CN105832793B - 滨蒿提取物作为制备治疗由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及滨蒿提取物的应用技术领域，是一种滨蒿提取物作为制备治疗由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎药物的应用。本发明首次公开了滨蒿提取物作为制备治疗由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎药物的应用；通过体外抗菌实验能够说明滨蒿提取物具有显著抑制肺炎链球菌和乙型溶血性链球菌生长的作用，通过抗炎实验能够说明滨蒿提取物具有抗炎活性，同时，滨蒿提取物对小鼠肺损伤模型具有保护作用；由上述能够说明滨蒿提取物对由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎具有治疗作用，从而为由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎的治疗提供了新途径。

Description

滨蒿提取物作为制备治疗由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链 球菌引起的肺炎药物的应用

技术领域

本发明涉及滨蒿提取物的应用技术领域，是一种滨蒿提取物作为制备治疗由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎药物的应用。

背景技术

肺炎是指终末气道、肺泡和肺间质的炎症，可由病原微生物、理化因素、免疫损伤、过敏及药物所致。肺炎按解剖可分为大叶性肺炎、小叶性肺炎和间质性肺炎；按病因可分为细菌性肺炎、非典型病原体所致肺炎、病毒性肺炎、真菌性肺炎、其他病原体所致肺炎以及理化因素所致的肺炎；按患病环境分为社区获得性肺炎和医院获得性肺炎。

细菌性肺炎是临床最常见的肺炎，也是常见的感染性疾病之一，发病率非常高，而且不容易治愈，更主要的是该病给患者的身体带来很大伤害，如果不能及时治疗或者治疗不当，不仅会加重病情的发展，还有可能引发其他疾病的发生，甚至引起死亡，其主要原因为重症肺炎患者的免疫功能低下，易合并多重耐药菌感染，出现严重的低氧血症，甚至感染性休克和多脏器功能衰竭。造成这种结果的主要原因不仅是致病菌的作用，还有机体免疫过程中引起的“炎症瀑布效应”，然而，抗生素的治疗并不能有效控制炎症的发生发展。

细菌性肺炎病因主要包括肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎克雷伯杆菌等。社区获得性肺炎的常见病原体为肺炎链球菌。细菌性肺炎占成人各类病原体肺炎的80％，其症状变化较大，可轻可重，决定于病原体和宿主的状态。常见症状为咳嗽、咳痰，或原有呼吸道症状加重，并出现脓性痰或血痰，伴或不伴胸痛。进入抗生素时代以来，细菌性肺炎的预后一度显著改善，但自60年代以后，由于细菌耐药率增高，所谓“难治性”肺炎屡见不鲜，病死率居高不降，尤其在儿童、老年人和免疫抑制患者中病死率极高。如何在抗感染治疗的同时，积极探索其他辅助治疗方法，降低重症肺炎的病死率，已成为近年来临床研究的热点。因此，临床更加注重非抗生素的辅助治疗，如研制新型的抗炎药物来减轻肺组织的炎性损伤，包括肺泡毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞受损，调节机体天然免疫系统来抵御致病菌感染，如何减轻炎症反应对肺组织造成的继发损伤，包括改善肺毛细血管通透性与肺水肿，进一步减轻肺组织病理改变，提高生存率。因此，寻找新型、安全的治疗药物对临床治疗具有重要意义。

中医药治疗肺炎在减轻患者症状、提高患者生存质量及减轻细菌耐药性等方面有明显优势。中医药对重症肺炎的炎性刺激有明显抑制作用，辅助西医药治疗更有利于重症肺炎的恢复及预后。此外西医大剂量使用抗生素、糖皮质激素常伴随免疫抑制等不良反应，不利于重症肺炎患者康复及预后，而中医药在调节患者免疫力，即“扶正”方面具有一定优势。中医药治疗肺炎的机制主要是：一方面可直接抑杀病原微生物，中药抗菌机制与抑制细菌呼吸和糖代谢中间产物的氧化和脱氧，抑制蛋白质和核酸的合成，降低细菌中镁含量，阻止细菌细胞壁合成有关。另一方面还可调节机体免疫功能，可对复杂的细胞因子网络进行协调，使之不致于过度分泌细胞因子或炎症介质，从而改善了炎症和组织损害。

单核巨噬细胞在炎症中扮有重要的角色，所产生的细胞因子和炎性介质，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、一氧化氮(NO)和前列腺素(PGE₂)等，还可产生大量的活性氧自由基(ROS)，参与炎症的发生与发展过程。在细胞内部，这些促炎细胞因子和介质受到核因子NF-κB的调控。因此，这一类促炎细胞因子和介质常作为炎症损伤的指标，也常作为评价抗炎药物的观测标准。由于脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7小鼠巨噬细胞会分泌以上细胞因子和介质并产生ROS，因此该细胞常作为研究抗炎药物的细胞模型。

NF-κB目前被认为是应激反应尤其是炎症过程的关键调控因子，NF-κB通过调控机体内多种前炎症因子等细胞因子调节炎症免疫反应，控制炎症性疾病的发展。当NF-κB结合位点接受多种免疫刺激，如TNF-α、LPS、T细胞激活剂、生长因子等均可通过一个或多个信号转录途径激活蛋白激酶，致使NF-κB被激活而由胞浆转核而发生效应。NF-κB调控过程中有多种蛋白激酶或受体参与，它们介导下游NF-κB信号通路的信号传导，从而影响细胞的生存、增殖、分化和死亡等多个生物学过程的调控。NF-κB活化后能调控一系列基因的表达：细胞表面受体，转录因子，黏附分子，前炎症性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6，趋化因子如单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等，而诱导表达的细胞因子又能上调其活性，形成正反馈调节机制，增强炎症反应。

丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen—Activated Protein Kinase，MAPK)信号转导通路是细胞内一类非常重要的信号转导通路，MAPK家族有三条经典的亚族通路分别是细胞外调节蛋白激酶1和2(extracellular signal-related kinases l and 2，ERKl/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38Mitogen-hctivated Protein Kinase，p38MAPK)。这些MAPK通路被脂多糖(LPS)等多种因素激活后，通过复杂的细胞内信号的传导，可产生大量的炎性介质，从而促进炎症的发生发展。ERK、JNK、p38MAPK通路活化的标志是其磷酸化形式表达量的增多。MAPK通路可以促进炎症的发展，因此，MAPK也是药物抑制炎症反应的靶点之一。

正常生理状态下，NF-κB与抑制性蛋白IκBα结合成无活性的二聚体复合物存在细胞浆中，当受到外界的刺激，如TNF-α、LPS、T细胞激活剂、生长因子等，IκBα就会发生磷酸化，磷酸化的IκBα蛋白发生泛素-蛋白酶体降解，从二聚体上解离出来，活化的NF-κB从细胞质转移至核内，对下游的细胞因子和炎症介质等发挥转录调控作用，上调炎症因子和炎症介质的蛋白表达，加重炎症反应；ERK1/2是MAPK家族三条经典的亚族通路之一，其磷酸化形式即：p-ERK1/2表达量的增多标志着MAPK信号通路的活化，从而促进炎症反应的发生和发展，导致炎症因子TNF-α、IL-6基因转录和蛋白表达水平增高。因此，抑制IκBα蛋白和ERK1/2蛋白发生磷酸化，即：下调p-IκBα、p-ERK1/2蛋白表达水平，就可以分别抑制NF-κB和ERK1/2MAPK信号通路的活化，从而发挥抗炎作用。

滨蒿(Artemisia scoparia Waldst.et kit)为菊科蒿属植物，维吾尔名“西瓦克”，是维吾尔医常用药材，同时也是中药茵陈的植物来源之一。滨蒿在新疆的资源分布极为广泛。目前为止，国内外未见滨蒿提取物用于治疗由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎的相关报道。

发明内容

本发明提供了一种滨蒿提取物作为制备治疗由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎药物的应用；本发明首次公开了滨蒿提取物作为制备治疗由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎药物的应用。

本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种滨蒿提取物作为制备治疗由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎药物的应用。

下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进：

上述滨蒿提取物中的黄酮类成分的质量百分比为25％至75％。

上述药物的剂型为药学上可接受的剂型。

上述药学上可接受的剂型为片剂或颗粒剂或口服液或注射剂。

本发明首次公开了滨蒿提取物作为制备治疗由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎药物的应用；通过体外抗菌实验能够说明滨蒿提取物具有显著抑制肺炎链球菌和乙型溶血性链球菌生长的作用，通过抗炎实验能够说明滨蒿提取物具有抗炎活性，同时，滨蒿提取物对小鼠肺损伤模型具有保护作用；由上述能够说明滨蒿提取物对由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎具有治疗作用，从而为由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎的治疗提供了新途径。

附图说明

附图1为空白对照组(cont)、LPS模型组、LPS+吲哚美辛组(indometacin，INDO)及LPS+滨蒿提取物(BH)组的凝胶图像。

附图2为空白对照组(cont)、LPS模型组、LPS+吲哚美辛组(indometacin，INDO)及LPS+滨蒿提取物(BH)组的p-IκBα蛋白表达。

附图3为空白对照组(cont)、LPS模型组、LPS+吲哚美辛组(indometacin，INDO)及LPS+滨蒿提取物(BH)组的p-ERK1/2蛋白表达。

附图4为空白对照组(cont)、LPS模型组、LPS+吲哚美辛组(indometacin，INDO)及LPS+滨蒿提取物(BH)组的TNF-α蛋白表达。

附图5为空白对照组(cont)、LPS模型组、LPS+吲哚美辛组(indometacin，INDO)及LPS+滨蒿提取物(BH)组的IL-6的蛋白表达。

附图6为空白对照组(cont)、LPS模型组、LPS+吲哚美辛组(indometacin，INDO)及LPS+滨蒿提取物(BH)组的TNF-αmRNA表达水平。

附图7为空白对照组(cont)、LPS模型组、LPS+吲哚美辛(INDO)组及LPS+滨蒿提取物(BH)组的IL-6mRNA表达水平。

附图8为空白对照组(cont)、LPS模型组、LPS+吲哚美辛(INDO)组及LPS+滨蒿提取物(BH)组的NF-κB核转位。

附图9为正常对照组(cont)、LPS模型组、LPS+DEX(5mg/kg)组、LPS+BH(200mg/kg)组、LPS+BH(400mg/kg)组的肺部病理(200×)。

具体实施方式

本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例1：该滨蒿提取物作为制备治疗由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎药物的应用。滨蒿提取物为申请号为200910113473的中国专利文献中提及的滨蒿提取物。滨蒿提取物也可以为现有普通市售的滨蒿提取物。

实施例2：作为上述实施例的优化，滨蒿提取物中的黄酮类成分的质量百分比为25％至75％。

实施例3：作为上述实施例的优化，药物的剂型为药学上可接受的剂型。

实施例4：作为上述实施例的优化，药学上可接受的剂型为片剂或颗粒剂或口服液或注射剂。

下面为本发明所述的滨蒿提取物作为制备治疗由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎药物的应用的具体药理实验：

(一)体外抗菌试验

1实验材料

1.1受试药物滨蒿提取物，新疆药物研究所制备，批号20141028；复方一枝蒿颗粒，新疆银朵兰维药股份有限公司，批号20141223；头孢氨苄胶囊，浙江亚太药业股份有限公司。

1.2菌株与试剂肺炎链球菌，批号：ATCC 49619；乙型溶血性链球菌，批号：ATCC19615；以上菌种均购于中国食品药品检定研究院。一次性使用培养皿，江拱医疗科技有限公司；营养琼脂培养基(杭州微生物试剂有限公司，批号：150117)；血琼脂培养基(杭州微生物试剂有限公司，批号：20150622)；胎牛血清(杭州微生物试剂有限公司,批号：051112)；过氧化氢(杭州微生物试剂有限公司，批号：051019)；Optochin纸片(杭州微生物试剂有限公司，批号：120829)。

2样品的预处理

分别称取滨蒿提取物样品10g、复方一枝蒿样品10g，样品分别以无菌双蒸水配制成浓度为1000mg/mL的药液，头孢氨苄胶囊(标示量125mg)以无菌双蒸水配成12.5mg/mL的浓度，充分振摇后置4℃冰箱浸泡过夜，取浸泡液过滤除菌,分别接种于M-H琼脂培养基和血琼脂平板，置37℃培养箱培养24h后观察有无菌生长。结果表明，受试样品(滨蒿提取物样品、复方一枝蒿样品、孢氨苄胶囊)溶液均无菌生长，可用于下一步实验。

3实验方法

3.1实验菌的准备

乙型溶血性链球菌和肺炎链球菌菌株分别接种于血琼脂平板，选取菌落直径约等于1mm大小的菌接种于1mL血清肉汤培养基，6h后，经麦氏比浊法确定细菌浓度，同时做细菌计数。确定细菌浓度约为10^9-10CFU/mL，并做系列稀释，通过倾倒平板法计数。实验中，每1mL液体培养基中加入0.1mL菌悬液为最终实验浓度，计数结果：乙型溶血性链球菌的实验浓度为3.3×10⁷CFU/mL，肺炎链球菌的实验浓度为3.8×10⁶CFU/mL。

3.2试管法测定对乙型溶血性链球菌和肺炎链球菌的MIC和MBC

实验包括三组，每组包括13个管。采用标准试管二倍稀释法稀释滨蒿提取物药液。2号-13号管，每管均分别加入胎牛血清0.05mL和肉汤培养基0.85mL，混匀即得到0.9mL血清肉汤培养基，1号管加入0.05mL胎牛血清和1.75mL滨蒿提取物初始药液(浓度为1000mg/mL)混匀，取1号管药液0.9mL加入2号管，混匀，然后取2号管药液0.9mL加入3号管，混匀，以此类推连续倍比稀释至第10管，将滨蒿提取物稀释成浓度1:1(500mg/mL)，1:2(250mg/mL)，1:4(125mg/mL)，1:8(62.5mg/mL)，1:16(31.25mg/mL)……1:256(1.95mg/mL)共10管。对照药复方一枝蒿的稀释方法同滨蒿提取物。对照药头孢氨苄配制成12.5mg/mL的溶液，同理稀释成浓度1:1(6.25mg/mL)，1:2(3.125mg/mL)，1:4(1.56mg/mL)，1:8(0.78mg/mL)，1:16(0.39mg/mL)……1:256(0.0024mg/mL)共10管。每组的第11管只加血清肉汤培养基做空白对照管，每组的第12管不加菌液(乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌)加0.1mL药液(各组对应的药液，比如对照药头孢氨苄组的药液为头孢氨苄溶液)做对照，第13管不加药液(各组对应的药液，比如对照药头孢氨苄组的药液为头孢氨苄溶液)做菌液(乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌)对照，第1号-10号管以及第13号每管分别加入0.1mL实验用新鲜菌液，置37℃培养箱中培养24h，24h后观察菌对照管的细菌生长情况，同时比对1号-12号试管每只试管上清浑浊度，摇匀后，用10uL加样器吸取少量划平板，观察是否有菌生长，观察最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)，并统计出MIC₅₀和MBC₅₀。滨蒿提取物、复方一枝蒿、头孢氨苄对乙型溶血性链球菌(乙型链球菌)和肺炎链球菌生长情况的影响如表1至表3所示，滨蒿提取物、复方一枝蒿、头孢氨苄对乙型溶血性链球菌(乙型链球菌)的MIC、MBC、MIC₅₀和MBC₅₀如表4所示，滨蒿提取物、复方一枝蒿、头孢氨苄对肺炎链球菌的MIC、MBC如表5所示。表1至表3中，“－”表示无菌生长，“+”表示有菌生长。表4和表5中，药物浓度(药浓，mg/mL))

4实验结果分析

通过表4至表5可以看出，滨蒿提取物对乙型溶血性链球菌的MIC、MBC分别为31.25mg/mL、62.5mg/mL，其50％MIC、50％MBC分别为7.8mg/mL、15.6mg/mL；复方一枝蒿对乙型溶血性链球菌的MIC、MBC分别为250mg/mL、500mg/mL，其50％MIC、50％MBC分别为15.6mg/mL、31.2mg/mL；头孢氨苄颗粒对乙型溶血性链球菌的MIC、MBC分别为0.19mg/mL、0.39mg/mL，其50％MIC、50％MBC分别为0.048mg/mL、0.095mg/mL，说明滨蒿提取物具有较强的抗乙型溶血性链球菌作用；滨蒿提取物对肺炎链球菌的MIC、MBC分别为15.63mg/mL、31.25mg/mL，复方一枝蒿对肺炎链球菌的MIC、MBC分别为250mg/mL、500mg/mL，头孢氨苄颗粒对肺炎链球菌的MIC、MBC分别为0.019mg/mL、0.039mg/mL，说明滨蒿提取物具有较强的抗肺炎链球菌作用。

(二)抗炎实验

虽然抗感染治疗仍然是临床上治疗肺炎的主要措施，但研究显示，现有的抗感染治疗措施不能进一步降低重症肺炎的病死率。主要原因不仅是致病菌的作用，还有机体免疫过程中引起的“炎症瀑布效应”。如何在抗感染治疗的同时，积极探索其他辅助治疗方法，降低重症肺炎的病死率，已成为近年来临床研究的热点。因此，临床逐渐对非抗生素辅助治疗更加重视，如应用抗炎药物来减轻肺组织的炎性损伤等。中医药对重症肺炎的炎性刺激有明显抑制作用，辅助西医药治疗更有利于重症肺炎的恢复及预后。由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的重症肺炎，在机体免疫过程中也会激发“炎症瀑布效应”，最终可能会导致胸膜炎、脓胸、心包炎、脑膜炎等并发症的发生，因此，在给予抗感染治疗的同时，积极采取抗炎辅助治疗就尤为重要。

1体外实验-滨蒿提取物的抗炎作用及抗炎机制

本实验以细菌脂多糖LPS诱导RAW 264.7小鼠巨噬细胞建立细胞炎症模型，模拟体内炎症反应。

1.1实验材料

1.1.1细胞小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7购自中科院上海细胞库(ATCC)，用10％(热灭火)胎牛血清、2Mm/L-glutamine、100μg/mL链霉素、100U/mL青霉素的DMEM培养液于37℃、5％二氧化碳培养箱中常规培养(隔天传代，细胞于对数生长期呈半贴壁状态生长)。

1.1.2试剂DMEM培养基、青霉素、链霉素、胎牛血清购自Gibco公司；胰蛋白酶Amreseo公司；Lipopolysaccharide(Escherichia coli 0111:B4),Dexamethasone(Dex),Indometaxin(Indo,53-86-1),DCFH-DA(D6883),Hoechst 33342(B2261)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。小鼠TNF-α、IL-6、MCP-1ELISA试剂盒均购自武汉华美生物科技有限公司；PGE₂Express EIA Kit购自Cayman Chemical Company(MI USA)；LPS(Escherichia coli 0111；B4)和MTT为Sigma公司产品。NaNO₂，对氨基苯磺酰胺，天津市河北区海晶精细化工厂；N-萘乙二胺盐酸盐，天津市化学试剂六厂，其他常用试剂均为国产分析纯；Anti-phospho-I-κBα(p-I-κBα)(Ser32)、Anti-NF-κB p65(D14E12)mAb、Phospho-p44/42MAPK(p-ERK1/2)、TNF-αAntibody购自Cell Signaling(Beverley,MA,USA)；Anti-GAPDH购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA,USA).Anti-IL-6antibody ab6672购自abcam；Goat Anti-Rabbit IgG,Biotin Conjugated,Streptavidin-HRP and eECL Western Blot Kit购自于康为世纪生物技术有限公司。Alexa Fluor 488Goat Anti-Rabbit IgG(A0423)购自于碧云天生物技术有限公司。

1.2实验方法

1.2.1滨蒿提取物的抗炎作用-滨蒿提取物对LPS致RAW 264.7细胞急性炎症的影响

(1)细胞毒性测定

取对数生长期的RAW 264.7细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，制成每mL含2×10⁵个细胞的单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，每孔含细胞数为2×10⁴，分组如表6所示，待细胞80％-90％融合后，将培养液换成无血清的培养基，每孔190μL，12h后分别加入不同浓度的样品10μL(稀释20倍)，置37℃、5％的二氧化碳浓度的条件下培养箱培养24h，然后加入5mg/mL MTT 10μL，继续培养，4h后弃去上清、每孔加入150μL DMSO，振摇至生成的蓝紫色甲瓒结晶完全溶解后，用微孔板检测系统M5测定490nm处的吸光度值(OD值)，各组的OD值如表6所示。

(2)对LPS致RAW 264.7产生炎性介质NO的影响

取对数生长期的巨噬细胞RAW 264.7，按2×10⁵个/孔接种在96孔板中，每孔100μL，待细胞80％-90％融合后，将培养液换成无血清的培养基，并加入滨蒿提取物孵育l小时，然后加入终浓度为1μg/mL的LPS，同时设LPS模型组、空白对照组和吲哚美辛组,每组6个重复孔。各组加剂量(μg/mL)如表7所示，置37℃培养箱中培养18h后，吸取培养液上清100μL至酶标板中，加入等体积的Griess试剂(Griess试剂A：0.1％N-萘乙二胺盐酸盐，溶于水；Griess试剂B：1％对氨基苯磺酰胺，溶于5％磷酸盐溶液中；使用前等体积混合试剂A和试剂B)。室温反应5min后测定540nm的吸光度值。用浓度为0μmol/L、1μmol/L、2.5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的亚硝酸钠绘制标准曲线，根据亚硝酸钠标准曲线计算细胞培养上清液中NO的浓度，空白对照组、LPS模型组、吲哚美辛组和滨蒿提取物组的NO浓度(μmol/L)如表7所示。在表7中，与空白对照组比较，^##P<0.01；与LPS模型组比较，^＊P<0.05，^＊＊P<0.01。

(3)对LPS致RAW 264.7产生ROS的影响

实验设空白对照组、LPS模型组、吲哚美辛组和滨蒿提取物组，细胞处理及给药同1.2.1(2)，置37℃培养箱中培养24h后，吸弃上清液，PBS洗细胞3遍，加入终浓度为1μMDCFH-DA探针(PBS 1:1000稀释)100μL，置37℃培养箱中孵育20min，M5检测各孔的荧光强度。空白对照组、LPS模型组、吲哚美辛组和滨蒿提取物组的荧光强度(ROS)如表7所示。在表7中，与空白对照组比较，^##P<0.01；与LPS模型组比较，^＊P<0.05，^＊＊P<0.01。

(4)对RAW 264.7细胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6、MCP-1、PGE₂的影响

实验设空白对照组、LPS模型组、吲哚美辛组和滨蒿提取物组，细胞处理及给药同1.2.1(2)，置37℃培养箱中培养24h后收集上清液，按照ELISA试剂盒说明书方法进行测定，根据标准曲线计算各组培养上清中TNF-α、IL-6、MCP-1、PGE₂的浓度。空白对照组、LPS模型组、吲哚美辛组和滨蒿提取物组的TNF-α、IL-6浓度(pg/mL)如表8所示，空白对照组、LPS模型组、吲哚美辛组和滨蒿提取物组的MCP-1、PGE₂的浓度(pg/mL)如表9所示。在表8、表9中，与空白对照组比较，^##P<0.01；与LPS模型组比较，^＊P<0.05，^＊＊P<0.01。

1.2.2滨蒿提取物的抗炎机制

①Western Blot法检测对p-IκBα、p-ERK1/2、TNF-α、IL-6蛋白表达的影响

实验方法：1)将状态良好的RAW 264.7细胞分别接种于21个直径为60mm的培养皿，待细胞融合90％时，将培养细胞随机分为空白对照组、LPS模型组、LPS+吲哚美辛组(15μg/mL)及LPS+滨蒿提取物组(12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)，每组每个浓度3个培养皿，将完全培养基换成不完全培养基，各组加入指定浓度的样品预先孵育1h，空白及LPS模型组给予DMEM培养液，然后除空白对照组外，每个皿加入终浓度为1μg/mL LPS的刺激RAW264.7细胞。2)24h后，弃去培养上清，尽量吸弃干净，每个皿加入150μL裂解液(10mmol/LHEPES-KOH pH7.9，60mmol/L KCl，1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT，0.4％NP-40，100mg/LPMSF)，冰上孵育5min，用细胞刮子将细胞刮下来收集于离心管中，4℃下12000g离心5min。取上清液加1/4体积的5×SDS-PAGE上样液，沸水浴8min，放于-20℃保存待用。3)同时取5ul上清液按照BCA蛋白质检测试剂进行蛋白浓度测定。用BCA蛋白定量试剂盒测定提取物蛋白含量。4)SDS－PAGE电泳。上样：每孔加样量为40μg，并加有预染Marker作为指示。电泳：浓缩胶中电压为80V，分离胶中电压为120V。根据蛋白质Marker的指示终止电泳，进行转膜。5)转膜：采用PVDF膜，BIO-RAD电转仪装置，恒流200mA，冰水浴转膜2h。6)封闭及杂交：转膜完后，将PVDF膜取出置封闭液(含5％BSA的TBST)中37℃孵育1h，加一抗(工作浓度1:1000)37℃孵育2h，TBST洗4次，每次5min。加二抗(工作浓度1：800)37℃孵育1h，用TBST洗4次，每次5min。7)发光鉴定：参照ECL化学发光试剂盒操作手册，主要步骤如下：将试剂A和试剂B等体积混合，室温放置1min。加混合液于PVDF膜上，充分浸润，然后爆片。8)凝胶图像分析：用凝胶图象处理系统Quantity one software分析目标条带的光密度值。空白对照组(cont)、LPS模型组、LPS+吲哚美辛组(indometacin，INDO)及LPS+滨蒿提取物(BH)组的凝胶图像如图1。空白对照组(cont)、LPS模型组、LPS+吲哚美辛组(indometacin INDO)及LPS+滨蒿提取物(BH)组的p-IκBα、p-ERK1/2、TNF-α、IL-6的蛋白表达如图2至图5所示。在图2至图5中，与空白对照组(Cont)比较，^##P<0.01。与LPS模型组比较，^＊P<0.05,^＊＊P<0.01。

②RT-PCR法检测TNF-α、IL-6mRNA表达水平

实验方法：1)总RNA的抽提。细胞总RNA的提取：用TRIZOL试剂提取，按TRIZOL试剂说明书进行。细胞培养及加药同1.2.2①。加1mL TRIZOl于培养皿中，反复吹打，直至细胞完全被消化。室温静置5min，加0.2mL氯仿，剧烈振动15s。室温静置5min，4℃、12000g离心15min。取上层水相600μL于另一1.5mL EP管中，加600μL异丙醇，颠倒混匀。室温静置10min，4℃、12000g离心10min。去上清，加入冰预冷的75％乙醇1mL。4℃、7500g离心5min。弃上清，空气干燥5min至10min。用30μL DEPC水溶解沉淀物。提取的总RNA用紫外分光光度测定其含量和纯度：OD260值1OD＝40μg RNA，要求OD260/OD280≥1.80及OD260/OD280≤2.1。

2)逆转录。取2μg RNA作为模板合成cDNA，反应体系(20μL)中包括：1×RT buffer，0.5mM dNTPs，1μg Oligo d(T)18，400U M-MLV,40U RNA酶抑制剂。反应程序：42℃逆转录30min，然后85℃、5s灭活RNA酶。合成的cDNA储存在-20℃备用。

3)实时荧光定量PCR：使用高亲合力双链DNA结合染料SYBR green I在Mx3000PT检测系统进行实时荧光定量PCR。25μL反应液中包含:150ng总RNA逆转录的cDNA，1μL Taq DNA聚合酶(1unit/μL),1×PCR反应缓冲液，3mM MgCl2，0.2mM dNTPs，SYBR Green I(20×)0.25μL,10pmol uPAR或GAPDH上游及下游特异性引物。反应程序为：94℃预变性30S，94℃变性5S，55℃退火15S，72℃延伸10S，共39个循环，85℃8s，每个循环在85℃时检测荧光强度。空白对照组、LPS模型组、LPS+吲哚美辛组及LPS+滨蒿提取物组的TNF-αmRNA表达水平如图6所示，空白对照组(cont)、LPS模型组、LPS+吲哚美辛(INDO)组及LPS+滨蒿提取物(BH)组的IL-6mRNA表达水平如图7所示。

引物由上海生工公司设计合成。引物序列：

小鼠GAPDH上游：5′-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′，

GAPDH下游,5′-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′；

IL-6上游,5′-CTGATGCTGGTGACAACCAC-3′，

IL-6下游,5′-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3′；

TNF-α上游,5′-CATGGATCTCAAAGACAACC-3′，

TNF-α下游,5′-GGTATATGGGCTCATACCAG-3′。

③免疫荧光染色法检测滨蒿提取物对LPS致RAW 264.7细胞急性炎症时NF-κB核转位的影响

实验方法：1)将状态良好的RAW 264.7细胞接种1块96孔培养板，待细胞融合90％时，将培养细胞随机分为空白对照组、LPS模型组、LPS+吲哚美辛组(15μg/mL)及LPS+滨蒿提取物组(12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)，每组每个浓度4个重复，将完全培养基换成不完全培养基，各组加入设定终浓度的样品预先孵育2h，空白及LPS模型组给予DMEM培养液。2)除空白对照组外，每孔加入终浓度为2μg/mL LPS，终体积为200μL，37℃孵育30min。3)各孔吸弃100μL培养上清，再加入8％中性甲醛100μL/孔，固定30min。4)弃上清，加入0.1％Triton100PBS溶液100μL/孔，37℃孵育30min并室温放置1h。5)弃上清，加入3％BSA封闭，50μL/孔，37℃孵育1h。6)弃上清，加入NF-κB p65抗体(3％BSA按400:1稀释)，50μL/孔，室温放置1h，4℃过夜。7)回收一抗，用PBS洗细胞3次，100μL/孔/次。8)二抗孵育，加入3％BSA稀释的浓度为1.6μL/mL的绿色荧光二抗Alexa Fluor 488Goat Anti-Rabbit IgG，50μl/孔，室温避光孵育1h。9)回收抗体，0.1％Tween-20PBS洗3次，100μL/孔/次，弃上清，用Hoechst33342染核(用PBS 1:1000稀释)，室温孵育20min。10)弃上清，PBS洗细胞3次，100μL/孔/次，最后加入200μL PBS，高内涵仪器ARRAYSCAN VTI(Thermo SCIENTIFIC)检测细胞核及细胞浆内绿色荧光强度。空白对照组(cont)、LPS模型组、LPS+吲哚美辛(INDO)组及LPS+滨蒿提取物(BH)组的NF-κB核转位如图8所示。在图8中，与空白对照组(Cont)比较，^##P<0.01。与LPS模型照组比较，^＊P<0.05,^＊＊P<0.01。

1.2.3统计方法以上实验数据以x±s表示,采用SPSS 17.0统计软件处理。组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

1.3实验结果分析

通过表6可以看出，滨蒿提取物在12.5μg/mL至100μg/mL的剂量时，滨蒿提取物对RAW264.7细胞无明显细胞毒作用；通过表7至表9可以看出，滨蒿提取物在剂量为12.5μg/mL-100μg/mL时，可呈浓度依赖性地显著抑制LPS诱导RAW264.7细胞产生炎症因子TNF-α、IL-6、MCP-1及炎症介质NO，显著抑制PGE₂及细胞内活性氧自由基ROS的产生，说明滨蒿提取物具有明显的抗炎活性。

由图1至图5可见，滨蒿提取物呈剂量(12.5μg/mL至100μg/mL)依赖性地显著抑制RAW 264.7细胞急性炎症时的TNF-α、IL-6、p-IκBα、p-ERK1/2蛋白表达，通过图6至图7可知，滨蒿提取物显著抑制TNF-αmRNA、IL-6mRNA表达；通过图8可知，LPS模型组NF-κB发生了核转位，而滨蒿提取物呈剂量(12.5μg/mL至100μg/mL)依赖性地显著抑制NF-κB核转位，抑制其活化。

通过体外实验可知，滨蒿提取物在LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型中，可浓度依赖性地显著抑制炎性因子TNF-α、IL-6、MCP-1和PGE₂的生成，显著抑制炎症介质NO的生成及活性氧自由基ROS的生成，可显著降低TNF-α、IL-6蛋白和mRNA表达水平，显著降低p-ERK1/2、p-IκBα蛋白表达水平，显著抑制NF-κB核转位，说明滨蒿提取物有显著的抗炎作用，滨蒿提取物通过抑制I-κB、ERK1/2的磷酸化，以剂量依赖的方式抑制LPS诱导的NF-κB和ERK1/2MAPK的活化,从而减少TNF-α、IL-6等炎性因子及炎症介质的表达来发挥抗炎作用。其抗炎作用与抑制NF-κB/MAPK信号通路的活化密切相关。

2体内抗炎实验-滨蒿提取物对LPS致小鼠急性肺损伤的保护作用

急性肺损伤(ALI)是多种因素(如感染、创伤等)直接或间接作用于肺脏导致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭。LPS是ALI的重要致病因素之一，LPS作为革兰氏阴性细菌细胞壁外膜中以脂多糖为主的成分，在细菌繁殖或死亡时释放到细胞外发挥致病效应。由LPS所致的ALI动物模型可表现出肺泡毛细血管损伤和弥漫性的肺泡损伤、中性粒细胞浸润，并伴有肺内出血、水肿等。大量研究发现，LPS诱导的ALI动物模型具有不会引起全身性炎症反应和多器官衰竭的特点，因此，十分适用于药物抗炎作用及机制的研究。由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎也会导致严重的肺损伤，本实验以LPS所诱导的ALI小鼠模型为载体，观察滨蒿提取物对急性肺损伤小鼠的保护作用，探讨其抗炎作用，可为该药临床用于由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎的治疗提供实验依据。

2.1实验材料

2.1.1受试药物：滨蒿提取物(BH)，阳性对照药地塞米松(DEX)。

2.2.2实验动物：雄性BALB/c小鼠，4-6周龄，体重18g-20g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

2.2.3主要试剂

内毒素LPS(055:B5)，Sigma公司；TNF-α、IL-6ELISA试剂盒，武汉华美公司；其他试剂均为国产分析纯。

2.2实验方法

取雄性BALB/c小鼠120只，适应性喂养3天后，依体重随机均衡分为5组，即正常对照组(0.5％羧甲基纤维素钠)、LPS模型组(0.5％羧甲基纤维素钠)、LPS+DEX(5mg/kg)组、LPS+BH(200mg/kg)组、LPS+BH(400mg/kg)组。配药：小鼠灌胃容积为10mL/kg，依据给药剂量计算出配药浓度，采用0.5％羧甲基纤维素钠制备成混悬液，对各实验组小鼠进行灌胃给药。然后，在超净工作台内，采用无菌生理盐水溶解LPS，配制成终浓度为6mg/mL的溶液。除正常对照组外，灌胃给药1小时后，采用乙醚轻度麻醉小鼠，用移液枪吸取50μL浓度为6mg/mL的LPS溶液滴鼻感染小鼠诱导肺损伤模型，6h后各实验组再给药一次。LPS刺激24小时后，

①颈椎脱臼处死小鼠，每组取6只小鼠，用4℃预冷灭菌的PBS进行肺气管插管灌洗，每次0.3mL，反复冲洗3次后收集肺泡灌洗液于1.5mL EP管中，4℃，1500rmp离心10min，回收上清置于-80℃冰箱保存待测TNF-α、IL-6炎症因子的含量。正常对照组、LPS模型组、DEX组和滨蒿提取物组的TNF-α、IL-6炎症因子的含量(pg/mL)如表10所示，在表10中，与正常对照组比较，^##P<0.01，与模型组比较，^＊＊P<0.01。数据用SPSS17.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，^＊P<0.05有统计学意义。

②采用50μL预冷灭菌PBS重悬灌洗液离心后收集的细胞，统计细胞总数；细胞总数进行涂片，用瑞氏-姬姆萨染色法统计中性粒细胞和巨噬细胞数。正常对照组、LPS模型组、DEX组和滨蒿提取物组的白细胞总数、巨噬细胞数和中性粒细胞数(×10⁶)如表11所示，表11中，与正常对照组比较，^##P<0.01，与模型组比较，^＊P<0.05，^＊＊P<0.01。数据用SPSS17.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05有统计学意义。

③每组再另取6只小鼠，摘取肺组织，并去除结缔组织和脂肪，左肺装入5mL离心管称湿重，然后置烘箱80℃烘烤48小时，称干重以计算肺的湿干重比，肺湿干重比率＝肺组织湿重/干重。正常对照组、LPS模型组、DEX组和滨蒿提取物组肺湿干重比如表12所示，表12中，与正常对照组比较，^##P<0.01，与模型组比较，^＊P<0.05，^＊＊P<0.01。数据用SPSS17.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05有统计学意义。

④取右肺中叶固定在4％的甲醛溶液中，用于病理切片分析。正常对照组(Cont)、LPS模型组、LPS+DEX(5mg/kg)组、LPS+BH(200mg/kg)组、LPS+BH(400mg/kg)组的肺部病理如图9(200×)所示。

2.3实验结果分析

通过表10可以看出，LPS刺激24h后，LPS模型组小鼠肺泡灌洗液中的促炎症因子TNF-α、IL-6水平显著升高，阳性对照药地塞米松可显著降低TNF-α、IL-6水平，滨蒿提取物在400mg/kg的剂量也可显著降低TNF-α、IL-6水平。

通过表11可以看出，LPS刺激24h后，LPS模型组小鼠肺泡灌洗液中的白细胞总数显著升高，中性粒细胞数及巨噬细胞数也显著升高。阳性对照药地塞米松可显著降低白细胞总数，中性粒及巨噬细胞数，滨蒿提取物低、高剂量也可浓度依赖性地显著降低炎症细胞的数目，说明滨蒿提取物对急性肺损伤小鼠具有抗炎保护作用。

通过表12可以看出，LPS刺激24h后，LPS模型组小鼠的肺湿干重比显著升高，说明急性肺损伤模型成立，肺部出现明显水肿等炎性变化，阳性对照药地塞米松可显著降低肺湿干重比，滨蒿提取物低、高剂量组可浓度依赖性地显著降低肺湿干重比。

通过图9可以看出，LPS刺激24h后，LPS模型组小鼠肺组织出现了典型的急性肺损伤病理改变，包括：肺泡结构破坏、中性粒细胞浸润、肺泡出血和肺间质水肿。阳性对照药地塞米松组小鼠的肺组织病变程度较轻，基本趋于正常。滨蒿提取物低、高剂量给药组可浓度依赖性地改善急性肺损伤肺组织病理变化。

通过体内实验，说明滨蒿提取物可显著降低LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型的肺湿干重比，显著降低肺泡灌洗液中的白细胞总数、中性粒及巨噬细胞数，还可显著降低肺泡灌洗液中炎症因子TNF-α、IL-6水平，并对肺组织病理变化具有显著改善作用，说明滨蒿提取物对小鼠急性肺损伤具有显著的保护作用。

(三)酶学实验—滨蒿提取物对环氧化酶COX-1、COX-2的抑制作用

环化氧酶COX-1和COX-2分别由两个独立的基因编码，两者在结构上有60％的同源性。COX-1在人体多数组织中持续表达，对外界刺激不敏感，维护机体正常的生理功能，发挥保护作用；而COX-2是一种诱导型酶，多数正常组织中无法检测到，但可被多种刺激因素，如细胞因子、丝裂原、诱癌剂等诱导而表达。因此，COX-2在某一组织内异常增高预示着炎症的发展，而是否能抑制COX-2也成为目前抗炎药物的判断标尺之一。目前，大多数传统的抗炎药物对COX-1和COX-2均有抑制作用，有的药物是选择性的抑制COX-2。因此，我们检测滨蒿提取物对COX-1、COX-2活性的抑制效果，进一步明确滨蒿提取物的抗炎作用机制，即滨蒿提取物是否可以通过调控炎症反应中的限速酶，对炎症起到控制作用。

1实验材料

COX Fluorescent Inhibitor Screening Assay Kit购自Cayman ChemicalCompany(MI USA)。

2实验方法

称取滨蒿提取物样品溶于DMSO中配制成浓度为200mg/mL的母液，采用蒸馏水倍比稀释成100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL的一系列浓度，按照试剂盒说明书方法操作，采用微孔板检测系统(Molecular Devices,M5)检测荧光强度值，激发波长535nm，吸收波长590nm。滨蒿提取物对COX-1酶的抑制活性如表13所示，滨蒿提取物对COX-2酶的抑制活性如表14所示。

3.实验结果分析

通过表13至表14可以看出，滨蒿提取物呈剂量(3.125μg/mL至100μg/mL)依赖性地抑制COX-1和COX-2的活性，IC₅₀分别为5.8μg/mL、4.1μg/mL。

通过酶学实验，环氧化酶COX-1和COX-2是抗炎药物的一个作用靶点，滨蒿提取物对该靶点具有较好的抑制作用。

综上所述，本发明首次公开了滨蒿提取物作为制备治疗由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎药物的应用；通过体外抗菌实验能够说明滨蒿提取物具有显著抑制肺炎链球菌和乙型溶血性链球菌生长的作用，通过抗炎实验能够说明滨蒿提取物具有抗炎活性，同时，滨蒿提取物对小鼠肺损伤模型具有保护作用；由上述能够说明滨蒿提取物对由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎具有治疗作用，从而为由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎的治疗提供了新途径。

以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。

Claims (3)

1.一种滨蒿提取物在制备治疗由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎药物的应用，其特征在于滨蒿提取物中的黄酮类成分的质量百分比为25%至75%。

2.根据权利要求1所述的滨蒿提取物在制备治疗由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎药物的应用，其特征在于药物的剂型为药学上可接受的剂型。

3.根据权利要求2所述的滨蒿提取物在制备治疗由肺炎链球菌或/和乙型溶血性链球菌引起的肺炎药物的应用，其特征在于药学上可接受的剂型为片剂或颗粒剂或口服液或注射剂。