CN104630203A - 制备昆虫肠道菌群dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了制备昆虫肠道菌群DNA的方法，该方法包括：从肠道内含物中制备得到含有肠道菌群的沉淀；利用裂解剂对含有肠道菌群的沉淀进行裂解，获得含有核酸的裂解液；利用蛋白酶对含有核酸的裂解液进行处理后离心，以便获得含有DNA的第一上清液；进一步对第一上清液进行提纯，以便获得昆虫肠道菌群DNA。利用该方法能够有效地获得含量高、纯度高的昆虫肠道菌群DNA。

Description

制备昆虫肠道菌群DNA的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体而言，本发明涉及制备昆虫肠道菌群DNA的方法 

背景技术

宏基因组（metagenome），即微生物环境基因组（Microbial Environmental Genome）或称为元基因组。是由Handelsman等1998年提出的新名词，其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature”，即生境中全部微生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因,目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学（或元基因组学，metagenomics）就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组DNA，进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。肠道宏基因组（肠道metagenome），即肠道中全部微生物遗传物质的总和。肠道宏基因组计划的启动，使肠道菌群的研究迎来了一个新的浪潮。 

应用传统分子生物学方法和宏基因组测序研究昆虫肠道菌群的前提是获取微生物群落基因组总DNA，因此有效提取群落中各种类型微生物的DNA，是客观反映群落微生物多样性的基础。此外，宏基因组测序还存在一个亟待解决的关键性问题，即宿主DNA的污染。肠道菌群的宏基因组研究，通常由于取样难度高或者取样方法、提取方法不当，会在肠道菌群Meta DNA的提取过程中混入大量的宿主DNA，致使测序结果掺入大量无用的干扰数据，极大地增加后续信息分析的处理难度，这对于深入了解肠道菌群及其与昆虫的关系是极为不利的。 

因此，对于肠道菌群的宏基因组DNA的制备方法仍有待进一步改进。 

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效地制备得到含量高、纯度高的昆虫肠道菌群DNA的方法。 

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种制备昆虫肠道菌群DNA的方法，该方法包括：将昆虫肠道的至少一部分浸入生理盐水中，通过震荡处理，使所述肠道的内含物与所述肠道分离；去除所述肠道，以便获得含有肠道内含物的盐水溶液；将所述含有肠道内含物的盐水溶液进行离心，并收集含有肠道菌群的沉淀；利用裂解剂对所述含有肠道菌群的沉淀进行裂解，以便获得含有核酸的裂解液；利用蛋白酶对所述含有核酸的裂解液进行处理后离心，以便获得含有DNA的第一上清液；将所述含有DNA的第一上清液与第一有机溶剂混合，并进行离心，以便获得含有DNA的第二上清液，其中，所述第一有机溶剂包含酚、氯仿和异戊醇，并且酚、氯仿和异戊醇的体积比例为25:24:1；将所述含有DNA的第二上清液与第二有机溶剂混合，并进行离心，以便获得含有DNA的第三上清液，其中，所述第二有机溶剂包含氯仿和异戊醇，并且氯仿和异戊醇的体积比例为24:1；将所述含有DNA的第三上清液与醇类有机溶剂混合，离心后除去上清液，以便获得所述昆虫肠道菌群DNA。由此，利用上述方法可以有效地制备得到昆虫肠道菌群DNA。 

提取昆虫幼虫肠道菌群DNA的普遍方法，是在分离出肠道后，直接解剖肠道取出肠道内容物，在此操作中很容易携带大量的宿主组织，导致肠道菌群DNA中混有大量的宿主DNA，不利于获取较纯的肠道菌群DNA。根据本发明的实施例，分离出完整的肠道，再单独对肠道进行处理获得其内容物，该方法操作简便，能够获得较高浓度的宏基因组DNA，同时能够保证肠道菌群宏基因组DNA的纯度，将宿主DNA的污染降低到最小，对后续肠道菌群的宏基因组测序研究、基因挖掘等具有重要意义。 

另外，根据本发明上述实施例的制备昆虫肠道菌群DNA的方法还可以具有如下附加的技术特征： 

根据本发明的实施例，所述昆虫为选自等翅目、鳞翅目、同翅目、直翅目、蜚蠊目、膜翅目、半翅目和鞘翅目昆虫的至少一种。由此可以进一步提高对更多种类昆虫的研究。 

根据本发明的实施例，所述昆虫为黄粉虫幼虫。由于黄粉虫的体内含有较多的蛋白质、氨基酸、脂肪、微量元素和维生素等多种化学物质，以黄粉虫为原料制成的保健品具有抗病、防病的功能。因此，根据本发明的实施例，以黄粉虫幼虫为例，提供一种高效地、专门用于昆虫幼虫（即无翅类昆虫除外）肠道菌群的DNA提取方法。该方法为开展肠道微生物结构及功能的研究、以及进一步探讨肠道微生物与昆虫的共生关系奠定基础。 

根据本发明的实施例，所述昆虫肠道是通过下列获得的：将所述昆虫浸入酒精中3～5分钟，以便麻醉所述昆虫；将所述昆虫浸入生理盐水中3～5分钟；去除所述昆虫表面的生理盐水；去除所述昆虫的头部和尾部；以及取出所述昆虫肠道的至少一部分。由此可以进一步提高制备昆虫肠道菌群DNA的效率以及纯度。 

根据本发明的实施例，将昆虫肠道的至少一部分浸入生理盐水中，通过在150～250rpm下震荡处理30～40分钟，使所述肠道的内含物与所述肠道分离。由此可以进一步提高分离得到肠道的内含物的效率，以及防止肠道的内含物被污染，以便进一步提高制备得到肠道菌群DNA的纯度。 

根据本发明的实施例，将所述含有肠道内含物的盐水溶液在10000～12000rpm下进行离心，并收集含有肠道菌群的沉淀。由此可以进一步提高分离得到含有肠道菌群的效率。 

根据本发明的实施例，所述裂解剂包含50mg/ml的溶菌酶、50mg/ml的纤维素酶和50mg/ml的蜗牛酶，并且所述裂解剂的体积是所述含有肠道菌群的沉淀的五十分之一。由此可以进一步提高制备得到肠道菌群DNA的效率以及纯度。 

根据本发明的实施例，利用蛋白酶对所述含有核酸的裂解液进行处理后离心，以便获得含有DNA的第一上清液进一步包括：将所述含有核酸的裂解液与1000微升TNES裂解液和10微升浓度为20mg/mL的蛋白酶K混合，并依次在55摄氏度下保温1～2小时以及在65摄氏度下保温40～60分钟。由此可以进一步提高制备得到肠道菌群DNA的效率以及纯度。 

根据本发明的实施例，所述含有DNA的第一上清液与所述第一有机溶剂的体积相同，并且所述含有DNA的第二上清液与第二有机溶剂的体积相同。由此可以进一步提高制备得到肠道菌群DNA的效率以及纯度。 

根据本发明的实施例，所述醇类有机溶剂为异丙醇，并且所述含有DNA的第三上清液与所述醇类有机溶剂的体积比为1：0.8。由此可以进一步提高肠道菌群DNA的纯度。由此可以进一步提高制备得到肠道菌群DNA的效率以及纯度。 

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。 

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中： 

图1是根据本发明的一个实施例，昆虫幼虫肠道菌群DNA电泳检测结果（M1：Marker，Hind III；M2：Marker，DL2000；1、2、3、4：昆虫幼虫肠道样品）； 

图2是根据本发明的一个实施例的昆虫幼虫肠道菌群DNA的纯度检测结果。 

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。 

在本发明的一个方面，本发明提出了一种制备昆虫肠道菌群DNA的方法，该方法包括：首先，将昆虫肠道的至少一部分浸入生理盐水中，通过震荡处理，使肠道的内含物与肠道分离；去除肠道，以便获得含有肠道内含物的盐水溶液；将含有肠道内含物的盐水溶液进行离心，并收集含有肠道菌群的沉淀；利用裂解剂对含有肠道菌群的沉淀进行裂解，以便获得含有核酸的裂解液；利用蛋白酶对含有核酸的裂解液进行处理后离心，以便获得含有DNA的第一上清液。 

发明人意外地发现，普遍的提取昆虫幼虫肠道菌群DNA的方法，是在分离出肠道后，直接解剖肠道取出肠道内容物，在此操作中很容易携带大量的宿主组织，导致肠道菌群DNA中混有大量的宿主DNA，不利于获取较纯的肠道菌群DNA。因此，根据本发明的一个实施例，发明人将解剖出昆虫的肠道后，单独对肠道进行分离，避免了解剖肠道后直接取出肠道内含物对肠道内含物造成污染。 

根据本发明的一个实施例，昆虫肠道可以通过下列获得的：将昆虫浸入酒精中3～5分钟，以便麻醉所述昆虫；将所述昆虫浸入生理盐水中3～5分钟；去除昆虫表面的生理盐水；去除昆虫的头部和尾部；以及取出昆虫肠道的至少一部分。由此可以进一步提高制备昆虫肠道菌群DNA的效率以及纯度。根据本发明的具体实施例，上述获取肠道的方法是发明人经过多次试验优化得到的。由于昆虫幼虫比较柔软，对其操作具有一定难度，根据本发明的具体实施例，采用酒精对昆虫进行麻醉的时间不宜过短或过长，避免对昆虫麻醉不够或者造成腐蚀。根据本发明的具体实施例，将昆虫浸入酒精中3～5分钟即可。根据本发明的具体实施例，在分离得到完整肠道时，应小心操作，避免带入幼虫本身的组织污染肠道内含物。 

根据本发明的一个实施例，将昆虫肠道的至少一部分浸入生理盐水中，通过在150～250rpm下震荡处理30～40分钟，使所述肠道的内含物与所述肠道分离。由此可以进一步提高分离得到肠道的内含物的效率，以及防止肠道的内含物被污染，以便进一步提高制备得到肠道菌群DNA的纯度。 

根据本发明的一个实施例，上述方法中将含有肠道内含物的盐水溶液进行离心，并收集含有肠道菌群的沉淀的离心条件为10000～12000rpm。由此可以进一步提高分离得到含有肠道菌群的效率。 

根据本发明的一个实施例，进一步对含有肠道菌群的沉淀进行裂解。根据本发明的具 体实施例，上述裂解剂并不受特别限制，根据本发明的具体实施例，裂解剂可以包含50mg/ml的溶菌酶、50mg/ml的纤维素酶和50mg/ml的蜗牛酶，并且裂解剂的体积是含有肠道菌群的沉淀的五十分之一。由此可以充分地对肠道菌群进行裂解，获得含有核酸的裂解液。由此采用上述裂解液可以进一步提高制备得到肠道菌群DNA的效率以及纯度。 

根据本发明的一个实施例，通过上述方法获得了含有核酸的裂解液。根据本发明的具体实施例，进一步利用蛋白酶对含有核酸的裂解液进行处理后离心，以便获得含有DNA的第一上清液。根据本发明的具体示例，获得含有DNA的第一上清液的方法进一步包括：将含有核酸的裂解液与1000微升TNES裂解液和10微升浓度为20mg/mL的蛋白酶K混合，并依次在55摄氏度下保温1～2小时以及在65摄氏度下保温40～60分钟。由此可以进一步提高制备得到肠道菌群DNA的效率以及纯度。 

根据本发明的实施例，将上述获得的含有DNA的第一上清液与第一有机溶剂混合，并进行离心，以便获得含有DNA的第二上清液。根据本发明的具体实施例，第一有机溶剂并不受特别限制，根据本发明的具体示例，第一有机溶剂可以包含酚、氯仿和异戊醇，并且酚、氯仿和异戊醇的体积比例为25:24:1，由此利用上述有机溶剂可以对含有DNA的第一上清液进行提纯。根据本发明的实施例，发明人发现当采用上述第一有机溶剂以及上述配比时，能够最大程度的去除含有DNA的第一上清液中的杂质，由可以进一步提高NDA的纯度。 

根据本发明的实施例，向含有DNA的第一上清液中加入等体积的第一有机溶剂，以便在最大限度地去除杂质，提高DNA的纯度。 

根据本发明的一个实施例，将上述获得的含有DNA的第二上清液与第二有机溶剂混合，并进行离心，以便获得含有DNA的第三上清液。根据本发明的具体实施例，第二有机溶剂可以包含氯仿和异戊醇，并且氯仿和异戊醇的体积比例为24:1。根据本发明的具体实施例，含有DNA的第二上清液与第二有机溶剂的体积相同。由此可以进一步提高制备得到肠道菌群DNA的效率以及纯度。 

根据本发明的一个实施例，将上述获得的含有DNA的第三上清液与醇类有机溶剂混合，离心后除去上清液，以便获得昆虫肠道菌群DNA。根据本发明的具体实施例，醇类有机溶剂可以为异丙醇，并且含有DNA的第三上清液与醇类有机溶剂的体积比为1：0.8。由此可以进一步提高肠道菌群DNA的纯度。由此可以进一步提高制备得到肠道菌群DNA的效率以及纯度。 

根据本发明的一个实施例，利用上述方法可以有效地制备得到昆虫肠道菌群DNA。通常提取昆虫幼虫肠道菌群DNA的方法，是在分离出肠道后，直接解剖肠道取出肠道内容物， 在此操作中很容易携带大量的宿主组织，导致肠道菌群DNA中混有大量的宿主DNA，不利于获取较纯的肠道菌群DNA。根据本发明的实施例，分离出完整的肠道，再单独对肠道进行处理获得其内容物，该方法操作简便，能够获得较高浓度的宏基因组DNA，同时能够保证肠道菌群宏基因组DNA的纯度，将宿主DNA的污染降低到最小，对后续肠道菌群的宏基因组测序研究、基因挖掘等具有重要意义。 

根据本发明的一个实施例，上述方法可以适用于多数昆虫幼虫，例如等翅目、鳞翅目、同翅目、直翅目、蜚蠊目、膜翅目、半翅目或者鞘翅目昆虫。由此可以进一步提高对更多种类昆虫的研究。根据本发明的具体实施例，上述方法尤其适用于鞘翅目昆虫幼虫肠道宏基因组DNA的提取。根据本发明的实施例，适用于该方法的昆虫还可以为黄粉虫幼虫。由于黄粉虫的体内含有较多的蛋白质、氨基酸、脂肪、微量元素和维生素等多种化学物质，以黄粉虫为原料制成的保健品具有抗病、防病的功能。因此，根据本发明的实施例，以黄粉虫幼虫为例，提供一种高效地、专门用于昆虫幼虫（即无翅类昆虫除外）肠道菌群的DNA提取方法。该方法为开展肠道微生物结构及功能的研究、以及进一步探讨肠道微生物与昆虫的共生关系奠定基础。 

下面通过具体的实施例，对本发明进行说明，需要说明的是这些实施例仅仅是为了说明目的，而不能以任何方式解释成对本发明的限制。另外，在下列实施例中如果没有特别说明，则所采用的设备和材料均为市售可得的。 

实施例 

试剂和仪器 

Tris-base、EDTA（二钠盐）、NaCl、SDS、冰乙酸、NaOH、盐酸、Triton X-100、溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶、蛋白酶K、Tris饱和酚、氯仿（AR）、异戊醇（AR）、异丙醇（AR）无水乙醇（AR）、琼脂糖、6×Loading buffer、λHind III Marker、 

需配制试剂 

0.5M EDTA、1M Tris-Cl、10%SDS、5M NaCl、50mg/ml溶菌酶、50mg/ml蜗牛酶、50mg/ml纤维素酶、20mg/ml蛋白酶K、TE缓冲液、TAE缓冲液、70%乙醇、0.9%NaCl 

仪器 

5417R eppendorf冷冻离心机（12000rpm，4℃）、分析天平、水浴锅（37℃、55℃、65℃）、通风橱、5ml、1000μl、200μl、100μl、10μl移液器及相对应的吸头、96孔双面板、1.5ml及2ml离心管、电泳仪、微波炉、三角瓶（250ml）、镊子（10cm尖头镊子，解剖用）、一次性培养皿（直径9cm）、超净工作台。 

1、制备肠道内容物 

1.1超净工作台紫外杀菌后，通风。取两只分液槽，分别装入适量95%的酒精和灭菌生理盐水，挑选出若干健康状况良好的鞘翅目昆虫—黄粉虫幼虫，放入95%酒精5min，将幼虫麻醉同时杀死体表的微生物。再将幼虫转入装有灭菌生理盐水的培养皿5min。从培养皿中取出预处理结束的昆虫幼虫，置于灭菌吸水纸上，去掉昆虫幼虫体表的生理盐水。最后将昆虫幼虫转移到用于解剖的灭菌培养皿上，待用。 

1.2用灭菌镊子去掉黄粉虫幼虫的头部和尾部，解剖出完整肠道，并减少肠道内容物流出。 

1.3将完整肠道放入已加入25mL灭菌生理盐水的50mL管中。常温，200rpm，振荡30min，使肠道与肠道内容物完全分离。 

1.4低温4℃、1500rpm离心3min，去掉肠道（少量悬浮的肠道用吸头挑出），肠道内容物溶于灭菌生理盐水。 

1.5上清分装入2ml离心管，4℃、12000rpm离心5min，收集沉淀。 

1.6沉淀中加入1ml TE缓冲液重悬沉淀，4℃、12000rpm离心5min，收集沉淀。 

2、提取宏基因组DNA 

2.1将1.6中的沉淀加入800μL TE缓冲液洗涤，4℃、12000r/min离心5min。 

2.2弃上清液，加入1/50体积50mg/mL溶菌酶、50mg/mL纤维素酶、50mg/mL蜗牛酶37℃处理1h（或4℃处理过夜），每隔15min颠倒混匀一次。 

2.3在12000r/min下离心3min，弃上清液，向沉淀加入1000μL TENS裂解液（200mmol/L NaCl，100mmol/L Tris-HCl，pH8.0，2.0%SDS，50mmol/L EDTA，0.5%Triton X-100）和20mg/mL蛋白酶K10μL，颠倒混匀，55℃保温1h，每隔15min颠倒混匀一次，65℃保温40min，每隔15min颠倒混匀一次。 

2.4在4℃、12000r/min下离心5min，取上清液，弃沉淀。 

2.5向上清液中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（体积比为：25:24:1），充分混匀，4℃、12000r/min离心10min。 

2.6上清液转管，加入等体积的氯仿：异戊醇（体积比为24:1），充分混匀，4℃、12000r/min离心10min。 

2.7上清液转管，加入0.8倍体积的异丙醇，混匀，4℃、30min。 

2.8在4℃、12000r/min下离心5min，弃上清液。把离心管倒扣在吸水纸上，吸干残留液体，自然风干。 

2.9加入30μL无菌水溶解沉淀。 

2.10电泳检测：0.8%琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，结果见图1。 

2.11采用Nanodrop ND-1000检测DNA浓度及纯度，结果见表1。 

表1Nanodrop ND-1000检测昆虫幼虫肠道菌群宏基因组DNA浓度 

结果说明：1-4分别为黄粉虫肠道meta的四个重复，各取1μl使用Nanodrop ND1000检测，结果为各重复1-4提取得到的DNA浓度。 

3、宏基因组DNA纯度检测 

经电泳检测，提取得到的宏基因组DNA，除轻微降解、少量RNA污染外，浓度较高。通过构建宏基因组DNA的克隆文库，分析肠道微生物在文库中所占的比例，从而可以知道所提取的宏基因组DNA的纯度。文库构建方法如下： 

3.1选择提取得到的肠道meta宏基因组DNA（选择浓度较高的1继续后续实验）约1μg，即对应样品1的25μl，经Covaris E随机打断； 

3.2电泳，选择500bp左右的片段，回收纯化； 

3.3将回收的片段末端补齐、磷酸化并加A 

3.4连接至pGEM-T载体，并转化至Top10感受态； 

3.5选择阳性克隆（克隆数100个），提取质粒，用通用引物M13F测序； 

3.6测序数据经处理后（500bp左右）提交NCBI比对，分析比对结果； 

结果说明：由图2可知，挑取100个克隆子测序，其中11个数据测序不佳，故去掉；由图2可得出，本方法提取黄粉虫肠道meta结果较好，仅有3%动物DNA污染（主要为黄粉虫本身DNA）及2%植物DNA污染（主要为黄粉虫食物摄入的植物导致DNA带入），其余高达94%的均为肠道微生物DNA。因此，肠道微生物在整个克隆文库中占94%，说明本发明实施例的制备肠道菌群DNA的方法极大地减少了宿主和其他非微生物物质的干扰，有利于后续的宏基因组测序研究。 

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定 指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。 

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。 

Claims (10)

1.一种制备昆虫肠道菌群DNA的方法，其特征在于，包括：

将昆虫肠道的至少一部分浸入生理盐水中，通过震荡处理，使所述肠道的内含物与所述肠道分离；

去除所述肠道，以便获得含有肠道内含物的盐水溶液；

将所述含有肠道内含物的盐水溶液进行离心，并收集含有肠道菌群的沉淀；

利用裂解剂对所述含有肠道菌群的沉淀进行裂解，以便获得含有核酸的裂解液；

利用蛋白酶对所述含有核酸的裂解液进行处理后离心，以便获得含有DNA的第一上清液；

将所述含有DNA的第一上清液与第一有机溶剂混合，并进行离心，以便获得含有DNA的第二上清液，其中，所述第一有机溶剂包含酚、氯仿和异戊醇，并且酚、氯仿和异戊醇的体积比例为25:24:1；

将所述含有DNA的第二上清液与第二有机溶剂混合，并进行离心，以便获得含有DNA的第三上清液，其中，所述第二有机溶剂包含氯仿和异戊醇，并且氯仿和异戊醇的体积比例为24:1；

将所述含有DNA的第三上清液与醇类有机溶剂混合，离心后除去上清液，以便获得所述昆虫肠道菌群DNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述昆虫为选自等翅目、鳞翅目、同翅目、直翅目、蜚蠊目、膜翅目、半翅目和鞘翅目昆虫的至少一种。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述昆虫为黄粉虫幼虫。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述昆虫肠道是通过下列获得的：

将所述昆虫浸入酒精中3～5分钟，以便麻醉所述昆虫；

将所述昆虫浸入生理盐水中3～5分钟；

去除所述昆虫表面的生理盐水；

去除所述昆虫的头部和尾部；以及

取出所述昆虫肠道的至少一部分。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将昆虫肠道的至少一部分浸入生理盐水中，通过在150～250rpm下震荡处理30～40分钟，使所述肠道的内含物与所述肠道分离。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

将所述含有肠道内含物的盐水溶液在10000～12000rpm下进行离心，并收集含有肠道菌群的沉淀。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解剂包含50mg/ml的溶菌酶、50mg/ml的纤维素酶和50mg/ml的蜗牛酶，并且所述裂解剂的体积是所述含有肠道菌群的沉淀的五十分之一。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用蛋白酶对所述含有核酸的裂解液进行处理后离心，以便获得含有DNA的第一上清液进一步包括：

将所述含有核酸的裂解液与1000微升TNES裂解液和10微升浓度为20mg/mL的蛋白酶K混合，并依次在55摄氏度下保温1～2小时以及在65摄氏度下保温40～60分钟。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有DNA的第一上清液与所述第一有机溶剂的体积相同，并且所述含有DNA的第二上清液与第二有机溶剂的体积相同。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醇类有机溶剂为异丙醇，并且所述含有DNA的第三上清液与所述醇类有机溶剂的体积比为1：0.8。