CN108841991B - 杨树叶绿体全基因组pcr扩增引物及其应用 - Google Patents

杨树叶绿体全基因组pcr扩增引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组从基因组总DNA中特异性地扩增获得杨树叶绿体全基因组的PCR引物。该PCR引物共有33对，其扩增片段范围为4.0 kb–8.0 kb，扩增产物可直接用于第三代Pacbio测序，且不同扩增片段之间具有100 bp–220 bp的重叠区域，获得PCR产物序列信息后，可以直接根据重叠区序列进行组装。本发明提供的用于杨树叶绿体全基因组PCR扩增引物，能够特异性地从杨树基因组总DNA中扩增得到叶绿体基因组序列，PCR产物适用于第三代高通量测序技术分析，操作简单，特异性强，可重复性高，易于组装，成本低。

Description

杨树叶绿体全基因组PCR扩增引物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术PCR扩增引物设计领域，尤其是涉及杨树叶绿体全基因组序列PCR扩增的特异性引物。
背景技术
由于杨属种间易于杂交，发生基因渗入，使杨属呈现为复杂的网络状进化特征。虽然形态特征的差异是经典分类学中划分植物不同种类的重要依据，但形态特征受环境条件影响明显，具有较强的可塑性，依靠形态特征进行杨树种的识别与分类，容易产生混乱，甚至部分形态特征非常相近的杨树种无法明确其分类地位。
随着新一代测序技术的发展和系统发育基因组学的兴起，当前开发利用的植物叶绿体全基因组序列，由于具有基因组较小，并且在种间具有较高而在种内具有较小的遗传分化，提供了鉴别近缘种所需的变异位点信息，在较低分类阶元的物种系统发育学、谱系地理学和群体遗传分析中能够非常有效地提高分辨率等突出优点，近年来已被广泛应用于近缘种鉴别、系统发育学、群体遗传分析以及个体区分等方面的研究。如香脂杨与毛果杨在形态上极为相似，既使分类学家也很难将二者区分开来，经常被认为是同一物种的2个不同亚种，Huang等（New Phytologist, 2014, 204: 693-703）采用叶绿体基因序列成功地鉴别了香脂杨和毛果杨，并明确了系统发育关系。
目前主要有3种方法获取植物叶绿体全基因组序列。第1种方法是采用差速离心法等，从植物总DNA中分离得到cpDNA，进一步对cpDNA进行测序与组装，得到叶绿体全基因组序列。该方法对操作要求较严格，技术难度较高，成功率较低，尚没有得到普及应用。第2种方法是通过对植物总DNA进行Illumina HiSeq高通量测序，要求数据量在8 Gb – 30 Gb左右，测序深度在10× - 30×，对测序得到的reads，参考已有近缘种的叶绿体基因组序列进行De novo组装从而获得目标植物叶绿体全基因组序列。该方法耗时较长，专业性强，成本较高，且需要参考基因组。第3种方法是设计特异性PCR引物，以植物总DNA为模板，通过PCR扩增，将扩增产物进行高通量测序及拼装，从而获得植物叶绿体全基因组序列。该方法操作技术简单，可重复性强，成本低，效率高，尤其在样本数量较大时，能够显著地提高效率和降低成本。
为降低植物叶绿体全基因组获取的技术难度和成本，Yang等（Molecular Ecology Resources, 2014, 14: 1024-1031）设计了适用于被子植物叶绿体基因组PCR扩增的9对引物。但该9对PCR引物扩增产物不能够获得完整的杨树叶绿体基因组序列，且PCR扩增产物适用于二代测序技术。
第三代测序技术具备了超长读长（8 kb – 10 kb）和不基于PCR建库，解决了二代测序技术无法解决的难题，又提高了通量，能够快速地完成基因组组装，并能够了解表观基因组、基因组变异等信息，且每个lane的数据量达16G，一次上机分析样本数量大，实现了快速与高效。
因而，为准确获得杨树叶绿体全基因组序列信息，目前杨属树种叶绿体全基因组序列的PCR扩增引物需要进一步设计，且PCR扩增产物的长度需要符合三代测序技术的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一组用于从核基因组总DNA中特异地扩增得到杨树叶绿体全基因组序列的PCR引物，且PCR产物满足第三代测序要求，本发明解决了前期需要通过重测序获得杨树叶绿体全基因组序列成本高、时间长的问题，同时也解决了现有引物扩增杨树叶绿体全基因组序列不完整的问题，该组引物在杨属树种间具有完全的通用性，可直接用于开展基于杨树叶绿体全基因组序列的相关研究工作。
在本发明提供的杨树叶绿体全基因组序列PCR扩增的引物中，以公开发布的被子植物通用叶绿体全基因组序列PCR扩增引物以及滇杨、银白杨、青杨叶绿体全基因组序列为参考，采用Primer Premier 5.0软件设计正、反向引物。
1、一组适用于第三代测序技术的杨树叶绿体全基因组PCR扩增引物，共包括33对特异性引物，每对引物有正向序列和反向序列构成，其核苷酸序列见表1。
2、应用该33对特异引物从杨树总DNA中特异地扩增叶绿体全基因组序列，其特征在于，包括下列步骤：
1）从杨树样本材料（嫩叶）中提取到总DNA样品；
2）用权利要求1所述的引物进行PCR扩增，由于每对引物扩增产物长度均在4 kb及以上，采用长片段PCR扩增技术（Long and accurate polymerase chain reaction，LA-PCR）进行杨树叶绿体全基因组序列的目的片段的扩增。扩增反应体系参照Yang等（Molecular Ecology Resources, 2014, 14: 1024-1031）方法，包括：25µL 反应体系，其中5ÍPrimeSTAR GXL buffer 5.0 µL，dNTP Mixture（2.5 uM）2.0 µL，正、反向引物（10 pM）各0.5µL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 0.5µL，DNA 2.0µL，灭菌蒸馏水14.5µL。反应条件为：变性94℃ 1min，退火温度98℃，时间10s，65℃/68℃，时间15 / 20min，30个偱环后72℃延伸 10min；
3）PCR扩增产物经0.5%琼脂糖凝胶电泳检测，若存在分子量与特异引物设计扩增长度相一致的单一条带，则说明扩增成功；
4）将经过检测扩增成功的33对特异引物PCR产物送生物技术公司，经过产物纯化、定量与均一化、pacbio文库制备及Sequel/RSII测序，去除测序片段两端的barcode序列，经过reads聚类分析及subreads的自我矫正，采用minimus2进行拼接组装，得到杨树叶绿体全基因组序列；
5）应用OGdraw软件构建杨树叶绿体全基因组结构图。
附图说明
图1: 22对引物PCR扩增产物凝胶电泳检测结果
1-22分别为33对引物中的22对引物PCR产物电泳结果；M. DNA分子量标准：从上至下依次为23130bp，9416bp，6557bp，4361bp，2322bp，2027bp。
具体实施方式
1 材料
所用材料为收集于四川省乡城县的乡城杨和稻城县的西南杨，分别采取2种杨树的嫩叶，保存于装有干冰的保温盒内带回实验室冻存于-80℃冰箱，备用。
2 叶绿体全基因组PCR扩增引物设计
参照公开发布的被子植物通用叶绿体全基因组序列PCR扩增引物以及滇杨、银白杨、青杨叶绿体全基因组序列，采用Primer Premier 5.0软件设计正、反向引物，共计33对，序列见表1。
表1 杨树叶绿体全基因组的PCR扩增引物
Figure 730145DEST_PATH_IMAGE001
3 总DNA提取
将冻存于-80℃冰箱的杨树嫩叶取出，快速剪取约1-1.5g，放于盛有液氮的研钵内，研磨至粉末状，将粉末转移到2.0mL的微量离心管中，依照Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒使用说明书提取乡城杨和西南杨样本基因组总DNA。用TE溶液将其浓度稀释为80ng/µL。
4 PCR扩增
PCR反应总体积为25µL，包括5ÍPrimeSTAR GXL buffer 5.0 µL，dNTP Mixture（2.5 uM）2.0 µL，正、反向引物（10 pM）各0.5µL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 0.5µL，DNA 2.0 µL，无菌双蒸水14.5 µL。采用长片段PCR扩增技术，反应条件为：变性94℃ 1min，退火温度98℃，时间10s，65℃/68℃，时间15/ 20min，30个偱环后72℃延伸 10min。取5 µL扩增产物，采用0.5%琼脂糖凝胶，在电压100-150V下电泳15 min，凝胶成像系统下观察并拍照。乡城杨叶绿体全基因组序列22对引物扩增产物电泳结果如图1。
33对引物PCR扩增产物经凝胶电泳检测，其扩增产物分子量大小与特异引物设计扩增长度相一致，且为单一条带，将PCR产物送生物技术公司进行第三代Pacbio测序。去除测序片段两端的barcode序列，经过reads聚类分析及subreads的自我矫正，采用minimus2进行拼接组装，得到乡城杨叶绿体全基因组序列为156634 bp，西南杨叶绿体全基因组序列为156430 bp。
>P-cp-01F
GGCTGAATGGTTAAAGCGCCCA
>P-cp-01R
GATTAGTGCCTAGTGCGGGAAAAGC
>P-cp-02F
ACCCTCTATCCTCTCTTTTTTCCAT
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TTGCGTCCAATAGGATTTGAACCTATACC
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GGTTCGATTCCCGCTACCCGC
>P-cp-03R
TTTTGTTTCTAATTGGTCAGGGGCG
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CGAAACTTAGTCAATGGTGTCCCTC
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AAAGGATGGCTAGTCCAAGATGCTG
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>P-cp-05R
GGATATGGGCTCGTGTGAGTAGGAA
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TTCCTTATCGCTCAGGAAAGACAAG
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CCCCAGTTCAAATCCGGGTGTCG
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ACTAACTTCGGGATTGGGCACAG
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TTGTGCTATAAACGCATAAGCAGG
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CGCCTTCAACCACTCGGCCA
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TGTAGGAGAGATGGCCGAGTGG
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AATGGGCGATGCTTGGTTACAATTT
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TACGGATACCCCCAATACATCGAAA
>P-cp-11R
CTTGGATACCATGAGGTGGGCCTTG
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CATGGACAACTGTGTGGACCGAC
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CCATTGCAATTGCCGGAAATACTAAGC
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ACGGCGGGAGTCATTGGTTCA
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TGAATGGCCTCGGTTAATCCTGTC
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GAACTTTCGATTGATCCAGGCACT
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GCATCCCCGTCGAATCAGACAGA
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GCGAATCCATCAAACTCGATCAACC
>P-cp-15R
AGTTCGGTAGAACATGGGTCTCCA
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TGAACCTACGACATTGGGTTTTGGAGA
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GATCAAATTCTATCCCTTAGGAACCGT
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ATTCTTTAGATCCCTTGTTTCACTCCG
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GGCCGTGCAGATATATGCCTTTAAT
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GCGGTGGAAAAATATGGGTACG
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GTTTGAGCTGTACGAGATGAAATTCT
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CTATATGATCCGATCGATTGCGTAAG
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CCTGACAAAATCGACGAAACGGAA
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GCCGCCACTCGGACTCGAACC
>P-cp-27F
GGTTCGAGTCCGAGTGGCGGC
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CAGTTCTTTACTTGGGCGGTTGGA
>P-cp-28F
TACCCATTGTTGTTCCAAAGACTCTAC
>P-cp-28R
GGTCTAGCTTAATATCGCAAAAATGGC
>P-cp-29F
TCTATGCGAGCTTTTTTCCGTATCG
>P-cp-29R
ACAGCCGACCGCTCTACCAC
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GTGGTAGAGCGGTCGGCTGT
>P-cp-30R
CAGGGACCAGGAGATTGGATCT
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TGGATCCCGCTCTAATAGCTCCG
>P-cp-33F
TCTTACCTGGGATCGCAAATCCC
>P-cp-33R
TGGGCGCTTTAACCATTCAGCC

Claims (2)

1.杨树叶绿体全基因组PCR扩增引物，其特征在于共有33对引物，分别包括上游引物和下游引物，
所述33对引物如下：
Figure FDA0003553967120000011
2.如权利要求1所述的引物在杨树叶绿体全基因组序列PCR扩增中的应用，其特征在于具体步骤如下：
1)从杨树样本材料嫩叶中提取到总DNA样品；
2)用权利要求1所述的引物进行PCR扩增，由于每对引物扩增产物长度均在4kb及以上，采用长片段PCR扩增技术进行杨树叶绿体全基因组序列的目的片段的扩增；
3)步骤2)得到的PCR扩增产物经0.5％琼脂糖凝胶电泳检测，若存在分子量与特异引物设计扩增长度相一致的单一条带，则说明扩增成功；
4)将步骤3)中经过检测扩增成功的33对特异引物PCR产物送生物技术公司，经过产物纯化、定量与均一化、pacbio文库制备及Sequel/RSII测序，去除测序片段两端的barcode序列，经过reads聚类分析及subreads的自我矫正，采用minimus2进行拼接组装，得到杨树叶绿体全基因组序列；
5)应用OGdraw软件构建杨树叶绿体全基因组结构图。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111088387B (zh) * 2020-01-16 2023-01-03 南京林业大学 香樟叶绿体全基因组pcr扩增引物及其应用
CN112921111B (zh) * 2021-03-25 2023-01-31 西南林业大学 鉴别杨属树种的叶绿体基因组及其pcr扩增引物与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533993A (zh) * 2011-12-28 2012-07-04 南京林业大学 一种多倍体杨树的筛选方法及其专用引物
CN107488742A (zh) * 2017-08-30 2017-12-19 上海伯杰医疗科技有限公司 B型流感病毒全基因组测序方法
CN107523649A (zh) * 2017-08-30 2017-12-29 上海伯杰医疗科技有限公司 H7n9亚型流感病毒全基因组测序方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533993A (zh) * 2011-12-28 2012-07-04 南京林业大学 一种多倍体杨树的筛选方法及其专用引物
CN107488742A (zh) * 2017-08-30 2017-12-19 上海伯杰医疗科技有限公司 B型流感病毒全基因组测序方法
CN107523649A (zh) * 2017-08-30 2017-12-29 上海伯杰医疗科技有限公司 H7n9亚型流感病毒全基因组测序方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Fifteen novel universal primer pairs for sequencing whole chloroplast genomes and a primer pair for nuclear ribosomal DNAs;Ting Zhang et al;《Journal of Systematics and Evolution》;20160413;第54卷(第3期);第219-227页 *
响叶杨（杨属）叶绿体基因组测序与比较分析;范李强等;《四川大学学报（自然科学版）》;20180131;第55卷(第1期);第165-171页 *
基于叶绿体片段序列的杨属系统发育关系分析;员涛等;《植物生理学报》;20150831;第51卷(第8期);第1339~1346页 *
木本植物全基因组测序研究进展;施季森等;《遗传》;20120228;第34卷(第2期);第145―156页 *

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