CN102643801B - 一种适用于全基因组测序的产糖被细菌基因组dna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于全基因组测序的产糖被细菌基因组DNA的提取方法，向产糖被细菌的培养物中加入提取缓冲液和溶菌酶，37℃下静置10min，再加入蛋白酶K，65℃下静置1h；加入苯酚-氯仿-异戊醇的混合溶液，抽提；加入氯仿-异戊醇混合溶液，抽提；加入冷乙醇和醋酸钠，离心，沉淀经乙醇洗涤后室温干燥，加DNA提取缓冲液溶解；加入RNA酶，37℃下静置10min；加入PEG6000，混匀，50℃下静置10min；加入苯酚-氯仿-异戊醇的混合溶液，抽提；加入氯仿-异戊醇混合溶液，抽提；加入冷乙醇和醋酸钠溶液，离心，沉淀经乙醇洗涤后室温干燥，加ddH2O或者TE缓冲液溶解，即为提取到的DNA溶液。
Description
技术领域
本发明涉及DNA提取方法。具体涉及一种适用于全基因组测序的产糖被细菌基因组DNA的提取方法。
背景技术
在分子生物学技术的研究中，关键在于DNA的提取。常规的分子生物学操作如PCR、酶切、杂交对DNA的质量要求不高，一般分子生物学实验指导书上的常规方法如浓盐法、酚氯仿抽提法等即可满足其要求。
随着全基因组随机测序方法—霹弹法（shotgun）的成熟，计算机拼装算法的发展，近年来细菌基因组测序以每年50%的速度增长。新一代高通量基因组测序仪的迅速发展（Solexa，454GS-FLX，SOLID，tSMS）给基因组领域带来革命性的突破。目前，细菌基因组研究进展迅猛，已有684个真细菌基因组和51个古细菌基因组序列发布。而且，对于细菌全基因序列的测定是分析细菌生物合成过程、基因调控、蛋白表达等之前非常必要的工作。通过全基因组测序，可以预测所含有的编码序列、可能表达的蛋白、与各种细胞功能相关的基因，还可以预测未知功能的基因等，从而可开创性的研究预测一些可能的方向，使得生物学实验具有可验证性和可循证性。但全基因组测序对DNA的样品具有高纯度、大片段的要求，不同于一般PCR样品的要求。
对于全基因组测序的基因组文库构建，DNA的需求量较大，长度至少大于23kb，而且质量要求较高，应尽量避免多糖、蛋白质的残留，否则影响库的构建及后续测序工作。因此，一次性获取高质高量的DNA就相当必要。
某些细菌在细胞壁外被一层厚度不定的透明胶状物质所包被，这层物质统称为糖被。它通常由多糖类、多肽类或多糖与多糖蛋白复合体组成。糖被具粘稠的特性，在进行DNA提取时，会与DNA结合形成共沉淀，获得的DNA溶液常常黏度大乃至呈胶状，在很大程度上影响基因组DNA提取的质量和数量。所以，如何高效简便地去除细菌的多糖类物质，对提取纯化细菌基因组DNA来说至关重要。
本实验室于2010年6月在华大基因科技股份有限公司启动了一株产多糖细菌的全基因组测序项目，但在提取该菌株全基因组DAN样品时发现，常规提取方法无法达到完全去除多糖类物质的目的，不能满足测序建库要求。而且多糖类物质对核酸限制性内切酶和PCR都有抑制作用。因此，本发明提供了一种适合于产糖被细菌的DNA提取体系，可获得高纯度基因组DNA，而且DNA含量高，片段在23kb以上，完全满足全基因组测序文库构建及一般分子生物学实验操作的要求。采用该方法提取的细菌DNA经华大基因科技股份有限公司检测，检测结论为合格，达到1类样品标准，可以用于全基因组测序文库构建。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作安全、简便、高通量、成本低的一种适用于全基因组测序的产糖被细菌基因组DNA的提取方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种适用于全基因组测序的产糖被细菌基因组DNA的提取方法，该方法包括以下步骤：
（1）向3~6mL产糖被细菌的培养物中加入400μL DNA提取缓冲液和10μL溶菌酶的水溶液，37℃下静置10min，再加入10μL蛋白酶K的水溶液，65℃下静置1h；
（2）向步骤（1）得到的混合溶液中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇的混合溶液，抽提，离心，取上清；
（3）向步骤（2）得到的上清中，加入等体积的氯仿-异戊醇混合溶液，抽提，离心，取上清；
（4）向步骤（3）得到的上清液中，加入2倍体积的冷乙醇和0.1倍体积的醋酸钠的水溶液，离心，沉淀经体积百分浓度为70%的乙醇洗涤后室温干燥，加DNA提取缓冲液溶解；
（5）向步骤（4）得到的体系中加入RNA酶的水溶液10μL，37℃下静置10min；
（6）向步骤（5）得到的体系中加入PEG6000，混匀，50℃下静置10min；
（7）向步骤（6）得到的体系中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇的混合溶液，抽提，离心，取上清；
（8）向步骤（7）得到的上清中，加入等体积的氯仿-异戊醇混合溶液，抽提，离心，取上清；
（9）向步骤（8）得到的上清中，加入2倍体积的冷乙醇和0.1倍体积的醋酸钠的水溶液，离心，沉淀经体积百分浓度为70%的乙醇洗涤后室温干燥，加200μl ddH2O或者TE缓冲液溶解，即为提取到的DNA溶液，-20℃保存备用。
其中，所述的产糖被细菌为：吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、越南伯克霍尔德氏菌（Burkholderia vietnamiensis）、洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia）、草木樨中华根瘤菌（SinorhizobiummeIiIoti）。
步骤（1）和（4）中，所述的DNA提取缓冲液按如下方法配制得到：将1mol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液10mL、0.5mol/L pH8.0的EDTA 4mL、5mol/L的NaCl 28mL、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）2g和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）2g溶于去离子水，定容到100mL；使用时加入2mL的2-巯基乙醇。
步骤（1）中，所述的溶菌酶的水溶液的浓度为50mg/mL。
步骤（1）中，所述的蛋白酶K的水溶液的浓度为20mg/mL。
步骤（2）和（7）中，所述的苯酚-氯仿-异戊醇的混合溶液，苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1。
步骤（3）和（8）中，所述的氯仿-异戊醇混合溶液，氯仿和异戊醇的体积比为24:1。
步骤（4）和（9）中，所述的醋酸钠的水溶液浓度为3mol/L。
步骤（4）和（9）中，所述的冷乙醇温度为-20℃。
步骤（5）中，所述的RNA酶的水溶液的浓度为10mg/mL。
步骤（6）中，PEG6000加入量为10~20g/L。
步骤（9）中，所述的TE缓冲液由10mM Tris-HCl和1mM EDTA组成，pH8.0。
本发明的保护范围不局限于上述物料的具体加入量，物料的加入量可根据提取样品量的增大进行相应的增加。
有益效果：
本发明方法与现有的常规CTAB方法相比具有如下优点：
（1）本发明方法操作安全、简便、高通量、成本低。
（2）本发明方法所述的DNA提取方法适用范围较广，提取产糖被细菌的基因组DNA质量较好，可以满足一般分子生物学操作及全基因组测序文库构建。
附图说明
图1为5种细菌改进方法获得的细菌全基因组DNA琼脂糖凝胶电泳示意图（其电泳图为1%琼脂糖凝胶，从左到右依次为：DNAmarker；泳道2-6：B1（吡咯伯克霍尔德氏菌），B2（巨大芽孢杆菌），B3（越南伯克霍尔德氏菌），B4（洋葱伯克霍尔德氏菌），B5（草木樨中华根瘤菌）的DNA产物）。其中，M，λ-Hind Шdigest（Takara）。
图2为通过常规DNA提取方法获得的细菌全基因组DNA琼脂糖凝胶电泳示意图（其电泳图为0.8%琼脂糖凝胶，从左到右依次为：DNAmarker；泳道2-6：B1（吡咯伯克霍尔德氏菌），B2（巨大芽孢杆菌），B3（越南伯克霍尔德氏菌），B4（洋葱伯克霍尔德氏菌），B5（草木樨中华根瘤菌）的DNA产物）。其中，M，λ-Hind Шdigest（Takara）。
图3为通过5种细菌改进方法获得的细菌全基因组DNA经PCR扩增后得到的16SrDNA产物琼脂糖凝胶电泳示意图（其电泳图为2%琼脂糖凝胶，从左到右依次为：DNAmarker；泳道2-6：B1（吡咯伯克霍尔德氏菌），B2（巨大芽孢杆菌），B3（越南伯克霍尔德氏菌），B4（洋葱伯克霍尔德氏菌），B5（草木樨中华根瘤菌）的DNA产物）。其中，M，DL2000（Takara）。
具体实施方式
根据下述实施例，可以使本领域的技术人员更好地理解本发明。实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
选择5种实验室保存的具糖被的细菌菌株（B1：吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderiapyrrocinia）；B2：巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）；B3：越南伯克霍尔德氏菌（Burkholderia vietnamiensis）；B4：洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia）；B5：草木樨中华根瘤菌（Sinorhizobium meIiIoti））按如下方法进行基因组DNA的提取。
（1）向3~6mL产糖被细菌的培养物中加入400μL DNA提取缓冲液和10μL50mg/mL溶菌酶的水溶液，37℃下静置10min，再加入10μL 20mg/mL蛋白酶K的水溶液，65℃下静置1h；所述的DNA提取缓冲液按如下方法配制得到：将1mol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液10mL、0.5mol/L pH8.0的EDTA 4mL、5mol/L的NaCl 28mL、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）2g和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）2g溶于去离子水，定容到100mL；使用时加入2mL的2-巯基乙醇；
（2）向步骤（1）得到的混合溶液中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇（体积比25:24:1）的混合溶液，抽提，离心，取上清；
（3）向步骤（2）得到的上清中，加入等体积的氯仿-异戊醇（体积比24:1）混合溶液，抽提，离心，取上清；
（4）向步骤（3）得到的上清液中，加入2倍体积的冷乙醇和0.1倍体积3mol/L的醋酸钠的水溶液，离心，沉淀经体积百分浓度为70%的乙醇洗涤后室温干燥，加DNA提取缓冲液溶解；
（5）向步骤（4）得到的体系中加入10mg/mL RNA酶溶液10μL，37℃下静置10min；
（6）向步骤（5）得到的体系中加入PEG6000，PEG6000加入量为10~20g/L，混匀，50℃下静置10min；
（7）向步骤（6）得到的体系中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇（体积比25:24:1）的混合溶液，抽提，离心，取上清；
（8）向步骤（7）得到的上清中，加入等体积的氯仿-异戊醇（体积比24:1）混合溶液，抽提，离心，取上清；
（9）向步骤（8）得到的上清中，加入2倍体积的冷乙醇和0.1倍体积3mol/L的醋酸钠的水溶液，离心，沉淀经体积百分浓度为70%的乙醇洗涤后室温干燥，加200μlddH2O或者TE缓冲液（TE缓冲液由10mM Tris-HCl和1mM EDTA组成，pH8.0）溶解，即为提取到的DNA溶液，-20℃保存备用。
实施例2：
对实施例1中提取的DNA及常规CTAB方法【Clank MS.Plant molecular biology-Alaboratory manual(植物分子生物学-实验手册)[M].北京:高等教育出版VS施普林格出版社,1998,4~7】提取的DNA采用NanoDrop 1000进行浓度检测。检测结果如表1所示。由表1可以看出，实施例1中提取的DNA满足1.8≤A260/A280≤2.0，A260/A230≥2.0，优于常规提取方法。说明所提取的DNA较纯，DNA中蛋白质、酶类及色素、RNA等杂质含量合乎要求。而且DNA浓度均在707.18ng/μL以上。
实施例3：
对实施例1中提取的DNA及常规方法提取的DNA片段大小的琼脂糖电泳检测，marker选用λ-Hind III digest，胶浓度为1%；电压为150V；电泳时间为40min。实施例1中提取的细菌基因组DNA结果如图1所示，5种菌基因组DNA主带在λ-Hind III digest最大条带23kb以上。泳道2~6的DNA图谱清晰、无拖尾。常规CTAB方法提取的DNA细菌基因组DNA结果如图2所示，5种菌基因组DNA主带在λ-Hind III digest最大条带23kb以上，但泳道2~6的DNA电泳图图谱有拖尾现象，且点样槽中有物质残留。以上说明传统方法不能有效去除DNA粗提液中的多糖类物质，与DNA形成共沉淀，而改进的DNA提取方法则能弥补这一不足。
实施例4：
对实施例1中提取的DNA进行16S rDNA的PCR扩增及产物检测，选择扩增细菌16S rDNA的通用引物（正向引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；反向引物1512R：ACGGCTACCTTGTTACGACT）对5种细菌基因组DNA进行扩增。扩增体系为20μL体系：10×Buffer（含Mg2+1.5mmol/L）2μL、2.5mmol dNTP 1.5μL、10μmol引物各1μL、Taq酶0.15μL、模板1μL、ddH2O补足20μL。PCR反应条件：94℃变性2min；再以94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1.5min，30次循环；72℃延伸7min。PCR产物于2%琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下拍照。电泳结果如图3所示，已经成功扩增出5种细菌的16S rDNA的目的条带（1500bp）。说明采用实施例1中提取的DNA可以满足PCR样品要求。
表1 5种具糖被菌两种提取方法提取DNA的纯度、浓度
Claims (1)
1.一种适用于全基因组测序的产糖被细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）向3～6mL产糖被细菌的培养物中加入400μL DNA提取缓冲液和10μL溶菌酶的水溶液，37℃下静置10min，再加入10μL蛋白酶K的水溶液，65℃下静置1h；
（2）向步骤（1）得到的混合溶液中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇的混合溶液，抽提，离心，取上清；
（3）向步骤（2）得到的上清中，加入等体积的氯仿-异戊醇混合溶液，抽提，离心，取上清；
（4）向步骤（3）得到的上清液中，加入2倍体积的冷乙醇和0.1倍体积的醋酸钠的水溶液，离心，沉淀经体积百分浓度为70%的乙醇洗涤后室温干燥，加DNA提取缓冲液溶解；
（5）向步骤（4）得到的体系中加入RNA酶的水溶液10μL，37℃下静置10min；
（6）向步骤（5）得到的体系中加入PEG6000，混匀，50℃下静置10min；
（7）向步骤（6）得到的体系中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇的混合溶液，抽提，离心，取上清；
（8）向步骤（7）得到的上清中，加入等体积的氯仿-异戊醇混合溶液，抽提，离心，取上清；
（9）向步骤（8）得到的上清中，加入2倍体积的冷乙醇和0.1倍体积的醋酸钠的水溶液，离心，沉淀经体积百分浓度为70%的乙醇洗涤后室温干燥，加200μl ddH2O或者TE缓冲液溶解，即为提取到的DNA溶液，-20℃保存备用；
所述的产糖被细菌为吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、越南伯克霍尔德氏菌（Burkholderia vietnamiensis）、洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia）和草木樨中华根瘤菌（Sinorhizobium meIiIoti）；
步骤（1）和（4）中，所述的DNA提取缓冲液按如下方法配制得到：将1mol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液10mL、0.5mol/L pH8.0的EDTA 4mL、5mol/L的NaCl 28mL、十六烷基三甲基溴化铵2g和聚乙烯吡咯烷酮2g溶于去离子水，定容到100mL；使用时加入2mL的2-巯基乙醇；
步骤（9）中，所述的TE缓冲液由10mM Tris-HCl和1mM EDTA组成，pH8.0；
步骤（1）中，所述的溶菌酶的水溶液中，溶菌酶的浓度为50mg/mL；
步骤（1）中，所述的蛋白酶K的水溶液中，蛋白酶K的浓度为20mg/mL；
步骤（4）和（9）中，所述的醋酸钠的水溶液中，醋酸钠的浓度为3mol/L；
步骤（5）中，所述的RNA酶的水溶液中，RNA酶的浓度为10mg/mL；
步骤（2）和（7）中，所述的苯酚-氯仿-异戊醇的混合溶液，苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1；
步骤（3）和（8）中，所述的氯仿-异戊醇混合溶液，氯仿和异戊醇的体积比为24:1；
步骤（6）中，PEG6000加入量为10～20g/L。
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