CN102604935B - 一种安全快速从血液中提取基因组dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种安全快速从血液中提取基因组DNA的方法，利用TritonX-100和SDS裂解血细胞，利用饱和NaCl沉淀蛋白质，通过离心使蛋白质分离出去，减少对溶液中DNA的机械剪切破坏；防止和抑制DNase对DNA的降解；排除有机溶剂、金属离子及其他核酸分子的污染；使蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度；提取的DNA具有一定的长度；纯化后存在对酶有抑制作用的物质。是一种绿色、快速、操作简单的从动物血液中提取基因组DNA的方法。
Description
技术领域：
本发明公开一种安全快速从血液中提取基因组DNA的方法，涉及血液总DNA制备技术，属于动物分子生物学技术研究领域。
背景技术：
基因组DNA (genomic DNA)是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，是进行基因操作的主要物质基础，在基因组学研究中占有重要地位。脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid，DNA)一类带有遗传信息的生物大分子，由4种主要的脱氧核苷酸(dAMP、dGMP、dCMT和dTMP)通过3′,5′-磷酸二酯键连接而成。它们的组成和排列不同，显示不同的生物功能，如编码功能、复制和转录的调控功能等。为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的基因组DNA是非常重要的前提。
DNA的提取是分子生物学研究中的基本技术，DNA样品的质量对实验的成败至关重要。经典方法中，从样品溶液中去除蛋白质采用酚/仿抽提，其标准程序是酚抽提一次，酚/仿抽提一次，氯仿抽提一次，有些情况下还要重复几次，这样就大大增加了工作量。同时，酚具有高度腐蚀性，易引起严重的烧伤；氯仿则作用于中枢神经系统，具有麻醉作用，对心、肝、肾有损害，吸入或经皮肤吸收引起急性中毒。所以，传统的操作方法对操作人员的身体伤害非常大。
目前，虽然有相关的试剂盒，但是其中大部分均含有对身体不利的有毒有害物质。
发明内容：
本发明提供一种安全快速从血液中提取基因组DNA的方法，克服了现在常用的方法中有害溶剂对人体危害的影响，具有提取的基因组DNA质量良好、且省时省力、降低成本等特点。
本发明公开的安全快速从血液中提取基因组DNA的方法，采用以下技术方案：
利用Triton X-100和SDS裂解血细胞，而无需蛋白酶K的处理，缩短了消化的时间、节约了实验的成本；利用饱和NaCl沉淀蛋白质，通过离心使蛋白质分离出去，这就避免了有机溶剂对人体的危害和对环境造成污染。
具体步骤如下：
（1）取200-300 份抗凝血和400-500 份低盐缓冲液加入1.5 ml离心管中，充分混匀，室温下1 000-1500 RPM离心8-12 min，弃上清；
（2）加入400-500 份低盐缓冲液，充分混匀，室温下1 000-1500 RPM离心3-8 min，重复上一步骤；
（3）小心吸出上清，加入300 份细胞裂解液，移液器吹打混匀，60-70℃水浴8-12 min；
（4）加入70-80 份饱和NaCl，充分混匀，室温下10000-12 000 RPM离心3-8 min，将上清转移到新的1.5 ml离心管中；
（5）加入2倍体积室温下的无水乙醇，充分混匀，室温下10 000-12000 RPM离心2-5 min，弃上清；
（6）加入400-600 份冰浴的70%-80%乙醇，颠倒混匀数次，10 000-12000 RPM离心1-5 min，弃上清；
（7）烘箱中60-70℃干燥5-15 min，加入80-150 μl ddH2O，60-70℃水浴10-20 min，-20℃保存。
上述的试剂配制：
(1)低盐缓冲液（pH 7.6-7.8）：12-13份Tris碱（三羟甲基氨基甲烷），32-35份 Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠），7-8份MgCl2，4-5份NaCl，余份为水。
(2)细胞裂解液：4-6份 SDS十二烷基硫酸钠，4-6份Triton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)，1000份低盐缓冲液。
本发明的提取方法平均基因组DNA得率介于Rapid Method法和试剂盒法之间，基因组DNA得率较理想，能较好地满足研究的需要。DNA纯度通常用A260/A280比值来检测，本发明的提取方法测得的A260/A280比值为1.35~1.68，平均为1.46；而Rapid Method法和试剂盒法的平均A260/A280比值分别为1.37、1.56。分子克隆中报道，没有酚的核酸样品其A260/A280比值应为1.2左右。
本发明的积极效果在于：减少对溶液中DNA的机械剪切破坏；防止和抑制DNase对DNA的降解；排除有机溶剂、金属离子及其他核酸分子的污染；使蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度；提取的DNA具有一定的长度；纯化后存在对酶有抑制作用的物质。是一种绿色、快速、操作简单的从动物血液中提取基因组DNA的方法。
克服了现在常用的方法中有害溶剂对人体危害的影响，避免了以往从血液中提取DNA过程中，使用酚、仿、异丙醇等对身体有害的有机溶剂，同时也避免了使用蛋白酶K等昂贵的试剂，整个过程不到1小时，非常快速，且DNA质量良好。所以本发明从科研人员的人身健康出发，并保证提取的基因组DNA质量良好、且省时省力、降低成本。
附图说明
图1 基因组DNA的电泳分析；
M：λDNA /EcoRⅠ+HindⅢ Marker；1-4：本发明的提取方法；5：Rapid Method法；6：试剂盒法；
图2 基因组DNA的PCR产物电泳分析；
M：DNA Marker；1-4: 本发明的提取方法：5：Rapid Method法；6：试剂盒法；0：阴性对照；
图3 基因组DNA的酶切产物电泳分析；
M：λDNA /EcoRⅠ+HindⅢ Marker；1-3: 基因组DNA；E: EcoRⅠ；B: BamHⅠ。
具体实施方式
下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明：
实施例1：
试剂的配制：
(1)低盐缓冲液（pH 7.6）：800ml蒸馏水溶解1.21gTris碱（三羟甲基氨基甲烷）、3.38g Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠）、0.76g MgCl2、0.47gNaCl。加浓盐酸调pH至所需值，加蒸馏水定容至1L。
(2)细胞裂解液：200ml低盐缓冲液中加入1g SDS（十二烷基硫酸钠）,1ml Triton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)。
操作步骤：
1）取梅花鹿的200 μl抗凝血和400 μl低盐缓冲液加入1.5 ml离心管中，充分混匀，室温下1 000 RPM离心10 min，弃上清；
2）加入500 μl低盐缓冲液，充分混匀，室温下1 000 RPM离心5 min，重复上一步骤；
3）小心吸出上清，加入300 μl细胞裂解液，移液器吹打混匀，65℃水浴10 min；
4）加入75 μl饱和NaCl，充分混匀，室温下12 000 RPM离心5 min，将上清转移到新的1.5 ml离心管中；
5）加入2倍体积室温下的无水乙醇，充分混匀，室温下10 000 RPM离心2 min，弃上清；
6）加入500 μl冰浴的70%乙醇，颠倒混匀数次，10 000 RPM离心1 min，弃上清；
7）烘箱中65℃干燥5 min，加入100 μl ddH2O，65℃水浴15 min，既得，-20℃保存。
实施例2
试剂配制：
(1)低盐缓冲液（pH 7.6）：800ml蒸馏水溶解1.21gTris碱（三羟甲基氨基甲烷）、3.38g Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠）、0.76g MgCl2、0.47gNaCl。加浓盐酸调pH至所需值，加蒸馏水定容至1L。
(2)细胞裂解液：200ml低盐缓冲液中加入1g SDS（十二烷基硫酸钠）,1ml Triton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)。
操作步骤：
1）取马鹿的200 μl抗凝血和400 μl低盐缓冲液加入1.5 ml离心管中，充分混匀，室温下1 000 RPM离心10 min，弃上清；
2）加入500 μl低盐缓冲液，充分混匀，室温下1 000 RPM离心5 min，重复上一步骤；
3）小心吸出上清，加入300 μl细胞裂解液，移液器吹打混匀，65℃水浴10 min；
4）加入75 μl饱和NaCl，充分混匀，室温下12 000 RPM离心5 min，将上清转移到新的1.5 ml离心管中；
5）加入2倍体积室温下的无水乙醇，充分混匀，室温下10 000 RPM离心2 min，弃上清；
6）加入500 μl冰浴的70%乙醇，颠倒混匀数次，10 000 RPM离心1 min，弃上清；
7）烘箱中65℃干燥5 min，加入100 μl ddH2O，65℃水浴15 min，既得，-20℃保存。
实施例3
试剂配制：
(1)低盐缓冲液（pH 7.7）：800ml蒸馏水溶解1.27gTris碱（三羟甲基氨基甲烷）、3.5g Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠）、0.78g MgCl2、0.46gNaCl。加浓盐酸调pH至所需值，加蒸馏水定容至1L。
(2)细胞裂解液：200ml低盐缓冲液中加入0.8克SDS（十二烷基硫酸钠）,0.8ml Triton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)。
操作步骤：
1）取（驯鹿、坡鹿、水鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿）各200 μl抗凝血和400 μl低盐缓冲液加入1.5 ml离心管中，充分混匀，室温下1 000 RPM离心10 min，弃上清；
2）加入500 μl低盐缓冲液，充分混匀，室温下1 000 RPM离心5 min，重复上一步骤；
3）小心吸出上清，加入300 μl细胞裂解液，移液器吹打混匀，65℃水浴10 min；
4）加入75 μl饱和NaCl，充分混匀，室温下12 000 RPM离心5 min，将上清转移到新的1.5 ml离心管中；
5）加入2倍体积室温下的无水乙醇，充分混匀，室温下10 000 RPM离心2 min，弃上清；
6）加入500 μl冰浴的70%乙醇，颠倒混匀数次，10 000 RPM离心1 min，弃上清；
7）烘箱中65℃干燥5 min，加入100 μl ddH2O，65℃水浴15 min，既得，-20℃保存。
实施例4
试剂配制：
(1)低盐缓冲液（pH 7.6）：800ml蒸馏水溶解1.3克Tris碱（三羟甲基氨基甲烷）、3.3g Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠）、0.74g MgCl2、0.46gNaCl。加浓盐酸调pH至所需值，加蒸馏水定容至1L。
(2)细胞裂解液：200ml低盐缓冲液中加入1.2g SDS（十二烷基硫酸钠）,1.2ml Triton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)。
操作步骤：
1）取猪的200 μl抗凝血和400 μl低盐缓冲液加入1.5 ml离心管中，充分混匀，室温下1 000 RPM离心10 min，弃上清；
2）加入500 μl低盐缓冲液，充分混匀，室温下1 000 RPM离心5 min，重复上一步骤；
3）小心吸出上清，加入300 μl细胞裂解液，移液器吹打混匀，65℃水浴10 min；
4）加入75 μl饱和NaCl，充分混匀，室温下12 000 RPM离心5 min，将上清转移到新的1.5 ml离心管中；
5）加入2倍体积室温下的无水乙醇，充分混匀，室温下10 000 RPM离心2 min，弃上清；
6）加入500 μl冰浴的70%乙醇，颠倒混匀数次，10 000 RPM离心1 min，弃上清；
7）烘箱中65℃干燥5 min，加入100 μl ddH2O，65℃水浴15 min，既得，-20℃保存。
实施例5
试剂配制：
(1)低盐缓冲液（pH 7.8）：800ml蒸馏水溶解1.22gTris碱（三羟甲基氨基甲烷）、3.29g Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠）、0.74g MgCl2、0.49gNaCl。加浓盐酸调pH至所需值，加蒸馏水定容至1L。
(2)细胞裂解液：200ml低盐缓冲液中加入1.1g SDS（十二烷基硫酸钠）,1.1mlTriton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)。
操作步骤：
1）取牛的200 μl抗凝血和400 μl低盐缓冲液加入1.5 ml离心管中，充分混匀，室温下1 000 RPM离心10 min，弃上清；
2）加入500 μl低盐缓冲液，充分混匀，室温下1 000 RPM离心5 min，重复上一步骤；
3）小心吸出上清，加入300 μl细胞裂解液，移液器吹打混匀，65℃水浴10 min；
4）加入75 μl饱和NaCl，充分混匀，室温下12 000 RPM离心5 min，将上清转移到新的1.5 ml离心管中；
5）加入2倍体积室温下的无水乙醇，充分混匀，室温下10 000 RPM离心2 min，弃上清；
6）加入500 μl冰浴的70%乙醇，颠倒混匀数次，10 000 RPM离心1 min，弃上清；
7）烘箱中65℃干燥5 min，加入100 μl ddH2O，65℃水浴15 min，既得，-20℃保存。
实施例6
试剂配制：
(1)低盐缓冲液（pH 7.8）：800ml蒸馏水溶解1.29gTris碱（三羟甲基氨基甲烷）、3.29g Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠）、0.74g MgCl2、0.5gNaCl。加浓盐酸调pH至所需值，加蒸馏水定容至1L。
(2)细胞裂解液：200ml低盐缓冲液中加入1.1g SDS（十二烷基硫酸钠）,1.1mlTriton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)。
操作步骤：
1）取羊的200 μl抗凝血和400 μl低盐缓冲液加入1.5 ml离心管中，充分混匀，室温下1 000 RPM离心10 min，弃上清；
2）加入500 μl低盐缓冲液，充分混匀，室温下1 000 RPM离心5 min，重复上一步骤；
3）小心吸出上清，加入300 μl细胞裂解液，移液器吹打混匀，65℃水浴10 min；
4）加入75 μl饱和NaCl，充分混匀，室温下12 000 RPM离心5 min，将上清转移到新的1.5 ml离心管中；
5）加入2倍体积室温下的无水乙醇，充分混匀，室温下10 000 RPM离心2 min，弃上清；
6）加入500 μl冰浴的70%乙醇，颠倒混匀数次，10 000 RPM离心1 min，弃上清；
7）烘箱中65℃干燥5 min，加入100 μl ddH2O，65℃水浴15 min，既得，-20℃保存。
实施例7
试剂配制：
(1)低盐缓冲液（pH 7.8）：800ml蒸馏水溶解1.19gTris碱（三羟甲基氨基甲烷）、3.4g Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠）、0.76g MgCl2、0.47gNaCl。加浓盐酸调pH至所需值，加蒸馏水定容至1L。
(2)细胞裂解液：200ml低盐缓冲液中加入0.9gSDS（十二烷基硫酸钠）,0.9mlTriton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)。
操作步骤：
1）取鸡的200 μl抗凝血和400 μl低盐缓冲液加入1.5 ml离心管中，充分混匀，室温下1 000 RPM离心10 min，弃上清；
2）加入500 μl低盐缓冲液，充分混匀，室温下1 000 RPM离心5 min，重复上一步骤；
3）小心吸出上清，加入300 μl细胞裂解液，移液器吹打混匀，65℃水浴10 min；
4）加入75 μl饱和NaCl，充分混匀，室温下12 000 RPM离心5 min，将上清转移到新的1.5 ml离心管中；
5）加入2倍体积室温下的无水乙醇，充分混匀，室温下10000 RPM离心2 min，弃上清；
6）加入500 μl冰浴的70%乙醇，颠倒混匀数次，10000 RPM离心1 min，弃上清；
7）烘箱中65℃干燥5 min，加入100 μl ddH2O，65℃水浴15 min，既得，-20℃保存。
试验例1：
基因组DNA的质量评估。
(1) 琼脂糖凝胶电泳
为了评估基因组DNA的完整性，分别取梅花鹿、马鹿、驯鹿、水鹿、白唇鹿、麋鹿、黇鹿、猪、牛、羊、鸡的DNA样品3 ul，0.7%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察电泳结果并拍照保存。见图1。
（2）分光光度法
为了评估基因组DNA的浓度和纯度，分别取梅花鹿、马鹿、驯鹿、水鹿、白唇鹿、麋鹿、黇鹿、猪、牛、羊、鸡的DNA样品各10 ul于190 ul ddH2O中，充分混匀，分光光度计分别测定其A260和A280的吸光值，计算得到DNA样品的浓度和纯度。
DNA纯度通常用A260/A280比值来检测，本发明的提取方法测得的A260/A280比值为1.35～1.68，平均为1.46；而Rapid Method法和试剂盒法的平均A260/A280比值分别为1.37、1.56。分子克隆中报道，没有酚的核酸样品其A260/A280比值应为1.2左右。这说明本发明的提取方法提取的DNA纯度较好。结果如下表：
（3）PCR扩增
为了验证本发明的提取方法提取所得基因组DNA是否影响PCR扩增，对本发明的提取方法提取的基因组DNA进行PCR扩增，以梅花鹿基因组为例说明，得到的PCR产物如图2所示。
PCR试剂的工作浓度：Taq酶 5U/ul，10PCR buffer包含500 mM KCl和15 mM MgCl2，dNTPs 100 μM，牛特异性引物 20 μM。PCR扩增反应在PCR System 9700上进行，
15 ul体系：ddH2O 9.3ul、10 × Buffer 1.5ul、dNTPs 2.0ul、引物1和引物2各0.5ul、Taq酶 0.2ul、DNA模板 1.0ul。
PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，30 cycles；72℃ 5min。
反应结束后取5 ul PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，凝胶成像系统中记录实验结果。
从图2中可知，所有的DNA样品均扩出了124 bp左右的tRNA-Val-16S rRNA目的片段，而阴性对照没有扩出目的片段。可见，本发明的提取方法提取所得基因组DNA具有较好的质量，无抑制Taq酶活性的物质，适用于PCR扩增反应。与Rapid Method法相比，以本发明的提取方法提取所得基因组DNA作为模板进行PCR扩增，所得的PCR产物量更多。
（4）基因组DNA的酶切反应
为了验证本发明的提取方法提取所得基因组DNA是否影响酶切反应，以梅花鹿基因组为例，使用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性酶对基因组DNA进行酶切（图3）。
反应体系为：1 ul EcoRⅠ或BamHⅠ，2 ul 10K buffer（200 mM Tris-HCl pH8.5，100 mM MgCl2，10 mM DTT，1 000 mM KCl），6 ul基因组DNA，补加ddH2O至终体积为10 ul。混匀后37 ℃水浴反应3 h，反应结束后取5 ul酶切产物在0.7%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，凝胶成像系统中记录实验结果。
从图中可知，提取的基因组DNA经过EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后，电泳图中仅有非常弱的弥散条带，说明本发明提取的基因组DNA是限制性酶的良好底物，可以成功地进行酶切。
Claims (1)
1.一种安全快速从血液中提取基因组DNA的方法，包括以下步骤：
（1）取200-300份抗凝血和400-500份低盐缓冲液加入到离心管中充分混匀，室温下1000-1500 RPM离心8-12 min，弃上清；
（2）加入400-500份低盐缓冲液，充分混匀，室温下1000-1500 RPM离心3-8 min，重复上一步骤；
（3）吸出上清，加入300份细胞裂解液，移液器吹打混匀，60-70℃水浴8-12 min；
（4）加入70-80份饱和NaCl，充分混匀，室温下10000-12000 RPM离心3-8 min，将上清转移到离心管中；
（5）加入2倍体积室温下的无水乙醇，充分混匀，室温下10000-12000 RPM离心2-5 min，弃上清；
（6）加入400-600份冰浴的70%-80%乙醇，颠倒混匀数次，10000-12000 RPM离心1-5 min，弃上清；
（7）烘箱中60-70℃干燥5-15 min，加入80-150 μl ddH2O，60-70℃水浴10-20 min，-20 ℃保存；
其中，所述低盐缓冲液及细胞裂解液试剂的配制如下：
(Ⅰ) pH 7.6-7.8的低盐缓冲液：12-13份Tris碱，32-35份乙二胺四乙酸二钠，7-8份MgCl2，4-5份NaCl，余份为水；
(Ⅱ)细胞裂解液：4-6份 SDS十二烷基硫酸钠，4-6份聚乙二醇对异辛基苯基醚，1000份低盐缓冲液。
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