ES2784136T3 - Combinaciones de lisina de bacteriófagos y antibióticos contra bacterias grampositivas - Google Patents

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Abstract

Una lisina PlySs2 en combinación con uno o más antibióticos seleccionados de daptomicina y linezolid para su uso en la destrucción de bacterias grampositivas en un método terapéutico para la prevención, interrupción o tratamiento de infección o colonización por bacterias grampositivas, en donde la combinación de lisina PlySs2 y antibiótico es sinérgica y es eficaz para destruir bacterias grampositivas a dosis menores o con concentración inhibidora mínima (CIM) menor que lisina PlySs2 o antibiótico solos.

Description

DESCRIPCIÓN
Combinaciones de lisina de bacteriófagos y antibióticos contra bacterias grampositivas
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a combinaciones de lisina PlySs2 y uno o más antibióticos para su uso en la prevención, la mejora y el tratamiento de bacterias grampositivas, incluyendo bacterias estafilocócicas.
Antecedentes de la invención
El desarrollo de bacterias resistentes a fármacos es un problema importante en la medicina, ya que se usan más antibióticos para una amplia variedad de enfermedades y otras afecciones. El uso de más antibióticos y la cantidad de bacterias que muestran resistencia ha provocado tiempos de tratamiento más largos. Asimismo, se están usando ahora con más frecuencia antibióticos inespecíficos, de amplio espectro, algunos de los cuales tienen efectos perjudiciales para el paciente. Un problema relacionado con este mayor uso es que muchos antibióticos no penetran fácilmente los revestimientos mucosos.
Las bacterias grampositivas están rodeadas por una pared celular que contiene polipéptidos y polisacáridos. Las bacterias grampositivas incluyen, pero sin limitación, los géneros Actinomyces, Bacillus, Listeria, Lactococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Mycobacterium, Corynebacterium y Clostridium. Las especies médicamente relevantes incluyen Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus y Enterococcus faecalis. Algunas especies de Bacillus, que forman esporas, provocan carbunco y gastroenteritis. Algunas especies de Clostridium formadoras de esporas son responsables del botulismo, el tétanos, la gangrena gaseosa y la colitis pseudomembranosa. Algunas especies de Corynebacterium provocan difteria y algunas especies de Listeria provocan meningitis.
Los enfoques novedosos de la terapia antimicrobiana incluyen antibióticos a base de enzimas ("enzibióticos") tales como lisinas de bacteriófagos. Los fagos usan estas lisinas para digerir la pared celular de sus hospedadores bacterianos, liberando la descendencia vírica a través de lisis hipotónica. Se produce un resultado similar cuando se añaden lisinas recombinantes purificadas de manera externa a las bacterias grampositivas. La alta actividad letal de las lisinas contra patógenos grampositivos las hace candidatos atractivos para su desarrollo como productos terapéuticos (Fischetti, V. A. (2008) Curr Opinion Microbiol 11: 393-400; Nelson, D. L. et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98: 4107-4112). Las lisinas de bacteriófagos se propusieron inicialmente para erradicar el transporte nasofaríngeo de estreptococos patógenos (Loeffler, J. M. et al. (2001) Science 294: 2170-2172; Nelson, D. et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98: 4107-4112). Las lisinas son parte del mecanismo lítico usado por el fago de ADN bicatenario (ADNbc) para coordinar la lisis del hospedador con la finalización del ensamblaje vírico (Wang, I. N. et al. (2000) Annu Rev Microbiol 54: 799-825). Las lisinas son peptidoglucano hidrolasas que rompen enlaces en la pared bacteriana, hidrolizando rápidamente enlaces covalentes esenciales para la integridad de los peptidoglucanos, provocando lisis bacteriana y liberación simultánea de fagos descendientes.
Los miembros de la familia de lisina presentan un diseño modular en el que un dominio catalítico se fusiona con un dominio de especificidad o de unión (Lopez, R. et al. (1997) Microb Drug Resist 3: 199-211). Las lisinas pueden clonarse a partir de secuencias víricas de probacteriófago dentro de genomas bacterianos y usarse para el tratamiento (Beres, S. B. et al. (2007) PLoS ONE 2 (8): 1-14). Cuando se añade de manera externa, las lisinas pueden acceder a los enlaces de una pared celular grampositiva (Fischetti, V. A. (2008) Curr Opinion Microbiol 11: 393-400). Las enzimas líticas de bacteriófagos se han establecido como útiles en la evaluación y el tratamiento específico de diversos tipos de infección en sujetos a través de diversas vías de administración. Por ejemplo, la patente de los Estados Unidos 5.604.109 (Fischetti et al.) se refiere a la detección rápida de estreptococos del grupo A en muestras clínicas, mediante la digestión enzimática por una enzima lisina asociada a fagos estreptocócicos del grupo C semipurificada. Este trabajo enzimático se convirtió en la base de investigación adicional, que conduce a métodos de tratamiento de enfermedades. Las patentes de Fischetti y Loomis (patentes de los Estados Unidos 5.985.271, 6.017.528 y 6.056.955) desvelan el uso de una enzima lisina producida por bacterias estreptocócicas del grupo C infectadas con un bacteriófago C1. La patente de los Estados Unidos 6.248.324 (Fischetti y Loomis) desvela una composición para infecciones dermatológicas mediante el uso de una enzima lítica en un vehículo adecuado para la aplicación tópica a tejidos dérmicos. La patente de los Estados Unidos 6.254.866 (Fischetti y Loomis) desvela un método para el tratamiento de infecciones bacterianas del tracto digestivo que comprende administrar una enzima lítica específica para las bacterias de infección. El vehículo para administrar al menos una enzima lítica al tracto digestivo se selecciona del grupo que consiste en enemas de supositorios, jarabes o píldoras con recubrimiento entérico. La patente de los Estados Unidos 6.264.945 (Fischetti y Loomis) desvela un método y una composición para el tratamiento de infecciones bacterianas mediante la introducción parenteral (por vía intramuscular, por vía subcutánea o por vía intravenosa) de al menos una enzima lítica producida por una bacteria infectada con un bacteriófago específico para esa bacteria y un vehículo adecuado para administrar la enzima lítica a un paciente. Se han identificado y clonado enzimas líticas asociadas a fagos de diversos bacteriófagos, cada uno de los cuales ha mostrado ser eficaz para destruir cepas bacterianas específicas. Las patentes de los Estados Unidos 7.402.309, 7.638.600 y la solicitud PCT publicada WO2008/018854 proporcionan enzimas líticas definidas asociadas a fagos útiles como agentes antibacterianos para el tratamiento o la reducción de infecciones por Bacillus anthracis. La patente de los Estados Unidos 7.569.223 describe enzimas líticas para Streptococcus pneumoniae. Se describe lisina útil para Enterococcus (E. faecalis y E. faecium, incluyendo cepas resistentes a vancomicina) en la patente de los Estados Unidos 7.582.291. El documento US 2008/0221035 describe lisinas mutantes Ply GBS muy eficaces para destruir estreptococos del grupo B. Una lisina quimérica denominada ClyS, con actividad contra bacterias estafilocócicas, incluyendo Staphylococcus aureus, se detalla en el documento WO 2010/002959.
Basándose en su degradación de la pared celular rápida, potente y específica y sus propiedades bactericidas, se han sugerido lisinas como agentes terapéuticos antimicrobianos para combatir patógenos grampositivos atacando las paredes celulares de peptidoglucano expuestas desde fuera de la célula (Fenton, M et al. (2010) Bioengineered Bugs 1: 9-16; Nelson, D et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98: 4107-4112). Se ha demostrado la eficacia de diversas lisinas como agentes individuales en modelos de faringitis en roedores (Nelson, D et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98: 4107-4112), neumonía (Witzenrath, M et al. (2009) Crit Care Med 37: 642-649), otitis media (McCullers, J. A. et al. (2007) PLOS pathogens 3: 0001-0003), abscesos (Pastagia, M et al. Antimicrobial agents and chemotherapy 55: 738-744) bacteriemia (Loeffler, J. M. et al. (2003) Infection and Immunity 71: 6199-6204), endocarditis (Entenza, J. M. et al. (2005) Antimicrobial agents and chemotherapy 49: 4789-4792) y meningitis (Grandgirard, D et al. (2008) J Infect Dis 197: 1519-1522). Además, las lisinas son en general específicas para su especie hospedadora bacteriana y no lisan organismos no diana, incluyendo bacterias comensales humanas que pueden ser beneficiosas para la homeostasis gastrointestinal (Blaser, M. (2011) Nature 476: 393-394; Willing, B. P. et al. (2011) Nature reviews. Microbiology 9: 233-243)
Los antibióticos en la práctica clínica incluyen varios que afectan habitualmente a la biosíntesis de peptidoglucanos de la pared celular en bacterias grampositivas. Estos incluyen glucopéptidos, que, como clase, inhiben la síntesis de peptidoglucanos al evitar la incorporación de subunidades peptídicas de N-acetilglucosamina (NAG) y ácido N-acetilmurámico (NAM) en la matriz de peptidoglucanos. Los glucopéptidos disponibles incluyen vancomicina y teicoplanina, siendo vancomicina un fármaco primario de preferencia y aplicación clínica en bacteriemia, en particular infecciones estafilocócicas. Las penicilinas actúan inhibiendo la formación de reticulaciones de peptidoglucanos. Las penicilinas habituales incluyen oxacilina, ampicilina y cloxacilina. El linezolid (Zyvox) es un inhibidor de la síntesis de proteínas y está en una clase de antibacterianos llamados oxazolidinonas (Ford CW et al. (1996) Antimicrob Agents Chemoth 40 (6): 1508-1513; Swaney SM et al. (1998) Antimicrob Agents Chemoth 42 (12): 3251-3255; patente de los Estados Unidos 6.444.813).
Daptomicina (cubicina), también denominado LY 146032, es un agente lipopeptídico antibacteriano que consiste en un péptido de aminoácidos de 13 miembros unido a una cola lipófila de 10 carbonos (Miao V et al. (2005) Microbiology 151 (Pt5): 1507-1523; Steenbergen JN et al. (2005) J Antimicrob Chemother 55 (3): 283-288; y descrito en la patente de los Estados Unidos 5.912.226). Esta estructura da como resultado un mecanismo de acción novedoso, la rotura de la membrana bacteriana mediante la formación de canales transmembrana, que provocan fugas de iones intracelulares que conducen a la despolarización de la membrana celular y la inhibición de la síntesis macromolecular. El espectro de actividad de la daptomicina se limita a organismos grampositivos, incluyendo varias especies muy resistentes (S. aureus resistente a la meticilina (SARM), S. aureus de sensibilidad intermedia a la vancomicina (SAIV), S. aureus resistente a la vancomicina (SARV), enterococo resistente a la vancomicina (ERV)). En los estudios parece ser más rápidamente bactericida que la vancomicina. Su régimen de dosificación aprobado es de 4 mg/kg IV una vez al día. Es necesario un ajuste de dosis en la disfunción renal. La toxicidad primaria de la daptomicina son las mialgias reversibles relacionadas con la dosis y la debilidad. La daptomicina se ha aprobado para el tratamiento de infecciones complicadas de piel y tejidos blandos provocadas por bacterias grampositivas, bacteriemia por Staphylococcus aureus y endocarditis del lado derecho por S. aureus. Están en curso ensayos que evalúan la eficacia de la daptomicina en el tratamiento de infecciones complicadas del tracto urinario y endocarditis/bacteriemia. Su régimen de dosificación aprobado es de 4 mg/kg IV una vez al día. Es necesario un ajuste de dosis en la disfunción renal. La toxicidad primaria de la daptomicina son las mialgias reversibles relacionadas con la dosis y la debilidad. Se ha encontrado resistencia a la daptomicina tanto in vitro como in vivo después de exposición a daptomicina. El o los mecanismos de resistencia no están completamente definidos, pero probablemente estén relacionados con alteraciones de la membrana celular. Múltiples pases de estafilococos y enterococos en concentraciones farmacológicas subinhibidoras dieron como resultado incrementos de CIM de manera gradual. La daptomicina se une ávidamente al tensioactivo pulmonar y no se puede usar con eficacia en el tratamiento de la neumonía (Baltz RH (2009) Curr Opin Chem Biol 13 (2): 144-151).
Los antibióticos de amplio espectro en uso clínico para el tratamiento de infecciones grampositivas, incluyendo, en particular, antibióticos de cuidados intensivos tales como vancomicina, están limitados en su uso y aplicación por sus efectos secundarios de malestar gastrointestinal y diarrea y el desarrollo de resistencia, en particular en relación con el uso continuo o a largo plazo.
Resulta evidente a partir de las deficiencias y los problemas asociados con los agentes antibacterianos tradicionales actuales que todavía existe la necesidad en la técnica de agentes bacterianos específicos adicionales, combinaciones y modalidades terapéuticas, en particular sin altos riesgos de resistencia adquirida. En consecuencia, existe una necesidad comercial de nuevos enfoques antibacterianos, especialmente los que funcionen a través de nuevas modalidades o proporcionen nuevas combinaciones para destruir eficazmente bacterias patógenas.
La cita de referencias en el presente documento no se interpretará como una admisión de que estas son técnica anterior a la presente invención.
Sumario de la invención
La presente solicitud se refiere a combinaciones de lisina(s) de bacteriófagos con antibiótico para la destrucción rápida y eficaz de bacterias grampositivas. De acuerdo con la invención, la lisina PlySs2, que demuestra amplia actividad de destrucción contra múltiples bacterias, en particular bacterias grampositivas, incluyendo cepas bacterianas de Staphylococcus y Streptococcus, proporciona sinergia notable en combinación con antibiótico(s) y puede reducir significativamente las dosis de CIM eficaces necesarias para antibiótico(s).
Por tanto, la invención proporciona una lisina PlySs2 en combinación con uno o más antibióticos seleccionados de daptomicina y linezolid para su uso en la destrucción de bacterias grampositivas en un método terapéutico para la prevención, interrupción o tratamiento de infección o colonización por bacterias grampositivas, en donde la combinación de lisina PlySs2 y antibiótico es sinérgica y es eficaz para destruir bacterias grampositivas a dosis menores o con concentración inhibidora mínima menor que lisina PlySs2 o antibiótico solos. La invención también proporciona una lisina PlySs2 en combinación con uno o más antibióticos para su uso en la destrucción de bacterias grampositivas en un método terapéutico para la prevención, interrupción o tratamiento de infección o colonización por bacterias grampositivas en donde el antibiótico es un antibiótico grampositivo de amplio espectro y la lisina PlySs2 es capaz de destruir bacterias grampositivas, en donde el desarrollo de resistencia a antibióticos se reduce tras la administración de la lisina y el antibiótico y en donde uno o ambos del antibiótico y la lisina PlySs2 se administran a una dosis inferior a la dosis de concentración inhibidora mínima (CIM). En una realización, tanto el antibiótico como la lisina PlySs2 se administran a una dosis inferior a la dosis de concentración inhibidora mínima (CIM).
La invención también proporciona una composición que comprende una lisina PlySs2 y un antibiótico para su uso en la destrucción de bacterias grampositivas en un método terapéutico para la prevención, interrupción o tratamiento de infección o colonización por bacterias grampositivas en donde el uso comprende la etapa de poner en contacto las bacterias con la composición y reduce la población de bacterias grampositivas, en donde la lisina PlySs2 es capaz de destruir bacterias grampositivas y en donde uno o ambos del antibiótico y la lisina PlySs2 están presentes en una cantidad inferior a la cantidad de concentración inhibidora mínima (CIM). En una realización, tanto el antibiótico como la lisina PlySs2 están presentes en una cantidad inferior a la cantidad de concentración inhibidora mínima (CIM).
La lisina se puede combinar con antibiótico(s) grampositivo(s) de amplio espectro, incluyendo uno o más de vancomicina, daptomicina, linezolid u oxacilina, incluyendo antibióticos relacionados o similares. En un aspecto particular, la lisina PlySs2 se combina con daptomicina para proporcionar actividad de destrucción sinérgica contra bacterias grampositivas, incluyendo estafilococos, incluyendo en particular SARM. En un aspecto particular de la invención y divulgación, la lisina PlySs2 se combina con vancomicina para proporcionar actividad de destrucción sinérgica contra estreptococos, incluyendo SARM. En un aspecto particular, la lisina PlySs2 se combina con linezolid para proporcionar actividad de destrucción sinérgica contra estreptococos, incluyendo SARM. En un aspecto de la invención, la combinación con lisina PlySs2 reduce significativamente la dosis de antibiótico necesaria para destruir una bacteria grampositiva, tal como S. aureus.
De acuerdo con la invención y divulgación, las combinaciones de lisina PlySs2 y antibiótico, incluyendo antibiótico de distinto tipo o clase, incluyendo en particular daptomicina, vancomicina, linezolid u oxacilina son eficaces para destruir bacterias grampositivas, incluyendo S. aureus, a dosis menores o con CIM menor que cualquiera por sí solo. En un aspecto de la invención, se proporcionan formulaciones de dosis menores de lisina y de antibiótico, incluyendo adecuadas para su administración en combinación o por separado simultáneamente o en serie, en donde la dosis para destruir o descolonizar eficazmente una infección grampositiva es menor que la dosis necesaria si se proporciona cualquiera por sí solo. En particular, se proporcionan formulaciones de dosis bajas de antibióticos para su administración en combinación con lisina PlySs2, administrada simultáneamente o en serie, en donde la dosis para destruir o descolonizar eficazmente una infección grampositiva del antibiótico es menor en combinación con la lisina que la dosis necesaria si el antibiótico se proporciona o administra solo.
En un aspecto de la invención y divulgación, se combinan lisinas eficaces contra estafilococos con uno o más de daptomicina, vancomicina, linezolid u oxacilina, o compuestos antibióticos relacionados, para destruir bacterias grampositivas, incluyendo S. aureus, a dosis menores o con CIM menor que cualquiera por sí solo. En un aspecto de la invención, se combinan lisinas eficaces contra estafilococos con daptomicina, o compuestos antibióticos relacionados, para destruir bacterias grampositivas, incluyendo S. aureus, a dosis menores o con CIM menor que cualquiera por sí solo. En un aspecto de la invención y divulgación, se combinan lisinas eficaces contra estafilococos con uno o más de vancomicina, o compuestos antibióticos relacionados, para destruir bacterias grampositivas, incluyendo S. aureus, a dosis menores o con CIM menor que cualquiera por sí solo. En un aspecto particular, el antibiótico se combina con lisina PlySs2 o una variante de la misma. En un aspecto de la invención y divulgación, la combinación de lisina con daptomicina evita el efecto del tensioactivo para reducir la actividad de la daptomicina. En combinación con lisina PlySs2, la daptomicina se vuelve eficaz para destruir S. aureus y en el tratamiento o alivio de la bacteriemia en un animal. De acuerdo con la presente invención y divulgación, se proporcionan composiciones que comprenden PlySs2 y uno o más antibióticos para la prevención, interrupción y tratamiento de la infección o colonización bacteriana. En su aspecto más amplio, la presente invención y divulgación proporciona uso y aplicación de una lisina que tiene amplia actividad de destrucción contra múltiples bacterias grampositivas, incluyendo cepas bacterianas de Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus y Listeria, en combinación con antibiótico, en particular en combinación con daptomicina, vancomicina, linezolid u oxacilina, o un antibiótico relacionado, para la prevención, el alivio o el tratamiento de bacterias grampositivas o infecciones bacterianas grampositivas.
De acuerdo con la presente invención, se utiliza lisina de bacteriófago PlysSs2 procedente de bacterias Streptococcus suis en los métodos y composiciones de la invención. El o los polipéptidos de lisina PlySs2 de uso en la presente invención, como se proporcionan en el presente documento y en la FIGURA 29 (SEQ ID NO: 1), son únicos por demostrar amplia actividad de destrucción contra múltiples bacterias, en particular bacterias grampositivas, incluyendo cepas bacterianas de Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus y Listeria. En uno de estos aspectos, la lisina PlySs2 es capaz de destruir cepas Staphylococcus aureus y bacterias en combinación con antibiótico, en particular en combinación con daptomicina, vancomicina, oxacilina o linezolid, como se demuestra en el presente documento. PlySs2 es eficaz contra Staphylococcus aureus resistente a antibióticos tal como Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM), Staphylococcus aureus resistente a la vancomicina (SARV), Staphylococcus aureus resistente a la daptomicina (SARd ) y Staphylococcus aureus resistente a linezolid (SARL). PlySs2 es eficaz contra Staphylococcus aureus de sensibilidad intermedia a la vancomicina (SAIV).
Se desvela en el presente documento un método para destruir bacterias grampositivas que comprende la etapa de poner en contacto las bacterias con una combinación de lisina PlySs2 y uno o más antibióticos, comprendiendo la combinación una cantidad de un polipéptido de lisina aislado eficaz para destruir bacterias grampositivas, incluyendo S. aureus, comprendiendo el polipéptido de lisina aislado el polipéptido de lisina PlySs2 o variantes del mismo eficaces para destruir bacterias grampositivas, en donde la cantidad de PlySs2 necesaria para ser eficaz para destruir bacterias grampositivas, incluyendo S. aureus, en presencia de antibiótico es significativamente menor que en ausencia de antibiótico. El polipéptido de lisina PlySs2 aislado de la invención o divulgación puede comprender la secuencia de aminoácidos proporcionada en la FIGURA 29 (SEQ ID NO: 1) o variantes de la misma que tienen al menos 80 % de identidad, 85 % de identidad, 90 % de identidad, 95 % de identidad o 99 % de identidad con el polipéptido de la FIGURA 29 (SEQ ID NO: 1) y eficaz para destruir las bacterias grampositivas.
Se desvela en el presente documento un método para destruir bacterias grampositivas que comprende la etapa de poner en contacto las bacterias con una combinación de lisina PlySs2 y uno o más antibióticos, comprendiendo la combinación una cantidad de un polipéptido de lisina aislado eficaz para destruir bacterias grampositivas, incluyendo S. aureus, comprendiendo el polipéptido de lisina aislado el polipéptido de lisina PlySs2 o variantes del mismo eficaces para destruir bacterias grampositivas, en donde la cantidad de antibiótico necesaria para ser eficaz para destruir bacterias grampositivas, incluyendo S. aureus, en presencia de PlySs2 es significativamente menor que en ausencia de PlySs2.
Según se demuestra de acuerdo con la presente invención, la lisina como se proporciona en el presente documento, incluyendo en particular lisina con actividad contra bacterias Staphylococcus y Streptococcus, incluyendo en particular PlySs2, actúa de manera sinérgica con antibióticos, en particular antibióticos de diferente clase y mecanismo antibacteriano. Por tanto, de acuerdo con la invención, las lisinas PlySs2 o variantes activas de las mismas demuestran mayor actividad en combinación con antibióticos, incluyendo cada uno de los antibióticos que afectan la síntesis de la pared celular, tales como glucopéptidos, penicilinas que inhiben la formación de peptidoglucano, inhibidores de la síntesis de proteínas y antibióticos lipopeptídicos. En cada caso, la actividad antibacteriana tanto de la lisina como del antibiótico mejora significativamente en combinación. La combinación con antibiótico glucopeptídico se demuestra mediante vancomicina, la combinación con la clase de penicilina se demuestra mediante oxacilina, la combinación con antibiótico inhibidor de la síntesis de proteínas, incluyendo la clase de oxazolidinona, se demuestra mediante linezolid y la combinación con antibiótico lipopeptídico se demuestra mediante daptomicina. La presente invención incluye y contempla combinaciones y mayor actividad con los antibióticos demostrados, así como miembros alternativos de su clase o un antibiótico relacionado.
Por tanto, en un aspecto de la divulgación, se proporciona un método para destruir bacterias grampositivas que comprende la etapa de poner en contacto las bacterias con una combinación de lisina y daptomicina o un antibiótico relacionado, comprendiendo la combinación una cantidad de un polipéptido de lisina aislado eficaz para destruir bacterias grampositivas, incluyendo S. aureus, en donde la cantidad de daptomicina o antibiótico relacionado necesaria para ser eficaz para destruir bacterias grampositivas, incluyendo S. aureus, en presencia de lisina es significativamente menor que en ausencia de lisina.
En un aspecto adicional de la divulgación, se proporciona un método para destruir bacterias grampositivas que comprende la etapa de poner en contacto las bacterias con una combinación de lisina y vancomicina o un antibiótico relacionado, comprendiendo la combinación una cantidad de un polipéptido de lisina aislado eficaz para destruir bacterias grampositivas, incluyendo S. aureus, en donde la cantidad de vancomicina o antibiótico relacionado necesaria para ser eficaz para destruir bacterias grampositivas, incluyendo S. aureus, en presencia de lisina es significativamente menor que en ausencia de lisina.
En un aspecto adicional de la divulgación, se proporciona un método para destruir bacterias grampositivas que comprende la etapa de poner en contacto las bacterias con una combinación de lisina y oxacilina o un antibiótico relacionado, comprendiendo la combinación una cantidad de un polipéptido de lisina aislado eficaz para destruir bacterias grampositivas, incluyendo S. aureus, en donde la cantidad de oxacilina o antibiótico relacionado necesaria para ser eficaz para destruir bacterias grampositivas, incluyendo S. aureus, en presencia de lisina es significativamente menor que en ausencia de lisina.
En un aspecto adicional de la divulgación, se proporciona un método para destruir bacterias grampositivas que comprende la etapa de poner en contacto las bacterias con una combinación de lisina y linezolid o un antibiótico relacionado, comprendiendo la combinación una cantidad de un polipéptido de lisina aislado eficaz para destruir bacterias grampositivas, incluyendo S. aureus, en donde la cantidad de linezolid o antibiótico relacionado necesaria para ser eficaz para destruir bacterias grampositivas, incluyendo S. aureus, en presencia de lisina es significativamente menor que en ausencia de lisina.
La divulgación también proporciona un método para destruir bacterias grampositivas resistentes a antibióticos que comprende poner en contacto las bacterias resistentes a antibióticos con una lisina capaz de destruir bacterias estafilocócicas. En uno de estos aspectos, la bacteria resistente a antibióticos se pone en contacto con lisina, en particular PlySs2, en combinación con un antibiótico al que las bacterias son sensibles, o en combinación con un antibiótico al que las bacterias son resistentes. En uno de estos aspectos del método, la lisina es PLySs2. En uno de estos aspectos, la lisina es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos proporcionada en la FIGURA 29 (SEQ ID NO: 1) o variantes de la misma que tienen al menos 80 % de identidad, 85 % de identidad, 90 % identidad, 95 % de identidad o 99 % de identidad con el polipéptido de la FIGURA 29 (SEQ ID NO: 1) y eficaz para destruir bacterias grampositivas, en particular S. aureus.
La divulgación proporciona uno de estos métodos para destruir bacterias grampositivas resistentes a daptomicina que comprende poner en contacto las bacterias resistentes a daptomicina con una lisina capaz de destruir bacterias estafilocócicas. Dicho método puede incluir la combinación de la lisina con daptomicina y/o con otro antibiótico. En uno de estos aspectos del método, la lisina es PLySs2 como se proporciona en el presente documento.
La divulgación proporciona además uno de estos métodos para destruir bacterias grampositivas resistentes a vancomicina que comprende poner en contacto las bacterias resistentes a vancomicina con una lisina capaz de destruir bacterias estafilocócicas. Dicho método puede incluir la combinación de la lisina con vancomicina y/o con otro antibiótico. En uno de estos aspectos del método, la lisina es PLySs2.
En otro aspecto de los métodos anteriores, los métodos se realizan in vitro, ex vivo o junto con implantación o colocación de un dispositivo in vivo para esterilizar o descontaminar una solución, material o dispositivo, destinado en particular para su uso por o en un ser humano.
En un aspecto adicional de la divulgación, se proporciona un método para mejorar la eficacia de los antibióticos para destruir o descolonizar bacterias grampositivas que comprende la etapa de poner en contacto las bacterias con una combinación de lisina, en particular PlySs2, y uno o más antibióticos, en donde la cantidad de antibiótico necesaria para ser eficaz para destruir o descolonizar las bacterias grampositivas, incluyendo S. aureus, en presencia de lisina es significativamente menor que en ausencia de lisina. En uno de estos aspectos, se proporciona un método para mejorar o facilitar la eficacia de la daptomicina o un antibiótico relacionado contra la neumonía estreptocócica que comprende administrar una lisina, en particular PlySs2, en combinación con daptomicina. En uno de estos métodos o aspectos particulares, la daptomicina es eficaz contra la neumonía estreptocócica cuando se administra en combinación con o después de la administración de lisina, en particular PlySs2, a una dosis de daptomicina que es ineficaz en ausencia de lisina, en particular PlySs2.
La divulgación proporciona un método para reducir una población de bacterias grampositivas que comprende la etapa de poner en contacto la bacteria con una composición que comprende una cantidad de un polipéptido de lisina aislado independientemente ineficaz para destruir las bacterias grampositivas y una cantidad de antibiótico independientemente ineficaz para destruir las bacterias grampositivas. El antibiótico puede ser un glucopéptido, penicilina, inhibidor de la síntesis de proteínas, ozalidinona o lipopéptido. Dicho método puede incluir un antibiótico seleccionado de vancomicina, daptomicina, linezolid y oxacilina. En un aspecto, el polipéptido de lisina aislado comprende la secuencia de aminoácidos de la FIGURA 29 o la SEQ ID NO: 1) o variantes de la misma que tienen al menos 80 % de identidad con el polipéptido de la FIGURA 29 o la SEQ ID NO: 1 y eficaz para destruir las bacterias grampositivas.
La divulgación proporciona un método para reducir una población de bacterias grampositivas que comprende la etapa de poner en contacto las bacterias con una composición que comprende una cantidad de un polipéptido de lisina aislado independientemente ineficaz para destruir las bacterias grampositivas y una cantidad de daptomicina independientemente ineficaz para destruir las bacterias grampositivas. En un aspecto, el polipéptido de lisina aislado comprende la secuencia de aminoácidos de la FIGURA 29 (SEQ ID NO: 1) o variantes de la misma que tienen al menos 80 % de identidad con el polipéptido de la FIGURA 29 (SEQ ID NO: 1) y eficaz para destruir las bacterias grampositivas.
En cualquiera de dicho método o dichos métodos anteriores, las bacterias susceptibles, destruidas, dispersas o tratadas pueden seleccionarse de Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus simulans, Streptococcus suis, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus equi, Streptococcus equi zoo, Streptococcus agalactiae (GBS), Streptococcus pyogenes (GAS), Streptococcus sanguinisi, Streptococcus gordoniii, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus de grupo G, Streptococcus de grupo E, Enterococcus faecalis y Streptococcus pneumonia.
De acuerdo con cualquiera de los métodos desvelados, la bacteria susceptible puede ser una bacteria resistente a antibióticos. La bacteria puede ser Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM), Staphylococcus aureus de sensibilidad intermedia a la vancomicina (SAIV), Staphylococcus aureus resistente a la vancomicina (SARV), Staphylococcus aureus resistente a la daptomicina (SARD) o Staphylococcus aureus resistente a linezolid (SARL). La bacteria susceptible puede ser una bacteria clínicamente relevante o patógena, en particular para seres humanos. En un aspecto del o los métodos, el o los polipéptidos de lisina son eficaces para destruir cepas bacterianas de Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus y Listeria.
En un aspecto o una realización adicional de los métodos y las composiciones proporcionadas en el presente documento, otra lisina específica estafilocócica distinta se usa en el presente documento sola o en combinación con la lisina PlySs2 como se proporciona y se describe en el presente documento. En uno de dichos aspectos o realizaciones de los métodos y composiciones proporcionados en el presente documento, la lisina ClyS específica estafilocócica se usa en el presente documento sola o en combinación con la lisina PlySs2 como se proporciona y se describe en el presente documento.
La divulgación proporciona métodos para mejorar o facilitar la actividad antibiótica que comprenden administrar una combinación juntos o en serie de lisina, en particular lisina PlySs2, y uno o más antibióticos. En un aspecto de la misma, la actividad antibiótica se mejora o facilita al menos 10 veces, al menos 16 veces, al menos 20 veces, al menos 24 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 70 veces, al menos 80 veces, al menos 100 veces, más de 10 veces, más de 20 veces, más de 50 veces, más de 100 veces. La divulgación proporciona métodos para mejorar o facilitar la actividad de lisina, en particular lisina PlySs2, que comprenden administrar una combinación juntos o en serie de lisina, en particular lisina PlySs2, y uno o más antibióticos. En un aspecto de la misma, la actividad de lisina, en particular PlySs2, se mejora al menos 2 veces, al menos 4 veces, al menos 8 veces, al menos 10 veces, hasta 10 veces, hasta 16 veces, hasta 20 veces.
La divulgación incluye un método para potenciar la actividad antibiótica contra bacterias grampositivas en líquidos biológicos que tienen actividad similar de tipo tensioactivo que comprende administrar antibiótico en combinación con lisina PlySs2 que comprende la secuencia de aminoácidos proporcionada en la FIGURA 29 (SEQ ID NO: 1) o variantes de la misma que tienen al menos 80 % de identidad, 85 % de identidad, 90 % de identidad, 95 % de identidad o 99 % de identidad con el polipéptido de la FIGURA 29 (SEQ ID NO: 1) y eficaz para destruir bacterias grampositivas, en donde el antibiótico es eficaz en combinación con PlySs2 a dosis a las que el antibiótico es ineficaz en ausencia de PlySs2. En un aspecto del método, el antibiótico es daptomicina o un compuesto relacionado. En un aspecto, la bacteria es S. pneumoniae.
Otros objetos y ventajas serán evidentes para los expertos en la materia a partir de una revisión de la siguiente descripción que procede con referencia a los siguientes dibujos ilustrativos.
Breve descripción de los dibujos
La FIGURA 1 representa curvas de destrucción en el tiempo de diversas cepas de SARM en presencia de daptomicina, vancomicina o lisina PlySs2 añadida.
La FIGURA 2 representa curvas de destrucción en el tiempo de diversas cepas de SASM en presencia de daptomicina, vancomicina, oxacilina o lisina PlySs2 añadida.
La FIGURA 3 proporciona un diagrama de resumen de curvas de destrucción en el tiempo de diversas cepas de SARM y SASM en presencia de daptomicina, vancomicina o lisina PlySs2 añadida.
La FIGURA 4A-4F proporciona curvas de destrucción en el tiempo compuestas de PlySS2 y antibióticos en células de S. aureus in vitro. (A, B) Curvas de destrucción en el tiempo compuestas de PlySS2 en comparación con oxacilina (OXA), vancomicina (VAN) y daptomicina (DAP) frente a conjuntos de 20 cepas de SASM y 42 de SARM, respectivamente. En cada análisis individual, las concentraciones farmacológicas corresponden a valores de CIM 1X específicos de cepa. Se muestran los valores medios (± error típico de la media) para cada punto temporal. (C, D) Análisis de valoración de PlySS2 frente a conjuntos de 15 aislados clínicos contemporáneos de SASM y SARM, respectivamente. En cada análisis individual, las concentraciones de PlySS2 corresponden a valores de CIM específicos de cepa. Se usaron concentraciones de CIM 4X, 1X y 0,25X. (E, F) Microfotografías electrónicas de transmisión (aumento 3300x) de células S. aureus (cepa MW2) antes y después de 3 segundos de tratamiento con PlySS2 8 g/ml. Las barras de escala corresponden a 2 pm. La lisis da como resultado la pérdida de componentes citoplasmáticos con tinción oscura.
La FIGURA 5 muestra curvas de destrucción en el tiempo para cepas de SARM tratadas con PlySs2 y vancomicina solas o en combinación a las dosis sub CIM indicadas.
La FIGURA 6 muestra curvas de destrucción en el tiempo para cepas de SARM tratadas con PlySs2 y daptomicina solas o en combinación a las dosis sub CIM indicadas.
La FIGURA 7 representa curvas de destrucción en el tiempo para la cepa de SARM 650 (O52C Tomasz) en presencia de daptomicina y lisina PlySs2 añadidas solas o en combinación a la dosis o CIM indicada.
La FIGURA 8A-8f muestra que PlySs2 actúa de manera sinérgica con antibióticos a través de múltiples cepas in vitro y representa resultados de destrucción en el tiempo para cepas de SASM tratadas con PlySs2 y oxacilina (A, B); cepas de SARM tratadas con Plyss2 y vancomicina (C, D), cepas de SARM tratadas con PlySs2 y daptomicina (E, F). En los paneles A, C y E se muestran datos de destrucción en el tiempo para tres cepas individuales, cepa de SASM JMI 7140, cepa de SARM JMI 3340 y cepa de SARM JMI 3345, respectivamente. (A) Se muestran valores para el crecimiento, el control del crecimiento (sin PlySs2 o antibiótico), PlySs2 CIM 0,13X, oxacilina (OXA) CIM 0,5X, combinación de PlySS2+Oxa de concentraciones farmacológicas indicadas. (C) Se muestran valores para el crecimiento, el control del crecimiento (sin PlySs2 o antibiótico), PlySs2 CIM 0,13X, vancomicina (VAN) CIM 0,5X, combinación de PlySS2+VAN de concentraciones farmacológicas indicadas. (E) Se muestran valores para el crecimiento, el control del crecimiento (sin PlySs2 o antibiótico), PlySs2 CIM 0,25X, daptomicina (DAP) CIM 0,5X, combinación de PlySS2+DAP de concentraciones farmacológicas indicadas. En los paneles B, D y F, se muestra el cambio logarítmico de UFC/ml entre el cultivo tratado con combinación y el control de crecimiento no tratado durante 6 horas para colecciones de cepas. Las líneas punteadas horizontales indican el punto de corte de 2 log necesario para puntuar la sinergia de destrucción en el tiempo. Se muestran reducciones en los recuentos logarítmicos de colonias (o Alog-io UFC/ml) para cultivos tratados durante 6 horas con combinación de fármacos, en comparación con cultivos tratados con el agente individual más activo. El CLSI define la sinergia como una disminución > 2-log-io de UFC/ml y se indica en la figura por la línea discontinua. Clave: Alog10 UFC/ml = cambio en unidades log-io de formadoras de colonias. La FIGURA 9 proporciona un panel de diluciones de dosis de combinaciones de daptomicina y PlySs2 a las concentraciones observadas en la cepa de SARM 553 en presencia de agente reductor (BME).
La FIGURA 10 proporciona un panel de diluciones de dosis de combinaciones de daptomicina y PlySs2 a las concentraciones observadas en la cepa de SARM 553 en ausencia de agente reductor (BME).
La FIGURA 11 proporciona un panel de diluciones de dosis de combinaciones de daptomicina y PlySs2 a las concentraciones observadas en la cepa de SARM 223 en presencia de BME.
La FIGURA 12 proporciona un panel de diluciones de dosis de combinaciones de daptomicina y PlySs2 a las concentraciones observadas en la cepa de SARM 223 en ausencia de BME.
La FIGURA 13 proporciona un panel de diluciones de dosis de combinaciones de daptomicina y PlySs2 a las concentraciones observadas en la cepa de SARM 270 en presencia y ausencia de BME.
La FIGURA 14 proporciona un panel de diluciones de dosis de combinaciones de daptomicina y PlySs2 a las concentraciones observadas en la cepa de SARM 269 en presencia y ausencia de BME.
La FIGURA 15 proporciona un panel de diluciones de dosis de combinaciones de daptomicina y PlySs2 a las concentraciones observadas en la cepa de SARM 241 en presencia y ausencia de BME.
La FIGURA 16 proporciona un panel de diluciones de dosis de combinaciones de daptomicina y PlySs2 a las concentraciones observadas en la cepa de SARM 263 en presencia y ausencia de BME.
La FIGURA 17 proporciona un panel de diluciones de dosis de combinaciones de daptomicina y PlySs2 a las concentraciones observadas en la cepa de SARM 650 en presencia y ausencia de BME.
La FIGURA 18 proporciona un panel de diluciones de dosis de combinaciones de daptomicina y PlySs2 a las concentraciones observadas en la cepa de SARM 828 en presencia y ausencia de BME.
La FIGURA 19 representa isobologramas representativos que representan valores de CIF de lisina PlySs2 frente a valores CIF de antibiótico. PlySs2 frente a los antibióticos oxacilina, vancomicina y daptomicina se representan contra cepas de SASM y cepas de SARM como se indica. La oxacilina y PlySs2 se evalúan contra la cepa de SASM JMI 33611. PlySs2 y vancomicina se evalúan contra la cepa de sAs M JMI 9365 y la cepa de SAr M JMI 6456. La daptomicina y PlySs2 se evalúan contra la cepa de SASM JMI 33611 y la cepa de SARM JMI 3345. La FIGURA 20A y 20B proporciona un ciclo temporal de tinción de S. aureus por daptomicina (A) y vancomicina (B) marcadas con BODIPY en ausencia y presencia de cantidades sub-CIM de PlySs2.
La FIGURA 21 representa el factor de cambio en el valor de CIM frente a la cepa de SARM MW2 y la cepa de SASM ATCC 29213 tratadas con PlySs2 o daptomicina en presencia de cantidades variables de tensioactivo (de 1,25 a 15 % de tensioactivo).
La FIGURA 22 proporciona un panel de diluciones de dosis de combinaciones de daptomicina y PlySs2 a las concentraciones observadas en la cepa de SARM 269 en presencia de 15 % de tensioactivo (Survanta).
La FIGURA 23 proporciona un gráfico compilado de % supervivencia de ratones (50 animales) expuestos a la cepa de SARM 269 (MW2) en varios experimentos con potencias bacterianas de inóculo de 1,1 -3,1x106 UFC y tratados con daptomicina o PlySs2 solos o en combinación.
La FIGURA 24 representa el % de supervivencia de ratones expuestos a la cepa de SARM 220 a 2,65x106 UFC y tratados con las dosis indicadas de daptomicina o PlySs2 solos o en combinación.
La FIGURA 25 representa el % de supervivencia de ratones expuestos a la cepa de SARM 833 a 1,4x106 UFC y tratados con las dosis indicadas de daptomicina o PlySs2 solos o en combinación.
La FIGURA 26 representa el % de supervivencia de ratones expuestos a la cepa de SARM 833 a 2,0x106 UFC y tratados con las dosis indicadas de daptomicina o PlySs2 solos o en combinación.
La FIGURA 27A-27F representa las curvas de supervivencia de la terapia combinada en comparación con monoterapias en modelos murinos de bacteriemia. Los ratones se expusieron a 7,5 x 106 ufc/ratón i.p. (modelo de baja exposición - panel a) o 109 ufc/ratón i.p. (modelo de alta exposición - paneles b-f) en el momento 0 y se trataron con antibiótico, PlySs2, combinación de PlySs2 y antibiótico o control y los datos de supervivencia resultantes se muestran en formato Kaplan-Meier. Todas las dosis se administraron como una dosis única en embolada, excepto para vancomicina (dos veces al día, panel e) y oxacilina (cuatro veces al día, panel f), que se administraron como múltiples dosis durante las primeras 24 horas. Las rutas de administración fueron PlySs2 (i.p.), daptomicina y vancomicina (subcutánea) y oxacilina (intramuscular). Los valores de P se calcularon para las combinaciones frente a antibiótico solo. (A) Modelo de baja exposición usando la cepa de SARM MW2 con daptomicina a 2 mg/kg y PlySs2 a 1,25mg/kg. Dosificación a las 4 horas después de la inoculación, n=30, P<0,0001. (B) Modelo de alta exposición usando la cepa de SARM MW2 con daptomicina a 50 mg/kg y PlySs2 a 5.25 mg/kg. Dosificación a las 2 horas después de la inoculación, n=45, P<0,0001. (C) igual que B usando la cepa de SARM 738, n=30, P<0,0001. (D) igual que B usando la cepa de SARM 832, n=30, P<0,0001. (E) Modelo de alta exposición usando la cepa de SARM MW2 con vancomicina a 110 mg/kg dos veces al día y PlySs2 a 5.25 mg/kg. Dosificación iniciada a las 2 horas después de la inoculación, n=30, P<0,0001. (F) Modelo de alta exposición usando la cepa de SASM ATCC 25923 con oxacilina a 200 mg/kg cuatro veces al día y PlySs2 a 5.25 mg/kg. Dosificación iniciada a las 2 horas después de la inoculación, n=30 P<0,0001.
La FIGURA 28 representa la CIM de daptomicina y PlySs2 en una cepa de SASM y SARM con número de pase y desarrollo de resistencia a la daptomicina. La CIM de PlySs2 desciende mostrando mayor sensibilidad a PlySs2 con mayor resistencia a la daptomicina.
La FIGURA 29 proporciona la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de ácido nucleico codificante (SEQ ID NO: 2) de la lisina PlySs2. El dominio CHAP N-terminal y el dominio SH-3 C-terminal de la lisina PlySs2 están sombreados, comenzando el dominio CHAP (SEQ ID NO: 3) con LNN... y terminando con ...YIT y comenzando el dominio SH-3 (SEQ ID NO: 4) con RSY... y terminando con ...VAT. Los restos de sitio activo del dominio CHAP (Cys26, His-102, Glu^s y Asn120) identificados por homología con PDB 2K3A (Rossi P et al. (2009) Proteins 74: 515-519) están subrayados.
La FIGURA 30 representa el factor de cambio en el valor de CIM de daptomicina en función de los días de pase en serie en condiciones de selección de resistencia en presencia de daptomicina sola o daptomicina con cantidades sub-CIM de lisina PlySs2 para múltiples cultivos (tres cultivos independientes de cada uno).
La FIGURA 31 representa el factor de cambio en el valor de CIM de vancomicina en función de los días de pase en serie en condiciones de selección de resistencia en presencia de daptomicina sola o daptomicina con cantidades sub-CIM de lisina PlySs2 para múltiples cultivos (tres cultivos independientes de cada uno).
Descripción detallada
De acuerdo con la presente invención, se puede emplear técnicas de biología molecular, microbiología y ADN recombinante convencionales dentro de la experiencia de este campo. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, p. ej., Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" volúmenes I-III [Ausubel, R. M., ed. (1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III [J. E. Celis, ed. (1994))]; "Current Protocols in Immunology" volúmenes I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames y S. J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B. D. Hames y S. J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R. I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).
Por lo tanto, si aparecen en el presente documento, las siguientes expresiones tendrán las definiciones establecidas a continuación.
Las expresiones "lisina(s) PlySs", "lisina PlySs2", "PlySs2" y cualquier variante no enumerada específicamente, pueden usarse indistintamente en el presente documento y, como se usa a lo largo de la presente solicitud y las reivindicaciones se refieren a material proteico, incluyendo proteínas individuales o múltiples, y se extiende a las proteínas que tienen los datos de secuencia de aminoácidos descritos en el presente documento y presentados en la FIGURA 29 y la SEQ ID NO: 1 y el perfil de actividades expuesto en el presente documento y en las reivindicaciones. En consecuencia, se contemplan igualmente proteínas que presenten actividad sustancialmente equivalente o alterada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo, tales como modificaciones obtenidas mediante mutagénesis dirigida, o pueden ser accidentales, tales como las obtenidas a través de mutaciones en hospedadores que son productores del complejo o sus subunidades nombradas. Además, se entiende que las expresiones "lisina(s) PlySs", "lisina PlySs2", "PlySs2" incluyen dentro de su alcance proteínas específicamente mencionadas en el presente documento, así como todos los análogos, fragmentos o truncamientos, y variaciones alélicas sustancialmente homólogos. La lisina PlySs2 se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos 61/477.836 y en la solicitud PCT PCT/US2012/34456. Un artículo más reciente, Gilmer et al., describe la lisina PlySs2 (Gilmer DB et al. (2013) Antimicrob Agents Chemother Epub 9 de abril de 2013 [PMID 23571534]).
El término "ClyS", "lisina ClyS" se refiere a una lisina quimérica ClyS, con actividad contra bacterias estafilocócicas, incluyendo Staphylococcus aureus, se detalla en el documento WO 2010/002959 y también se describe en Daniel et al. (Daniel, A et al. (2010) Antimicrobial Agents and Chemother 54 (4): 1603-1612). Se proporciona una secuencia de aminoácidos de ClyS ilustrativa en la SEQ ID NO: 5.
Una "enzima lítica" incluye cualquier enzima lítica de la pared celular bacteriana que destruye una o más bacterias en condiciones adecuadas y durante un periodo de tiempo relevante. Los ejemplos de enzimas líticas incluyen, sin limitación, diversas enzimas amidasas líticas de la pared celular. En un aspecto particular, una enzima lítica se refiere a una enzima lítica bacteriófaga. Una "enzima lítica bacteriófaga" se refiere a una enzima lítica extraída o aislada de un bacteriófago o una enzima lítica sintetizada con una estructura proteica similar que mantiene una funcionalidad enzimática lítica.
Una enzima lítica es capaz de escindir específicamente enlaces que están presentes en el peptidoglucano de células bacterianas para romper la pared celular bacteriana. También se postula actualmente que el peptidoglucano de la pared celular bacteriana está muy conservado entre la mayoría de las bacterias y la escisión de solo algunos enlaces puede romper la pared celular bacteriana. Son ejemplos de enzimas líticas que escinden estos enlaces las muramidasas, glucosaminidasas, endopeptidasas o N-acetil-muramoil-L-alanina amidasas. Fischetti et al. (1974) informaron de que la enzima lisina del fago estreptocócico C1 era una amidasa. García et al. (1987, 1990) informaron de que la lisina Cpl de un S. pneumoniae de un fago Cp-1 era una lisozima. Caldentey y Bamford (1992) informaron de que una enzima lítica del fago phi 6 de Pseudomonas era una endopeptidasa, que divide el enlace peptídico formado por ácido melo-diaminopimílico y D-alanina. Las enzimas líticas de fago T1 y T6 de E. coli son amidasas, al igual que la enzima lítica del fago de Listeria (ply) (Loessner et al., 1996). También hay otras enzimas líticas conocidas en la técnica que son capaces de escindir una pared celular bacteriana.
Una "enzima lítica codificada genéticamente por un bacteriófago" incluye un polipéptido capaz de destruir una bacteria hospedadora, por ejemplo, al tener al menos algo de actividad lítica de la pared celular contra la bacteria hospedadora. El polipéptido puede tener una secuencia que abarca la enzima lítica de secuencia nativa y variantes de la misma. El polipéptido puede aislarse de diversas fuentes, tales como de un bacteriófago ("fago"), o prepararse mediante métodos recombinantes o sintéticos. El polipéptido puede, por ejemplo, comprender una parte de unión a colina en el lado carboxilo terminal y puede caracterizarse por una actividad enzimática capaz de escindir peptidoglucano de la pared celular (tal como actividad amidasa para actuar sobre enlaces amida en el peptidoglucano) en el lado amino terminal. Se han descrito enzimas líticas que incluyen múltiples actividades enzimáticas, por ejemplo, dos dominios enzimáticos, tales como lisina PlyGBS. Además, se han descrito otras enzimas líticas que contienen solo un dominio catalítico y ningún dominio de unión a la pared celular.
"Una enzima lítica asociada a fagos de secuencia nativa" incluye un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que una enzima procedente de un genoma bacteriano (es decir, un profago). Dicha enzima de secuencia nativa puede aislarse o puede producirse mediante medios recombinantes o sintéticos.
La expresión "enzima de secuencia nativa" abarca formas de origen natural (p. ej., formas alteradas o cortadas y empalmadas de manera alternativa) y variantes de origen natural de la enzima. En una realización de la invención, la enzima de secuencia nativa es un polipéptido maduro o de longitud completa que está codificado genéticamente por un gen de un bacteriófago específico para Streptococcus suis. Por supuesto, una serie de variantes son posibles y conocidas, como se reconoce en publicaciones tales como Lopez et al., Microbial Drug Resistance 3: 199-211 (1997); Garcia et al., Gene 86: 81-88 (1990); Garcia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 914-918 (1988); Garcia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 914-918 (1988); Garcia et al., Streptococcal Genetics (J. J. Ferretti y Curtis eds., 1987); Lopez et al., FEMS Microbiol. Lett. 100: 439-448 (1992); Romero et al., J. Bacteriol. 172: 5064-5070 (1990); Ronda et al., Eur. J. Biochem. 164: 621-624 (1987) y Sanchez et al., Gene 61: 13-19 (1987).
"Una enzima lítica de secuencia variante" incluye una enzima lítica caracterizada por una secuencia polipeptídica que es diferente de la de una enzima lítica, pero conserva la actividad funcional. La enzima lítica puede, en algunas realizaciones, estar codificada genéticamente por un bacteriófago específico para Streptococcus suis como en el caso de PlySs2 que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos particular con la o las secuencias de enzimas líticas de la presente, como se proporciona en la FIGURA 29 y en la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una enzima lítica funcionalmente activa puede destruir bacterias Streptococcus suis y otras bacterias susceptibles según lo proporcionado en el presente documento, incluyendo como se muestra en las TABLAS 1,2 y 3, al romper la pared celular de la bacteria. Una enzima lítica activa puede tener una identidad de secuencia de aminoácidos de 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 o 99,5 % con la o las secuencias de enzimas líticas de la presente, como se proporciona en la FIGURA 29 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4). Dichas variantes de enzimas líticas asociadas a fagos incluyen, por ejemplo, polipéptidos de enzimas líticas en donde se añaden o suprimen uno o más restos de aminoácidos en el extremo N o C de la secuencia de la o las secuencias de enzimas líticas de la presente, como se proporciona en la FIGURA 29 (SEQ ID NO: 1).
En un aspecto particular, una enzima lítica asociada a fagos tendrá al menos aproximadamente 80 % u 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos con secuencias de enzimas líticas nativas asociadas a fagos, en particular al menos aproximadamente 90% (p. ej., 90%) de identidad de secuencia de aminoácidos. Más en particular, una variante de enzima lítica asociada a fagos tendrá al menos aproximadamente 95 % (p. ej., 95 %) de identidad de secuencia de aminoácidos con la o las secuencias de enzimas líticas nativas asociadas a fagos de la presente, como se proporciona en la FIGURA 29 (SEQ ID NO: 1) para lisina PlySs2 o como se ha descrito anteriormente para ClyS, incluyendo en el documento WO 2010/002959 y también se ha descrito en Daniel et al. (Daniel, A et al. (2010) Antimicrobial Agents and Chemother 54 (4): 1603-1612) y la SEQ ID NO: 5.
El "porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias de enzimas líticas asociadas a fagos identificadas se define en el presente documento como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en la secuencia de enzimas líticas asociadas a fagos, después de alinear las secuencias en el mismo marco de lectura e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia.
El "porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico" con respecto a las secuencias de enzimas líticas asociadas a fagos identificadas en el presente documento se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos en la secuencia de enzimas líticas asociadas a fagos, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia.
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos, las secuencias se alinean para fines de comparación óptimos (p. ej., pueden introducirse huecos en la secuencia de una primera secuencia de nucleótidos). Después se comparan los nucleótidos o aminoácidos en las posiciones correspondientes de nucleótidos o aminoácidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido o aminoácido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje identidad entre las dos secuencias está en función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad=n.° de posiciones idénticas/n.° total de posicionesX100). La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede realizar usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993), que se incorpora en el programa NBLAST que puede usarse para identificar secuencias que tienen la identidad deseada con secuencias de nucleótidos de uso en la invención. Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., Nucleic Acids Res, 25: 3389-3402 (1997). Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros predeterminados de los programas respectivos (p. ej., NBLAST). Véase los programas provistos por el Centro Nacional para la Información Biotecnológica, Biblioteca Nacional de Medicina, Instituto Nacional de Salud.
El "polipéptido" incluye una molécula polimérica compuesta de múltiples aminoácidos unidos de manera lineal. Un polipéptido puede, en algunas realizaciones, corresponder a moléculas codificadas por una secuencia polinucleotídica de origen natural. El polipéptido puede incluir sustituciones conservadoras donde el aminoácido de origen natural se reemplaza por uno que tiene propiedades similares, donde dichas sustituciones conservadoras no alteran la función del polipéptido.
La expresión "enzimas líticas alteradas" incluye enzimas líticas redistribuidas y/o quiméricas.
Se ha descubierto que las enzimas líticas de fagos específicas para bacterias infectadas con un fago específico descomponen de manera eficaz y eficiente la pared celular de la bacteria en cuestión. Se cree que la enzima lítica carece de actividad enzimática proteolítica y, por lo tanto, no es destructiva para proteínas y tejidos de mamíferos cuando está presente durante la digestión de la pared celular bacteriana. Asimismo, debido a que se ha descubierto que la acción de enzimas líticas de fagos, a diferencia de los antibióticos, era más bien específica para el o los patógenos diana, es probable que la flora normal permanezca esencialmente intacta (M. J. Loessner, G. Wendlinger, S. Scherer, Mol Microbiol 16, 1231-41. (1995)). De hecho, la lisina PlySs2, aunque demuestra destrucción de especies y cepas bacterianas excepcionalmente amplia, es comparativa y particularmente inactiva contra bacterias que comprenden la flora normal, incluyendo E. coli, como se describe en el presente documento.
Una enzima lítica o un polipéptido de uso puede ser producido por el organismo bacteriano en la invención después de ser infectado con un bacteriófago particular o puede producirse o prepararse de manera recombinante o sintética como tratamiento profiláctico para evitar que enfermen quienes hayan estado expuestos a otros que tengan los síntomas de una infección o como tratamiento terapéutico para quienes ya han enfermado por la infección. En la medida en que las secuencias polipeptídicas de lisina y los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de lisina se describen y se mencionan en el presente documento, la o las enzimas/polipéptidos líticos pueden producirse preferentemente a través del gen aislado para la enzima lítica del genoma del fago, poniendo el gen en un vector de transferencia y clonando dicho vector de transferencia en un sistema de expresión, usando métodos convencionales de la técnica, incluyendo, como se ilustra en el presente documento. La o las enzimas o polipéptidos líticos ser truncados, quiméricos, redistribuidos o "naturales", y pueden estar en combinación. Una enzima lítica "alterada" se puede producir de varias maneras. En una realización preferida, un gen para la enzima lítica alterada del genoma del fago se coloca en un vector móvil o de transferencia, preferentemente un plásmido, y el plásmido se clona en un vector de expresión o sistema de expresión. El vector de expresión para producir un polipéptido de lisina o enzima de uso en la invención puede ser adecuado para E. coli, Bacillus, o varias otras bacterias adecuadas. El sistema de vector también puede ser un sistema de expresión sin células. Todos estos métodos para expresar un gen o conjunto de genes son conocidos en la técnica. La enzima lítica también se puede crear infectando Streptococcus suis con un bacteriófago específico para Streptococcus suis, en donde dicha al menos una enzima lítica lisa de manera exclusiva la pared celular de dicho Streptococcus suis tiene como mucho efectos mínimos en otra flora bacteriana presente, por ejemplo, natural o comensal.
Una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" comprende la totalidad o una parte (preferentemente biológicamente activa) de un polipéptido de uso en la invención unido operativamente con un polipéptido heterólogo. Se producen proteínas o péptidos quiméricos, por ejemplo, combinando dos o más proteínas que tienen dos o más sitios activos. La proteína y los péptidos quiméricos pueden actuar de manera independiente en las mismas o diferentes moléculas, y por lo tanto tienen el potencial de tratar dos o más infecciones bacterianas diferentes al mismo tiempo. Las proteínas y péptidos quiméricos también se pueden usar para tratar una infección bacteriana al escindir la pared celular en más de una ubicación, proporcionando de este modo potencialmente una destrucción más rápida o eficaz (o sinérgica) de una sola molécula de lisina o péptido quimérico.
Una región "heteróloga" de una construcción de ADN o construcción peptídica es un segmento identificable de ADN dentro de una molécula de ADN mayor o un péptido dentro de una molécula peptídica mayor que no se encuentra en asociación con la molécula mayor en la naturaleza. Por tanto, cuando la región heteróloga codifica un gen de mamífero, el gen estará flanqueado habitualmente por ADN que no flanquea el ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo fuente. Otro ejemplo de una secuencia codificante heteróloga es una construcción donde la secuencia codificante en sí misma no se encuentra en la naturaleza (p. ej., un ADNc donde la secuencia codificante genómica contiene intrones o secuencias sintéticas que tienen codones diferentes que el gen nativo). Las variaciones alélicas o acontecimientos de mutación de origen natural no dan lugar a una región heteróloga de ADN o péptido como se define en el presente documento.
La expresión "unido operativamente" significa que el polipéptido de la divulgación y el polipéptido heterólogo se fusionan en el marco. El polipéptido heterólogo puede fusionarse con el extremo N o el extremo C del polipéptido de la divulgación. Se producen proteínas quiméricas de manera enzimática mediante síntesis química o mediante tecnología de ADN recombinante. Se han producido y estudiado varias enzimas líticas quiméricas. Un ejemplo de una proteína de fusión útil es una proteína de fusión de GST en la que el polipéptido de la divulgación está fusionado con el extremo C de una secuencia de GST. Dicha proteína quimérica puede facilitar la purificación de un polipéptido recombinante de la divulgación.
En otra realización, la proteína o el péptido quimérico contiene una secuencia señal heteróloga en su extremo N. Por ejemplo, la secuencia señal nativa de un polipéptido de la divulgación puede eliminarse y reemplazarse con una secuencia señal de otra proteína conocida.
La proteína de fusión puede combinar un polipéptido de lisina con una proteína o un polipéptido que tenga una capacidad diferente o que proporcione una capacidad adicional o carácter añadido al polipéptido de lisina. La proteína de fusión puede ser una proteína de fusión de inmunoglobulina en la que la totalidad o parte de un polipéptido de la divulgación se fusiona con secuencias procedentes de un miembro de la familia de proteínas de inmunoglobulina. La inmunoglobulina puede ser un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo dirigido a una proteína de superficie o epítopo de una bacteria susceptible o diana. La proteína de fusión de inmunoglobulina puede alterar la biodisponibilidad de un ligando afín de un polipéptido de la divulgación. La inhibición de la interacción ligando/receptor puede ser útil terapéuticamente, tanto para tratar enfermedades y trastornos asociados a bacterias como para modular (es decir, promover o inhibir) la supervivencia celular. La proteína de fusión puede incluir un medio para dirigir o direccionar la lisina, incluyendo a tejidos u órganos particulares o a superficies tales como dispositivos, plástico, membranas. Se pueden producir proteínas y péptidos quiméricos y de fusión de la divulgación mediante técnicas convencionales de ADN recombinante.
Una forma modificada o alterada de la proteína o péptidos y fragmentos peptídicos, como se desvela en el presente documento, incluye proteínas o péptidos y fragmentos peptídicos que se sintetizan químicamente o se preparan mediante técnicas de ADN recombinante, o ambos. Estas técnicas incluyen, por ejemplo, quimerización y redistribución. Como se usa en el presente documento, las proteínas o péptidos redistribuidos, los productos génicos o los péptidos para más de una proteína de fago relacionada o fragmentos peptídicos de proteínas se han escindido y reensamblado aleatoriamente en una proteína más activa o específica. Los oligonucleótidos, péptidos o moléculas de fragmentos peptídicos redistribuidos se seleccionan o exploran para identificar una molécula que tenga una propiedad funcional deseada. Se puede usar redistribución para crear una proteína que sea más activa, por ejemplo, hasta 10 a 100 veces más activa que la proteína molde. La proteína molde se selecciona entre diferentes variedades de proteínas de lisina. La proteína o péptidos redistribuidos constituyen, por ejemplo, uno o más dominios de unión y uno o más dominios catalíticos. Cuando la proteína o el péptido se produce mediante síntesis química, preferentemente carece de manera sustancial de precursores químicos u otros productos químicos, es decir, está separado de precursores químicos u otros productos químicos que estén implicados en la síntesis de la proteína. En consecuencia, dichas preparaciones de la proteína tienen menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 %, 5 % (en peso seco) de precursores químicos o compuestos distintos del polipéptido de interés.
La presente invención también se refiere a otras variantes de los polipéptidos útiles en la invención. Dichas variantes pueden tener una secuencia de aminoácidos alterada que puede actuar como agonistas (miméticos) o como antagonistas. Pueden generarse variantes mediante mutagénesis, es decir, mutación puntual discreta o truncamiento. Un agonista puede conservar sustancialmente las mismas actividades biológicas, o un subconjunto de ellas, que la forma de origen natural de la proteína. Un antagonista de una proteína puede inhibir una o más de las actividades de la forma de origen natural de la proteína, por ejemplo, al unirse de manera competitiva con un miembro corriente abajo o corriente arriba de una cascada de señalización celular que incluye la proteína de interés. Por tanto, se pueden inducir efectos biológicos específicos mediante el tratamiento con una variante de función limitada. El tratamiento de un sujeto con una variante que tiene un subconjunto de las actividades biológicas de la forma de origen natural de la proteína puede tener menos efectos secundarios en un sujeto en relación con el tratamiento con la forma de origen natural de la proteína. Pueden identificarse variantes de una proteína de uso en la divulgación que actúan como agonistas (miméticos) o como antagonistas mediante la exploración de bibliotecas combinatorias de mutantes, tales como mutantes de truncamiento, de la proteína de la divulgación. En una realización, se genera una biblioteca heterogénea de variantes mediante mutagénesis combinatoria al nivel de ácido nucleico y se codifica mediante una genoteca heterogénea. Existen diversos métodos que pueden usarse para producir bibliotecas de variantes potenciales de los polipéptidos de la divulgación a partir de una secuencia oligonucleotídica degradada. Las bibliotecas de fragmentos de la secuencia codificante de un polipéptido de la divulgación se pueden usar para generar una población heterogénea de polipéptidos para la exploración y posterior selección de variantes, fragmentos activos o truncamientos. Se conocen varias técnicas en este campo para explorar productos génicos de bibliotecas combinatorias realizadas mediante mutaciones puntuales o truncamiento y para explorar bibliotecas de ADNc para determinar productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Las técnicas más ampliamente utilizadas, que son susceptibles de análisis de alto rendimiento, para la exploración de grandes genotecas normalmente incluyen clonación de la genoteca en vectores de expresión replicables, transformación de células adecuadas con la biblioteca de vectores resultante y expresión de los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. En este contexto, la parte más pequeña de una proteína (o ácido nucleico que codifica la proteína) según las realizaciones es un epítopo que es reconocible como específico para el fago que produce la proteína lisina. En consecuencia, el polipéptido más pequeño (y el ácido nucleico asociado que codifica el polipéptido) que se puede esperar que se una a una diana o un receptor, tal como un anticuerpo, y es útil para algunas realizaciones puede ser de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 85 o 100 aminoácidos de longitud. Aunque pequeñas secuencias tan cortas como 8, 9, 10, 11, 12 o 15 aminoácidos de longitud comprenden de manera fiable suficiente estructura para actuar como dianas o epítopos, secuencias más cortas de 5, 6 o 7 aminoácidos de longitud pueden presentar estructura diana o epitópica en algunas condiciones y tener valor en una realización. Por tanto, la parte más pequeña de la o las proteínas o polipéptidos de lisina proporcionados en el presente documento, incluyendo como se establece en la FIGURA 29 (SEQ ID NO: 1) incluye polipéptidos tan pequeños como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14 o 16 aminoácidos de longitud.
Las partes biológicamente activas de un fragmento de proteína o péptido de las realizaciones, como se describe en el presente documento, incluyen polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a o derivadas de la secuencia de aminoácidos de la proteína lisina de la divulgación, que incluyen menos aminoácidos que la proteína de longitud completa de la proteína lisina y presentan al menos una actividad de la proteína de longitud completa correspondiente. Normalmente, las partes biológicamente activas comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de la proteína correspondiente. Una secuencia de dominio ilustrativo para el dominio CHAP N terminal de la lisina de uso en la presente invención se proporciona en la FIGURA 29 y la SEQ ID NO: 3. Una secuencia de dominio ilustrativo para el dominio SH3 C terminal de la lisina de uso en la presente invención se proporciona en la FIGURA 29 y la SEQ ID NO: 4. Una parte biológicamente activa de una proteína o fragmento de proteína de la divulgación puede ser un polipéptido que es, por ejemplo, de 10, 25, 50, 100 menos o más aminoácidos de longitud. Por otra parte, otras partes biológicamente activas, en las que otras regiones de la proteína se suprimen o añaden, se pueden preparar mediante técnicas recombinantes y evaluar para determinar una o más de las actividades funcionales de la forma nativa de un polipéptido de las realizaciones.
Se pueden preparar proteínas y ácidos nucleicos homólogos que comparten funcionalidad con dichas proteínas y/o ácidos nucleicos pequeños (o regiones de proteínas y/o ácidos nucleicos de moléculas mayores) como apreciará un experto en la materia. Se pretende específicamente que dichas moléculas pequeñas y regiones cortas de moléculas mayores que pueden ser homólogas sean realizaciones. preferentemente, la homología de dichas regiones valiosas es al menos 50 %, 65 %, 75 %, 80 %, 85 % y preferentemente al menos 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o al menos 99 % en comparación con los polipéptidos de lisina proporcionados en el presente documento, incluyendo los establecidos en la FIGURA 29. Estos valores de porcentaje de homología no incluyen alteraciones debido a sustituciones conservadoras de aminoácidos.
Dos secuencias de aminoácidos son "sustancialmente homólogas" cuando al menos aproximadamente 70 % de los restos de aminoácidos (preferentemente al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 % y preferentemente al menos aproximadamente 90 o 95 %) son idénticos o representan sustituciones conservadoras. Las secuencias de lisinas comparables, tales como lisinas PlySs2 comparables o lisinas ClyS comparables, son sustancialmente homólogas cuando uno o más, o varios, o hasta 10%, o hasta 15%, o hasta 20% de los aminoácidos del polipéptido de lisina están sustituidos con una sustitución de aminoácidos similar o conservadora, y en donde las lisinas comparables tienen el perfil de actividades, efectos antibacterianos y/o especificidades bacterianas de una lisina, tal como la lisina PlySs2 y/o la lisina ClyS, desvelada en el presente documento.
Se prefiere que los restos de aminoácidos descritos en el presente documento estén en la forma isomérica "L". Sin embargo, restos en la forma isomérica "D" pueden sustituir cualquier resto de L-aminoácido, siempre que el polipéptido conserve la propiedad funcional deseada de unión a inmunoglobulina. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxilo libre presente en el extremo carboxilo de un polipéptido. De acuerdo con la nomenclatura de polipéptidos convencional, J. Biol. Chem., 243: 3552-59 (1969), las abreviaturas para restos de aminoácidos se muestran en la siguiente tabla de correspondencia:
TABLA DE CORRESPONDENCIA
SÍMBOLO AMINOÁCIDO
1 letra 3 letras
Y Tyr tirosina
G Gly glicina
F Phe fenilalanina
M Met metionina
A Ala alanina
S Ser serina
I Ile isoleucina
L Leu leucina
T Thr treonina
V Val valina
P Pro prolina
K Lys lisina
H His histidina
Q Gln glutamina
E Glu ácido glutámico
W Trp triptófano
R Arg arginina
D Asp ácido aspártico
N Asn asparagina
C Cys cisteína
Se pueden realizar mutaciones en las secuencias de aminoácidos o en las secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos y lisinas en el presente documento, incluyendo en las secuencias de lisina establecidas en la FIGURA 29 (SEQ ID NO: 1) o en fragmentos activos o truncamientos de las mismas, de modo que un codón particular se cambia a un codón que codifica un aminoácido diferente, un aminoácido se sustituye por otro aminoácido o se suprimen uno o más aminoácidos. Dicha mutación se realiza en general haciendo la menor cantidad de cambios de aminoácidos o nucleótidos posible. Se puede realizar una mutación de sustitución de este tipo para cambiar un aminoácido en la proteína resultante de una manera no conservadora (por ejemplo, cambiando el codón de un aminoácido que pertenece a un agrupamiento de aminoácidos que tiene un tamaño o característica particular a un aminoácido que pertenece a otro agrupamiento) o de manera conservadora (por ejemplo, cambiando el codón de un aminoácido que pertenece a un agrupamiento de aminoácidos que tiene un tamaño o característica particular a un aminoácido que pertenece al mismo agrupamiento). Dicho cambio conservador conduce en general a menor cambio en la estructura y función de la proteína resultante. Un cambio no conservador tiene más probabilidades de alterar la estructura, actividad o función de la proteína resultante. Se debe considerar que la presente invención incluye secuencias que contienen cambios conservadores que no alteran significativamente la actividad o las características de unión de la proteína resultante.
Por tanto, un experto en la materia, basándose en una revisión de la secuencia del polipéptido de lisina PlySs2 proporcionada en el presente documento y en su conocimiento y la información pública disponible para otros polipéptidos de lisina, puede realizar cambios o sustituciones de aminoácidos en la secuencia del polipéptido de lisina. Se pueden realizar cambios de aminoácidos para reemplazar o sustituir uno o más, uno o unos pocos, uno o varios, de uno a cinco, de uno a diez u otro número similar de aminoácidos en la secuencia de la o las lisinas proporcionada en el presente documento para generar mutantes o variantes de las mismas. Puede predecirse la función de dichos mutantes o variantes de las mismas o estos pueden probarse para determinar la función o capacidad de destrucción de bacterias, incluyendo bacterias estafilocócicas, estreptocócicas, de Listeria o enterocócicas y/o para determinar si tienen actividad similar a la o las lisinas como se describe y proporciona en particular en el presente documento. Por tanto, se pueden realizar cambios en la secuencia de lisina y se pueden probar mutantes o variantes que tienen un cambio en la secuencia usando los ensayos y métodos descritos e ilustrados en el presente documento, incluyendo en los ejemplos. Un experto en la materia, en función de la estructura de dominio de la o las lisinas de la presente puede predecir uno o más, uno o varios aminoácidos adecuados para sustitución o reemplazo y/o uno o más aminoácidos que no son adecuados para sustitución o reemplazo, incluyendo sustituciones conservadoras o no conservadoras razonables.
A este respecto, y con referencia ilustrativa a lisina PlySs2, se señala que, aunque el polipéptido lisina PlySs2 representa una clase divergente de enzima lítica profágica, la lisina comprende un dominio CHAP N-terminal (cisteína-histidina amidohidrolasa/peptidasa) (SEQ ID NO: 3) y un dominio C-terminal SH3 de tipo 5 (SEQ ID NO: 4) como se representa en la FIGURA 29. Los dominios se representan en la secuencia de aminoácidos en regiones de color sombreado definidas, con el dominio CHAP correspondiente a la primera región de secuencia de aminoácidos sombreada que comienza con LNN... y el dominio SH3 de tipo 5 correspondiente a la segunda región sombreada que comienza con RSY... Los dominios CHAP están incluidos en varias lisinas de fago estreptocócico y estafilocócico previamente caracterizadas. Por tanto, un experto en la materia puede realizar y probar de manera razonable sustituciones o reemplazos en el dominio CHAP y/o el dominio SH-3 de PlySs2. Se pueden realizar comparaciones de secuencias con la base de datos de Genbank con una o ambas de las secuencias de dominio CHAP y/o SH-3 o con la secuencia de aminoácidos completa de lisina PlySs2, por ejemplo, para identificar aminoácidos para sustitución. Por ejemplo, el dominio CHAP contiene secuencias de aminoácidos de cisteína e histidina conservadas (las primeras cisteína e histidina en el dominio CHAP) que son características y conservadas en dominios CHAP de diferentes polipéptidos. Es razonable predecir, por ejemplo, que los restos de cisteína e histidina conservados se deben mantener en un mutante o variante de PlySs2 para mantener la actividad o la capacidad. Es notable que un mutante o variante que tiene una valina reemplazada por alanina en el aminoácido valina 19 en la secuencia de aminoácidos PlySs2 de la FIGURA 29 (SEQ ID NO: 1) es activo y capaz de destruir bacterias grampositivas de una manera similar a y tan eficaz como la lisina PlySs2 de la FIGURA 29 (SEQ ID NO: 1). A continuación hay un ejemplo de diversos grupos de aminoácidos:
Aminoácidos con grupos R no polares
Alanina, Valina, Leucina, Isoleucina, Prolina, Fenilalanina, Triptófano, Metionina
Aminoácidos con grupos R polares sin carga
Glicina, Serina, Treonina, Cisteína, Tirosina, Asparagina, Glutamina
Aminoácidos con grupos R polares con carga (carga negativa a pH 6,0)
Ácido aspártico, Ácido glutámico
Aminoácidos básicos (carga positiva a pH 6,0)
Lisina, Arginina, Histidina (a pH 6,0)
Otro agrupamiento puede ser los aminoácidos con grupos fenilo: Fenilalanina, Triptófano, Tirosina
Otro agrupamiento puede ser según el peso molecular (es decir, tamaño de los grupos R):
Glicina 75 Alanina 89
Serina 105 Prolina 115
Valina 117 Treonina 119
Cisteína 121 Leucina 131
Isoleucina 131 Asparagina 132
Ácido aspártico 133 Glutamina 146
Lisina 146 Ácido glutámico 147
Metionina 149 Histidina (a pH 6,0) 155
Fenilalanina 165 Arginina 174
Tirosina 181 Triptófano 204
Son sustituciones particularmente preferidas:
- Arg por Lys y viceversa, de modo que se pueda mantener una carga positiva;
- Asp por Glu y viceversa, de modo que se pueda mantener una carga negativa;
- Thr por Ser de modo que se pueda mantener un -OH libre; y
- Asn por Gln de modo que se pueda mantener un NH2 libre.
Las sustituciones de aminoácidos conservadoras ilustrativas y preferidas incluyen cualquiera de: ácido glutámico (E) por glutamina (Q) y viceversa; valina (V) por leucina (L) y viceversa; treonina (T) por serina (S) y viceversa; valina (V) por isoleucina (I) y viceversa; glutamina (Q) por lisina (K) y viceversa; metionina (M) por isoleucina (I) y viceversa; asparagina (N) por serina (S) y viceversa; metionina (M) por leucina (L) y viceversa; ácido glutámico (E) por lisina (L) y viceversa; serina (S) por alanina (A) y viceversa; fenilalanina (F) por tirosina (Y) y viceversa; ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E) y viceversa; isoleucina (I) por leucina (L) y viceversa; arginina (R) por lisina (K) y viceversa. También se pueden introducir sustituciones de aminoácidos para sustituir un aminoácido con una propiedad particularmente preferible. Por ejemplo, se puede introducir una Cys en un sitio potencial para enlaces disulfuro con otra Cys. Se puede introducir una His como un sitio particularmente "catalítico" (es decir, His puede actuar como ácido o base y es el aminoácido más habitual en catálisis bioquímica). Se puede introducir Pro debido a su estructura particularmente plana, que induce vueltas p en la estructura de la proteína.
De acuerdo con la presente invención, se proporcionan composiciones y métodos basados en combinaciones de lisina(s) de bacteriófagos con antibiótico para la destrucción rápida y eficaz de bacterias grampositivas. De acuerdo con la invención, la lisina PlySs2, que demuestra amplia actividad de destrucción contra múltiples bacterias, en particular bacterias grampositivas, incluyendo cepas bacterianas de Staphylococcus y Streptococcus, proporciona sinergia notable en combinación con antibiótico(s) y puede reducir significativamente las dosis de CIM eficaces necesarias para antibiótico(s).
Como se demuestra y se proporciona en el presente documento, la lisina, en particular lisina PlySs2, es capaz de actuar de manera sinérgica con antibióticos, incluyendo antibióticos de diferentes tipos y clases, incluyendo vancomicina, daptomicina, linezolid y oxacilina, en un proceso caracterizado por mejor actividad bactericida, penetración más rápida del antibiótico y supresión de la resistencia. En modelos de bacteriemia murina, como se demuestra en el presente documento, las combinaciones por pares de PlySs2 con antibióticos confieren un aumento de la supervivencia muy significativo en relación con los tratamientos con un solo agente. Por tanto, las combinaciones de lisina/antibiótico, en relación con los tratamientos convencionales actuales, serán terapias más eficaces para tratar la bacteriemia en la clínica.
La invención demuestra además la mejora dependiente de PlySs2 de antibióticos en combinación tanto a través de ensayos in vitro como en un modelo murino de bacteriemia inducida por S. aureus en condiciones en las que fallan las dosis simuladas en seres humanos de antibióticos de un único agente. Se presentan datos en el presente documento que ilustran el mecanismo de mejora mediada por PlySs2 de la actividad antibiótica e indican una sinergia general entre lisinas y antibióticos. La sinergia tiene implicaciones para una nueva estrategia antiinfecciosa general eficaz basada en la administración conjunta de lisina y antibióticos. En particular, cada uno y ambos agentes lisinas y antibióticos pueden administrarse a dosis y cantidades significativamente reducidas, con actividad bactericida y bacteriostática mejorada y con riesgo reducido de resistencia a antibióticos o agentes.
Aunque la lisina, en particular lisina PlySs2, es reconocida como un agente individual, la presente invención y divulgación proporciona que la lisina, en particular lisina PlySs2, demuestra notablemente un grado significativo de sinergia in vitro e in vivo con diversos antibióticos. Aunque en los presentes ejemplos la sinergia se valida mediante curvas de destrucción en el tiempo y ensayos en damero con múltiples cepas y antibióticos, el alcance de la sinergia in vitro se ilustra en particular usando un ensayo de CIM de agente doble en el que tan poco como 0,25X CIM de PlySs2 redujo la CIM de daptomicina de 1 pg/ml a 0,0075 pg/ml, una disminución de 128 veces. Este efecto sinérgico se observó en 12 cepas de SARM, variando el grado de mejora de la potencia de 64 a 256 veces. Los dos antimicrobianos, antibióticos más lisina, en una combinación, por lo tanto, están haciendo más que simplemente destruir secuencialmente (reducción de la población en masa por lisina seguido de la eliminación antibiótica de bacterias residuales) ya que la daptomicina 7,5 ng/ml es muy insuficiente para destruir tanto como un solo agente. En los modelos de bacteriemia proporcionados y demostrados en el presente documento, los tratamientos de terapia combinada superaron uniformemente las dosis simuladas en seres humanos de potencia completa de tratamientos con antibióticos de agente único. Esto se demuestra tanto para la vancomicina como para la daptomicina, los antibióticos de referencia en la actualidad para tratar la bacteriemia por SARM, así como para oxacilina, un betalactámico, el antibiótico de referencia en la actualidad para tratar la bacteriemia por SASM. Estos resultados tienen claras implicaciones clínicas y proporcionan nuevos regímenes de terapia combinada eficaces que emplean lisina(s) y antibiótico(s) para tratar la bacteriemia, así como otras infecciones graves. Se proporcionan métodos y composiciones basados en la terapia combinada de lisina más antibiótico usando dosis menores de estos agentes con mayor eficacia y menor riesgo de resistencia. De hecho, los presentes métodos y composiciones son eficaces en bacterias resistentes, incluyendo bacterias estafilocócicas resistentes a antibióticos.
En aplicaciones clínicas, la divulgación proporciona métodos para tratar la bacteriemia mediante la administración de una combinación de lisina/antibiótico, en particular combinación de PlySs2/antibiótico. Mientras está por encima de su CIM, la lisina de acción rápida reducirá eficazmente la población de patógenos. Una vez que la concentración de lisina cae por debajo de la CIM, la actividad del antibiótico compañero de combinación se potenciará de manera sinérgica por la presencia de la lisina durante aproximadamente una o dos semividas farmacocinéticas de lisina más, extendiendo el tiempo en que la destrucción potenciada por sinergia está activa. Por tanto, las combinaciones de PlySs2/antibiótico proporcionarán terapias antibacterianas más potentes y eficaces que las opciones de un único agente disponibles en la actualidad.
La lisina PlySs2 presenta actividad y capacidad para destruir numerosas cepas y especies distintas de bacterias grampositivas, incluyendo bacterias estafilocócicas, estreptocócicas, de Listeria o enterocócicas. En particular y de manera significativa, PlySs2 es activa en la destrucción de cepas de Staphylococcus, incluyendo Staphylococcus aureus, en particular cepas sensibles a antibióticos y resistentes a antibióticos distintas. PlySs2 también es activa en la destrucción de cepas de Streptococcus y muestra destrucción particularmente eficaz contra cepas de Streptococcus del grupo A y del grupo B. La capacidad de la lisina PlySs2 contra bacterias se representa a continuación en la TABLA 1, en función de evaluaciones logarítmicas de destrucción usando cepas aisladas in vitro.
TABLA 1
Reducción por PlySs2 del crecimiento de diferentes bacterias (listado parcial) Bacterias____________________________________Destrucción relativa con Plys2 Staphylococcus aureus (SARV, SAIV, SARM, SASM) +++
Streptococcus suis +++
Staphylococcus epidermidis ++
Staphylococcus simulans +++
Lysteria monocytogenes ++
Enterococcus faecalis ++
Streptococcus dysgalactiae - GBS ++
Streptococcus agalactiae -GBS +++
Streptococcus pyogenes -GAS +++
Streptococcus equi ++
Streptococcus sanguinis ++
Streptococcus gordonii ++
Streptococcus sobrinus +
Streptococcus rattus +
Streptococcus oralis +
Streptococcus pneumoniae +
Bacillus thuringiensis -Bacillus cereus -Bacillus subtilis -Bacillus anthracis -Escherichia coli -Enterococcus faecium -Pseudomonas aeruginosa -
La expresión "anticuerpo monoclonal" en sus diversas formas gramaticales se refiere a un anticuerpo que tiene solo una especie de sitio de combinación de anticuerpos capaz de inmunorreaccionar con un antígeno particular. Por tanto, un anticuerpo monoclonal presenta normalmente una única afinidad de unión por cualquier antígeno con el que inmunorreaccione. Por lo tanto, un anticuerpo monoclonal puede contener una molécula de anticuerpo que tenga una pluralidad de sitios de combinación de anticuerpos, cada uno inmunoespecífico para un antígeno diferente; p. ej., un anticuerpo monoclonal biespecífico (quimérico).
El término "específico" puede usarse para hacer referencia a la situación en la que un miembro de un par de unión específico no mostrará unión significativa con moléculas distintas de su o sus compañeros de unión específicos. El término también es aplicable cuando, p. ej., un dominio de unión a antígeno es específico para un epítopo particular que es portado por varios antígenos, en cuyo caso el miembro de unión específico que porta el dominio de unión a antígeno podrá unirse a los diversos antígenos que portan el epítopo.
El término "comprender" se usa en general en el sentido de incluir, es decir, permitir la presencia de una o más características o componentes.
La expresión "que consiste esencialmente en" se refiere a un producto, en particular una secuencia peptídica, de un número definido de restos que no está unido covalentemente a un producto mayor. En el caso del péptido de uso en la invención del presente documento, los expertos en la materia apreciarán que, sin embargo, se pueden contemplar modificaciones menores en el extremo N o C del péptido, tales como la modificación química del extremo para añadir un grupo protector o similares, p. ej., la amidación del extremo C.
El término "aislado" se refiere al estado en el que estarán el o los polipéptidos de lisina de uso en la invención o el ácido nucleico que codifica dichos polipéptidos, de acuerdo con la presente invención. Los polipéptidos y el ácido nucleico carecerán o carecerán sustancialmente de material con el que están asociados de manera natural, tal como otros polipéptidos o ácidos nucleicos con los que se encuentran en su ambiente natural o el ambiente en el que se preparan (p. ej., cultivo celular) cuando dicha preparación es mediante tecnología de ADN recombinante practicada in vitro o in vivo. Los polipéptidos y el ácido nucleico pueden formularse con diluyentes o adyuvantes y aún estar aislado a efectos prácticos; por ejemplo, los polipéptidos normalmente se mezclarán con polímeros o mucoadhesivos u otros vehículos, o se mezclarán con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, cuando se usen en diagnóstico o terapia.
Se proporcionan en el presente documento ácidos nucleicos capaces de codificar el o los polipéptidos de lisina PlySs2 de S. suis útiles y aplicables en la invención. Son secuencias de ácido nucleico representativas en este contexto las secuencias polinucleotídicas que codifican el polipéptido de la FIGURA 29 (SEQ ID NO: 1), y secuencias que hibridan, en condiciones rigurosas, con secuencias complementarias del ADN de la o las secuencias de la FIGURA 29 (SEQ ID NO: 2). También se contemplan variantes adicionales de estas secuencias y secuencias de ácidos nucleicos que hibridan con las mostradas en las figuras para su uso en la producción de enzimas de lisis según la divulgación, incluyendo variantes naturales que se pueden obtener. Una gran variedad de secuencias de ácido nucleico aisladas o secuencias de ADNc que codifican enzimas de lisis asociadas a fagos y secuencias parciales que hibridan con dichas secuencias génicas son útiles para la producción recombinante de la o las enzimas o el o los polipéptidos de lisina de uso en la invención.
Un "replicón" es cualquier elemento genético (p. ej., plásmido, cromosoma, virus) que actúe como una unidad autónoma de replicación de ADN in vivo; es decir, con capacidad de replicación bajo su propio control.
Un "vector" es un replicón, tal como plásmido, fago o cósmido, al que puede unirse otro segmento de ADN para provocar la replicación del segmento unido.
Una "molécula de ADN" se refiere a la forma polimérica de desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina o citosina) en su forma monocatenaria o una hélice bicatenaria. Esta expresión se refiere solo a la estructura primaria y secundaria de la molécula y no la limita a ninguna forma terciaria particular. Por tanto, esta expresión incluye ADN bicatenario encontrado, entre otros, en moléculas de ADN lineales (p. ej., fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas. Al analizar la estructura de moléculas particulares de ADN bicatenarias, las secuencias pueden describirse en el presente documento según la convención normal de dar solo la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la cadena de ADN no transcrita (es decir, la cadena que tiene una secuencia homóloga del ARNm). Un "origen de replicación" se refiere a las secuencias de ADN que participan en la síntesis de ADN.
Una "secuencia codificante" de ADN es una secuencia de ADN bicatenaria que se transcribe y traduce a un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras adecuadas. Los límites de la secuencia codificante están determinados por un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de parada de la traducción en el extremo 3' (carboxilo). Una secuencia codificante puede incluir, pero sin limitación, secuencias procariotas, ADNc de ARNm eucariota, secuencias de ADN genómico de ADN eucariota (p. ej., mamífero) e incluso secuencias de ADN sintético. Una señal de poliadenilación y secuencia de terminación de la transcripción se localizarán habitualmente en dirección 3' de la secuencia codificante.
Las secuencias de control de la transcripción y la traducción son secuencias reguladoras de ADN, tales como promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores y similares, que posibilitan la expresión de una secuencia codificante en una célula hospedadora.
Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante cadena abajo (dirección 3'). Para fines de definición de la presente invención, la secuencia promotora está limitada en su extremo 3' por el sitio de inicio de la transcripción y se extiende cadena arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción (convenientemente definido por mapeo con nucleasa S1), así como dominios de unión a proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de ARN polimerasa. Los promotores eucariotas contendrán con frecuencia, pero no siempre, secuencias "TATA" y secuencias "CAT". Los promotores procariotas contienen secuencias Shine-Dalgarno además de las secuencias consenso -10 y -35.
Una "secuencia de control de la expresión" es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y traducción de otra secuencia de ADN. Una secuencia codificante está "bajo el control" de secuencias de control de la transcripción y la traducción en una célula cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia codificante a ARNm, que después se traduce a la proteína codificada por la secuencia codificante.
Se puede incluir una "secuencia de señal" antes de la secuencia codificante. Esta secuencia codifica un péptido señal, en dirección N-terminal del polipéptido, que se comunica con la célula hospedadora para dirigir el polipéptido a la superficie celular o secretar el polipéptido al medio, y este péptido señal es cortado por la célula hospedadora antes de que la proteína abandone la célula. Se pueden encontrar secuencias señal asociadas con diversas proteínas nativas de procariotas y eucariotas.
El término "oligonucleótido", como se usa en el presente documento en referencia a la sonda de la presente divulgación, se define como una molécula compuesta por dos o más ribonucleótidos, preferentemente más de tres. Su tamaño exacto dependerá de muchos factores que, a su vez, dependen de la función final y el uso del oligonucleótido.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refieren a enzimas bacterianas, cada una de los cuales corta ADN bicatenario en o cerca de una secuencia de nucleótidos específica.
Una célula se ha "transformado" mediante ADN exógeno o heterólogo cuando dicho ADN se ha introducido dentro de la célula. El ADN transformante puede estar o no integrado (unido covalentemente) en ADN cromosómico que compone el genoma de la célula. En procariotas, levaduras y células de mamíferos, por ejemplo, el ADN transformante puede mantenerse en un elemento episómico tal como un plásmido. Con respecto a células eucariotas, una célula transformada de manera estable es una en la que el ADN transformante se ha integrado en un cromosoma de modo que las células descendientes lo hereden a través de la replicación cromosómica. Esta estabilidad es demostrada por la capacidad de la célula eucariota para establecer líneas celulares o clones comprendidos por una población de células descendientes que contienen el ADN transformante. Un "clon" es una población de células procedentes de una única célula o ancestro común por mitosis. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria que tiene capacidad de crecimiento estable in vitro durante muchas generaciones.
Dos secuencias de ADN son "sustancialmente homólogas" cuando al menos aproximadamente 75 % (preferentemente al menos aproximadamente 80 % y lo más preferentemente al menos aproximadamente 90 o 95 %) de los nucleótidos coinciden en la longitud definida de las secuencias de ADN. Las secuencias que son sustancialmente homólogas pueden identificarse comparando las secuencias usando software convencional disponible en bancos de datos de secuencias o en un experimento de hibridación de Southern en, por ejemplo, condiciones rigurosas como se define para ese sistema en particular. La definición de condiciones de hibridación adecuadas está dentro de la experiencia de la técnica. Véase, p. ej., Maniatis et al., mencionado anteriormente; DNA Cloning, Vols. I y II, mencionado anteriormente; Nucleic Acid Hybridization, mencionado anteriormente.
La divulgación contempla moléculas de ADN y secuencias de nucleótidos que son derivadas de las desveladas específicamente en el presente documento y que difieren de las desveladas por la supresión, adición o sustitución de nucleótidos codificando aún al mismo tiempo una proteína que posee la característica funcional del o los polipéptidos de lisina. También se incluyen moléculas pequeñas de a Dn que proceden de las moléculas de ADN desveladas. Dichas moléculas de ADN pequeñas incluyen oligonucleótidos adecuados para su uso como sondas de hibridación o cebadores de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como tales, estas moléculas pequeñas de ADN comprenderán al menos un segmento de una enzima lítica codificada genéticamente por un bacteriófago de Staphylococcus suis y, para los fines de la PCR, comprenderán al menos una secuencia de 10-15 nucleótidos y, más preferentemente, una secuencia de 15-30 nucleótidos del gen. Las moléculas de ADN y las secuencias de nucleótidos que proceden de las moléculas de ADN desveladas como se ha descrito anteriormente también pueden definirse como secuencias de ADN que hibridan en condiciones rigurosas con las secuencias de ADN desveladas o fragmentos de las mismas.
En realizaciones preferidas de la presente divulgación, las condiciones rigurosas pueden definirse como aquellas en las que las moléculas de ADN con más de 25 % de variación de secuencia (también denominada "emparejamiento incorrecto") no se hibridarán. En una realización más preferida, las condiciones rigurosas son aquellas en las que las moléculas de ADN con más de 15 % de emparejamiento incorrecto no se hibridarán y, aún más preferentemente, las condiciones rigurosas son aquellas en las que las secuencias de ADN con más de 10% de emparejamiento incorrecto no se hibridarán. Preferentemente, las condiciones rigurosas son aquellas en las que las secuencias de ADN con más de 6 % de emparejamiento incorrecto no se hibridarán.
La degeneración del código genético amplía adicionalmente el alcance de las realizaciones, ya que permite variaciones importantes en la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN manteniendo al mismo tiempo la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada. Por tanto, la secuencia de nucleótidos del gen podría cambiarse en esta posición a cualquiera de estos tres codones sin afectar a la composición de aminoácidos de la proteína codificada o las características de la proteína. El experto en la técnica conoce bien el código genético y variaciones en los codones de nucleótidos para aminoácidos particulares. Basándose en la degeneración del código genético, las moléculas de ADN variantes pueden proceder de las moléculas de ADNc desveladas en el presente documento usando técnicas de mutagénesis de ADN convencionales como se ha descrito anteriormente o mediante síntesis de secuencias de ADN. La presente divulgación abarca en el presente documento secuencias de ADN que no se hibridan en condiciones rigurosas con las secuencias de ADNc desveladas en virtud de la variación de secuencia basada en la degeneración del código genético.
Por tanto, debería apreciarse que también dentro del alcance de la presente invención y divulgación hay secuencias de ADN que codifican una lisina de uso en la presente invención, es decir, PlySs2, secuencias que codifican un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos como se proporciona en la FIGURA 29 (SEQ ID NO: 1), pero que están degeneradas con respecto a la misma o están degeneradas con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos ilustrativas proporcionadas en la FIGURA 29 (SEQ ID NO: 2). Por "degeneradas con respecto a" se entiende que se usa un codón diferente de tres letras para especificar un aminoácido particular. Se conocen bien en la técnica los codones que se pueden usar indistintamente para codificar cada aminoácido específico.
Un experto en la materia reconocerá que las técnicas de mutagénesis de ADN descritas aquí y conocidas en la técnica pueden producir una amplia variedad de moléculas de ADN que codifican una lisina de bacteriófago de Streptococcus suis pero que mantienen las características esenciales de los polipéptidos líticos descritos y proporcionados en el presente documento. También pueden seleccionarse proteínas recientemente derivadas para obtener variaciones en la característica del o los polipéptidos líticos, como se describirá más detalladamente a continuación. Dichos derivados incluyen los que tienen variaciones en la secuencia de aminoácidos incluyendo supresiones, adiciones y sustituciones menores.
Aunque se puede predeterminar el sitio para introducir una variación de la secuencia de aminoácidos, no es necesario que la mutación en sí misma sea predeterminada. Las sustituciones de aminoácidos son normalmente de restos únicos o pueden ser de uno o más, uno o unos pocos, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete residuos; las inserciones serán habitualmente del orden de aproximadamente 1 a 10 restos de aminoácidos; y las supresiones variarán de aproximadamente 1 a 30 restos. Las supresiones o inserciones pueden estar en forma individual, pero preferentemente se realizan en pares adyacentes, es decir, una supresión de 2 restos o una inserción de 2 restos. Las sustituciones, supresiones, inserciones o cualquier combinación de las mismas se pueden combinar para llegar a una construcción final. Las variantes de sustitución son aquellas en las que se ha eliminado al menos un resto en la secuencia de aminoácidos y se ha insertado un resto diferente en su lugar. Dichas sustituciones pueden realizarse para no generar ningún efecto significativo sobre las características de la proteína o cuando se desea modular con precisión las características de la proteína. Los aminoácidos que pueden sustituir un aminoácido original en una proteína y que se consideran sustituciones conservadoras se han descrito anteriormente y serán reconocidos por un experto en la materia.
Como es bien conocido en la técnica, las secuencias de ADN pueden expresarse uniéndolas operativamente con una secuencia de control de la expresión en un vector de expresión adecuado y empleando ese vector de expresión para transformar un hospedador unicelular adecuado. Dicha unión operativa de una secuencia de ADN de uso en la presente invención con una secuencia de control de la expresión, por supuesto, incluye, si aún no es parte de la secuencia de ADN, la provisión de un codón de iniciación, ATG, en el marco de lectura correcto cadena arriba de la secuencia de ADN. Se puede emplear una amplia variedad de combinaciones de hospedador/vector de expresión para expresar las secuencias de ADN de uso en la presente invención. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden consistir en segmentos de secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas. Se puede usar cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de la expresión, secuencias que controlan la expresión de una secuencia de ADN unida operativamente a ellas, en estos vectores para expresar las secuencias de ADN de uso en la presente invención. Una amplia variedad de células hospedadoras unicelulares también son útiles para expresar las secuencias de ADN de uso en la presente invención. Estos hospedadores pueden incluir hospedadores eucariotas y procariotas bien conocidos, tales como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, hongos como levaduras y células animales, células humanas y células vegetales en cultivo tisular. Un experto en la materia podrá seleccionar los vectores, secuencias de control de la expresión y hospedadores adecuados sin experimentación indebida para lograr la expresión deseada sin apartarse del alcance de uso en la presente invención.
Las composiciones terapéuticas o farmacéuticas pueden comprender uno o más polipéptidos líticos y, opcionalmente, incluyen enzimas líticas naturales, truncadas, quiméricas o redistribuidas, combinadas con uno o más antibióticos, opcionalmente combinadas con excipientes, transportadores o vehículos adecuados. La invención y la divulgación proporcionan composiciones terapéuticas o composiciones farmacéuticas de PlySs2, en combinación con antibióticos para su uso en la destrucción, el alivio, la descolonización, la profilaxis o el tratamiento de bacterias grampositivas, incluyendo infecciones bacterianas o afecciones relacionadas. La invención y la divulgación proporcionan composiciones terapéuticas o composiciones farmacéuticas de PlySs2, en combinación con vancomicina, linezolid o daptomicina para su uso en la destrucción, el alivio, la descolonización, la profilaxis o el tratamiento de bacterias grampositivas, incluyendo infecciones bacterianas o afecciones relacionadas. La invención y la divulgación proporcionan composiciones terapéuticas o composiciones farmacéuticas de PlySs2, en combinación con daptomicina para su uso en la destrucción, el alivio, la descolonización, la profilaxis o el tratamiento de bacterias grampositivas, incluyendo infecciones bacterianas o afecciones relacionadas. Se proporcionan en el presente documento composiciones que comprenden lisina PlySs2, incluyendo truncamientos o variantes de la misma, en combinación con antibiótico, incluyendo daptomicina, para su uso en la destrucción, el alivio, la descolonización, la profilaxis o el tratamiento de bacterias grampositivas, incluyendo infecciones bacterianas o afecciones relacionadas, particularmente de Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus o Listeria, incluyendo Streptococcus pyogenes y Staphylococcus aureus resistente a antibióticos.
La o las enzimas o el o los polipéptidos incluidos en las composiciones terapéuticas pueden ser uno o más o cualquier combinación de enzima(s) lítica(s) asociada(s) a fagos no alterados, polipéptidos líticos truncados, polipéptido(s) lítico(s) variante(s) y enzimas líticas quiméricas y/o redistribuidas. Además, pueden usarse diferentes polipéptidos líticos codificados genéticamente por diferentes fagos para el tratamiento de la misma bacteria. Estas enzimas líticas también pueden ser cualquier combinación de enzimas o polipéptidos líticos "inalterados", polipéptido(s) lítico(s) truncado(s), polipéptido(s) lítico(s) variante(s) y enzimas líticas quiméricas y redistribuidas. La o las enzimas/el o los polipéptido líticos en una composición terapéutica o farmacéutica para bacterias grampositivas, incluyendo Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus y Listeria, pueden usarse solos o en combinación con antibióticos o, si hay otros organismos bacterianos invasivos para tratar, en combinación con otras enzimas líticas asociadas a fagos específicas para otras bacterias diana. La enzima lítica, enzima truncada, enzima variante, enzima quimérica y/o enzima lítica redistribuida se pueden usar junto con una proteína holina. La cantidad de la proteína holina también puede variar. Se pueden incluir opcionalmente diversos antibióticos en la composición terapéutica con la o las enzimas o el o los polipéptidos y con o sin la presencia de lisostafina. Se puede incluir más de una enzima o polipéptido lítico en la composición terapéutica.
La composición farmacéutica también puede incluir una o más enzimas líticas alteradas, incluyendo isoenzimas, análogos o variantes de las mismas, producidas por síntesis química o técnicas de ADN recombinante. En particular, se puede producir proteína lítica alterada por sustitución, supresión, truncamiento, quimerización, redistribución de aminoácidos o combinaciones de los mismos. La composición farmacéutica puede contener una combinación de una o más proteínas líticas naturales y una o más proteínas líticas truncadas, variantes, quiméricas o redistribuidas. La composición farmacéutica también puede contener un péptido o un fragmento peptídico de al menos una proteína lítica procedente de la misma o diferente especie de bacteria, con una adición opcional de uno o más agentes complementarios y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención contienen un agente complementario, uno o más antibióticos convencionales, en particular como se proporciona en el presente documento. Los antibióticos se pueden subagrupar ampliamente en los que afectan a la biosíntesis de peptidoglucano de la pared celular y los que afectan a la síntesis de ADN o proteínas en bacterias grampositivas. Los inhibidores de la síntesis de la pared celular, incluyendo penicilina y antibióticos similares, rompen la pared celular externa rígida de modo que la célula relativamente sin soporte se hinche y finalmente se rompa. El agente complementario puede ser un antibiótico, tal como eritromicina, claritromicina, azitromicina, roxitromicina, otros miembros de la familia de los macrólidos, penicilinas, cefalosporinas y cualquier combinación de las mismas en cantidades que sean eficaces para mejorar de manera sinérgica el efecto terapéutico de la enzima lítica. Prácticamente cualquier otro antibiótico puede usarse con la enzima lítica alterada y/o inalterada. Los antibióticos que afectan a la biosíntesis de peptidoglucano de la pared celular incluyen: Glucopéptidos, que inhiben la síntesis de peptidoglucanos al evitar la incorporación de subunidades peptídicas de ácido N-acetilmurámico (NAM) y N-acetilglucosamina (NAG) en la matriz de peptidoglucanos. Los glucopéptidos disponibles incluyen vancomicina y teicoplanina; Penicilinas, que actúan inhibiendo la formación de reticulaciones de peptidoglucanos. El grupo funcional de las penicilinas, el resto p-lactámico, se une a e inhibe la DD-transpeptidasa que une las moléculas de peptidoglucano en bacterias. Las enzimas hidrolíticas continúan descomponiendo la pared celular, provocando citólisis o muerte debido a la presión osmótica. Las penicilinas habituales incluyen oxacilina, ampicilina y cloxacilina; y polipéptidos, que interfieren con la desfosforilación de la C55-pirofosfato de isoprenilo, una molécula que transporta componentes básicos de peptidoglucanos fuera de la membrana plasmática. Un polipéptido que influye en la pared celular es la bacitracina. Otros antibióticos útiles y relevantes incluyen vancomicina, linezolid y daptomicina.
Se pueden incluir otras enzimas líticas en el vehículo para tratar otras infecciones bacterianas. La composición farmacéutica también puede contener un péptido o un fragmento peptídico de al menos una proteína lítica, una proteína holina o al menos una holina y una proteína lítica, procediendo dichas proteínas líticas y holinas cada una de las mismas o diferentes especies de bacterias, con una adición opcional de agentes complementarios y un vehículo o diluyente adecuado.
También se desvelan composiciones que contienen moléculas de ácido nucleico que, ya sea solas o en combinación con otras moléculas de ácido nucleico, son capaces de expresar una cantidad eficaz de un polipéptido(s) lítico(s) o un fragmento peptídico de un polipéptido(s) lítico(s) in vivo. También se proporcionan cultivos celulares que contienen estas moléculas de ácido nucleico, polinucleótidos y vectores que portan y expresan estas moléculas in vitro o in vivo.
Las composiciones terapéuticas o farmacéuticas pueden comprender polipéptido(s) lítico(s) y antibiótico(s) combinados con diversos vehículos para tratar las enfermedades provocadas por las bacterias grampositivas susceptibles. El vehículo contiene convenientemente cantidades menores de aditivos, tales como sustancias que mejoran la isotonicidad y la estabilidad química. Dichos materiales no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, succinato, ácido acético y otros ácidos orgánicos o sus sales; antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente diez restos), p. ej., poliarginina o tripéptidos; proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; glicina; aminoácidos tales como ácido glutámico, ácido aspártico, histidina o arginina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, manosa, trehalosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcares tales como manitol o sorbitol; contraiones tales como sodio; tensioactivos no iónicos tales como polisorbatos, poloxámeros o polietilenglicol (PEG); y/o sales neutras. La glicerina o glicerol (1,2,3-propanetriol) está disponible en el mercado para uso farmacéutico. DMSO es un disolvente aprótico con una capacidad notable para mejorar la penetración de muchos fármacos aplicados localmente. El vehículo de transporte también puede incluir la solución de Ringer, una solución tamponada y una solución de dextrosa, en particular cuando se prepara una solución intravenosa.
Las tasas o cantidades de dosificación eficaces de una enzima/polipéptido(s) líticos alterados o inalterados y para su uso en la presente invención dependerán en parte de si la enzima/polipéptido(s) líticos se usarán de manera terapéutica o profiláctica, la duración de la exposición del receptor a las bacterias infecciosas, el tamaño y peso del individuo, etc. La duración para el uso de la composición que contiene la enzima/polipéptido(s) también depende de si el uso es con fines profilácticos, en donde el uso puede ser cada hora, diariamente o semanalmente, durante un periodo de tiempo corto, o si el uso será para fines terapéuticos en donde puede ser necesario un régimen más intensivo del uso de la composición, de modo que el uso puede durar horas, días o semanas, y/o diariamente, o en intervalos programados durante el día. Cualquier forma farmacéutica empleada debería proporcionar un número mínimo de unidades durante un periodo de tiempo mínimo. Los vehículos que se clasifican como vehículos de liberación "larga" o "lenta" (tales como, por ejemplo, determinados aerosoles nasales o pastillas) podrían poseer o proporcionar una concentración menor de unidades activas (enzimas) por ml, pero durante un periodo de tiempo más largo, mientras que un vehículo de liberación "corto" o "rápido" (tal como, por ejemplo, un colutorio) podría poseer o proporcionar una alta concentración de unidades activas (de enzima) por ml, pero durante un periodo de tiempo más corto. La cantidad de unidades activas por ml y la duración del tiempo de exposición dependen de la naturaleza de la infección, tanto si el tratamiento va a ser profiláctico como terapéutico, y otras variables. Hay situaciones donde puede ser necesario tener una dosis de unidad/ml mucho mayor o una dosis de unidad/ml menor.
La enzima/polipéptido(s) líticos deberían estar en un entorno que tenga un pH que permita la actividad de la enzima/polipéptido(s) líticos. Un tampón estabilizador puede permitir la actividad óptima de la enzima/polipéptido(s) de lisina. El tampón puede contener un reactivo reductor, tal como ditiotreitol o beta mercaptoetanol (BME). El tampón estabilizador también puede ser o incluir un reactivo quelante metálico, tal como sal disódica del ácido etilendiaminotetracético, o también puede contener un tampón de fosfato o citrato-fosfato, o cualquier otro tampón.
Es notable que el ambiente y determinados aspectos de la ubicación del tratamiento pueden afectar a la eficacia de un antibiótico. Por ejemplo, la daptomicina se une con avidez al tensioactivo pulmonar y, por lo tanto, no es eficaz en el tratamiento de neumonía bacteriana, incluyendo neumonía estafilocócica. La presente invención demuestra la notable eficacia y sinergia de PlySs2 y daptomicina en combinación contra bacterias susceptibles. Además, la lisina PlySs2 y daptomicina en combinación siguen siendo muy eficaces en presencia de un tensioactivo disponible en el mercado que se asemeja al tensioactivo pulmonar. Por tanto, PlySs2 facilita y mejora la eficacia del antibiótico, en particular daptomicina, y sirve para permitir la efectividad y actividad de la daptomicina incluso en presencia de tensioactivo.
Se puede incluir un tensioactivo suave en una composición terapéutica o farmacéutica en una cantidad eficaz para potenciar el efecto terapéutico de la enzima/polipéptido(s) líticos que se puede usar en una composición. Los tensioactivos suaves adecuados incluyen, entre otros, ésteres de sorbitano polioxietilenado y ácidos grasos (serie Tween), octilfenoxi polietoxi etanol (serie Triton-X), n-octil-p-D-glucopiranósido, n-octil-p-D-tioglucopiranósido, ndecil-p-D-glucopiranósido, n-dodecil-p-D-glucopiranósido y tensioactivos de origen biológico, p. ej., ácidos grasos, glicéridos, monoglicéridos, desoxicolato y ésteres de desoxicolato.
También se pueden usar conservantes en la presente invención y preferentemente comprenden aproximadamente de 0,05 % a 0,5 % en peso de la composición total. El uso de conservantes garantiza que si el producto está contaminado por microbios, la formulación evitará o disminuirá el crecimiento de microorganismos. Algunos conservantes útiles en la presente invención incluyen metilparabeno, propilparabeno, butilparabeno, cloroxilenol, benzoato de sodio, DMDM hidantoína, carbamato de 3-yodo-2-propilbutilo, sorbato de potasio, digluconato de clorhexidina o una combinación de los mismos.
La composición terapéutica puede comprender además otras enzimas, tales como la enzima lisostafina para el tratamiento de cualquier bacteria Staphylococcus aureus presente junto con las bacterias grampositivas susceptibles. La lisostafina, un producto génico de Staphylococcus simulans, ejerce un efecto bacteriostático y bactericida sobre S. aureus degradando enzimáticamente las reticulaciones de poliglicina de la pared celular (Browder et al., Res. Comm., 19: 393-400 (1965)). El gen para lisostafina se ha clonado y secuenciado posteriormente (Recsei et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 1127-1131 (1987). Una composición terapéutica también puede incluir mutanolisina y lisozima.
Los medios de aplicación de la composición terapéutica que comprende una enzima/polipéptido(s) líticos y antibiótico(s) incluyen, pero sin limitación, medios directos, indirectos, de transporte y especiales o cualquier combinación de medios. La aplicación directa de la enzima/polipéptido(s) líticos puede ser por cualquier medio adecuado para poner directamente el polipéptido en contacto con el sitio de infección o colonización bacteriana, tal como con el área nasal (por ejemplo, pulverizaciones nasales), aplicaciones dérmicas o cutáneas (por ejemplo, pomadas o formulaciones tópicas), supositorios, aplicaciones de tampones, etc. Las aplicaciones nasales incluyen, por ejemplo, pulverizaciones nasales, gotas nasales, pomadas nasales, lavados nasales, inyecciones nasales, taponamientos nasales, pulverizaciones e inhaladores bronquiales, o indirectamente mediante el uso de pastillas para la garganta, enjuagues bucales o colutorios, o mediante el uso de pomadas aplicadas a las narinas, o la cara o cualquier combinación de estos y métodos de aplicación similares. Las formas en las que se puede administrar la enzima lítica incluyen, pero sin limitación, pastillas, trociscos, caramelos, inyecciones, gomas de mascar, comprimidos, polvos, pulverizaciones, líquidos, pomadas y aerosoles.
El modo de aplicación de la enzima lítica y el antibiótico incluye varios tipos y combinaciones diferentes de vehículos que incluyen, pero sin limitación, un líquido acuoso, un líquido a base de alcohol, un gel hidrosoluble, una loción, una pomada, una base líquida no acuosa, una base de aceite mineral, una mezcla de aceite mineral y vaselina, lanolina, liposomas, vehículos proteicos tales como seroalbúmina o gelatina, celulosa en polvo carmel y combinaciones de los mismos. Un modo de suministro del vehículo que contiene el agente terapéutico incluye, pero sin limitación, una extensión, pulverización, un parche de liberación prolongada, una toallita con líquido absorbido y combinaciones de los mismos. La enzima lítica se puede aplicar a un vendaje directamente o en uno de los otros vehículos. Los vendajes pueden comercializarse húmedos o secos, en donde la enzima está en forma liofilizada en el vendaje. Este método de aplicación es más eficaz para el tratamiento de la piel infectada. Los vehículos de composiciones tópicas pueden comprender vehículos semisólidos y de tipo gel que incluyen un espesante polimérico, agua, conservantes, tensioactivos activos o emulsionantes, antioxidantes, filtros solares y un sistema de disolvente o disolvente mixto Los espesantes poliméricos que se pueden usar incluyen los conocidos por un experto en la materia, tales como gelificantes hidrófilos e hidroalcohólicos usados frecuentemente en las industrias cosmética y farmacéutica. Otros polímeros gelificantes preferidos incluyen hidroxietilcelulosa, goma de celulosa, polímero cruzado de decadieno MVE/MA, copolímero de PVM/MA o una combinación de los mismos.
Una composición que comprende una enzima/polipéptido(s) líticos y antibiótico(s) puede administrarse en forma de un caramelo, goma de mascar, pastilla para chupar, trocisco, comprimido, un polvo, un aerosol, un líquido, una pulverización líquida o pasta de dientes para la prevención o el tratamiento de infecciones bacterianas asociadas con enfermedades de las vías respiratorias altas. La pastilla para chupar, el comprimido o la goma en los que se añade la enzima/polipéptido(s) líticos pueden contener azúcar, jarabe de maíz, diversos colorantes, edulcorantes sin azúcar, aromatizantes, cualquier aglutinante o combinaciones de los mismos. De manera similar, cualquier producto a base de goma puede contener goma arábiga, cera de carnauba, ácido cítrico, almidón de maíz, colorantes alimentarios, aromatizantes, edulcorantes sin azúcar, gelatina, glucosa, glicerina, base de goma, goma laca, sacarina de sodio, azúcar, agua, cera blanca, celulosa, otros aglutinantes y combinaciones de los mismos. Las pastillas para chupar pueden contener además sacarosa, almidón de maíz, goma arábiga, goma de tragacanto, anetol, linaza, oleorresina, aceite mineral y celulosa, otros aglutinantes y combinaciones de los mismos. También se pueden usar sustitutos de azúcar en lugar de dextrosa, sacarosa u otros azúcares. Las composiciones que comprenden enzimas líticas o sus fragmentos peptídicos pueden dirigirse al revestimiento de la mucosa, donde, en residencia, destruyen bacterias colonizadoras de la enfermedad. El revestimiento de la mucosa, como se desvela y describe en el presente documento, incluye, por ejemplo, las vías respiratorias altas y bajas, ojo, cavidad bucal, nariz, recto, vagina, bolsa periodontal, intestinos y colon. Debido a los mecanismos naturales de eliminación o limpieza de los tejidos mucosos, no se conservan formas farmacéuticas convencionales en el sitio de aplicación durante un periodo de tiempo significativo.
Puede ser ventajoso tener materiales que presenten adhesión a tejidos de la mucosa, para administrar con una o más enzimas de fagos y otros agentes complementarios durante un periodo de tiempo. Son particularmente deseables materiales que tienen capacidad de liberación controlada y el uso de mucoadhesivos de liberación sostenida ha recibido un grado significativo de atención. Se conocen otros enfoques que implican mucoadhesivos que son la combinación de materiales hidrófilos e hidrófobos. También pueden usarse micelas y micelas multilaminares para controlar la liberación de enzima. Los materiales con capacidad para dirigirse o adherirse a superficies, tales como plástico, membranas, dispositivos utilizados en la práctica clínica, incluyendo en particular cualquier material o componente que se coloque en el cuerpo y sea susceptible a la adhesión bacteriana o al desarrollo de biopelículas, tales como catéteres, válvulas, dispositivos protésicos, bombas de fármacos o compuestos, endoprótesis vasculares, materiales ortopédicos, etc., pueden combinarse, mezclarse o fusionarse con la o las lisinas de uso en la presente invención.
Las composiciones terapéuticas o farmacéuticas de la invención también pueden contener mucoadhesivos poliméricos incluyendo un copolímero de injerto que comprende una cadena principal hidrófila y cadenas de injerto hidrófobas para la liberación controlada de agentes biológicamente activos. Las composiciones de la presente solicitud pueden contener opcionalmente otros materiales poliméricos, tal como poli(ácido acrílico), plastificantes de poli-(vinilpirrolidona) y carboximetilcelulosa de sodio, y otros excipientes farmacéuticamente aceptables en cantidades que no provocan un efecto perjudicial en la mucoadhesividad de la composición.
Una enzima/polipéptido(s) líticos y antibiótico(s) de la invención pueden administrarse para su uso de acuerdo con la invención por cualquier medio farmacéuticamente aplicable o aceptable, incluyendo por vía tópica, por vía oral o por vía parenteral. Por ejemplo, la enzima/polipéptido(s) líticos pueden administrarse por vía intramuscular, por vía intratecal, por vía subdérmica, por vía subcutánea o por vía intravenosa para tratar infecciones por bacterias grampositivas. En casos donde la inyección parenteral es el modo de administración elegido, se usa preferentemente una formulación isotónica. En general, los aditivos para isotonicidad pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. En algunos casos, se prefieren soluciones isotónicas tales como solución salina tamponada con fosfato. Los estabilizadores incluyen gelatina y albúmina. Se puede añadir un agente de vasoconstricción a la formulación. Las preparaciones farmacéuticas según la presente solicitud se proporcionan estériles y sin pirógenos.
Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente en ensayos de cultivo celular o en modelos animales, habitualmente ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal también se usa para lograr un intervalo de concentraciones y una vía de administración deseables. Dicha información puede usarse después para determinar dosis y vías útiles para administración en seres humanos. La dosificación exacta es elegida por el médico individual en vista del paciente que se va a tratar. La dosificación y administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del resto activo o para mantener el efecto deseado. Los factores adicionales que pueden tenerse en cuenta incluyen la gravedad de la patología, la edad, el peso y el sexo del paciente; la dieta, la duración deseada del tratamiento, el método de administración, el momento y la frecuencia de administración, la o las combinaciones de fármacos, las sensibilidades a la reacción y la tolerancia/respuesta a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada pueden administrarse cada 3 a 4 días, cada semana o una vez cada dos semanas, según la vida media y la tasa de eliminación de la formulación en particular.
Las tasas o cantidades eficaces de dosificación de la enzima/polipéptido(s) líticos para administrar y la duración del tratamiento dependerán en parte de la gravedad de la infección, el peso del paciente, en particular, ser humano, la duración de la exposición del receptor a las bacterias infecciosas, el número de centímetros cuadrados de piel o tejido que están infectados, la profundidad de la infección, la gravedad de la infección y diversas otras variables. La composición se puede aplicar en cualquiera de una vez a varias veces al día o a la semana, y se puede aplicar durante un periodo de tiempo breve, tal como días o hasta varias semanas, o largo, tal como muchas semanas o hasta meses. El uso puede durar días o semanas. Cualquier forma farmacéutica empleada debería proporcionar un número mínimo de unidades durante un periodo de tiempo mínimo. La concentración de las unidades activas de enzimas que se cree que proporcionan una cantidad o dosis eficaz de enzimas se puede seleccionar según sea adecuado.
La lisina y los antibióticos de uso y aplicación en las composiciones y métodos de la invención pueden administrarse de manera simultánea o posteriormente. Los agentes de lisina y antibióticos pueden administrarse en una única dosis o en múltiples dosis, individualmente o en combinación. La lisina y el antibiótico pueden administrarse por el mismo modo de administración o por diferentes modos de administración y pueden administrarse una vez, dos veces o múltiples veces, uno o más en combinación o individualmente. Por tanto, puede administrarse lisina en una dosis inicial seguida de una dosis o dosis posteriores, dependiendo en particular de la respuesta y destrucción o descolonización bacteriana, y puede combinarse o alternarse con una o más dosis de antibiótico. En un aspecto particular de la invención y en vista de la reducción en el desarrollo de resistencia a los antibióticos mediante la administración de una lisina, en particular PlySs2, con antibiótico, se pueden administrar combinaciones de antibiótico y lisina durante periodos más largos y la dosificación se puede extender sin riesgo de resistencia. Además, en la medida en que las dosis necesarias para la eficacia de cada antibiótico y lisina se reducen significativamente combinando o coadministrando los agentes simultáneamente o en serie, un paciente puede ser tratado de manera más agresiva y más continua sin riesgo, o con riesgo reducido, de resistencia.
El término 'agente' significa cualquier molécula, incluyendo polipéptidos, anticuerpos, polinucleótidos, compuestos químicos y moléculas pequeñas. En particular, el término agente incluye compuestos tales como compuestos de prueba, compuesto(s) adicional(es) añadido(s) o compuestos de enzima lisina.
El término 'agonista' se refiere a un ligando que estimula el receptor al que se une el ligando en el sentido más amplio.
El término 'ensayo' significa cualquier proceso usado para medir una propiedad específica de un compuesto. Un 'ensayo de exploración' significa un proceso utilizado para caracterizar o seleccionar compuestos en función de su actividad de una colección de compuestos.
El término 'prevenir' o 'prevención' se refiere a una reducción del riesgo de adquirir o desarrollar una enfermedad o un trastorno (es decir, provocar que al menos uno de los síntomas clínicos de la enfermedad no se desarrolle) en un sujeto que puede estar expuesto a un agente causante de la enfermedad o predispuesto a la enfermedad antes del inicio de la enfermedad.
El término 'profilaxis' está relacionado con y está abarcado en el término 'prevención' y se refiere a una medida o un procedimiento cuyo fin es prevenir, en lugar de tratar o curar, una enfermedad. Los ejemplos no limitantes de medidas profilácticas pueden incluir la administración de vacunas; la administración de heparina de bajo peso molecular a pacientes hospitalizados con riesgo de trombosis debido, por ejemplo, a la inmovilización; y la administración de un agente antipalúdico tal como cloroquina, antes de una visita a una región geográfica donde la malaria es endémica o el riesgo de contraer malaria es alto.
'Cantidad terapéuticamente eficaz' significa la cantidad de un fármaco, compuesto, antimicrobiano, anticuerpo, polipéptido o agente farmacéutico que provoque la respuesta biológica o médica de un sujeto que busca un médico u otro profesional clínico. En particular, con respecto a infecciones bacterianas grampositivas y crecimiento de bacterias grampositivas, se entiende que la expresión "cantidad eficaz" incluye una cantidad eficaz de un compuesto o agente que provoque una disminución biológicamente significativa en la cantidad o extensión de infección de bacterias grampositivas, incluyendo tener un efecto bactericida y/o bacteriostático. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se usa en el presente documento para indicar una cantidad suficiente para prevenir, y preferentemente reducir en al menos aproximadamente 30 por ciento, más preferentemente en al menos 50 por ciento, más preferentemente en al menos 90 por ciento, un cambio clínicamente significativo en el crecimiento o la cantidad de bacterias infecciosas u otra característica de la patología tal como, por ejemplo, fiebre elevada o recuento de glóbulos blancos que pueden acompañar a su presencia y actividad.
El término 'tratar' o 'tratamiento' de cualquier enfermedad o infección se refiere, en una realización, a aliviar la enfermedad o infección (es decir, detener la enfermedad o el crecimiento del agente infeccioso o la bacteria o reducir la manifestación, extensión o gravedad de al menos uno de los síntomas clínicos del mismo). En otra realización, 'tratar' o 'tratamiento' se refiere a aliviar al menos un parámetro físico, que puede no ser perceptible por el sujeto. En otra realización más, 'tratar' o 'tratamiento' se refiere a modular la enfermedad o infección, ya sea físicamente, (p. ej., estabilización de un síntoma perceptible), fisiológicamente, (p. ej., estabilización de un parámetro físico), o ambos. En una realización adicional, 'tratar' o 'tratamiento' se refiere a ralentizar la progresión de una enfermedad o reducir una infección.
Cabe señalar que en el contexto de los métodos de tratamiento que se llevan a cabo in vivo o métodos de tratamiento médico y clínico de acuerdo con la presente solicitud y reivindicaciones, se entiende que el término sujeto, paciente o individuo se refiere a un ser humano.
Las expresiones "bacterias grampositivas", "bacterias Grampositivas", "grampositivas" y cualquier variante no enumerada específicamente, pueden usarse en el presente documento indistintamente y, como se usan a lo largo de la presente solicitud y las reivindicaciones, se refieren a bacterias grampositivas que son conocidas y/o pueden identificarse por la presencia de determinadas características de la pared celular y/o de la membrana celular y/o por tinción con tinción de Gram. Las bacterias grampositivas son conocidas y pueden identificarse fácilmente y pueden seleccionarse, pero sin limitación, de los géneros Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Mycobacterium, Corynebacterium y Clostridium e incluyen todas y cada una de las especies o cepas reconocidas o no reconocidas de los mismos. En un aspecto de la invención, las bacterias grampositivas sensibles a lisina PlyS incluyen bacterias seleccionadas de una o más de Listeria, Staphylococcus, Streptococcus y Enterococcus.
El término "bactericida" se refiere a capaz de destruir células bacterianas.
El término "bacteriostático" se refiere a capaz de inhibir el crecimiento bacteriano, incluyendo inhibir el crecimiento de células bacterianas.
La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y que normalmente no producen una reacción alérgica o similar negativa, tal como malestar gástrico, mareos y similares, cuando se administra a un ser humano.
La invención puede entenderse mejor por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes, que se proporcionan como ilustrativos de la invención. Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar más completamente las realizaciones preferidas de la invención y no deberían interpretarse de ninguna manera, sin embargo, como limitantes del amplio alcance de la invención.
EJEMPLO 1
La lisina PlySs2 demuestra la capacidad de destruir varias cepas de bacterias grampositivas clínicamente significativas, incluyendo cepas resistentes a antibióticos tales como cepas resistentes y sensibles a meticilina y vancomicina de Staphylococcus aureus (SARM, SASM, SARV, SAIV), Staphylococcus aureus resistente a la daptomicina (SARD) y Staphylococcus aureus resistente a linezolid (SARL). PlySs2 es una lisina única que tiene amplia actividad de destrucción de especies y puede destruir múltiples especies de bacterias, en particular bacterias grampositivas, incluyendo cepas bacterianas de Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus y Listeria. En la TABLA 2 se muestra una tabulación de la sensibilidad (como se representa usando los valores de CIM y las concentraciones j M) de estafilococos a la lisina PlySs2 y diversos antibióticos. La concentración inhibidora mínima (CIM) se determinó usando el método de microdilución en caldo de cultivo de acuerdo con los patrones y como se describe en el documento M07-A9 del Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (CLSI) (Methods for dilutional antimicrobial sensitivity tests for bacteria that grow aerobically. Volumen 32 (Wayne [PA]: Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio [Estados Unidos], 2012). Este valor es el CIM determinado en presencia de agente reductor (tal como DTT o BMS) en el ensayo de CIM. Se añade agente reductor con el fin de mejorar la capacidad de reproducción entre y dentro de los ensayos para determinar los valores de CIM.
TABLA 2
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* Las CIM se determinaron usando el método de microdilución en caldo de cultivo y evaluando la inhibición del crecimiento al 80 % según los métodos de CLSI (M07-A9).
*Rojo/negrita=fracaso del fármaco (el valor CIM está por encima del punto de corte EUCAST para el fármaco indicado en S. aureus)
La actividad de PlySs2 contra diversos organismos grampositivos y gramnegativos se tabula en la TABLA 3, que incluye valores de CIM e intervalo para los diferentes organismos. Se proporciona actividad de PlySs2 contra Staphylococcus aureus resistente a antibióticos en la TABLA 4. PlySs2 tiene actividad inhibidora del crecimiento potente en todas las cepas de Staphylococcus aureus probadas que incluyen 103 aislados de SASM y 120 de SARM (CIM = 8 |jg/ml), así como estreptococos de los grupos A y B y Staphylococcus lugdiensis (TABLA 3). Se observó poca o ninguna actividad en una colección de otras bacterias grampositivas, así como en todas las bacterias Gram negativas probadas. Aunque PlySs2 destruye eficazmente S. aureus resistente y sensible a antibióticos así como muchas otras bacterias grampositivas clínicamente significativas, es notablemente ineficaz en numerosas bacterias comensales, tales como Escherichia coli, como se ha mostrado anteriormente en la TABLA 1 y en la TABLA 5 a continuación, que proporciona la sensibilidad de las bacterias intestinales humanas y CIM de PlySs2.
TABLA
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TABLA 4
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TABLA
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Aunque PlySs2 es eficaz contra muchas bacterias clínicamente relevantes diferentes, conserva el carácter beneficioso de muchas lisinas al carecer de destrucción bacteriana de amplio espectro, por lo tanto, se minimizarán los efectos secundarios, tales como alteración de la flora intestinal, observados con muchos antibióticos. Además, las lisinas han demostrado una baja probabilidad de resistencia bacteriana. La capacidad notablemente amplia de destrucción clínicamente relevante de PlySs2 hace que sea aplicable de manera única al entorno clínico, incluso en casos donde hay una infección bacteriana completamente no caracterizada o mixta.
Staphylococcus aureus es el agente causante de varias enfermedades infecciosas graves y la aparición de cepas de S. aureus resistente a antibióticos ha dado como resultado dificultades de tratamiento significativas, intensificando la necesidad de nuevos agentes antimicrobianos. En la actualidad, 40 a 60 % de las infecciones hospitalarias de S. aureus son resistentes a la oxacilina (Massey RC et al. (2006) Nat Rev Microbiol 4: 953-958) y más del 60 % de los aislados son resistentes a la meticilina (Gill SR et al. (2005) J Bacteriol 187: 2426-2438). Varios nuevos agentes antimicrobianos, tales como linezolid, quinupristina-dalfopristina, daptomicina, telavancina, nuevos glucopéptidos, ceftarolina y ceftobiprol, se han introducido o están en desarrollo clínico (Aksoy DY y S Unal (2008) Clin Microbiol Infect 14: 411-420). Como una opción, los antibióticos actuales a los que cepas tales como SARM son resistentes pueden recuperarse como candidatos viables en el tratamiento de SARM cuando se usan en combinación con otros agentes, ofreciendo una nueva dimensión de posibles agentes antiinfecciosos. La aplicación y el uso de lisina en combinación con antibiótico tiene el potencial de eludir la resistencia bacteriana en virtud de la muy baja probabilidad de desarrollo de resistencia al componente de lisina.
Para evaluar más completamente la aplicabilidad de PlySs2 a infecciones clínicas estafilocócicas, se realizaron estudios de destrucción en el tiempo contra numerosas cepas de Staphylococcus aureus, incluyendo cepas resistentes a la meticilina y sensibles a la meticilina. Se realizaron ensayos de destrucción en el tiempo según metodología CLSI (documento del CLSI M07-A9 columna 32 n.° 2) en 42 cepas de S. aureus resistente a meticilina (SARM) y 20 cepas de S. aureus sensible a la meticilina (SASM). Se trataron cultivos de cada cepa (5,5X105-1X106 de inóculo inicial) con lisina PlySs2 y con los antibióticos daptomicina, oxacilina o vancomicina para comparación durante 6 horas con aireación. Las cepas de SARM y SASM fueron tratadas con PlySs2, daptomicina y vancomicina. Las cepas de SASM también se trataron con oxacilina. Se utilizaron concentraciones de ClM 1X de los diferentes antibióticos, en función de los valores de CIM de antibióticos publicados y establecidos. El tratamiento con lisina PlySs2 fue a aproximadamente CIM 1X como se ha determinado previamente (véase TABLA 2 anterior). Se retiraron alícuotas de cultivo cada hora hasta 6 horas (puntos temporales tomados a los 15 y 30 minutos, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h y 6 h) y se añadieron a una solución de PBS/carbón (para inactivar cada fármaco), que después se diluyó en serie y se sembró en placas para determinar la viabilidad bacteriana. Se representó el log UFC/ml resultante para cada cultivo. Se incluyeron controles de crecimiento para cada cepa y representan el crecimiento bacteriano en ausencia de cualquier agente antibacteriano. Se representan curvas ilustrativas de log de destrucción para cepas de SARM seleccionadas en la FIGURA 1. Se representan curvas ilustrativas de log de destrucción para cepas de SASM seleccionadas en la FIGURA 2. Se muestra una representación resumida de los estudios de destrucción en el tiempo con las cepas de SARM y SASM en la FIGURA 3.
Se proporciona una lista de cepas usadas en los estudios proporcionados en el presente documento, incluyendo la referencia cruzada para nombres de cepas reconocidos y disponibles a continuación en la TABLA 6.
TABLA
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PlySs2 tiene cinética de destrucción rápida in vitro
La cinética de destrucción rápida es deseable en el entorno clínico para tratar a pacientes con infecciones bacterianas fulminantes. Para probar la tasa de actividad antimicrobiana in vitro, se usaron ensayos de destrucción en el tiempo (Mueller M et al. (2004) Antimicrob Agents Chemotherapy 48: 369-377) en los que se probaron concentraciones de fármaco CIM 1X en 20 cepas diferentes de SASM y 42 de SARM. PlySs2 alcanzó niveles bactericidas (Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Vol. 32 (Wayne (PA): Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (Estados Unidos), 2012) (reducción >3-log-io de UFC) en 30 minutos (FIGURA 4A y B). Por el contrario, la daptomicina requirió 6 horas para alcanzar niveles bactericidas, mientras que la vancomicina y la oxacilina lograron solo 2 logi0 de destrucción en un periodo de 6 horas. También se obtuvo cinética de destrucción rápida para PlySs2 contra conjuntos de 15 aislados contemporáneos diferentes de SASM (FIGURA 4C) o SARM (FiGu Ra 4D), que ilustran la actividad bactericida eficaz de PlySs2 en aislados clínicos relevantes. La potente actividad de PlySs2 fue ilustrada adicionalmente por microscopia electrónica que muestra bacteriólisis extensa de cocos de S. aureus después de solo 15 segundos de tratamiento; la velocidad de acción de PlySs2 es coherente con un efecto bactericida inmediatamente después del contacto (FIGURA 4E).
Todas las cepas de SARM y SASM probadas se destruyen rápidamente con PlySs2, con destrucción máxima (es decir, reducción >3 log) observada en general durante la primera hora de incubación con lisina y los log reducidos a 1 log de UFC/ml (el límite inferior eficaz de la prueba) en la mayoría de los casos. La daptomicina o la vancomicina reducen el crecimiento de la mayoría de las cepas de SARM y SASM en 2-3 log observados en general durante algunas horas o más de incubación, siendo la daptomicina la más eficaz contra la mayoría de las cepas. La oxacilina fue el agente antibiótico menos eficaz contra las cepas de SASM. En todos los casos, la destrucción por PlySs2 fue mayor y más rápida que cualquier antibiótico.
Los estudios se ampliaron para incluir pruebas de diversas cepas de S. aureus, incluyendo S. aureus de sensibilidad intermedia a la vancomicina (SAIV), S. aureus resistente a la vancomicina (SARV), S. aureus resistente a linezolid (SARL) y S. aureus resistente a la daptomicina (SARD), con lisina PlySs2, daptomicina, vancomicina y linezolid, usando los métodos descritos anteriormente. Se proporciona una tabulación de estudios realizados con cepas de SASM, SARM, SAIV, SARV, SARL y SARD de Staphylococcus aureus en la TABLA 2 anterior con concentraciones inhibidoras mínimas (CIM) de PlySs2 y diversos anticuerpos proporcionados para diversas cepas.
EJEMPLO 2
Aunque la lisina PlySs2 por sí sola destruye más rápidamente que los antibióticos solos, como se ha mostrado anteriormente, no se conoce ni está disponible información acerca de la capacidad o eficacia de PlySs2 en combinación con antibióticos. Se realizaron estudios de destrucción bacteriana para evaluar combinaciones de lisina PlySs2 con antibiótico contra Staphylococcus aureus in vitro.
Se realizaron ensayos de destrucción en el tiempo como se ha descrito anteriormente en varias cepas de SARM con adición de PlySs2 o antibiótico solo o en combinación a diversas concentraciones. Se trataron cultivos de cada cepa (5,5x105-1x106 de inóculo inicial) con lisina PlySs2, antibiótico (daptomicina o vancomicina) o combinaciones de PlySs2 y antibiótico durante 6 horas con aireación. En cada caso, se utilizaron dosis sub-CIM de PlySs2 y de antibiótico para observar la sinergia y la eficacia mejorada del agente combinado. Se incluyeron controles de crecimiento para cada cepa y representan el crecimiento bacteriano en ausencia de cualquier agente antibacteriano. Se muestran las curvas de destrucción en el tiempo de dos cepas de SARM con adición de 1/2 CIM de PlySs2 y 1/4 CIM de vancomicina en la FIGURA 5. A estas dosis sub-CIM, la vancomicina o PlySs2 son ineficaces o poco eficaces por sí solas hasta 6 horas. Las combinaciones de 1/2 CIM de PlySs2 y 1/4 CIM de vancomicina dan como resultado hasta 4 log de destrucción de SARM en cultivo en 6 horas.
Se muestran las curvas de destrucción en el tiempo de dos cepas de SARM con adición de 1/4 CIM de PlySs2 y 1/8 CIM de daptomicina en la FIGURA 6. Las combinaciones de 1/4 CIM de PlySs2 y 1/8 CIM de daptomicina dan como resultado hasta 4 log de destrucción de SARM en cultivo en 6 horas. La FIGURA 7 representa otro estudio de combinación basado en los valores de CIM 1X de PlySs2 y daptomicina en la cepa de SARM 650 (cepa O52C Tomasz - 1X109 de inóculo inicial). Se añade lisina PlySs2 a 16 pg/ml, se añade daptomicina a 1 pg/ml. Aunque cada agente individual por sí solo da como resultado 4-5 log de destrucción a las concentraciones añadidas, la combinación de PlySs2 y daptomicina proporciona destrucción completa (log de destrucción hasta el límite de detección del ensayo) en 2 horas.
EJEMPLO 3
La terapia combinada es particularmente eficaz cuando los fármacos actúan de manera sinérgica (Cottarel G y Wierzbowski J (2007) Trends Biotechnology 25: 547-555). La evaluación de la sinergia entre PlySs2 y antibióticos activos en la envoltura celular se realizó mediante el ensayo de destrucción en el tiempo, un método preferido para examinar la actividad antimicrobiana sinérgica in vitro (Mueller M et al. (2004) Antimicrob Agents and Chemotherapy 48: 369-377; Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, Vol. 32 (Wayne (PA): Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (Estados Unidos), 2012). Los estudios de sinergia se evaluaron adicionalmente con el antibiótico oxacilina, que es un miembro de la familia de la penicilina y destruye bacterias de manera distinta en comparación con la vancomicina o la daptomicina. Los resultados de los estudios de oxacilina sola o en presencia de lisina PlySs2 se muestran en la FIGURA 8. Se generaron curvas de destrucción en el tiempo usando concentraciones sub-CIM de PlySs2, daptomicina, vancomicina y oxacilina solos o en combinaciones contra aislados clínicos de SARM (FIGURA 8C-8F) o SASM (FIGURA 8A-8B). La sinergia se definió como una disminución >2-log10 de UFC/ml en el punto temporal de 6 horas para la combinación en comparación con el agente individual más activo. En función de estos criterios, PlySs2 actuó de manera sinérgica con todos los antibióticos evaluados contra todas las cepas representativas de SARM y SASM evaluadas (véase FIGURAS 4-8). Se examinó de manera similar un conjunto ampliado de aislados y se observó sinergia en 45 de 49 análisis para SASM y 24 de 26 para SARM con PlySs2 combinada con distintos antibióticos, incluyendo oxacilina, vancomicina y daptomicina (TABLAS 7-11 proporcionadas a continuación).
TABLA 7
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TABLA
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continuación
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TABLA
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TABLA 1
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TABLA 11
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EJEMPLO 4
Se realizaron pruebas de CIM de microdilución en caldo de cultivo usando paneles de 96 pocilios según los métodos descritos anteriormente para el ejemplo 1 (metodología CLSI, documento de CLSI M07-A9, columna 32 n.° 2). En los presentes estudios, sin embargo, tanto la lisina PlySs2 como el antibiótico daptomicina están presentes juntos en cada pocillo a diferentes concentraciones iniciales. Los estudios se completaron con 12 cepas de S. aureus SARM diferentes. En cada caso, primero se determinó la CIM de PlySs2 para la cepa. Las CIM de DAP para cada cepa se basaron en pruebas de CIM de microdilución en caldo de cultivo según la metodología publicada y se confirmaron con los datos publicados y disponibles para los aislamientos probados. Se añadieron 5,5X105-1X106 células a cada pocillo y se cultivaron en presencia de diversas cantidades de lisina PlySs2 y daptomicina durante 24 horas a 37 °C sin aireación. Los valores de CIM se determinaron a simple vista y se confirmaron sembrando bacterias en placas para determinar recuentos de células viables en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Los cultivos se evaluaron en presencia y ausencia de un agente reductor (p. ej., beta mercaptoetanol (BME), ditiotreitol (DTT)). Los valores de CIM son relativamente más bajos en presencia de agente reductor y la capacidad de repetición se mejora con agente reductor.
Determinaciones de CIM de agente doble. El ensayo de CIM de agente doble procede del método convencional de microdilución en caldo de cultivo (Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically (2012) Vol. 32 (Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (Estados Unidos), Wayne (PA)). Mientras que el ensayo de CIM diluye un fármaco a través del eje x, los ensayos combinados de CIM diluyen dos fármacos juntos a través del eje x. De dos a cuatro placas de microtitulación de polipropileno de 96 pocillos (Becton, Dickenson, and Company) se combinan para producir esquemas de dilución deseados. Primero se diluye PlySs2 dos veces verticalmente hacia abajo en la columna 1, produciendo un intervalo de concentraciones de 2048 a 1 |jg/ml. A continuación, se añade daptomicina a una concentración constante (4 jg/ml) a cada pocillo de la columna 1. Todos los pocillos de la columna 1, por lo tanto, contienen un intervalo de dilución de PlySs2 frente a un fondo de daptomicina 4 jg/ml. A continuación, la columna 1 se diluye dos veces a lo largo del eje x completo, de modo que todos los pocillos de la columna 11 tienen una concentración de daptomicina de 0,0037 jg/ml. Después de las diluciones de fármacos, se añaden células (~5x105 UFC/ml) y después de 24 horas de incubación a 35 °C en aire ambiental, se registraron las CIM como las concentraciones de fármaco más diluidas que inhiben el crecimiento bacteriano.
Se representan los resultados ilustrativos con ocho cepas de SARM en las FIGURAS 9-18. En cada una de las FIGURAS 9-18, un intervalo de dilución de duplicación en doce pocillos avanza hacia la derecha para cada fila del panel. Cada panel representa el pocillo de una placa de 96 pocillos. Las cepas bacterianas indicadas se inocularon después en cada pocillo y se incubaron durante 24 horas, momento en el que se examinó el crecimiento. Los paneles sin sombrear indican pocillos en los que las combinaciones de fármacos inhibieron el crecimiento. Los paneles sombreados en amarillo (claro) indican las menores concentraciones de combinación de fármacos que inhibieron el crecimiento (esencialmente correspondientes a la CIM). Los paneles sombreados en rojo (oscuro) indican el crecimiento bacteriano (en otras palabras, combinaciones de agentes que no inhibieron el crecimiento). Los estudios se realizaron en presencia y ausencia de agente reductor. En cada caso, con o sin el agente reductor, se observó sinergia significativa, con reducción múltiple de la cantidad tanto de lisina como de antibiótico necesaria cuando ambos se proporcionaron en combinación. La reducción del antibiótico necesario fue particularmente significativa con la adición de lisina.
Se resumen los resultados experimentales generales con una docena de cepas de SARM en la TABLA 12 a continuación. Como se muestra a continuación y se representa en las FIGURAS 9-18, la combinación de PlySs2 y antibiótico (daptomicina) entre sí puede lograr de manera sinérgica una reducción de 2-4 veces de la CIM eficaz de PlySs2. Notablemente, la combinación de PlySs2 y daptomicina entre sí puede lograr de manera sinérgica un incremento de 16-256 (factor de reducción) de la sensibilidad de la CIM eficaz del antibiótico daptomicina.
TABLA 12
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EJEMPLO 5
Se acometió la evaluación adicional de la sinergia realizando ensayos en damero y calculando los valores de índice de concentración inhibidora fraccional (ICIF) (Tallarida RJ (2012) J Pharmacol and Exper Therapeutics 342: 2-8). Estos estudios se realizaron usando los antibióticos ilustrativos daptomicina, vancomicina y oxacilina. Usando esta evaluación, la sinergia se define como actividad inhibidora mayor de la que se predeciría al sumar los dos fármacos juntos (ICIF de <0,5). En la FIGURA 19 se proporcionan isobologramas representativos para los diferentes antibióticos contra las cepas de SARM y SASM. Se observó sinergia para 79 % (daptomicina), 86 % (vancomicina) y 100 % (oxacilina) de las 29 cepas de SASM y para 89 % (daptomicina) y 69 % (vancomicina) de las 26 cepas de SARM. Los resultados se tabulan a continuación en las TABLAS 13-15.
TABLA 1
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TABLA 14
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TABLA 1
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En el ensayo en damero, las interacciones farmacológicas se definen como sinérgicas, aditivas o antagonistas en función de la CIFmín para cada combinación. La CIF para un fármaco se define como la CIM del fármaco en combinación dividida por la CIM del fármaco usado solo. La CIFmín se basa en la suma de las CIF para cada fármaco. Si la CIFmín es < 0,5, la combinación se interpreta como sinérgica; entre > 0,5 y < 2, como aditiva; y > 2, como antagonista.
EJEMPLO 6
PlySs2 acelera la unión del antibiótico a la envoltura celular
Como complemento a los estudios de sinergia, se examinó la unión a la envoltura celular de daptomicina y vancomicina usando antibióticos marcados con BODIPY-fluoresceína en presencia y ausencia de niveles sub-CIM de CF-301. Un análisis de evolución temporal de la unión de daptomicina (FIGURA 20A) muestra la penetración de antibióticos después de solo 15 minutos en presencia de CF-301 (a 1/32 CIM) frente a 3 horas sin CF-301. De manera similar, se produce marcaje de la pared celular con vancomicina en 5 minutos en presencia de CF-301 (1/8 CIM) frente a 30 minutos sin CF-301 (FIGURA 20B). Para ambos antibióticos, el marcaje se observó por primera vez en los planos de división bacteriana.
EJEMPLO 7
La daptomicina se une con avidez al tensioactivo pulmonar y, por lo tanto, no es eficaz en el tratamiento de neumonía estafilocócica. En vista de la eficacia de PlySs2 y daptomicina en combinación contra bacterias susceptibles, como se ha mostrado anteriormente, la lisina PlySs2 y daptomicina se evaluaron solas y en combinación en presencia de un tensioactivo disponible en el mercado, para imitar el tensioactivo pulmonar.
En estos estudios, se usaron la cepa de SARM MW2 y la cepa de SASM ATCC 29213. La daptomicina y la lisina PlySs2 se evaluaron en primer lugar solas en presencia de tensioactivo (Survanta, Abbott Laboratories). Las CIM de daptomicina y PlySs2 para cada cepa se determinaron en presencia de Survanta usando métodos de microdilución en caldo de cultivo. Se establecieron series de dilución doble en presencia y ausencia de tensioactivo a concentraciones que variaron desde 0% hasta 15%. Las CIM se puntuaron a simple vista a las 24 horas y se confirmaron mediante recuentos de UFC en todos los pocillos. Se informa de un estudio similar en Silverman et al., 2005 (JID, volumen 191, 2149-52) usando la cepa de SASM 581. Después se calculó el factor de cambio de CIM para daptomicina y CF301 a cada concentración de tensioactivo (en comparación con las CIM obtenidas en ausencia de tensioactivo). El factor de cambio de CIM a concentraciones de tensioactivo para cada cepa se representa en la FIGURA 21. En presencia de Survanta como tensioactivo, la CIM de daptomicina se inhibe hasta 256 veces. A una concentración de tensioactivo de 1,25%, la daptomicina se inhibe más de 20 veces. Por el contrario, la CIM de PlySs2 se inhibe 8 veces, de manera uniforme en un intervalo de 1,25 a 15 % de tensioactivo. Los efectos de las combinaciones de lisina PlySs2 y daptomicina se evaluaron en presencia de tensioactivo (Survanta) al 15 % en un estudio de combinación de CIM. La configuración experimental es similar a la descrita anteriormente para los estudios de combinación de CIM sin tensioactivo (véase ejemplo 3). Los resultados de la evaluación de sinergia en presencia de tensioactivo se muestran en la FIGURA 22. En resumen, las concentraciones de lisina PlySs2 más daptomicina mostradas en los pocillos de la izquierda se diluyeron dos veces a lo largo los doce pocillos de cada fila. Después se añadieron células de la cepa de SARM 269 (MW2) (5,5X105-1X106) a cada pocillo y se incubaron durante 24 horas antes de evaluar el crecimiento. Los pocillos sin sombrear indican inhibición del crecimiento. Los pocillos sombreados en amarillo (claro) indican las combinaciones de fármacos más diluidas que aún inhiben el crecimiento (es decir, la CIM). Los pocillos sombreados en rojo (oscuro) indican combinaciones de fármacos que permiten el crecimiento. La dosis sinérgica de PlySs2 es de 2 pg/ml o 1/8 de la CIM para la cepa probada. En este estudio, la daptomicina es eficaz a 0,25 pg/ml, que corresponde a 1/1024 CIM de la daptomicina. EJEMPLO 8
Combinación frente a terapia con un solo agente en modelos murinos de bacteriemia
Se realizaron estudios en animales para evaluar el efecto de PlySs2 en combinación con antibiótico contra infección por S. aureus in vivo en modelos murinos de bacteriemia. Se inyectó a ratones BALB/c IP inóculos de diferentes niveles de cepas de SARM y después se dosificó a los animales con fármaco, ya sea antibiótico, lisina PlySs2 o una combinación de antibiótico y PlySs2.
En un primer conjunto de estudios con inóculos en el entorno de 106 de bacterias, se inyectaron 35 pg de daptomicina por vía subcutánea (sc) a las 5 horas después de la infección bacteriana, en una sola dosis. Esta dosis es equivalente a una dosis de 1,75mg/kg de daptomicina para un ratón de 20 gramos, mientras que la dosis equivalente humana de daptomicina en ratones sería de 50 mg/kg. La dosificación de 1,75 mg/kg de daptomicina en ratones es equivalente a aproximadamente 3,5 % de la dosis equivalente humana. PlySs2 se inyectó IP tres veces al día (TID), con 15 pg de PlySs2 administrados a las 5 horas, 9 horas y 13 horas después de la infección bacteriana (15 pg es aproximadamente igual a una dosis de 0,8 mg/kg para un ratón de 20 gramos). Se supervisan los animales y se registra el porcentaje de supervivencia cada tres horas hasta 24 horas después de la infección. Se evaluó la supervivencia animal con dosis de SARM (cepa 269 o MW2) de 1,8 x 106, 1,1 x 106, 3,0 x 106 y 3,1 x 106 la bacteria y se proporciona un gráfico compilado de datos de supervivencia en la FIGURA 23 para esta cepa de SARM. Se realizaron estudios similares con otras cepas de S. aureus (cepas 220 y 833) con resultados comparables (FIGURAS 24-26). En todos los casos, la supervivencia animal se mejoró notablemente mediante la dosificación combinada con lisina PlySs2 y antibiótico daptomicina. Estos estudios proporcionan pruebas in vivo de la eficacia de la terapia combinada de lisina PlySs2 con antibiótico daptomicina en comparación con lisina PlySs2 o antibiótico daptomicina solos.
Estudios de inóculos de dosis alta
Se realizaron estudios adicionales en animales en un modelo de bacteriemia en ratones para evaluar la capacidad de PlySs2 para mejorar la eficacia de los antibióticos de tratamiento habitual in vivo. En el modelo de exposición baja (inóculo de hasta 7x106 UFC con dosificación a las 4 horas), la terapia con un solo agente administrada como una única dosis de 1,25 mg/kg de PlySs2 o 2 mg/kg de daptomicina dio como resultado una supervivencia del 13 % y del 23 % a las 72 horas, respectivamente (FIGURA 27A). Tras la combinación de PlySs2 con daptomicina, se observó una mejora significativa con una tasa de supervivencia a las 72 horas de 73% (P<0,0001). La combinación de PlySs2 con daptomicina fue, por lo tanto, superior a cada agente solo en condiciones de baja exposición.
Para probar cómo de robusta puede ser la terapia combinada de PlySs2, se aumentó el inóculo bacteriano hasta un punto donde las dosis simuladas en seres humanos de antibióticos de un solo agente fueron poco eficaces. En este modelo de alta exposición (inóculo de 109 UFC con dosificación a las 2 horas), dosis simuladas en seres humanos de daptomicina (50 mg/kg una vez al día)26 o vancomicina (110 mg/kg dos veces al día)27 como agentes individuales produjeron tasas de supervivencia a las 24 horas de 47 % y 20 %, respectivamente, y tasas de supervivencia a las 72 horas de 31 % y 3 %, respectivamente (FIGURA 27B y 27E). PlySs2 administrada como un agente único produjo de manera similar tasas de supervivencia de 56/60% y 18/3% a las 24 y 72 horas, respectivamente. Por el contrario, PlySs2 en combinación con daptomicina o vancomicina logró tasas de supervivencia a las 24 horas de 87 % y 93 % a las 24 horas y 82 % y 67 % a las 72 horas, respectivamente, lo que demuestra la superioridad de las terapias combinadas sobre los regímenes de un solo agente en estas condiciones de infección difíciles. Se realizaron experimentos adicionales de combinación de PlySs2/daptomicina con dos cepas adicionales de SARM, produciendo resultados similares (FIGURA 27C y 27D). Cuando PlySs2 se probó adicionalmente en combinación con oxacilina usando una cepa de SASM como inóculo, el tratamiento combinado fue de nuevo superior al de los agentes individuales (FIGURA 27F). En conjunto, los resultados demuestran que las combinaciones de PlySs2/antibiótico son más eficaces que los regímenes de un solo agente para tratar la bacteriemia y que se obtienen resultados estadísticamente significativos en diversos antibióticos de tratamiento habitual y en múltiples cepas de S. aureus (P<0,0001 en todos los casos).
La lisina PlySs2 demuestra cinética de destrucción rápida, sensible a dosis, in vivo
En un modelo de bacteriemia murina, PlySs2 presenta una clara respuesta a la dosis con mejora de la supervivencia sobre la observada para el control de inyección simulada con tan solo 0,25 mg/kg y protección significativa a la dosis de 5 mg/kg (datos no mostrados). Para evaluar la velocidad de la actividad bactericida de PlySs2 in vivo, las UFC de SARM se midieron en la sangre de ratones infectados antes y después de la administración de PlySs2. Tras la dosificación de 5,25 mg/kg de PlySs2 a las 2 horas después de la infección, se produjo una disminución 0,5-log-iü de UFC en 15 minutos y se observó una disminución logarítmica 2-log-iü en los primeros 60 minutos después del tratamiento, lo que demuestra la rápida actividad bactericida de PlySs2 en el torrente sanguíneo de animales infectados (datos no mostrados).
Modelo de bacteriemia murina.
Se obtuvieron ratonas BALB/c (cepa endogámica), de 5-7 semanas de edad, 16,0-19,5 g de peso corporal, de Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine y se utilizaron en todos los experimentos con ratones. Se generaron inóculos bacterianos en fase exponencial permitiendo que las células bacterianas crecieran hasta una densidad óptica de ~0,5 a 600 nm, se recogieron, se lavaron y se concentraron entre 1,5 x 107 y 2 x 109 UFC/ml. El sedimento bacteriano se suspendió en un volumen adecuado de mucina al 5 % (p/v) (Sigma n.° de lote SLBD5666V o SLBD5666V) para lograr el inóculo específico y se colocó en hielo húmedo. Se inyectaron quinientos pl (~7,5 x 106 -1 x 109 UFC) i.p. en ratones. Las dosis de fármaco del estudio se ajustaron en peso con el volumen inyectado entre 160-200 pl. Se evaluó la supervivencia posterior a la infección cada 3 o 6 horas durante las primeras 24 horas, después a las 48 y 72 horas. Los experimentos se repitieron 2-3 veces con cada grupo de tratamiento que contenía entre 10 y 20 ratones. Todas las manipulaciones experimentales usando el agente infeccioso se realizaron en una campana BSL-2. Los animales muertos se retiraron al observar la mortalidad.
EJEMPLO 9
Se realizaron experimentos de pase en serie con la cepa de SARM ATCC 700699 y la cepa de SASM ATCC 25923 para generar y evaluar la resistencia a la daptomicina y la lisina PlySs2. Estos estudios se realizaron para evaluar y determinar si la resistencia a la daptomicina se correlaciona con la resistencia o sensibilidad a la lisina, incluyendo en particular la resistencia o sensibilidad a la lisina PlySs2. En primer lugar, se generaron clones resistentes a la daptomicina (con valores crecientes de CIM), de manera gradual, a lo largo de 21 días de crecimiento in vitro. Después, la serie de clones resistentes a la daptomicina se evaluó con respecto a los valores de CIM de lisina, evaluando la CIM de lisina PlySs2. Los resultados se representan en la FIGURA 28. En los clones resistentes a la daptomicina, la CIM de daptomicina aumenta de 1 a 18 pg/ml. La CIM de lisina PlySs2 disminuye de 8 a entre 2 y 4 pg/ml. Estos estudios muestran que la resistencia a la daptomicina se correlaciona con sensibilidad a la lisina PlySs2. Estos son los primeros estudios que han evaluado la resistencia a la daptomicina y la sensibilidad a la lisina. Notablemente, en estas condiciones, la resistencia a la daptomicina confiere mayor respuesta a la lisina, lo que proporciona una mayor justificación para la administración y terapia combinada o en serie.
EJEMPLO 10
Se llevaron a cabo estudios de resistencia de pase en serie para evaluar la capacidad de PlySs2 para suprimir la aparición de resistencia a antibióticos cuando se usa en combinación con diversos antibióticos de tratamiento habitual usados para tratar infecciones por Staphylococcus aureus. Se describen métodos usados para realizar experimentos de pases en serie de agente único y combinación en Palmer et al. (Palmer et al. (2011) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 55: 3345-56) y Berti et al. (Berti et al. (2012) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 56: 5046-53), respectivamente. Los aumentos en los valores de CIM para el antibiótico se evaluaron por triplicado para una cepa de SARM Staphylococcus aureus (MW2) cultivada en presencia de antibiótico solo o en presencia de antibiótico más valores sub-CIM de PlySs2. La CIM para PlySs2 para la cepa MW2 es 32 pg/ml (sin DTT). Por tanto, se eligieron valores de sub-CIM de 4 pg/ml (correspondientes a 1/8 CIM) u 8 pg/ml (correspondientes a 1/4 CIM) como la concentración de PlySs2 para estos experimentos. Tanto la daptomicina como la vancomicina se probaron como antibióticos ilustrativos en este estudio.
Para los experimentos con daptomicina, se descubrió que en el transcurso del estudio de 30 días, la resistencia a la daptomicina aumentó significativamente para los tres cultivos solo con daptomicina (FIGURA 30). En estos cultivos, los valores de CIM de daptomicina aumentaron desde el valor inicial de 1 pg/ml, a los tres valores finales de 128, 128 y 64 pg/ml, un aumento de 64 a 128 veces. Para cultivos que se pasaron en presencia de cantidades sub-CIM de PlySs2 (4 pg/ml) más daptomicina, los valores de CIM de daptomicina al final del experimento de 30 pases en serie fueron significativamente menores: 4, 4 y 4 pg/ml (un aumento de 4 veces). Por lo tanto, las concentraciones sub-CIM de PlySs2 suprimieron la capacidad de la cepa de SARM de aumentar la resistencia a la daptomicina entre 8 y 16 veces en relación con las condiciones solo con daptomicina. La resistencia a la daptomicina aumentó solo aproximadamente 4 veces en presencia de lisina PlySs2.
Para los experimentos de vancomicina, se descubrió que en el transcurso del estudio de 25 días, la resistencia a la vancomicina aumentó significativamente para los tres cultivos solo con vancomicina. En estos cultivos, los valores de CIM de vancomicina aumentaron desde el valor inicial de 1 pg/ml, a los tres valores finales de 16, 16 y 16 pg/ml (un aumento de 16 veces). Para cultivos que se pasaron en presencia de cantidades sub-CIM de PlySs2 (8 pg/ml) más vancomicina, los valores de CIM de vancomicina al final del experimento de pases en serie de 25 días fueron significativamente menores: 4, 4 y 2 pg/ml (un aumento de 2 a 4 veces). Por lo tanto, las concentraciones sub-CIM de PlySs2 suprimieron la capacidad de la cepa de SARM de aumentar la resistencia a la vancomicina entre 4 y 8 veces en relación con las condiciones solo con vancomicina. La resistencia a la daptomicina aumentó solo aproximadamente 4 veces en presencia de lisina PlySs2.
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Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Una lisina PlySs2 en combinación con uno o más antibióticos seleccionados de daptomicina y linezolid para su uso en la destrucción de bacterias grampositivas en un método terapéutico para la prevención, interrupción o tratamiento de infección o colonización por bacterias grampositivas, en donde la combinación de lisina PlySs2 y antibiótico es sinérgica y es eficaz para destruir bacterias grampositivas a dosis menores o con concentración inhibidora mínima (CIM) menor que lisina PlySs2 o antibiótico solos.
2. Una lisina PlySs2 en combinación con uno o más antibióticos para su uso según la reivindicación 1 en donde el antibiótico es daptomicina y en donde se potencia la actividad antibiótica contra bacterias grampositivas en líquidos biológicos que tienen actividad de tipo tensioactivo y en donde el antibiótico es eficaz en combinación con lisina PlySs2 en dosis a las que el antibiótico es ineficaz en ausencia de lisina PlySs2.
3. Una lisina PlySs2 en combinación con uno o más antibióticos para su uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde las bacterias grampositivas son bacterias grampositivas resistentes a antibióticos.
4. Una lisina PlySs2 en combinación con uno o más antibióticos para su uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde las bacterias grampositivas son bacterias S. pneumoniae.
5. Una lisina PlySs2 en combinación con uno o más antibióticos para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las bacterias grampositivas se seleccionan de bacterias Staphylococcus y Streptococcus.
6. Una lisina PlySs2 en combinación con uno o más antibióticos para su uso según la reivindicación 5, en donde las bacterias son bacterias Staphylococcus aureus.
7. Una lisina PlySs2 en combinación con uno o más antibióticos para su uso en la destrucción de bacterias grampositivas en un método terapéutico para la prevención, interrupción o tratamiento de infección o colonización por bacterias grampositivas en donde el antibiótico es un antibiótico grampositivo de amplio espectro y la lisina PlySs2 es capaz de destruir bacterias grampositivas, en donde el desarrollo de resistencia a antibióticos se reduce tras la administración de la lisina y el antibiótico y en donde uno o ambos del antibiótico y la lisina PlySs2 se administran a una dosis inferior a la dosis de concentración inhibidora mínima (CIM).
8. Una lisina PlySs2 en combinación con uno o más antibióticos para su uso según la reivindicación 7, en donde tanto el antibiótico como la lisina PlySs2 se administran a dosis inferiores a la dosis de concentración inhibidora mínima (CIM).
9. Una composición que comprende una lisina PlySs2 y un antibiótico para su uso en la destrucción de bacterias grampositivas en un método terapéutico para la prevención, interrupción o tratamiento de infección o colonización por bacterias grampositivas en donde el uso comprende la etapa de poner en contacto las bacterias con la composición y reduce la población de bacterias grampositivas, en donde la lisina PlySs2 es capaz de destruir bacterias grampositivas y en donde uno o ambos del antibiótico y la lisina PlySs2 están presentes en una cantidad inferior a la cantidad de concentración inhibidora mínima (CIM).
10. La composición para su uso según la reivindicación 9, en donde el antibiótico pertenece a una clase de antibióticos seleccionada de la lista que comprende penicilinas, glucopéptidos, oxazolidinonas y agentes antibacterianos lipopeptídicos.
11. La composición para su uso según la reivindicación 9, en donde el antibiótico es daptomicina, vancomicina, oxacilina o linezolid.
12. La lisina PlySs2 en combinación con uno o más antibióticos para su uso según la reivindicación 7 o la reivindicación 8 o la composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde las bacterias grampositivas se seleccionan de bacterias Staphylococcus y Streptococcus.
13. La lisina PlySs2 en combinación con uno o más antibióticos para su uso según la reivindicación 12 o la composición para su uso según la reivindicación 11, en donde las bacterias son bacterias Staphylococcus aureus.
14. La lisina PlySs2 en combinación con uno o más antibióticos para su uso según las reivindicaciones 1 a 8, 12 o 13 o la composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en donde el antibiótico es daptomicina.
15. Una lisina PlySs2 en combinación con uno o más antibióticos para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 12, 13 o 14 o la composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en donde la lisina PlySs2 comprende la secuencia de aminoácidos proporcionada en la SEQ ID NO: 1 o variantes de la misma que tienen al menos 80 % de identidad, 85 % de identidad, 90 % de identidad, 95 % de identidad o 99 % de identidad con el polipéptido de la SEQ ID NO: 1 y eficaz para destruir las bacterias grampositivas en presencia del antibiótico.
16. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, en donde tanto el antibiótico como la lisina PlySs2 están presentes en una cantidad inferior a la cantidad de concentración inhibidora mínima (CIM).
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