CN101564320A - 一种建立多发性硬化动物模型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药动物模型技术领域，具体涉及一种建立多发性硬化动物模型的方法。本发明所述的方法，将MOG35－55肽段与佐剂形成的乳化物分2－3次注射Lewis大鼠，采用尾根部皮下注射，每次注射的间隔时间为3－6周，从而成功得到EAE动物模型。采用本发明所述的方法制得的多发性硬化动物模型，稳定性好，非常适合于临床对多发性硬化的研究，并且能够为影像学、病理学的研究提供满意的图像质量，为人们更好的认识和研究多发性硬化提供了良好的模型。
Description
技术领域
本发明属于医药动物模型技术领域，具体涉及一种建立多发性硬化动物模型的方法。
背景技术
多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种以炎症、脱髓鞘、轴索破坏为特点的神经系统疾病，它的起因和病理尚不完全清楚。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)为研究MS普遍应用的动物模型，在许多方面模拟了人类MS的特点。
EAE可以由多种抗原诱导，如髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)、蛋白脂蛋白(proteolipid protein，PLP)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)等，然而以往大多数EAE模型仅模拟出MS的急性期表现，仅很少试验真正模拟出具有典型慢性期的MS。MOG的含量在中枢神经系统中只占0.05-0.1％，却能诱导出具有多相病程的EAE模型，且能在模型脑内产生大片脱髓鞘斑块，这与以往MBP、PLP等诱导的以炎性病灶为主的EAE模型明显不同，更加近似的模拟了MS，为后续的临床治疗提供了有利的参考，但是利用MOG建立的EAE模型，与利用其他抗原建立的EAE模型相比，MOG诱导的EAE模型临床表型多样，发病率也不同，文献报道从不发病到100％发病非常不一致，非常不稳定，是其缺点，所以建立一个稳定的EAE动物模型，对于后续的免疫学、影像学、病理学的研究都有很大实用价值。
MR影像作为临床和病理的一个重要的辅助工具，可以对MS动物模型中新旧病灶进行观察，对整个发病过程进行全程监测，是临床表现的一个重要补充。而目前用于MRI研究EAE病理改变的大鼠模型以急性炎症为主，脱髓鞘轻微，仅适用于急性炎症期研究，无法开展MTI等新技术在髓鞘损伤方面的研究。由于大鼠中枢神经系统的体积很小，进行大鼠MRI研究通常选用超高场强(＞4.7T)设备及专用小孔径动物线圈，但这些设备普及率很低，使之应用受到很大限制。有学者尝试在临床型MRI设备上应用特殊小孔径动物线圈进行大鼠的MRI研究，结果仅能获得脑组织及其病灶的MRI图像，无法获得质量满意的脊髓图像，而且这些小孔径线圈由研究者自制，使其普及应用受到限制。有报道应用豚鼠进行1.5TMR成像，但其图像组织分辨率差，仅能粗略估计病灶形态，对于精细解剖结构的显示非常不理想。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种建立多发性硬化动物模型的方法，通过该方法制得的EAE模型，稳定性好，对于后续的免疫学、影像学、病理学的研究有非常实用的临床价值，为研究人类的多发性硬化疾病提供了有利的支持。
为达到以上目的，本发明采用的技术方案是：一种建立多发性硬化动物模型的方法，包括以下步骤：
步骤一、准备动物，健康雄性Lewis大鼠，普通级；
步骤二、准备诱导剂：MOG35-55肽段；
步骤三、制备动物模型：
将MOG35-55溶于生理盐水，然后与等体积的佐剂混合成乳化物，然后将上述乳化物注射Lewis大鼠，注射次数为两次以上，9-12周后即制得多发性硬化动物模型；
步骤三中，将MOG35-55溶于生理盐水时，每μl生理盐水中MOG35-55的用量为：3-6μg，生理盐水的用量为30-100μl；
更进一步，步骤三中，每μl生理盐水中MOG35-55的用量为：3-6μg，生理盐水的用量为50μl；
进一步，步骤三中，分次注射时，分为2-3次注射，每次注射的间隔时间为3-6周；再进一步，如果分2次注射，每次注射的间隔时间为6周，如果分3次注射，每次注射的间隔时间为3周；
进一步，步骤三中，分次注射时，每次注射乳化物0.6-0.20ml；更进一步，每注射乳化物的剂量为0.10ml；
进一步，步骤三中，对Lewis大鼠注射时，选择Lewis大鼠尾根部皮下注射。
本发明的效果在于：采用本发明所述方法制备的多发性硬化动物模型，该模型的稳定性好，非常适合于临床对多发性硬化的研究，并且能够为影像学、病理学的研究提供满意的图像质量，为人们更好的认识和研究多发性硬化提供了良好的模型。
附图说明
图1是三种临床表型的EAE大鼠发病进程图，其中，图1A是单纯急性型大鼠发病进程；图1B是慢性进展型的大鼠发病进程；图1C是复发缓解型的大鼠发病进程；
图2是急性期的EAE模型大鼠病灶的MR影像表现，其中，图2A是T2WI见脑桥大片云雾状高信号示意图，图2B是双侧丘脑病灶，并可见USPIO强化示意图；
图3.是EAE模型大鼠病灶的组织病理学表现，其中，图3A是LFB染色，(光镜×100)，实施例1中的大鼠的丘脑病灶，内囊部分受累，可见大片脱髓鞘斑块；图3B是HE染色，(光镜×100)，实施例2中的大鼠的左顶叶皮层病灶，炎症细胞围绕小血管周围，伴有小胶质细胞和巨噬细胞浸润示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述：
实施例1
本实施例意在建立一种急性重度EAE模型，该方法建立的EAE模型的发病临床表现以中重度为主，发病时间一致，病灶相对较大，脱髓鞘病灶重，适合典型急性期研究，建立该模型的具体方法如下：
步骤一、准备健康雄性Lewis大鼠10只，普通级，体重为300±10g；
步骤二、准备诱导剂：MOG35-55肽段，该物质可以在生物用品试剂公司购买到，也可以自己合成，本实施例中的MOG35-55肽段为宣武医院自己合成的；
步骤三、制备动物模型：
本实施例中，每次注射时均先将MOG35-55溶于50μl的生理盐水中，然后与等体积的佐剂50μl混合成乳化物0.1ml，然后对Lewis大鼠进行乳化物注射，注射部位为：尾根部皮下注射；本实施例中，注射次数为2次，2次注射的间隔时间为6周，第一次注射时，乳化物中含有150μgMOG35-55、添加含结核分枝杆菌(H37RA型)200μg的完全福氏佐剂(complete Freund′s adjuvant，CFA)50μl；第二次注射时，乳化物中含有300μg的MOG35-55、不完全福氏佐剂(incomplete Freund′sadjuvant，IFA)50μl，第2次注射后即制成急性重度EAE模型；
本实施例中所用的佐剂IFA购自Sigma公司，IFA(不完全福氏佐剂)添加MT后即为CFA(完全福氏佐剂)，MT即结核分枝杆菌(H37RA型)，在佐剂中的浓度为4mg/ml，生理盐水与佐剂的量是等量的，可以根据需要适当改变，保证MT的浓度即可；生理盐水的作用是溶解MOG35-55，佐剂的目的是包裹抗原小颗粒，使之缓慢释放并产生最大量的抗体。
本实施例制得的急性重度EAE模型，其临床表现、MR影像及组织病理学表现如图1A、2A、3A所示。
实施例2
本实施例意在建立一种多相病程的慢性期EAE模型，通过本发明所述的方法建立的模型其临床表现以轻中度为主，发病时间不一，发病持续时间不同，具有急性、慢性进展、慢性复发和隐匿型多个病程，其病灶大小与方法一无明显差别，但病灶范围更加广泛，脱髓鞘程度相对方法一为轻，适合慢性期的研究，建立该模型的具体方法如下：
步骤一、准备健康雄性Lewis大鼠10只，普通级，体重为300±10g；
步骤二、准备诱导剂：MOG35-55肽段，该物质可以在生物用品试剂公司购买到，也可以自己合成，本实施例中的MOG35-55肽段为宣武医院自己合成的；
步骤三、制备动物模型：
本实施例中，每次注射时均先将MOG35-55溶于50μl的生理盐水中，然后与等体积的佐剂50μl混合成乳化物0.1ml，然后对Lewis大鼠进行乳化物注射，注射部位为：尾根部皮下注射；本实施例中，注射次数为3次，每次注射的间隔时间为3周，第一次注射时，乳化物中含有150μgMOG35-55、添加含结核分枝杆菌(H37RA型)200μg的完全福氏佐剂(complete Freund′s adjuvant，CFA)50μl；第二次及第三次注射时，乳化物中均含有150μg的MOG35-55、不完全福氏佐剂(incompleteFreund′s adjuvant，IFA)50μl，第3次注射后即制得慢性期EAE模型。
本实施例中所用的佐剂IFA同样购自Sigma公司。
本实施例制得的多病程EAE模型，其临床表现、MR影像及组织病理学表现如图1A、图1B、图1C、2B、3B所示。
上述两个实施例中，对Lewis大鼠分次注射的用量可总结为如下表格：
| 注射剂量：乳化物0.1ml | 第一次注射 | 第二次注射 | 第三次注射 |
| 实施例1 | 含有150μgMOG35-55的生理盐水50μl+含有MT200μg的CFA 50μl | 含有300μgMOG35-55的生理盐水50μl+IFA 50μl | |
| 实施例2 | 含有150μg MOG35-55的生理盐水50μl+含有MT200μg的CFA 50μl | 含有150μgMOG35-55的生理盐水50μl+IFA 50μl | 含有150μgMOG35-55的生理盐水50μl+IFA 50μl |
通过上述两个实施例可以看出，本发明所述方法建立的EAE模型，其优点在于：两种方法都模拟了MS典型的脱髓鞘病灶，病灶范围大，方法二更加模拟了MS的临床不均一性。两种模型在3.0TMR设备上成像清晰，无论是脑还是脊髓都有清晰的组织分辨率，病灶边界清楚，无论是Gd-DTPA或是USPIO造影剂强化，都可见明确的强化效果，非常有助于临床进行研究。
上述实施例只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。
Claims (8)
1、一种建立多发性硬化动物模型的方法，包括以下步骤：
步骤一、准备动物，健康雄性Lewis大鼠，普通级；
步骤二、准备诱导剂：MOG35-55肽段；
步骤三、制备动物模型：
将MOG35-55溶于生理盐水，然后与等体积的佐剂混合成乳化物，然后将上述乳化物注射Lewis大鼠，注射次数为两次以上，9-12周后即制得多发性硬化动物模型。
2、如权利要求1所述的一种建立多发性硬化动物模型的方法，其特征在于：步骤三中，将MOG35-55溶于生理盐水时，每μl生理盐水中MOG35-55的用量为：3-6μg，生理盐水的用量为30-100μl。
3、如权利要求2所述的一种建立多发性硬化动物模型的方法，其特征在于：步骤三中，每μl生理盐水中MOG35-55的用量为：3-6μg，生理盐水的用量为50μl。
4、如权利要求1或2所述的一种建立多发性硬化动物模型的方法，其特征在于：步骤三中，分次注射时，分为2-3次注射，每次注射的间隔时间为3-6周。
5、如权利要求4所述的一种建立多发性硬化动物模型的方法，其特征在于：如果分2次注射，每次注射的间隔时间为6周，如果分3次注射，每次注射的间隔时间为3周。
6、如权利要求2所述的一种建立多发性硬化动物模型的方法，其特征在于：步骤三中，分次注射时，每次注射乳化物0.6-0.2ml。
7、如权利要求6所述的一种建立多发性硬化动物模型的方法，其特征在于：每次注射乳化物的剂量为0.10ml。
8、如权利要求1所述的一种建立多发性硬化动物模型的方法，其特征在于：步骤三中，对Lewis大鼠注射时，选择Lewis大鼠尾根部皮下注射。
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| CN106619740A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-05-10 | 首都医科大学附属北京中医医院 | 一种pa动物体内耐药性诱导模型及其构建方法和应用 |
| CN110402890A (zh) * | 2019-08-21 | 2019-11-05 | 管阳太 | 一种nmosd动物模型构建方法 |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20091028 |