CN105567678B - 细菌噬菌体基因组dna提取试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种细菌噬菌体基因组DNA提取试剂盒及方法。试剂盒试剂包括：试剂A(氯仿)、试剂B(DNase I)、试剂C(RNase A)、试剂D(沉淀缓冲液)、试剂E(裂解缓冲液)、试剂F(主裂解主液)、试剂G(副裂解液)、试剂H(杂质去除液)、试剂I(DNA结合缓冲液)、试剂J(漂洗缓冲液)和试剂K(DNA洗脱液)；提取方法包括以下步骤：细菌菌体及其碎片去除、细菌核酸降解、噬菌体粒子沉淀、噬菌体衣壳蛋白结构破坏和水解、杂质去除、DNA离液、DNA吸附、吸附DNA清洗和吸附DNA洗脱。本发明的试剂盒和方法可以广泛使用于细菌噬菌体基因组DNA的提取，具有提取迅速、提取的DNA产量高、纯度高且不受宿主菌基因组DNA污染的优点。

Description

细菌噬菌体基因组DNA提取试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物核酸提取技术领域，具体涉及一种细菌噬菌体基因组DNA提取试剂盒以及使用该试剂盒提取细菌噬菌体基因组DNA的方法。
背景技术
噬菌体是一类以细菌为宿主的病毒。跟别的病毒一样，噬菌体只是一团由蛋白质外壳包裹的遗传物质，大部分噬菌体还长有“尾巴”，用来将遗传物质注入宿主体内。噬菌体是一种普遍存在的生物体，而且经常都伴随着细菌。通常在一些充满细菌群落的地方，如：河水、泥土、动物的内脏里，都可以找到噬菌体的踪影。噬菌体被认为是地球上含量最为丰富的生物种类。
噬菌体只含有DNA或RNA中的一种遗传物质，绝大部分的噬菌体的遗传物质是DNA。近二十年来，随着分子生物学技术的进步，噬菌体的研究变得越来越热门，主要原因在于几个方面：第一，细菌的耐药问题日趋严重使曾经被寄予希望的噬菌体治疗再次进入研究者的视野；第二，微生物基因组测序技术的发展使人们发现细菌基因组中广泛存在着噬菌体的痕迹，显示出噬菌体在细菌基因组进化中扮演着非常重要的角色；第三，一些严重威胁人类健康的致病株的致病性都与前噬菌体有关；第四，噬菌体在细菌分型、检测、噬菌体展示、细菌重组工程、发展新的遗传学操作工具领域都有广泛的应用。
提取噬菌体基因组DNA是进行基于分子技术研究噬菌体的基础；此外在日益增加的噬菌体基因组测序要求中，最关键的一步也要求提取高质量、具有一定浓度并且不受宿主核酸污染基因组DNA，目前还没有可广泛使用的细菌噬菌体基因组DNA提取方法及试剂盒，但是微生物领域却存在对细菌噬菌体基因组DNA提取方法及试剂盒的强烈需求，通用的细菌噬菌体基因组DNA提取方法及试剂盒的出现必将大大减少技术人员的操作时间，加快相关领域的研究进程。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以广泛使用的细菌噬菌体基因组DNA提取试剂盒及方法，从而填补没有可广泛使用的噬菌体基因组DNA提取试剂盒及方法的技术空白。
本发明的细菌噬菌体基因组DNA提取试剂盒，包括以下试剂：
(1)试剂A：氯仿；
(2)试剂B：用TE缓冲液配制的10-20mg/ml的DNase I，-20℃保存；
(3)试剂C：用TE缓冲液配制的10-20mg/ml的RNase A，-20℃保存；
(4)试剂D：为沉淀缓冲液，含300-400mg/ml的聚乙二醇-8000(PEG-8000)和3MNaCl，无菌水配制，室温保存；
(5)试剂E：为裂解缓冲液，每升含有5.8g NaCl、1.23g MgSO4·7H2O、50ml的1MpH8.0的Tris-Cl(1M Tris，pH调整8.0)和100ml 0.05mol EDTA，水为溶剂，高压灭菌20min；
(6)试剂F：为主裂解液，150-200mg/ml的十二烷基苯磺酸钠(SDS)，水为溶剂；
(7)试剂G：为副裂解液，用TE缓冲液配制的15-25mg/ml的蛋白酶K，4℃保存；
(8)试剂H：为杂质去除液，5-6M NaCl，溶剂为水；
(9)试剂I：为DNA结合缓冲液，含6-7M异硫氰酸胍(GuSCN)和100mM Tris，pH 6.4；，溶剂为水；
(10)试剂J：为漂洗缓冲液，由5-10mM pH 8.0的Tris-Cl与无水乙醇按1:4的体积比混合而成；
(11)试剂K：为DNA洗脱液，5-10mM pH 8.0的Tris-Cl；
所述的TE缓冲液含有10mM三羟基甲基氨基四烷(Tris)和1mM乙二酸四乙酸(EDTA)，pH 8.0。
本发明的主要原理为：噬菌体裂解细菌后，释放到培养基中，以少量的试剂A(氯仿)杀死残存的细菌，并且可以促进培养基中脂质物质的分离；高速离心后，细菌细胞及细胞碎片沉淀，而噬菌体以及细菌自身的DNA和RNA仍然保留在培养液上清中；加入足量的试剂B(DNase I)和试剂C(RNase A)后，细菌自身的DNA和RNA受到降解破坏；试剂D中的NaCl、PEG-8000具有强烈的夺水能力，在高盐、高PEG-8000以及低温环境下，噬菌体粒子因夺水能力弱而逐渐沉降下来，再次离心去掉上清，沉淀的即为噬菌体粒子；噬菌体粒子的主要成分为蛋白和核酸，在试剂F(SDS)的作用下，噬菌体粒子的结构被破坏，在SDS以及试剂G(含蛋白酶K)的共同作用下，衣壳蛋白溶解，内部的基因组DNA释放出来；加入试剂H则提供了高浓度的NaCl环境，有利于残存的各种杂质沉淀。试剂I的主要成分为GuSCN，为一种高离液剂，试剂I提供一种高离液、低pH的环境，在这种环境下DNA可以与硅胶膜发特异性吸附，而杂质不能吸附，通过离心可以去除；在低浓度的缓冲液(如试剂I)或水中DNA又从硅胶膜释放，从而达到分离纯化目的。
因此，本发明还提供了细菌噬菌体基因组DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
接种噬菌体裂解细菌后得到细菌的噬菌体裂解物，然后加入氯仿杀死残存的细菌和促进脂质物质的分离，再离心使细菌细胞和细胞碎片沉淀，取上清，在上清中加入DNaseI和RNase A，降解细菌本身的DNA和RNA，然后再加入含有聚乙二醇-800和NaCl的溶液，使噬菌体沉降，然后再离心去除上清，沉淀即为噬菌体粒子，然后再提取噬菌体的基因组DNA。
优选，具体方法如下：
(1)细菌菌体及其碎片去除：细菌过夜培养后，按体积分数2％接种于LB新鲜培养基，加入体积分数2％的噬菌体液，37℃振荡培养4-6小时，即获得细菌的噬菌体裂解物；取细菌的噬菌体裂解物10-20ml，加入试剂A使其终浓度为体积分数1％，4℃10000g离心10min；
(2)细菌核酸降解：小心取上清，用0.45μm滤膜过滤，取滤液向其中加入10-20μL试剂B及10-20μL试剂C，混匀，37℃温育30min；
(3)细菌噬菌体粒子沉淀：加入5-10ml试剂D，轻柔上下混合，冰上放置60min以上或4℃过夜放置；10000g，4℃离心10min，小心弃去上清，得细菌噬菌体粒子沉淀；
(4)细菌噬菌体衣壳蛋白结构破坏和水解：向细菌噬菌体粒子沉淀中依次加入250-500μL试剂E、50-100μL试剂F和1.5-3μL试剂G，50℃温育30min；
(5)杂质去除：加入100-200μL试剂H，轻柔混匀4-6次，12000g离心10min，取上清；
(6)DNA离液：加入步骤(5)所取上清二分之一体积的试剂I，上下轻轻颠倒混匀6-8次得混合液；
(7)DNA吸附：将DNA吸附柱放置在离心管中，将上述步骤(6)中的混合液移入DNA吸附柱，12000g离心1min，弃去过滤液；
(8)吸附DNA清洗：向DNA吸附柱中加入600-700μL试剂J，12000g离心1min，弃去过滤液；再次加入600-700μL试剂J，12000g离心1min，弃去过滤液，将DNA吸附柱室温放置2-5min；
(9)吸附DNA洗脱：将DNA吸附柱转移到一支新的离心管中，加入50-100μL试剂K于DNA吸附柱的膜中央，室温放置1-2min；12000g离心1min，取洗脱液即得到细菌噬菌体基因组DNA。
优选，所述的细菌噬菌体为溶藻弧菌噬菌体ФPE333、大肠杆菌噬菌体ФP1655或阴沟肠杆菌噬菌体ФPZJ02。
优选，所述的DNA吸附柱购自宁波重鼎生物技术有限公司。
本发明的优点及积极效果：(1)提取迅速，最快可以在2个小时内完成提取；(2)提取产量高，纯度高，提取基因组的DNA浓度达到100ng/μL以上，一次提取可满足PCR、基因组测序等分子实验需求；(3)提取产物不受宿主菌基因组DNA污染，因而根除了宿主基因组DNA的干扰。
附图说明
图1是实施例1-3中提取的三种噬菌体基因组DNA电泳图。图中：M，分子量Markerλ-Hind III digest；1，溶藻弧菌噬菌体ФPE333；2，大肠杆菌噬菌体ФP1655；3，阴沟肠杆菌噬菌体ФPZJ02。
图2是对提取的噬菌体基因组DNA是否有宿主基因组DNA污染的PCR检测。图中：M，分子量Marker DL2000；1，溶藻弧菌基因组DNA阳性对照；2，噬菌体ФPE333基因组DNA；3，大肠杆菌基因组DNA阳性对照；4，噬菌体ФP1655基因组DNA；5，阴沟肠杆菌基因组DNA阳性对照；6，噬菌体ФPZJ02基因组DNA；采用的靶基因为宿主菌保守看家基因gyrB，采用的扩增引物为gyrB扩增通用引物对gyrB-UF/gyrB-UR。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下列实施例中未注明的具体实验条件和方法均为采用本领域技术人员所熟知的常规手段。
以下实施例中所采用的DNA吸附柱购自宁波重鼎生物技术有限公司。
实施例1：提取溶藻弧菌噬菌体ФPE333基因组DNA
按以下配方配制试剂：
(1)试剂A：氯仿；
(2)试剂B：用TE缓冲液配制的20mg/ml的DNase I，-20℃保存；
(3)试剂C：用TE缓冲液配制的20mg/ml的RNase A，-20℃保存；
(4)试剂D：为沉淀缓冲液，含400mg/ml的聚乙二醇-8000(PEG-8000)和3M NaCl，室温保存；
(5)试剂E：为裂解缓冲液，称取5.8g NaCl、1.23g MgSO4·7H2O，配制50ml的1MTris-Cl(1M Tris，pH调整8.0)、100ml的0.5M EDTA，将上述各组分混合后加ddH2O至1000ml，高压灭菌20min；
(6)试剂F：为主裂解液，200mg/ml的十二烷基苯磺酸钠(SDS)；
(7)试剂G：为副裂解液，用TE缓冲液配制的25mg/ml的蛋白酶K，4℃保存；
(8)试剂H：为杂质去除液，6M NaCl；
(9)试剂I：为DNA结合缓冲液，含7M异硫氰酸胍(GuSCN)和100mM Tris，pH 6.4；
(10)试剂J：为漂洗缓冲液，由10mM pH 8.0的Tris-Cl与无水乙醇按1:4的体积比混合而成；
(11)试剂K：为DNA洗脱液，10mM pH 8.0的Tris-Cl；
所述的TE缓冲液含有10mM三羟基甲基氨基四烷(Tris)和1mM乙二酸四乙酸(EDTA)，pH 8.0。
噬菌体ФPE333基因组DNA提取按以下程序进行操作：
(1)溶藻弧菌菌体及其碎片去除：溶藻弧菌过夜培养后，按2％(V/V)接种于LB新鲜培养基，加入2％(V/V)噬菌体ФPE333液，37℃振荡培养5小时，即获得溶藻弧菌的噬菌体ФPE333裂解物。取溶藻弧菌的噬菌体ФPE333裂解物20ml，加入试剂A使其终浓度为体积分数1％，4℃10000g离心10min；
(2)溶藻弧菌核酸降解：小心取上清，用0.45μm滤膜过滤，取滤液向其中加入20μL试剂B及20μL试剂C，混匀，37℃温育30min；
(3)噬菌体ФPE333粒子沉淀：加入10ml试剂D，轻柔上下混合，冰上放置60min；10000g，4℃离心10min，小心弃去上清，得噬菌体ФPE333粒子沉淀；
(4)噬菌体ФPE333衣壳蛋白结构破坏和水解：向噬菌体ФPE333粒子沉淀中依次加入500μL试剂E、100μL试剂F和3μL试剂G，50℃温育30min；
(5)杂质去除：加入200μL试剂H，轻柔混匀6次，12000g离心10min，取上清；
(6)DNA离液：加入步骤(5)所取上清二分之一体积的试剂I，上下轻轻颠倒混匀8次得混合液；
(7)DNA吸附：将DNA吸附柱放置在离心管中，将上述步骤(6)中的混合液的一半移入DNA吸附柱，12000g离心1min，弃去过滤液；在DNA吸附柱中加入剩余的步骤(6)中的混合液，12000g离心1min，弃去过滤液；
(8)吸附DNA清洗：向DNA吸附柱中加入700μL试剂J，12000g离心1min，弃去过滤液；再次加入700μL试剂J，12000g离心1min，弃去过滤液，将DNA吸附柱放置在干净的操作台上，室温放置5min；
(9)吸附DNA洗脱：将DNA吸附柱转移到一支新的离心管中，加入100μL试剂K于DNA吸附柱的膜中央，室温放置1min；12000g离心1min，取洗脱液即得到噬菌体ФPE333基因组DNA。
实施例2：提取大肠杆菌噬菌体ФP1655基因组DNA
按以下配方配制试剂：
(1)试剂A：氯仿；
(2)试剂B：用TE缓冲液配制的10mg/ml的DNase I，-20℃保存；
(3)试剂C：用TE缓冲液配制的10mg/ml的RNase A，-20℃保存；
(4)试剂D：为沉淀缓冲液，含300mg/ml的聚乙二醇-8000(PEG-8000)和3M NaCl，室温保存；
(5)试剂E：为裂解缓冲液，称取5.8g NaCl、1.23g MgSO4·7H2O，配制50ml的1MTris-Cl(1M Tris，pH调整8.0)、100ml的0.5M EDTA，将上述各组分混合后加ddH2O至1000ml，高压灭菌20min；
(6)试剂F：为主裂解液，150mg/ml的十二烷基苯磺酸钠(SDS)；
(7)试剂G：为副裂解液，用TE缓冲液配制的15mg/ml的蛋白酶K，4℃保存；
(8)试剂H：为杂质去除液，5M NaCl；
(9)试剂I：为DNA结合缓冲液，含6M异硫氰酸胍(GuSCN)和100mM Tris，pH 6.4；
(10)试剂J：为漂洗缓冲液，由5mM pH 8.0的Tris-Cl与无水乙醇按1:4的体积比混合而成；
(11)试剂K：为DNA洗脱液，5mM pH 8.0的Tris-Cl；
所述的TE缓冲液含有10mM三羟基甲基氨基四烷(Tris)和1mM乙二酸四乙酸(EDTA)，pH 8.0。
噬菌体ФP1655基因组DNA提取按以下程序进行操作：
(1)大肠杆菌菌体及其碎片去除：大肠杆菌过夜培养后，按2％(V/V)接种于LB新鲜培养基，加入2％(V/V)噬菌体ФP1655液，37℃振荡培养4小时，即获得大肠杆菌的噬菌体ФP1655裂解物。取大肠杆菌的噬菌体ФP1655裂解物10ml，加入试剂A使其终浓度为体积分数1％，4℃10000g离心10min；
(2)大肠杆菌核酸降解：小心取上清，用0.45μm滤膜过滤，取滤液向其中加入10μL试剂B及10μL试剂C，混匀，37℃温育30min；
(3)噬菌体ФP1655粒子沉淀：加入8ml试剂D，轻柔上下混合，冰上放置60min；10000g，4℃离心10min，小心弃去上清，得噬菌体ФP1655粒子沉淀；
(4)噬菌体ФP1655衣壳蛋白结构破坏和水解：向噬菌体ФP1655粒子沉淀中依次加入250μL试剂E、100μL试剂F和3μL试剂G，50℃温育30min；
(5)杂质去除：加入100μL试剂H，轻柔混匀4次，12000g离心10min，取上清；
(6)DNA离液：加入步骤(5)所取上清二分之一体积的试剂I，上下轻轻颠倒混匀6次得混合液；
(7)DNA吸附：将DNA吸附柱放置在离心管中，将上述步骤(6)中的混合液的一半移入DNA吸附柱，12000g离心1min，弃去过滤液；在DNA吸附柱中加入剩余的步骤(6)中的混合液，12000g离心1min，弃去过滤液；
(8)吸附DNA清洗：向DNA吸附柱中加入600μL试剂J，12000g离心1min，弃去过滤液；再次加入700μL试剂J，12000g离心1min，弃去过滤液，将DNA吸附柱放置在干净的操作台上，室温放置2min；
(9)吸附DNA洗脱：将DNA吸附柱转移到一支新的离心管中，加入50μL试剂K于DNA吸附柱的膜中央，室温放置2min；12000g离心1min，取洗脱液即得到噬菌体ФP1655基因组DNA。
实施例3：提取阴沟肠杆菌噬菌体ФPZJ02基因组DNA
按以下配方配制试剂：
(1)试剂A：氯仿；
(2)试剂B：用TE缓冲液配制的15mg/ml的DNase I，-20℃保存；
(3)试剂C：用TE缓冲液配制的15mg/ml的RNase A，-20℃保存；
(4)试剂D：为沉淀缓冲液，含330mg/ml的聚乙二醇-8000(PEG-8000)和3M NaCl，室温保存；
(5)试剂E：为裂解缓冲液，称取5.8g NaCl、1.23g MgSO4·7H2O，配制50ml的1MTris-Cl(1M Tris，pH调整8.0)、100ml的0.5M EDTA，将上述各组分混合后加ddH2O至1000ml，高压灭菌20min；
(6)试剂F：为主裂解液，180mg/ml的十二烷基苯磺酸钠(SDS)；
(7)试剂G：为副裂解液，用TE缓冲液配制的20mg/ml的蛋白酶K，4℃保存；
(8)试剂H：为杂质去除液，5.5M NaCl；
(9)试剂I：为DNA结合缓冲液，含6.5M异硫氰酸胍(GuSCN)和100mM Tris，pH 6.4；
(10)试剂J：为漂洗缓冲液，由8mM pH 8.0的Tris-Cl与无水乙醇按1:4的体积比混合而成；
(11)试剂K：为DNA洗脱液，8mM pH 8.0的Tris-Cl；
所述的TE缓冲液含有10mM三羟基甲基氨基四烷(Tris)和1mM乙二酸四乙酸(EDTA)，pH 8.0。
噬菌体ФPZJ02基因组DNA提取按以下程序进行操作：
(1)阴沟肠杆菌菌体及其碎片去除：阴沟肠杆菌过夜培养后，按2％(V/V)接种于LB新鲜培养基，加入2％(V/V)噬菌体ФPZJ02液，37℃振荡培养6小时，即获得阴沟肠杆菌的噬菌体ФPZJ02裂解物。取阴沟肠杆菌的噬菌体ФPZJ02裂解物15ml，加入试剂A使其终浓度为体积分数1％，4℃10000g离心10min；
(2)阴沟肠杆菌核酸降解：小心取上清，用0.45μm滤膜过滤，取滤液向其中加入15μL试剂B及15μL试剂C，混匀，37℃温育30min；
(3)噬菌体ФPZJ02粒子沉淀：加入8ml试剂D，轻柔上下混合，冰上放置60min；10000g，4℃离心10min，小心弃去上清，得噬菌体ФPZJ02粒子沉淀；
(4)噬菌体ФPZJ02衣壳蛋白结构破坏和水解：向噬菌体ФPZJ02粒子沉淀中依次加入380μL试剂E、75μL试剂F和1.5μL试剂G，50℃温育30min；
(5)杂质去除：加入150μL试剂H，轻柔混匀5次，12000g离心10min，取上清；
(6)DNA离液：加入步骤(5)所取上清二分之一体积的试剂I，上下轻轻颠倒混匀8次得混合液；
(7)DNA吸附：将DNA吸附柱放置在离心管中，将上述步骤(6)中的混合液的一半移入DNA吸附柱，12000g离心1min，弃去过滤液；在DNA吸附柱中加入剩余的步骤(6)中的混合液，12000g离心1min，弃去过滤液；
(8)吸附DNA清洗：向DNA吸附柱中加入650μL试剂J，12000g离心1min，弃去过滤液；再次加入700μL试剂J，12000g离心1min，弃去过滤液，将DNA吸附柱放置在干净的操作台上，室温放置3min；
(9)吸附DNA洗脱：将DNA吸附柱转移到一支新的离心管中，加入80μL试剂K于DNA吸附柱的膜中央，室温放置2min；12000g离心1min，取洗脱液即得到噬菌体ФPZJ02基因组DNA。
实施例4：提取噬菌体基因组DNA质量检测
(1)提取DNA浓度及纯度检测
分别测定上述提取噬菌体DNA的浓度，以及OD260/280，测量仪器为NanoDrop 2000(Thermo)，样品上样量1μL。结果为：提取噬菌体ФPE333基因组DNA的浓度为128ng/μL，OD260/280＝1.85；提取噬菌体ФP1655基因组DNA的浓度为105ng/μL，OD260/280＝1.86；提取噬菌体ФPZJ02基因组DNA的浓度为233ng/μL，OD260/280＝1.80。结果表明，三种噬菌体基因组DNA提取的浓度都达到100ng/μL以上，DNA纯度高，可以满足下游实验需求。
对提取的基因组DNA也进行了电泳检测，电泳图见图1。由图可见，三种噬菌体基因组DNA的片段集中在15Kb左右的位置，没有明显的RNA污染，表明提取成功。
(2)提取噬菌体基因组是否受宿主基因组污染检测
本发明所采取的措施确保了提取的噬菌体基因组不受到宿主基因组的污染，为了证明这一点，采用了高灵敏度的PCR方法来检测提取样品中是否有宿主的基因存在，检测的基因为细菌中保守的看家基因gyrB，采用的引物序列为文献报道(Yamamoto S,Harayama S[1995]PCR amplification and direct sequencing ofgyrBgenes with universalprimers and their application to the detection and taxonomic analysis ofPseudomonas putida strains.Appl Environ Microbiol,61:1104-1109)的引物序列，引物序列如下：
gyrB-UF：GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA(划线部分为人工添加的5’端接头，方便测序)；
gyrB-UR：AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT(划线部分为人工添加的5’端接头，方便测序)。
PCR扩增程序：94℃4min；94℃20sec，58℃30sec，72℃90sec，30个循环；72℃7min。
PCR扩增结果检测见图2。由图可见，当采用提取的噬菌体基因组DNA作为模板时，采用引物对gyrB-UF/gyrB-UR均不能产生预期大小的条带，而对应的细菌基因组DNA阳性对照出现预期大小的条带。表明提取样品中不存在污染的宿主基因组DNA分子。

Claims (2)

1.一种细菌噬菌体基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：
(1)试剂A：氯仿；
(2)试剂B：用TE缓冲液配制的10-20mg/ml的DNase I；
(3)试剂C：用TE缓冲液配制的10-20mg/ml的RNase A；
(4)试剂D：含300-400mg/ml的聚乙二醇-8000和3M NaCl；
(5)试剂E：每升含有5.8g NaCl、1.23g MgSO4·7H2O、50ml的1M pH8.0的Tris-Cl和100ml 0.05mol EDTA；
(6)试剂F：150-200mg/ml的十二烷基苯磺酸钠；
(7)试剂G：用TE缓冲液配制的15-25mg/ml的蛋白酶K；
(8)试剂H：5-6M NaCl；
(9)试剂I：含6-7M异硫氰酸胍和100mM Tris，pH 6.4；
(10)试剂J：由5-10mM pH 8.0的Tris-Cl与无水乙醇按1:4的体积比混合而成；
(11)试剂K：5-10mM pH 8.0的Tris-Cl；
所述的TE缓冲液含有10mM三羟基甲基氨基四烷和1mM乙二酸四乙酸，pH 8.0；
所述的细菌噬菌体为溶藻弧菌噬菌体ФPE333、大肠杆菌噬菌体ФP1655或阴沟肠杆菌噬菌体ФPZJ02。
2.一种细菌噬菌体基因组DNA的提取方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)细菌菌体及其碎片去除：细菌过夜培养后，按体积分数2％接种于LB新鲜培养基，加入体积分数2％的噬菌体液，37℃振荡培养4-6小时，即获得细菌的噬菌体裂解物；取细菌的噬菌体裂解物10-20ml，加入试剂A使其终浓度为体积分数1％，4℃10000g离心10min；
(2)细菌核酸降解：小心取上清，用0.45μm滤膜过滤，取滤液向其中加入10-20μL试剂B及10-20μL试剂C，混匀，37℃温育30min；
(3)细菌噬菌体粒子沉淀：加入5-10ml试剂D，轻柔上下混合，冰上放置60min以上或4℃过夜放置；10000g，4℃离心10min，小心弃去上清，得细菌噬菌体粒子沉淀；
(4)细菌噬菌体衣壳蛋白结构破坏和水解：向细菌噬菌体粒子沉淀中依次加入250-500μL试剂E、50-100μL试剂F和1.5-3μL试剂G，50℃温育30min；
(5)杂质去除：加入100-200μL试剂H，轻柔混匀4-6次，12000g离心10min，取上清；
(6)DNA离液：加入步骤(5)所取上清二分之一体积的试剂I，上下轻轻颠倒混匀6-8次得混合液；
(7)DNA吸附：将DNA吸附柱放置在离心管中，将上述步骤(6)中的混合液移入DNA吸附柱，12000g离心1min，弃去过滤液；
(8)吸附DNA清洗：向DNA吸附柱中加入600-700μL试剂J，12000g离心1min，弃去过滤液；再次加入600-700μL试剂J，12000g离心1min，弃去过滤液，将DNA吸附柱室温放置2-5min；
(9)吸附DNA洗脱：将DNA吸附柱转移到一支新的离心管中，加入50-100μL试剂K于DNA吸附柱的膜中央，室温放置1-2min；12000g离心1min，取洗脱液即得到细菌噬菌体基因组DNA；所述的细菌噬菌体为溶藻弧菌噬菌体ФPE333、大肠杆菌噬菌体ФP1655或阴沟肠杆菌噬菌体ФPZJ02；
所述的试剂如下：
(1)试剂A：氯仿；
(2)试剂B：用TE缓冲液配制的10-20mg/ml的DNase I；
(3)试剂C：用TE缓冲液配制的10-20mg/ml的RNase A；
(4)试剂D：含300-400mg/ml的聚乙二醇-8000和3M NaCl；
(5)试剂E：每升含有5.8g NaCl、1.23g MgSO4·7H2O、50ml的1M pH8.0的Tris-Cl和100ml 0.05mol EDTA；
(6)试剂F：150-200mg/ml的十二烷基苯磺酸钠；
(7)试剂G：用TE缓冲液配制的15-25mg/ml的蛋白酶K；
(8)试剂H：5-6M NaCl；
(9)试剂I：含6-7M异硫氰酸胍和100mM Tris，pH 6.4；
(10)试剂J：由5-10mM pH 8.0的Tris-Cl与无水乙醇按1:4的体积比混合而成；
(11)试剂K：5-10mM pH 8.0的Tris-Cl；
所述的TE缓冲液含有10mM三羟基甲基氨基四烷和1mM乙二酸四乙酸，pH 8.0。
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CN108410858A (zh) * 2018-04-27 2018-08-17 四川大学 一种粪污噬菌体dna的提取方法、提取粪污噬菌体dna的试剂盒及该试剂盒的应用
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101089184A (zh) * 2006-06-12 2007-12-19 国家海洋局第三海洋研究所 高温双链dna噬菌体gbsv1的全基因组序列
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101089184A (zh) * 2006-06-12 2007-12-19 国家海洋局第三海洋研究所 高温双链dna噬菌体gbsv1的全基因组序列
CN102277449A (zh) * 2011-07-19 2011-12-14 辽宁大学 一种钝齿棒杆菌噬菌体分型鉴定方法

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