,获得所述C组的PA耐药程度以及PA耐药变化规律。
本发明技术方案,具有如下优点:
(1)本发明所述的PA动物体内耐药性诱导模型的构建方法,包括如下步骤:(1)取健康小鼠若干只,雌雄各半,随机分成空白对照组、未诱导耐药模型组A1、未诱导耐药模型给药组A2、诱导耐药模型组B1和诱导耐药模型给药组B2,备用;所述未诱导耐药模型组A1和未诱导耐药模型给药组A2合称为A组,所述诱导耐药模型组B1和诱导耐药模型给药组B2合称为B组;(2)对所述A组和B组的小鼠以PA敏感菌菌液感染至少一次,备用;(3)对所述步骤(2)中所述B组第一次感染后,对所述小鼠给予低浓度的左氧氟沙星进行诱导耐药造模,备用;所述空白对照组和A组在所述B组诱导造模期间每天以相同条件下给予蒸馏水,备用;(4)对步骤(3)中的所述A2组和B2组给予治疗剂量的所述左氧氟沙星进行给药治疗;所述空白对照组、A1组和B1组在上述A2组和B2组给药治疗期间每天以相同条件下给予蒸馏水,备用;(5)在给药治疗后,分别对步骤(4)中的所述空白对照组、A组和所述B组中的小鼠称重并记录体重,然后处死小鼠进行取材,取肺部称重并记录肺湿重,然后按照下述公式(1)计算小鼠的肺指数,计算得到所述空白对照组、A组和所述B组的肺指数,采用T值检验法比较所述B1组是否构建成功,包括如下步骤:S1、采用T值检测法,将所述A1组和B1组分别与所述空白对照组的肺指数进行比较,若两者的P值均为P<0.05,则所述PA敏感菌菌液感染所述A组和B组中的所述健康小鼠;反之,则没有;S2、采用T值检测法,将所述A2组与所述A1组进行比较,若P<0.05,则所述治疗剂量的所述左氧氟沙星具有治疗PA感染的功效;反之,则没有;S3、在S1步骤中和S2步骤中的P值均为P<0.05时,采用T值检测法,将所述B1组与所述B2组的肺指数进行比较,若P>0.05,则所述B1组构建成功,即所述PA动物体内耐药性诱导模型构建成功;反之,则没有;通过所述方法构建的模型能更好的模拟临床长期应用广谱抗生素的患者出现PA感染的现象,尤其是患者呼吸道感染PA的现象,可以观察铜绿假单胞菌在小鼠体内耐药性发展变化的规律,以期达到模拟机体中该菌的变化,便于对抗细菌耐药的药物治疗的研究,同时该动物模型采用肺指数评价动物模型更加直观,评价结果精确,造模周期短,效率高。
(2)本发明所述的PA动物体内耐药性诱导模型的构建方法,通过采用实时荧光定量RT-PCR检测mexC基因表达量来验证所构建的模型是否成功,在实验过程中,发现当动物体内PA产生耐药性时,其mexC基因表达量增大,因此以mexC基因是否大量表达来验证构建的PA动物体内耐药模型是否成功,验证结果精确,效率高。
(3)本发明所说的利用所述的PA动物体内耐药性诱导模型筛选药物抗细菌耐药性的方法,检测药物抗细菌耐药性结果精确,周期短。
具体实施方式
下述实施例中所使用的PA敏感菌菌株购自美国ATCC,-80℃冰箱保存,现用现配;
ICR小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司;
电子天平购自上海越平科学仪器有限公司,型号YP1002(称体重);梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司,型号AL204(称肺重);
实时荧光定量PCR仪购自Thermo公司,型号PikoReal Real-Time型;
所述PA敏感菌菌液按照常规方法进行培养,具体为如下方法培养获得:取灭菌后的10ml MH肉汤培养基中,然后接种10μl的浓度为1.5×108cfu/ml铜绿假单胞菌菌液,将含有菌液的培养基置于恒温振荡培养箱(由哈尔滨市东联电子技术开发有限公司提供,型号HZQ-F160)中,37℃下培养24h,振荡频率为65rpm。培养结束后,采用比浊法,将菌液稀释到1×109CFU/ml,即得所述PA敏感菌菌液。
所述MH肉汤培养基购自OXOID公司,1583507。在使用前对其灭菌,步骤如下:称取所述MH肉汤培养基21.0g,加热溶解于1000ml蒸馏水中,121℃高压灭菌15分钟,备用。
所使用的芪归银颗粒由北京中医药大学中药学院中药研究室提供,由如下原料药组成:生黄芪60g、当归15g、金银花15g、青蒿10g和虎杖10g。左氧氟沙星,由第一三共制药(北京)有限公司提供。
实施例1
本实施例提供了一种PA动物体内耐药性诱导模型的构建方法,包括如下步骤:
(1)取健康ICR小鼠200只,雌雄各半,体重14±1g,随机分组,诱导造模期分别设置为3天、5天、7天、9天,每个诱导造模期设置空白对照组、未诱导耐药模型组A1、未诱导耐药模型给药组A2、诱导耐药模型组B1和诱导耐药模型给药组B2,总共20个小组(见下表2),每组10只,备用;所述未诱导耐药模型组A1和未诱导耐药模型给药组A2合称为A组,所述诱导耐药模型组B1和诱导耐药模型给药组B2合称为B组;
(2)对所述A组和B组的小鼠用乙醚麻醉,以1×109cfu/ml浓度的PA敏感菌菌液滴鼻感染麻醉的小鼠,每只50μl,备用;所述A组和所述B组自第一次感染后到取材(处死小鼠)之前,每隔3天对上述各组的每只小鼠进行感染一次;
(3)对所述步骤(2)中所述B组第一次感染1小时后,对所述B组的每只小鼠灌胃给予低浓度左氧氟沙星进行诱导耐药造模,按照27mg/kg/d(每1kg小鼠每天给予27mg左氧氟沙星)给小鼠灌胃给予左氧氟沙星,灌胃体积为0.2ml/10g体重/次(每10g小鼠每次给予0.2ml/左氧氟沙星),在诱导造模期,每天一次,备用;所述空白对照组和A组在所述B组诱导造模期间每天在相同条件下给予蒸馏水,备用;
(4)对步骤(3)中A2组和B2组给予治疗剂量的左氧氟沙星进行给药治疗,按照92mg/kg/d(每1kg小鼠每天给予92mg左氧氟沙星)给小鼠灌胃给予左氧氟沙星,灌胃体积为0.2ml/10g体重/次(每10g小鼠每次给予0.2ml/左氧氟沙星),连续给药治疗3天,每天一次;所述空白对照组和A1组以及B1组在上述A2组和B2组给药治疗期间每天相同条件下给予蒸馏水,备用;
(5)在给药治疗后,分别对步骤(4)中的所述空白对照组、A组和所述B组中的小鼠称重并记录体重,然后处死小鼠进行取材,取肺部称重并记录肺湿重,然后按照下述公式(1)计算小鼠的肺指数,结果见下表2,
计算得到所述空白对照组、A组和所述B组的肺指数,采用T值检验法比较所述B1组是否构建成功,包括如下步骤:
S1、采用T值检测法,将所述A1组和B1组分别与所述空白对照组的肺指数进行比较,若两者的P值均为P<0.05,则所述PA敏感菌菌液感染所述A组和B组中的所述健康小鼠;反之,则没有;
S2、采用T值检测法,将所述A2组与所述A1组进行比较,若P<0.05,则所述治疗剂量的所述左氧氟沙星具有治疗PA感染的功效;反之,则没有;
S3、在S1步骤中和S2步骤中的P值均为P<0.05时,采用T值检测法,将所述B1组与所述B2组的肺指数进行比较,若P>0.05,则所述B1组构建成功,即所述PA动物体内耐药性诱导模型构建成功;反之,则没有;
分别将计算得到的所述A组和B组的肺指数代入下述公式(2)中计算得到A2组小鼠的肺指数抑制率和B2组的肺指数抑制率,通过比较不同诱导造模时间的所述A2组小鼠和B2组小鼠的肺指数抑制率,获得所述B2组的PA耐药程度以及PA耐药变化规律,结果见下表2,
本实施例还提供了利用上述构建的所述的PA动物体内耐药性诱导模型在筛选芪归银颗粒是否具有抗细菌耐药性作用或延缓细菌耐药性作用的应用,步骤如下:
a)按照所述的PA动物体内耐药性诱导模型的构建方法构建所述芪归银颗粒的PA动物体内耐药性诱导模型,构建了不同诱导造模期的空白对照组、未诱导耐药模型组A1、未诱导耐药模型给药组A2、诱导耐药模型组B1、诱导耐药模型给药组B2和所述待测药物的诱导耐药模型给药组C;在上述实施例所述的PA动物体内耐药性诱导模型构建方法基础上,还设置所述芪归银颗粒的诱导耐药模型给药组C,所述C组与B2组相同,区别仅在于在所述的PA动物体内耐药性诱导模型的构建方法的所述步骤(3)中,对所述C组诱导造模时,对所述小鼠给予低浓度左氧氟沙星同时给予所述待测药物;即取健康ICR小鼠120只,雌雄各半,体重14±1g,随机分组见下表1,诱导造模时间分别为3天、5天、7天、9天,每个诱导造模时间设置所述芪归银颗粒的大、中、小剂量组(即芪归银颗粒的大剂量组C1、芪归银颗粒的中剂量组C2和芪归银颗粒的小剂量组C1),所述芪归银颗粒的大、中、小剂量组的给药量依次为220g生药/60kg/d、110g生药/60kg/d和55g生药/60kg/d,总共12个小组,每组10只小鼠,按照所述诱导耐药模型给药组B2的构建方法依次进行感染、诱导造模、给药治疗和肺指数、肺指数抑制率计算,其中在诱导造模时,对所述小鼠灌胃给予低浓度左氧氟沙星的同时,灌胃给予相应剂量的所述芪归银颗粒,在诱导造模期间,每天1次;
b)采用T值检验法,将所述B2组的肺指数和所述的B1组的肺指数比较得到P>0.05,且将所述C组的肺指数和所述的B1组的肺指数比较得到P<0.05,则所述待测药物具有抗细菌耐药性的作用或延缓细菌耐药性作用;反之,则没有;
还包括将所述A组肺指数代入上述公式(2)中计算得到所述A2组小鼠的肺指数抑制率,将所述B1组和C组的肺指数代入上述公式(2)中计算得到所述C组小鼠的肺指数抑制率,通过比较不同诱导造模时间的所述A2组小鼠和C组小鼠的所述肺指数抑制率,获得所述C组的PA耐药程度以及PA耐药变化规律,结果见表2。
表1分组情况
表2芪归银颗粒对低浓度左氧氟沙星诱导致小鼠体内产生耐药的延缓作用
注:与空白对照组比较,##P<0.01;
与未诱导耐药模型组A1比较**P<0.01,*P<0.05;
与诱导耐药模型组B1比较▽P<0.05,▽▽P<0.01。
如表2结果显示,如诱导造模期为3天的所述PA动物体内耐药性诱导模型:采用铜绿假单胞菌敏感株感染健康的ICR小鼠后,未诱导耐药模型组A1和诱导耐药模型组B1的小鼠肺指数均明显增高,两者与空白对照组比较均有显著性差异(##P<0.01),说明所述PA敏感菌菌液感染了所述A组和B组中的所述健康ICR小鼠;未诱导耐药模型给药组A2的小鼠肺指数明显降低,未诱导耐药模型给药组A2和未诱导耐药模型组A1的肺指数比较具有显著性差异(*P<0.05),说明所述治疗剂量的所述左氧氟沙星具有治疗PA感染的功效;所述诱导耐药模型给药组B2的小鼠肺指数无明显降低,所述诱导耐药模型组B1和诱导耐药模型给药组B2的小鼠肺指数比较没有显著性差异(P>0.05),说明诱导造模期为3天的所述诱导耐药模型组B1构建成功,即所述PA动物体内耐药性诱导模型构建成功;如诱导造模期为3天的所述芪归银颗粒干预的诱导耐药给药组C,所述诱导耐药给药组B2对小鼠肺指数无明显降低作用,与诱导耐药模型组B1比较无显著性差异(P>0.05),所述芪归银颗粒大剂量组C1和芪归银颗粒中剂量组C2对小鼠肺指数有明显降低作用,与诱导耐药模型组B1比较有显著性差异(▽▽P<0.01),说明大、中剂量的芪归银颗粒对诱导超过3天的诱导耐药模型(PA动物体内耐药诱导模型)有抗细菌耐药性或延缓细菌耐药性的作用,所述芪归银颗粒小剂量组C3对小鼠肺指数无明显降低作用,与诱导耐药模型组B1比较没有显著性差异(▽P>0.05),说明小剂量的芪归银颗粒对诱导超过3天的诱导耐药模型(PA动物体内耐药模型)无抗细菌耐药性或延缓细菌耐药性的作用。再如诱导造模期为7天的所述芪归银颗粒的诱导耐药给药组C,所述诱导耐药给药组B2对小鼠肺指数无明显降低作用,与诱导耐药模型组B1比较无显著性差异(P>0.05),而所述芪归银颗粒剂量组C1、C2和C3对小鼠肺指数也无明显降低作用,与诱导耐药模型组B1比较无显著性差异(P>0.05),说明大、中、小剂量的芪归银颗粒对诱导超过7天的诱导耐药模型(PA动物体内耐药诱导模型)抗细菌耐药性或延缓细菌耐药性的作用降低或没有。
比较不同诱导造模期的未诱导耐药模型给药组A2、诱导耐药模型给药组B2和所述芪归银颗粒的诱导耐药给药组C的肺指数抑制率,发现随着诱导造模期的增加,未诱导耐药模型给药组A2的肺指数抑制率逐渐降低,对于感染PA菌时间短具有明显的治疗效果,对于感染PA菌时间长没有有明显的治疗效果,诱导耐药模型给药组B2的肺指数抑制率逐渐降低,说明所述PA菌诱导耐药时间越长,左氧氟沙星治疗PA感染的效果逐渐降低,没有效果,即使用左氧氟沙星治疗PA感染的时间越长,PA菌对其产生耐药性越强;所述芪归银颗粒大剂量组C1、中剂量组C2对于诱导造模时间为3天的诱导耐药模型具有显著的抑制PA菌耐药的作用,而小剂量组没有抑制细菌耐药的作用,说明在临床上使用芪归银颗粒大剂量组C1和中剂量组C2结合左氧氟沙星治疗PA菌感染,芪归银颗粒大剂量组C1和中剂量组C2抑制PA菌对左氧氟沙星等抗生素耐药显著;所述芪归银颗粒中剂量组C2对于诱导造模时间为5天的诱导耐药模型具有显著的抑制PA菌耐药的作用,而所述C1组和C3组具有相当的抑制PA菌耐药作用,说明在临床上稍长期使用芪归银颗粒中剂量组C2结合左氧氟沙星治疗PA菌感染,芪归银颗粒中剂量组C2对于抑制PA菌对左氧氟沙星等抗生素耐药效果显著,在临床稍长期使用芪归银颗粒大剂量组C1或小剂量组C3结合左氧氟沙星治疗PA菌感染,能够抑制PA菌对左氧氟沙星等抗生素耐药,而在诱导造模期为7天或9天中观察,C1组、C2组和C3组对于结合左氧氟沙星治疗PA菌感染,芪归银颗粒对于抑制PA菌对左氧氟沙星等抗生素耐药效果低。
实施例2
本实施例在实施例1的基础上,利用小鼠肺组织中外排泵基因mexC表达量来验证所述PA动物体内耐药性诱导模型是否构建成功的步骤,采用实时荧光定量RT-PCR检测所述mexC基因表达量的方法包括如下步骤:
1)采集实施例1中各组所述小鼠的肺组织作为样本置于研钵中,加入液氮,研磨细后,收集于1.5ml离心管中,每个样本加入1ml Trizol,提取RNA;将加入1ml TrizolReagent的EP管轻弹管底,使混合样品重悬,室温放置20min,4℃,12000rpm,离心10min;移澄清上清液入一新的EP管中,加入0.2ml氯仿,盖紧管盖,用力摇动15s,室温孵育2-3min,4℃,12000rpm,离心15min;移上清液到新的EP管中,加入0.5ml异丙醇,混匀,室温孵育30min,4℃,12000rpm,离心10min;弃上清,用1ml 75%乙醇(含DEPC)洗沉淀(应使白色或半透明的沉淀飘起),4℃,7500rpm,离心5min;弃上清(用移液器吸弃),通风橱内干燥5-10min;用DEPC水溶解沉淀,﹣80℃保存或进入下一步PCR。
2)取步骤(1)中提取的RNA,采用铜绿假单胞菌mexC基因的特异性上下游引物以及作为内参基因的看家基因rpsL的特异性上下游引物进行一步法实时荧光定量PCR反应,分析PCR过程各检测样本的Ct值,使用实时荧光定量PCR仪中的PikoRealTM Software 2.1软件分析PCR过程各检测样本的Ct(Threshold of cycle)值;
所述mexC基因的特异性上下游引物(所述引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成),参见SEQ ID NO:1-2,如下:
mexC-F:5′-GTACCGGCGTCATGCAGGGTTC-3′;
mexC-R:5′-TTACTGTTGCGGCGCAGGTGACT-3′;
所述看家基因rpsL的特异性上下游引物(所述引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成),参见SEQ ID NO:3-4,如下:
rpsL-F:5′-GCAAGCGCATGGTCGACAAGA-3′
rpsL-R:5′-CGCTGTGCTCTTGCAGGTTGTGA-3′;
所述实时荧光定量PCR扩增体系如下:
样本RNA,2μl;
One Step SYBR GREEN,16.4μl;
mexC-F引物液,10pmol,0.8μl;
mexC-R引物液,10pmol,0.8μl;
rpsL-F引物液,10pmol,0.8μl;
rpsL-R引物液,10pmol,0.8μl;
所述扩增体系反应体积为20μl;
所述实时荧光定量PCR的扩增程序如下:
95℃灭活30sec,95℃变性20sec,60℃退火20sec,72℃延伸30sec,共40个循环;
3)根据上述CT值计算各检测样本mexC基因的相对表达量,所述mexC基因的相对表达量的计算方法如下:以rpsL作为内对照,任意选择一个样本Con作为Calibrator,Con△Ct=Con Ct-Con rpsL Ct;样本△Ct=样本Ct-样本rpsL Ct;样本△△Ct=样本△Ct-Con△Ct;2-ΔΔCt数值代表样本mexC基因表达相对Calibrator的表达倍数;所述样本mexC基因的相对表达量=2-ΔΔCt×100%;相对表达倍数=各组样本mexC基因表达量均值/未诱导耐药模型组样本mexC基因表达量均值,结果见表3;
采用T值检测法,将所述B1组与所述B2组的mexC基因表达量进行比较得到P>0.05时,然后采用T值检测法,将所述C组与所述B1组的mexC基因表达量进行比较得到P<0.05,且将所述C组与所述A1组的mexC基因表达量进行比较得到C/A1<5,则所述待测药物具有抗细菌耐药性的作用或延缓细菌耐药性作用;若以上任一条件未满足,则没有。
将所述A组mexC基因表达量分别代入上述公式(3)中计算得到所述A2组小鼠的基因表达量抑制率,将所述B1组和C组的mexC基因表达量代入上述公式(3)中计算得到所述C组小鼠的基因表达量抑制率,通过比较不同诱导造模时间的所述A2组小鼠和C组小鼠的所述基因表达量抑制率,获得所述C组的PA耐药程度以及PA耐药变化规律,结果见表3,
表3芪归银颗粒对铜绿假单胞菌感染正常小鼠肺组织中外排泵基因表达量的影响
注:与空白对照组比较,##P<0.01,#P<0.05;
与未诱导耐药模型组A1比较*P<0.05;
与诱导耐药模型组B1比较▽▽P<0.01,▽P<0.05;
如表3结果显示:不同诱导造模期的未诱导耐药模型组A1采用铜绿假单胞菌敏感株感染正常小鼠后,未诱导耐药模型组A1的小鼠肺组织中mexC基因表达无明显变化,与空白对照组比较均无显著性差异(P>0.05),而所述诱导耐药模型组B1小鼠肺组织中mexC基因表达明显增高,与所述未诱导耐药模型组A1比较具有显著性差异(*P<0.05),且较未诱导耐药模型组A1小鼠肺组织中mexC基因表达倍数依次为8.57、7.93、12.13、8.47,均大于5,验证了不同诱导造模期的所述诱导耐药模型组B1构建成功。如诱导造模期为3天的所述芪归银颗粒的诱导耐药给药组C,所述诱导耐药给药组B2对小鼠mexC基因表达与诱导耐药模型组B1比较无显著性差异(P>0.05),所述芪归银颗粒剂量组C2可显著降低小鼠肺组织中mexC基因表达水平,与诱导耐药模型组B1比较有显著性差异(▽P<0.05),且较未诱导耐药模型组A1小鼠肺组织中mexC基因表达倍数为1.23倍,小于5倍,说明芪归银颗粒中剂量组对诱导超过3天的诱导耐药模型(PA动物体内耐药模型)有抗细菌耐药性或延缓细菌耐药性的作用。再如诱导造模期为7天的所述芪归银颗粒的诱导耐药给药组C,所述诱导耐药给药组B2对小鼠mexC基因表达水平与诱导耐药模型组B1比较无显著性差异(P>0.05),而所述芪归银颗粒剂量组C1、C2和C3对小鼠mexC基因表达水平与诱导耐药模型组B1比较无显著性差异(P>0.05),但基因表达量较诱导耐药模型组低,说明大、中、小剂量的芪归银颗粒对诱导超过7天的诱导耐药模型(PA动物体内耐药模型)作用降低。
比较不同诱导造模期的诱导耐药模型给药组B2和所述芪归银颗粒的诱导耐药给药组C的基因表达抑制率,发现随着诱导造模期的增加,诱导耐药模型给药组B2的基因表达抑制率逐渐降低,说明所述PA菌诱导耐药时间越长,左氧氟沙星治疗PA感染的效果逐渐降低,即使用左氧氟沙星治疗PA感染的时间越长,PA菌对其产生耐药性越强,所述芪归银颗粒大剂量组C1、中剂量组C2、小剂量组C3对于诱导造模时间为3天的诱导耐药模型具有显著的抑制PA菌耐药的作用,说明在临床上使用芪归银颗粒大剂量组C1、中剂量组C2和小剂量组C3结合左氧氟沙星治疗PA菌感染,芪归银颗粒大剂量组C1、中剂量组C2和小剂量组C3抑制PA菌对左氧氟沙星等抗生素耐药显著,所述芪归银颗粒中剂量组C2对于诱导造模时间为5天的诱导耐药模型具有显著的抑制PA菌耐药的作用,而所述C1组和C3组具有相当的抑制PA菌耐药作用,说明在临床上稍长期使用芪归银颗粒中剂量组C2结合左氧氟沙星治疗PA菌感染,芪归银颗粒中剂量组C2对于抑制PA菌对左氧氟沙星等抗生素耐药效果显著,在临床稍长期使用芪归银颗粒大剂量组C1或小剂量组C3结合左氧氟沙星治疗PA菌感染,能够抑制PA菌对左氧氟沙星等抗生素耐药,而在诱导造模期为7天和9天中观察,C1组、C2组和C3组对于结合左氧氟沙星治疗PA菌感染,芪归银颗粒对于抑制PA菌对左氧氟沙星等抗生素耐药效果降低,说明长期使用芪归银颗粒其抑制PA菌耐药作用降低。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 首都医科大学附属北京中医医院
<120> 一种PA动物体内耐药性模型及其构建方法和应用
<130> HA201602458
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gtaccggcgt catgcagggt tc 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ttactgttgc ggcgcaggtg act 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gcaagcgcat ggtcgacaag a 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
cgctgtgctc ttgcaggttg tga 23
Claims (10)
1.一种PA动物体内耐药性诱导模型的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)取健康小鼠若干只,雌雄各半,随机分成空白对照组、未诱导耐药模型组A1、未诱导耐药模型给药组A2、诱导耐药模型组B1和诱导耐药模型给药组B2,备用;所述未诱导耐药模型组A1和未诱导耐药模型给药组A2合称为A组,所述诱导耐药模型组B1和诱导耐药模型给药组B2合称为B组;
(2)对所述A组和B组的小鼠以PA敏感菌菌液感染至少一次,备用;
(3)对所述步骤(2)中所述B组第一次感染后,对所述小鼠给予低浓度的左氧氟沙星进行诱导耐药造模,备用;所述空白对照组和A组在所述B组诱导造模期间每天以相同条件下给予蒸馏水,备用;
(4)对步骤(3)中的所述A2组和B2组给予治疗剂量的所述左氧氟沙星进行给药治疗;所述空白对照组、A1组和B1组在上述A2组和B2组给药治疗期间每天以相同条件下给予蒸馏水,备用;
(5)在给药治疗后,分别对步骤(4)中的所述空白对照组、A组和所述B组中的小鼠称重并记录体重,然后处死小鼠进行取材,取肺部称重并记录肺湿重,然后按照下述公式(1)计算小鼠的肺指数,
计算得到所述空白对照组、A组和所述B组的肺指数,采用T值检验法比较所述B1组是否构建成功,包括如下步骤:
S1、采用T值检测法,将所述A1组和B1组分别与所述空白对照组的肺指数进行比较,若两者的P值均为P<0.05,则所述PA敏感菌菌液感染所述A组和B组中的所述健康小鼠;反之,则没有;
S2、采用T值检测法,将所述A2组与所述A1组进行比较,若P<0.05,则所述治疗剂量的所述左氧氟沙星具有治疗PA感染的功效;反之,则没有;
S3、在S1步骤中和S2步骤中的P值均为P<0.05时,采用T值检测法,将所述B1组与所述B2组的肺指数进行比较,若P>0.05,则所述B1组构建成功,即所述PA动物体内耐药性诱导模型构建成功;反之,则没有。
2.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,还包括利用小鼠肺组织中外排泵基因mexC表达量来验证所述PA动物体内耐药性诱导模型是否构建成功的步骤:
Q1、采用T值检测法,将所述A1组与所述空白对照组的mexC基因表达量进行比较,若P>0.05,则所述PA敏感菌菌液是敏感菌;反之,则不是;
Q2、在Q1步骤中的P>0.05时,采用T值检测法,将所述B1组与所述A1组的mexC基因表达量进行比较得到P<0.05,且将所述B1组与所述A1组的mexC基因表达量进行比较得到B1/A1>5,则所述B1组构建成功,即所述PA动物体内耐药性诱导模型构建成功;反之,则不成功。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法,其特征在于,在所述步骤(2)中,对所述A组和B组的小鼠用乙醚麻醉,以1×109cfu/ml浓度的PA敏感菌菌液滴鼻感染麻醉的小鼠,每只50μl,备用;所述A组和B组自第一次感染后到取材之前,每隔3天对上述各组小鼠进行感染一次。
4.根据权利要求1-3任一项所述的构建方法,其特征在于,在所述步骤(3)中,在所述步骤(2)中所述B组第一次感染1小时后,对所述B组的每只小鼠按照27mg/kg/d的给药量灌胃给予左氧氟沙星进行诱导耐药造模,在诱导造模期间,每天1次。
5.根据权利要求1-4任一项所述的构建方法,其特征在于,在所述步骤(4)中,对所述步骤(3)中的所述A2组和B2组的每只小鼠按92mg/kg/d的给药量灌胃给予左氧氟沙星进行给药治疗,每天1次,连续3天。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的PA动物体内耐药性诱导模型的构建方法构建得到所述的PA动物体内耐药性诱导模型。
7.一种如权利要求1-5任一项所述的PA动物体内耐药性诱导模型的构建方法或权利要求6所述的PA动物体内耐药性诱导模型在筛选具有抗细菌耐药性作用或延缓细菌耐药性作用的药物的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,包括所述的PA动物体内耐药性诱导模型在筛选芪归银颗粒是否具有抗细菌耐药性作用或延缓细菌耐药性作用的应用。
9.一种利用所述的PA动物体内耐药性诱导模型筛选药物抗细菌耐药性的方法,其特征在于,包括如下步骤:
a)按照权利要求1-5任一项所述的PA动物体内耐药性诱导模型的构建方法构建待测药物的PA动物体内耐药性诱导模型,构建了空白对照组、未诱导耐药模型组A1、未诱导耐药模型给药组A2、诱导耐药模型组B1、诱导耐药模型给药组B2和所述待测药物的诱导耐药模型给药组C;
b)采用T值检验法,将所述B2组的肺指数和所述的B1组的肺指数比较得到P>0.05,且将所述C组的肺指数和所述的B1组的肺指数比较得到P<0.05,则所述待测药物具有抗细菌耐药性的作用或延缓细菌耐药性作用;反之,则没有。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,还包括通过小鼠肺组织中外排泵基因mexC表达量来验证所述待测药物是否具有抗细菌耐药性作用或延缓细菌耐药性作用的步骤:
采用T值检测法,将所述B1组与所述B2组的mexC基因表达量进行比较得到P>0.05时,然后采用T值检测法,将所述C组与所述B1组的mexC基因表达量进行比较得到P<0.05,且将所述C组与所述A1组的mexC基因表达量进行比较得到C/A1<5,则所述待测药物具有抗细菌耐药性的作用或延缓细菌耐药性作用;若以上任一条件未满足,则没有。
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