CN102302385A - 一种胃轻瘫大鼠模型的造模方法 - Google Patents

一种胃轻瘫大鼠模型的造模方法 Download PDF

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朱进霞
冯小燕
郑丽飞
王建刚
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Abstract

一种胃轻瘫大鼠模型的造模方法，涉及医学研究用动物模型的造模方法，其特征是用6-OHDA损毁坐标为AP＝-5mm，ML＝±2mm，DV＝-8mm，处的神经核团，没有干扰动物的胰岛功能和糖代谢功能，提供一种成模率高，死亡率低，操作简单结果稳定，宜于标准化的非糖尿病胃轻瘫大鼠模型的造模方法。为系统的研究胃轻瘫的发病机制，尤其是非糖尿病胃轻瘫的研究提供了新的工具。

Description

一种胃轻瘫大鼠模型的造模方法
技术领域：
本发明涉及医学研究用动物模型的造模方法，具体涉及一种胃轻瘫动物模型的造模方法。
背景技术：
胃轻瘫(Gastroparesis)是以胃排空延缓为主要特征的一组临床征候群，主要表现为恶心、呕吐、早饱等一系列胃动力不足症状，而无胃肠道器质性病变，临床上慢性多见，症状持续或反复发作常达数月甚至10余年，对患者的生活质量造成了一定的影响。越来越多的证据显示，胃轻瘫对于致死率和致残率的影响不容忽视。胃轻瘫根据病因可分为原发性和继发性两类。原发性又称特发性胃轻瘫，多发于年轻女性。继发性胃轻瘫常见于糖尿病、胃部手术和帕金森病等患者。近年来，随着中国进入老龄化社会，较快的生活节奏和较大的精神压力使上述疾病发病率的逐渐增高，胃轻瘫在人群的发病率更加不容乐观。胃轻瘫不但严重危害人们的健康，而且占用大量医疗资源，给社会经济带来较重负担。因此，有关胃轻瘫的研究在国内外均是热点课题。进行胃轻瘫的研究，首先要复制标准理想的胃轻瘫动物模型。理想的胃轻瘫动物模型应具备以下要求：I)临床相似性：即制作的胃轻瘫动物模型应与临床相近似，动物模型能够模拟人类发生胃轻瘫的特殊病理过程，尽量接近人类情况。II)可重复性：即对胃轻瘫动物模型造模的关键步骤客观化、定量化。III)可操作性：即模型操作技术简单，易于掌握，便于推广。目前，关于糖尿病胃轻瘫的研究较为深入，而关于其它类型胃轻瘫研究的报道较少。糖尿病胃轻瘫模型造模的主要方法有四氧嘧啶联合饮食失节法，链脲佐菌素腹腔注射法、葡萄糖注射法和高脂饮食法等。四氧嘧啶能选择性破坏多种属动物的胰岛B细胞，引起实验性糖尿病胃轻瘫。此法常用于制备胰岛素依赖性糖尿病胃轻瘫动物模型。链尿佐菌素是一种药效强大的烷化剂，能干扰葡萄糖的转运，影响葡萄糖激酶的功能，诱导DNA双链的断裂。该模型具有中度高血糖、高血脂、高血压、胰岛素抵抗等特点。上述造模方法，促进了糖尿病胃轻瘫的研究，但由于缺乏糖尿病之外的胃轻瘫动物模型造模方法，阻碍了对于其它类型的胃轻瘫机理研究。
发明内容：
本发明的目的是提供一种成模率高，死亡率低，操作简单结果稳定，宜于标准化的非糖尿病胃轻瘫大鼠模型的造模方法。
本发明的方案是：一种胃轻瘫大鼠模型的造模方法，包括以下步骤：
(1)选取雄性SD大鼠，体重210～240g，随机分成实验组和假手术组，称量体重，并按每100g体重0.4ml的剂量注射10％水合氯醛麻醉大鼠；
(2)将动物俯卧固定于立体定位仪上，插入耳杆，两侧耳杆坐标相等为4至6mm，用镊子拉出舌头，上牙齿挂好，夹紧鼻夹，调整齿杆-2.3mm(SD)；
(3)用酒精湿润头部毛发，剃刀剃去毛发，碘氟消毒皮肤，酒精脱碘后切开皮肤，约1至1.5cm长，刀柄钝性分离皮下组织，暴露颅骨，3％H2O2烧灼，直至看清囟门；
(4)调整立体定位仪，注射器针尖对准前囟的十字缝中心，下降触及颅骨，横纵坐标调零；根据图谱坐标在前囟后5mm，左旁开2mm和右旁开2mm两处，用记号笔做记号；
(5)分别在两个记号处钻孔；
(6)对于上述两个钻孔，分别进行(7)至(9)步骤；
(7)注射器留1μl气泡，然后抽取浓度为2μg/μl的6-OHDA 4μl；
(8)在钻孔处进针至硬脑膜下，读取深度坐标，缓缓进针至图谱坐标处硬脑膜下8mm，匀速进药，1μl/分钟，注射2μl，留针2分钟，缓慢上升，抽出针头；
(9)针头沾少量生理盐水湿润切口，用生理盐水浸泡明胶海绵，挤干后封孔；
(10)撒少量青霉素粉末于创口，缝合皮肤，肌肉注射青霉素每只0.5ml；
(11)正常对照组注射生理盐水，其它与模型组相同；
(12)动物在室温条件下，正常昼夜更替的光照，24小时食水供应；饲养四周后成模。
从实验结果看，该模型能稳定的模拟人类胃轻瘫时的诸多症状。
由于方案采用的是损毁坐标为AP＝-5mm，ML＝±2mm，DV＝-8mm，的的神经核团，没有干扰动物的胰岛功能和糖代谢功能，因此是一种非糖尿病胃轻瘫动物模型的造模方法。容易形成标准化的方法。
从操作过程和结果看，制模技术简单，易于掌握，结果稳定。
经过大量的实验统计可知此模型的死亡率为11.5％，远低于糖尿病胃轻瘫模型普遍的死亡率。
实验证明，该方法的成模率高达90％。
因此，本发明的方案实现了提供一种成模率高，死亡率低，操作简单结果稳定，宜于标准化的非糖尿病胃轻瘫大鼠模型的造模方法的目的。
具体实施方式：
步骤：
((1)选取雄性SD大鼠，体重210～240g，随机分成实验组和假手术组，称量体重，并按每100g体重0.4ml的剂量注射10％水合氯醛麻醉大鼠；
(2)将动物俯卧固定于立体定位仪上，插入耳杆，两侧耳杆坐标相等为4至6mm，用镊子拉出舌头，上牙齿挂好，夹紧鼻夹，调整齿杆-2.3mm(SD)；
(3)用酒精湿润头部毛发，剃刀剃去毛发，碘氟消毒皮肤，酒精脱碘后切开皮肤，约1至1.5cm长，刀柄钝性分离皮下组织，暴露颅骨，3％H2O2烧灼，直至看清囟门；
(4)调整立体定位仪，注射器针尖对准前囟的十字缝中心，下降触及颅骨，横纵坐标调零；根据图谱坐标在前囟后5mm，左旁开2mm和右旁开2mm两处，用记号笔做记号；
(5)分别在两个记号处钻孔；
(6)对于上述两个钻孔，分别进行(7)至(9)步骤。
(7)注射器留1μl气泡，然后抽取浓度为2μg/μl的6-OHDA 4μl；
(8)在钻孔处进针至硬脑膜下，读取深度坐标，缓缓进针至图谱坐标处硬脑膜下8mm，匀速进药，1μl/分钟，注射2μl，留针2分钟，缓慢上升，抽出针头；
(9)针头沾少量生理盐水湿润切口，用生理盐水浸泡明胶海绵，挤干后封孔；
(10)撒少量青霉素粉末于创口，缝合皮肤，肌肉注射青霉素每只0.5ml；
(11)正常对照组注射生理盐水，其它与模型组相同；
(12)动物在室温条件下，正常昼夜更替的光照，24小时食水供应；饲养四周后成模。
结果
动物基本情况观察
术后一周内，大鼠活动较少，饮食少，体重改变不大。此后饮食逐渐恢复正常，体重增加，活动增多。所有大鼠切口干燥，未见感染。实验过程中，未出现大鼠意外死亡。经观察发现实验组动物笼中出现较多食物碎屑，排出的大便明显干结，并部分出现腹部胀大情况。
大体观察
大鼠自由饮食成模后断颈处死，切开腹部，快速取出胃。观察发现实验组动物的胃明显比假手术组大，食物储留多。
组织学观察
大鼠自由饮食成模后断颈处死，切开腹部，快速取出胃，用K-HS冲洗胃内容物，取胃体，沿着胃大弯处剪开，4℃下移入4％多聚甲醛固定6小时，依次移入20％和30％的蔗糖溶液中直至沉底，然后常规脱水，石蜡包埋，水平连续切片，厚5μm，HE染色，光镜下观察。发现实验组动物的胃的肌层较假手术组略厚。
在体胃动力观察
(1)大鼠术前禁食24小时，但自由饮水。用水合氯醛(0.4g/kg，i.p.)麻醉动物。
(2)大鼠仰卧固定于恒温加热板上，用肛门探针检测大鼠体温并维持在37±1℃(ATC heating system，WPI)。
(3)用酒精湿润腹部毛发，剃去毛发，碘氟消毒并用酒精脱碘后，沿腹正中线在剑突下1cm处切开皮肤约2cm。
(5)用消毒棉棒将胃拉出腹腔，将已定标的应变片(WS100；北京新航新业技术有限公司)缝在离幽门管尾侧0.5cm处的胃窦的浆膜层，并将其联于PowerLab的前置放大器(ML112，PowerLab，AD Instruments，Australia)上记录胃窦纵行肌的收缩活动，通过“Chart & Scope”进行实验数据采集(PowerLab，ADInstruments，Australia)。
(6)禁食胃收缩活动稳定2个小时后开始采集实验数据。
结果发现在假手术组大鼠，胃的移行性复合运动可以很清楚的分辨。移行性复合运动的每一个周期可分为四个时相：I相(静息期)，不出现胃肠收缩；II相胃肠开始有散发的蠕动；III相胃肠出现规则的簇状的高振幅收缩；Ⅳ相是从III相转至下一个周期I相之间的短暂过渡期。然而实验组大鼠移行性复合运动III相收缩的收缩幅度明显减小和频率显著降低。
离体胃动力观察
(1)自由饮食大鼠成模后断颈处死，切开腹部，快速取出胃，用K-HS冲洗胃内容物，取胃体并沿着胃大弯处剪开，腔面膜朝下平铺在装有冰K-HS的硅胶上。
(2)全层的胃体沿纵行肌剪成1～1.5cm长，2mm宽的肌条，用外科缝线将肌条的两端分别固定在标本支持棒和压力传感器上并置于恒温(37±0.5℃)、持续通气(95％O2&5％CO2)的水浴中(15mL K-HS)。
(3)当给肌条施加1g的静息张力时，肌条长度的改变被张力传感器记录，肌条适应45～60分钟后，待基线稳定后正式记录自发收缩的频率和幅度。
结果发现在去除胃肠激素的影响的胃体平滑肌条，在基础张力的作用下仍然表现有节律性收缩。实验组大鼠与假手术组相比胃张力显著降低，但频率没有明显改变。胃动力变化值为假手术组与实验组之间平均每次波动曲线下面积或面积增大之比。
胃固体排空情况观察
(1)选取体重相当的假手术组和实验组大鼠各一只，实验前禁食24小时。
(2)给予标准实验鼠粮自由进食1小时，而后撤去食物并在4小时后脱颈椎处死，剖开腹腔，结扎胃的幽门和贲门后取出。
(3)将胃内容物取出即胃内残留物，烘干称重，计算胃内残留物占进食量百分比即为胃内残留率。
胃排空是胃内食糜由胃排入十二指肠的过程，主要反映了胃消化期间的运动情况。实验结果发现4小时后假手术组大鼠和实验组大鼠相比胃排空率下降了43％。
胃液体排空情况观察
(1)选取体重相当的假手术组和实验组大鼠各一只，实验前禁食24小时。
(2)将1.4kg/L硫酸钡剂2mL在2min内用灌胃针经食管注入胃腔。
(3)迅速用水合氯醛(0.4g/kg，i.p.)麻醉动物。受检动物仰卧固定，将全腹部作为感兴趣区进行扫描，然后分别于45min，90min，135min，180min，225min和270min时采像，观察胃内容物排空情况。
为更加直观地观察胃排空情况，我们应用了小动物活体X光成像系统。研究结果显示假手术组大鼠在180min时的胃内硫酸钡剂已完全排空，但实验组大鼠胃内硫酸钡剂依旧清晰可见，说明实验组大鼠胃排空率显著降低。
通过对大鼠基本情况、大体及组织学和胃动力及胃排空的观察证实：可以通过客观量化实验大鼠的选取和固定、药物注射部位及药物剂量来标准化的制作大鼠的胃轻瘫动物模型。本发明作为一种新型的非糖尿病胃轻瘫大鼠模型制模方法具有并发症少、成模率高、重复性好等特点，为系统的研究胃轻瘫的发病机制，尤其是非糖尿病胃轻瘫的研究提供了新的工具。

Claims (1)

1.一种胃轻瘫大鼠模型的造模方法，包括以下步骤：
(1)选取雄性SD大鼠，体重210至240g，随机分成实验组和假手术组，称量体重，并按每100g体重0.4ml的剂量注射10％水合氯醛麻醉大鼠；
(2)将动物俯卧固定于立体定位仪上，插入耳杆，两侧耳杆坐标相等为4至6mm，用镊子拉出舌头，上牙齿挂好，夹紧鼻夹，调整齿杆-2.3mm(SD)；
(3)用酒精湿润头部毛发，剃刀剃去毛发，碘氟消毒皮肤，酒精脱碘后切开皮肤，约10至15mm长，刀柄钝性分离皮下组织，暴露颅骨，3％H2O2烧灼，直至看清囟门；
(4)调整立体定位仪，注射器针尖对准前囟的十字缝中心，下降触及颅骨，横纵坐标调零；根据图谱坐标在前囟后5mm，左旁开2mm和右旁开2mm两处，用记号笔做记号；
(5)分别在两个记号处钻孔；
(6)对于上述两个钻孔，分别进行(7)至(9)步骤；
(7)注射器留1μl气泡，然后抽取浓度为2μg/μl的6-OHDA 4μl；
(8)在钻孔处进针至硬脑膜下，读取深度坐标，缓缓进针至图谱坐标处硬脑膜下8mm，匀速进药，1μl/分钟，注射2μl，留针2分钟，缓慢上升，抽出针头；
(9)针头沾少量生理盐水湿润切口，用生理盐水浸泡明胶海绵，挤干后封孔；
(10)撒少量青霉素粉末于创口，缝合皮肤，肌肉注射青霉素每只0.5ml；
(11)正常对照组注射生理盐水，其它与模型组相同；
(12)动物在室温条件下，正常昼夜更替的光照，24小时食水供应；饲养四周后成模。
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