DK143707B - Fremgangsmaade til isolering af glucagon - Google Patents

Description

1 143707

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til isolering af glucagon i højt udbytte fra overvæsken fra insulinfremstilling ved alkalisk krystallisation.

Kort efter opdagelsen af insulin i 1921 har adskillige forskere [Murlin et al., J. Biol. Chem. 56, 252 (1923) og Kimball and Murlin, J. Biol. Chem., £8, 337 (1924)] bemærket, at der kunne opnås en hyperglycemisk respons med visse pan-creatiske ekstrakter af insulin. Den komponent, der var ansvarlig for den hyperglycemiske respons, blev kaldt glucagon.

Nu om dage er den vigtigste anvendelse af glucagon ved behandling af insulininduceret hypoglycemia. Da verdensbefolkningen af diabetikere vokser, stiger behovet for glucagon. Endvidere har man fundet, at glucagon kan anvendes ved behandling af hjertesygdomme. Disse to anvendelsesområder har givet en forøget efterspørgsel efter glucagon, og denne efterspørgsel kan bedst tilfredsstilles ved at forbedre udbyttet af glucagon fra naturlige kilder.

Den første fremstilling af krystallinsk glucagon er beskrevet i 1953 [Staub et al., Science, 117, 628 (1953); se også Staub, et al., J. Biol. Chem., 214, 619 (1955)]. Udgangsmaterialet var en amorf fraktion opnået ved kommerciel fremstilling af insulin, der omfatter en syre-alkohol-ekstraktion af pan-creatisk væv, koncentrering af ekstrakten, fældning med natriumchlorid, isoelektrisk fældning, adskillige alkoholfraktioneringer, affarvning, krystallisation med zink fra acetatpuffer, udvaskning for at fjerne den amorfe fraktion og tørring af det således opnåede zinkinsulin. Den opnåede amorfe fraktion indeholdt ca. 4 vægtprocent glucagon og ca.

7 vægtprocent insulin. Sædvanligvis lå udbyttet af amorft materiale på 2-5 mg pr. kg pancreas. Glucagonfremstillingen omfattede en eventuel fraktionering ved pH 6,7, acetonefraktionering, fraktioneret fældning ved pH 4,3, to fraktionerede fældninger ved pH 2,5 og to krystallisationer fra urinstof/-glycinpuffer ved pH 8,6. Udbyttet af krystallinsk glucagon var ca. 20 vægtprocent af glucagonet indeholdt i det tørre amorfe 143707 2 stof, hvilket svarer til et udbytte på 0,02 - 0,04 mg glucagon pr. kg pancreas.

Ved indførelsen af en mellemliggende krystallisation af zinkinsulin fra citratpuffer, jævnfør USA patentskrift nr. 2 626 228, opnåedes en reduktion af det totale antal trin, der var nødvendige for at fremstille insulinet ud fra okse-pancreas. Medens der opnåedes tilnærmelsesvis samme mængde amorf fraktion under udvaskningstrinnet som ved den gamle proces, var glucagonindholdet i den amorfe fraktion faldet til kun ca. 0,2 vægtprocent. Det viste sig, at glucagon blev holdt tilbage i citratpufferen under den mellemliggende krystallisation. Udvinding af glucagon fra citratpufferen krævede fældning med overskud af zink, efterfulgt af en saltfældning og to fældninger ved henholdsvis pH 5,1 og 5,6 for at fjerne zinken. Udbyttet af rå glucagon fra citratpufferen svarede til 0,4 - 0,45 mg. pr. kg. pancreas, fra hvilken kilde udbyttet af renset glucagon svarer til 0,05 - 0,15 mg pr. kg pancreas. Anvendelsen af zink som fældningsmiddel gjorde en fuldstændig fjernelse af zinken vanskelig og forøgede mængden af insulin, der førtes med over i det endelige rensede glucagon.

Studier af pancreasekstraktioner har vist, at de forskellige syre-alkoholekstrakter, der sædvanligvis anvendes ved insulinfremstilling, indeholder 2 - 3 mg glucagon pr. kg pancreas. Efter koncentrering og affedtning af ekstrakten er glucagonindholdet faldet til 0,75 - 1,0 mg pr. kg. Som forklaret ovenfor, er imidlertid kim 25-50 vægtprocent af denne mængde tilgængelig for oprensning, afhængigt af udgangsmaterialet.

Formålet med opfindelsen er at angive en fremgangsmåde, der på simpel vis muliggør isolering af glucagon i godt udbytte og høj renhed, og dette opnås ved at gå frem som anført i krav l’s kendetegnende del.

3 143707

Opfindelsen hviler på den overraskende erkendelse, at man ved som glucagonkilde at anvende et særligt udgangsmateriale, nemlig overvæsken fra fremstilling af insulin ved alkalisk krystallisation, jævnfør USA patentskrift nr. 3 719 655, kan undlade et antal tidligere nødvendige behandlingstrin, der alle medførte et større eller mindre glucagontab, og indskrænke sig til de nævnte i og for sig kendte trin A-C, hvor trin A omfatter en radske alternative muligheder, der kan anvendes alene eller i kombination.

Denne særlige kombination af behandlingstrin har ikke tidligere været beskrevet, og fagmanden kunne ikke forvente, at netop anvendelsen af den nævnte glucagonkilde ville muliggøre denne betydelige forenkling af oparbejdelsen.

Ved en umiddelbar betragtning udviser opfindelsen betydelige lighedspunkter med det i USA patentskrift nr. 3 715 345 beskrevne, der diskuteres nedenfor, og som beskæftiger sig med separation af glucagon fra insulin i pancreasekstrakteme. En nærmere sammenligning foretages dog enklest, når fremgangsmåden ifølge opfindelsen er beskrevet i detaljer.

Glucagonkilden ved den omhandlede fremgangsmåde er som nævnt overvæsken (supernatanten) fra den alkaliske krystallisation af insulin. Denne overvæske er en vandig opløsning med pH

7,2-10,2 og med en kationkoncentration på 0,2-1,0 molær og har et indhold af opløst protein på 1-10% insulin og 0,2-1,5% glucagon, afhængigt af den anvendte pancreas.

F.eks. indeholder overvæsken fra denne alkaliske krystallisation, når der anvendes okse-pancreas, normalt 5-10% insulin og 1,0-1,5% glucagon. Når der anvendes svine-pancreas, indeholder overvæsken 1-2% insulin og 0,2-0,3% glucagon. Det må bemærkes, at det aktuelle udbytte af glucagon fra batch til batch kan variere temmelig meget, på grund af glucagons følsomhed over for enzymatisk nedbrydning.

Anvendelsen af isoelektrisk fældning eller ionbytningskromatografi eller en kombination deraf indgår som en mulighed ved 143707 4 isoleringen af det glucagonholdige protein fra den alkaliske overvæske i trin A). Generelt kræver isoelektrisk fældning, at overvæsken har et pH på 4,2-6,6. Det foretrukne pH ligger på 4,6-5,2, medens det allermest foretrukne ligger på 4,7-5,0.

Da overvæsken fra den alkaliske krystallisation har et pH på 7,2-10, er det nødvendigt at gøre denne væske sur til det ønskede pH. Dette kan simpelt gøres ved at tilsætte en fortyndet uorganisk eller organisk syre, der ikke nedbryder eller reagerer med glucagon. Eksempler på egnede syrer er saltsyre, phosphorsyre, myresyre, eddikesyre, propionsyre og lignende, idet saltsyre foretrækkes.

Der tilsættes op til 20 volumenprocent ethanol for at sænke opløsningens dielektricitetskonstant og derved sikre en mere fuldstændig udfældning ved at reducere opløseligheden af det glucagonholdige protein i den alkaliske væske.

Når den alkaliske overvæske er blevet gjort sur til det ønskede pH, begynder udfældningen af det ønskede glucagonholdige protein hurtigt, sædvanligvis inden for få minutter.

For at sikre fuldstændig udfældning henstår opløsningen sædvanligvis ved en temperatur, der ikke er højere end stuetemperatur. Fortrinsvis afkøles opløsningen til 3-10°C. Selv om udfældningen normalt er tilendebragt efter 24 timer, kan blandingen stå i uendelig lang tid uden skadelige virkninger.

Når udfældningen er tilendebragt, isoleres bundfaldet, herefter refereret til som isoelektrisk bundfald, på kendt måde, såsom ved centrifugering eller filtrering, idet filtrering normalt foretrækkes. Det således opnåede isoelektriske bundfald behøver ikke at vaskes eller tørres, selv om dette om ønsket kan gøres.

En anden metode, der er velegnet til isolering af glucagon-holdigt protein fra den alkaliske krystallisationsvæske i trin A) er ionbytningskromatografi. Af de kendte ionbytnings- 5 143707 metoder foretrækkes en fremgangsmåde beskrevet i USA patentskrift nr. 3 715 345» der er særlig effektiv. Ionbytningskromatografi består kort fortalt i at lede den glucagonholdige opløsning over en sulfoneret macrotværbundet styren-divinylbenzen-copolymerharpiks på alkalimetalform ved pH 7-8. Glucagon absorberes på harpiksen. Glucagonet elueres derefter med fortyndet base, såsom 0,1N ammonium-hydroxid. Det glucagonholdige eluat indstilles til pH 2,5, og glucagonet udfældes ved standard-saltfældningsmetoder.

Det fremkomne glucagonholdige bundfald er i det væsentlige adskilt fra insulinproteiner, men bundfaldet indeholder stadig andre ikke-glucagonstoffer.

Ved at udsætte overvæsken fra den alkaliske krystallisation for fremgangsmåden beskrevet i USA patentskrift nr. 3 715 345 opnås et insulinholdigt eluat og en glucagonholdig saltkage.

Det insulinholdige eluat kan om ønsket recirkuleres til insulinprocessen. Den glucagonholdige saltkage genopløses til yderligere behandling. Af bekvemmelighedsgrunde indstilles pH og proteinkoncentrationen til næsten samme værdier som de, der findes i den alkaliske krystallisations-overvæske.

Det er ofte fordelagtigt at udføre det første trin ved den omhandlede fremgangsmåde, dvs. isoleringen af glucagorihol-digt protein fra den alkaliske overvæske, under anvendelse af iso elektrisk fældning og ionbytningschromatografi i rækkefølge. F.eks. kan den alkaliske overvæske underkastes ionbytningskromatografi,, Den således opnåede glucagonholdige saltkage genopløses og underkastes isoelektrisk fældning som beskrevet ovenfor. Alternativt kan den alkaliske overvæske underkastes en isoelektrisk fældning, og det opnåede bundfald kan opløses i et svagt alkalisk vandigt medium og herefter underkastes ionbytningskromatografi. I begge tilfælde kan det insulinholdige eluat fra ionbytningskromatografien recirkuleres til insulinprocessen.

143707 6

Det må imidlertid påpeges, at ionbytningskromatografi ikke er den eneste måde at adskille insulin fra glucagon, før glucagon adskilles fra de andre proteiner. Således kan bundfaldet fra en isoelektrisk fældning også underkastes en såkaldt hyperglycemisk komponentfraktionering ved udsaltning af glucagon fra et svagt alkalisk phenolisk vandigt medium (pH 7,5). Hyperglycemisk komponentfraktionering er beskrevet af Staub, et al., se ovenfor. Den insulinholdige væske kan recirkuleres til insulinprocessen, medens det udfældede rå glucagon viderebehandles i trin B i den omhandlede fremgangsmåde.

Som anført tidligere separeres glucagon i trin B fra andet protein ved en glucagonfibrildannelse. I almindelighed udføres dannelsen af glucagonfibriller i sur vandig opløsning.

Normalt opløses det glucagonholdige protein i et surt medium med et pH under 2, 7. Medens der ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes et pH på 1,5-2,7, er det foretrukne pH-område 2,0-2,5. Enhver af de ovennævnte syrer, der er anvendelige til at gøre overvæsken sur inden isoelektrisk fældning, kan anvendes, men saltsyre foretrækkes. Med saltsyre skal der imidlertid anvendes et konserveringsmiddel, såsom en phenol, sædvanligvis i en koncentration på ca. 0,2% (vægt pr. volumen). Typisk opløses det glucagonholdige protein i 0,01 N saltsyre indeholdende 0,2% phenol (vægt/volumen).

Koncentrationen af det glucagonholdige protein i opløsning ligger i reglen på 2,5-30 mg/ml. Det foretrukne område er 5-20 mg/ml, især 5-10 mg/ml.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen sættes et vandopløseligt uorganisk salt til den sure glucagonholdige proteinopløsning for at initiere fibrildannelsen. Ved vandopløselige salte forstås uorganiske salte, der er opløselige i vand ved de koncentrationer, der er beskrevet nedenfor. Da det uorganiske salt menes primært at have en udsaltende virkning i forhold til initieringen af fibrildannelsen, er valget af uorganisk salt ikke kritisk. I praksis er anvendelsen af 7 143707 radioaktive, toxiske eller farvede salte, eller salte, der er oxidationsmidler,reduktionsmidler eller stærke syrer eller baser, ikke ønskede af naturlige grunde. Egnede uorganiske salte er således generelt vandopløselige ammoniumsalte, vandopløselige salte af alkalimetaller til og med periode 6 i det periodiske system (Robert C. Weast, Ed.-in-Chief, "Handbook of Chemistry and Physics"» 53rd Edition,

The Chemical Rubber Co., Cleveland, Ohio, 1972, p. B3) og vandopløselige salte af jordalkalimetaller til og med periode 6 i det periodiske system. Eksempler på sådanne salte er ammoniumbromid, ammoniumchlorid, ammoniumfluorid, ammoniumiodid, ammoniummagnesium-sulfat, ammoniummangansulfat, ammoniumnitrat, ammoniumsulfat, lithiumbromid, lithiumchlorid, lithiumfluorsilikat, lithiumfluorsulfonat, lithiumiodid, lithiummolybdat, lithium-nitrat, lithiumkaliumsulfat, natriumammoniumphosphat, natrium-ammoniumsulfat, natriumbromid, natriumchlorid, natriumiodid, natriumhexafluorphosphat, natriumfluorsulfonat, natriummagnesium sul fat, natriumnixrat, natriumhexametaphosphat, natrium-dihydrogenorthophosphat, natriummonohydrogenorthopho sphat, natriumsulfat, natriumhydrogensulfat, natriumbromid, kalium-calciumchlorid, kaliumchlorid, kaliumfluorid, kaliumiodid, kaliummagnesiumchloridsulfat, kaliummagnesiumsulfat, kalium-magnesiumchlorid, kaliummolybdat, kaliumorthophosphat, kalium-natriumphosphat, rubidiumbromid, rubidiumchlorid, rubidium-fluorid, rubidiumiodid, rubidiumnitrat, caesiumbromid, cae-siumchlorid, caesiumfluorid, caesiumiodid, caesiumnitrat, caesiumsulfat, berylliumbromid, berylliumchlorid, berylliumfluorid, berylliumnitrat, berylliumorthophosphat, magnesium-bromid, magnesiumchlorid, magnesiumiodid, magnesiumnitrat, magnesiumsiliciumfluorid, calciumbromid, calciumchlorid, calciumiodid, calciumnitrat, calciumbromid, calciumchlorid, calciumiodid, bariumbromid, bariumiodid °S vandopløselige hydrater heraf. Ammoniumsalte foretrækkes, idet ammoniumsul-fat er det foretrukne. Det uorganiske salt anvendes i reglen i koncentrationer op til 0,5 M, fortrinsvis 0,01-0,05 M.

143707 8

Temperaturområdet, hvor glucagonfibrildannelsen sker, ligger på 20-30°C. Det foretrukne område ligger på 24-26°C, og den foretrukne temperatur er 25°C.

Fibrildannelsen, der lettes ved omrøring, begynder sædvanligvis 3-4 timer fra det tidspunkt, hvor fremstillingen af den sure, vandige glucagonopløsning er tilendebragt, og er færdig efter 48 timer. Mere end 48 timer er sædvanligvis ikke påkrævet.

Når fibrildannelsen er tilendebragt, kan glucagonfibrillerne opsamles på kendt måde, såsom ved filtrering eller centrifugering, idet sidstnævnte metode foretrækkes. Om ønsket kan glucagonfibrillerne vaskes ved at suspendere disse i et surt vandigt medium, der eventuelt kan indeholde et uorganisk salt. Temperaturen af vaskemediet skal ligge på 20-30°C, fortrinsvis 25°C. Fibrillerne opsamles som før og holdes kolde, sædvanligvis ved en temperatur under 10°C, hvis ikke næste trin udføres med det samme.

Om ønsket kan et chelatdannende middel, såsom ethylendiamin-tetraeddikesyre tilsættes det fibrildannende medium. Koncentrationen af det chelatdannende middel er normalt under ca.

0,01 M, fortrinsvis 0,004 M. Imidlertid er anvendelsen af et chelatdannende middel ikke foretrukken, medmindre zink eller andre divalente metalioner er til stede.

Som anført tidligere gennemføres trin C, nemlig rensningen af glucagon opnået i trin B, ved krystallisation. I reglen udføres krystallisationen af glucagon ved at opløse denne i et alkalisk vandigt medium og gøre dette surt, indtil der nås et svagt basisk eller svagt surt pH, hvorved krystallisationen initieres, dvs. til et pH på 4,5-8,5.

Opløsningen af glucagon kan udføres på to måder. Enten kan glucagonen opløses direkte i et alkalisk vandigt medium, eller glucagonen kan suspenderes i destilleret vand, og pH kan indstilles ved tilsætning af vandig base, Egnede baser er alkali 143707 9 metal- og ammoniumhydroxider, idet kaliumhydroxid foretrækkes.

I reglen har den fremkomne glucagonopløsning pH 9,0-11,5, fortrinsvis 9,5-10,5.

Koncentrationen af glucagon i den alkaliske opløsning bør ligge på 2-10 mg/ml. En foretrukken koncentration er 4-8 mg/ml, og der anvendes fortrinsvis ca. 5 mg/ml.

Da tilsætning af syre hyppigt resulterer i umiddelbar udfældning af en lille mængde ikke-glucagonprotein, foretrækkes den følgende procedure, selv om den ikke er påkrævet.

Den alkaliske glucagonopløsning opvarmes til en temperatur på 55-65°C. Opløsningen gøres sur til pH 4-6, fortrinsvis 4,5-6,5, med 10% phosphorsyre. Selv om enhver af de ovennævnte syrer kan anvendes, foretrækkes phosphorsyre. Den fremkomne opløsning filtreres, medens den stadig er ved en høj temperatur. Filtreringstrinnet kan normalt udelades, når mængden af bundfald fra syretilsætningen er minimal.

Endvidere kan der anvendes metoder andre end filtrering, som f.eks. centrifugering.

Hvis glucagonopløsningen er misfarvet, kan der tilsættes aktivt kul enten efter syretilsætningen, eller fortrinsvis før denne.

Efter syretilsætningen og eventuelt filtrering henstår glucagonopløsningen ved en temperatur på 2-10°C i 24-120 timer. Fortrinsvis anvendes 4°C. Krystallisationen vil normalt være tilendebragt på 72-120 timer, idet den foretrukne krystallisationstid ligger på 72 timer.

Det meste af overvæsken dekanteres fra de fremkomne glucagon-krystaller, sædvanligvis gennem et filter. Den tilbageblevne overvæske fjernes fra glucagonkrystalleme, sædvanligvis ved centrifugering. Den rensede glucagon vaskes successivt 143707 10 med en tynd NaCl-opløsning (sædvanligvis 0,001%) og vand.

Glucagon lyofiliseres og lagres koldt.

Afhængigt af renheden af den glucagon, der opnås fra trin B og den ønskede renhed af det endelige rensede glucagon kan da?foretages en eller flere yderligere krystallisationer.

Det har imidlertid vist sig, at to successive krystallisationer sædvanligvis er tilstrækkeligt til at give glucagon med en renhedsgrad på mindst 80% baseret på biologiske forsøg med katte.

Når to krystallisationer anvendes, foretrækkes følgende metode:

Den første krystallisation udføres som beskrevet ovenfor ved pH 4,5-5,5» og krystallerne opløses i en alkalisk opløsning.

Ved den anden krystallisation tilsættes syre til pH 7,0-8,5, fortrinsvis 7,3-7,5, og allerhelst 7,4. Opløsnings- og filtreringsproceduren udføres fortrinsvis ved 35-45°C, bedst ved 40°C, Glucagonkoncentrationen ligger fortrinsvis på 10 mg/'ml.

Om ønsket kan overvæsken fra en eller flere af krystallisationsmetoderne recirkuleres. F.eks. kan al opløst protein i overvæsken udfældes ved at indstille pH til 2,5-3,0 med fortyndet saltsyre og ved at tilsætte 20% natriumchlorid (vægt/-volumen). Det således opnåede bundfald kan behandles som under det første trin i den omhandlede fremgangsmåde, enten separat eller opløst i den alkaliske krystallisationsvæske.

Som tidligere anført indeholder den alkaliske krystallisations-overvæske normalt væsentligt mere insulin end glucagon. Dette insulin er en komponent af det glucagonholdige protein, der opnås ved isoelektrisk fældning. Medens det andet trin i den omhandlede fremgangsmåde, nemlig separering af glucagon fra andre proteiner, effektivt fraseparerer glucagon fra insulin, kan separationsproceduren være ødelæggende for insulinkomponenten i proteinblandingen. Som følge heraf er det ofte nødvendigt at udføre det første trin ved hjælp af en metode, såsom ionbytningskromatografi, der også vil føre til en separering 143707 11 af insulin og glucagon.

Selv om det ikke er væsentligt for den omhandlede fremgangsmåde, foretrækkes det, at overvæsken fra fibrildannelsen recirkuleres til insulinprocessen, sædvanligvis til begyndelsen af det alkaliske krystallisationstrin som beskrevet i USA patentskrift nr. 3 719 655. Naturligvis er en sådan recirkulering ikke nødvendig, hvis insulinet før fibrildannelsen er separeret fra glucagonet som beskrevet ovenfor. I dette tilfælde vil den således fraseparerede insulin kunne recirkuleres til insulinprocessen.

Den omhandlede fremgangsmåde og dens forbindelse til insulinprocessen illustreres tydeligst, når der henvises til tegningen, der viser et strømningsdiagram af en udførelsesform for den foreliggende opfindelse. Af hensyn til overskueligheden er overvæskerne opnået efter første og tredje trin ved fremgangsmåden kasseret, men det er underforstået, at disse overvæsker kan recirkuleres som beskrevet ovenfor. Den alkaliske krystallisationsmetode beskrevet i USA-patentskrift nr. 3 719 655 er vist øverst. Denne metode fører til alkali-metal- eller ammoniuminsulin og en overvæske som vist. Da selve den alkaliske krystallisation og det opnåede alkalimetal- eller ammoniuminsulin udgør en del af insulinprocessen, er blokkene, der repræsenterer både metoden og insulinet, omgivet af en stiplet linie og betegnes Hinsulinproces". Alt uden for denne stiplede linie udgør en del af den omhandlede fremgangsmåde og betegnes "glucagonproces".

Processen begynder som vist med den alkaliske krystallisationsvæske. De foretrukne trin, der udgør fremgangsmåden ifølge opfindelsen, gennemføres dernæst, hvilket giver henholdsvis det isoelektriske bundfald, glucagonfibriller, og krystalliseret glucagon. Tegningen viser også recirkulation af overvæsken fra fibrildannelsestrinnet til insulinprocessen.

I den foranstående gennemgang af opfindelsen er der flere gange henvist til USA patentskrift nr. 3 715 345, blandt andet som anbefalelsesværdig ionbytningschromatografimetode. Dette patentskrift beskriver en glucagon-separeringsproces. I korte 12 143707 træk indstilles pH af en sur vandig alkoholisk ekstrakt af pancreas-kirtler til 7-8, hvorpå den resulterende opløsning underkastes ionhytningschromatografi over en sulfoneret macro-reticulær styren-divinylbenzen-copolymer på alkalimetalform. Ioribytteren udvaskes derpå med en passende puffer. Glucagonet elueres fra ionbytteren med en passende vandig base, hvorpå pH af eluatet indstilles til 2-3, og glucagonet udfældes med natriumchlorid. Bundfaldet, der indeholder en meget stor del af det i ekstrakten tilstedeværende glucagon, men i blanding med andre basiske proteiner separeres fra ved filtrering, og den resulterende saltkage anvendes som udgangsmateriale ved en standardglucagon-rensningsprocedure, såsom Staubs metode, op.cit. Fremgangsmåden ifølge USA patentet er således i det væsentlige en ionbytningsproces, der selektivt fjerner basiske proteiner fra rå pancreasekstrakt.

Den ifølge patentet anvendte eluering med vandig base og saltfældning er således alene isoleringstrin, der virker lige godt på glucagon og alle andre basiske proteiner. Medens således i det væsentlige al det tilstedeværende glucagon i det rå koncentrat udvindes ved elueringen med vandig base, så er glucagonindholdet i proteinet, der fældes med salt, normalt mindre end ca. 5 vægtprocent af den totale proteinmængde. Fremgangsmåden ifølge det nævnte patentskrift er således kun tilnærmelsesvis ækvivalent med trin A ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, eftersom det derved isolerede glucagon kun er en mindre bestanddel af den totale mængde protein, der opnås ved isoleringstrinnene. I patentet hverken beskrives eller antydes anvendelsen af overvæsken fra den alkaliske insulinkrystallisation, der er udgangsmaterialet for fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnår man en udvinding af ren krystallinsk glucagon, medens dette i patentet først skal udvindes af proteinbundfaldet.

Som nævnt anføres det i patentet, at det opnåede glucagon kan renses ved kendte procedurer, såsom Staubs metode. Imidlertid kræver Staubs metode som minimum (1) en acetonefraktionering, (2) en fraktioneret fældning ved pH 4,3, (3) mindst to fraktionerede fældninger ved pH 2,5 og (4) mindst to krystallisa 13 143707 tioner fra en urinstof-glycin-puffer ved pH 8,6. Det er således klart, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen ikke er foregrebet af det nævnte patentskrift, og er væsentligt sinrplere end den deri indeholdte totale udvindingsmetode.

De følgende eksempler illustrerer nærmere fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Alle temperaturer er anført i °C.

EKSEMPEL 1

Trin A. 1) Isoelektrisk fældning 14,75 liter alkalisk krystallisationsvæske fra behandling af 5 897 kg okse/svine-pancreas med et faststofindhold på 40,7 mg/ml fortyndedes med 1,45 liter absolut ethanol. pH af den fremkomne opløsning indstilledes til 5,2 med 3 N saltsyre. Opløsningen afkøledes til 5°C natten over,

Bundfaldet, der dannedes, blev opsamlet ved filtrering, opløst i 11,28 liter 0,01 N saltsyre indeholdende 0,2% phenol, vægt pr. volumen, herefter refereret til som syrephenolvand, og den fremkomne opløsning gav følgende analyser:

Totalt indhold af faststof..........512,6 g (45,4 mg/ml)

Insulin............................. 87,43 enheder /ml (1,93 enhed/mg faststof)

Glucagon............................463,7 yug/ml (1,02% af den totale faststofmængde).

En 870 ml portion af opløsningen blev udtaget til forsøg, hvilket efterlod 10,4 liter indeholdende ca. 473 g faststof.

Trin A. 2) Hyperglycemisk komponentfraktionering

Til udførelse af en hyperglycemisk komponentfraktionering fortyndedes den ovennævnte opløsning med 111,8 liter syre-phenolvand, hvilket gav et totalvolumen på 122,2 liter med et faststofindhold på 0,387%. Den fortyndede opløsning tilsattes 245,8 ml flydende phenol, 941 g natriumchlorid og tilstrækkeligt 40% vandigt natriumhydroxid til at indstille pH til 9,0 for at lette opløsningen af det faste stof. pH indstilledes herefter til 7,5 med 3 N saltsyre. Den fremkomne 14 143707 opløsning afkøledes til 5°C i 1-2 dage, hvorunder der dannedes et bundfald. Overvæsken dekanteredes fra og sugefiltreredes. Bundfaldet blev opsamlet ved centrifugering. Det faste stof opnået ved filtrering og centrifugering blev blandet og opløst i 10 liter syrephenolvand. Opløsningen gav følgende analyser:

Totalt faststofindhold............... 75,0 g (7,5 mg/ml)

Insulin.............................. 6,35 enheder/ml

Glucagon.............................275 yug/ml (5,01% af det totale faststof).

Opløsningen fortyndedes til et faststofindhold på 5,0 mg/ml ved tilsætning af yderligere 5 liter syrephenolvand. En 5 liter portion af den fremkomne opløsning fjernedes til forsøg, hvilket efterlod 10 liter opløsning indeholdende ca.

50 g faststof.

Trin B. Glucagonfibrildannelse

Til denne opløsning sattes under omrøring 8,0 ml 0,5 M vandig ethylendiamintetraeddikesyre (som tetranatriumsalt) og 60 ml 50% vandig ammoniumsulfat. Omrøringen fortsattes 16 timer ved stuetemperatur. De dannede glucagonfibriller, blev opsamlet ved centrifugering og vaskedes to gange med syrephenolvand, der indeholdt ethylendiamintetraeddikesyre og ammoniumsulfat som før.

Trin C. Krystallisation

Glucagonfibrillerne suspenderedes i 10 liter vand indeholdende 0,2% phenol (vægt pr. volumen). Blandingen opvarmedes til 40 °C, og pH indstilledes til 10,5 ved tilsætning af 150 ml 10% vandig natriumhydroxid. Opløsningen opvarmedes til 60°C, medens pH indstilledes til 7,8 ved tilsætning af 68 ml 10% phosphorsyre. Efter temperaturen var nået 60°C, indstilledes pH til 5,0 ved tilsætning af 68 ml 10% phosphorsyre. Opløsningen gravitetsfiltreredes, medens den var varm, og filtratet 143707 15 afkøledes under omrøring til 5°C i 72 timer. Glucagonet der var udfældet, blev isoleret ved filtrering. Det opnåede faste stof opløstes som beskrevet ovenfor for glucagonfi-briller, idet dog det totale volumen efter indstilling til pH 10,5 var 870 ml. Opløsningen opvarmedes til 60°C, og pH indstilledes til 5,0 med 10$ phosphorsyre, og den fremkomne opløsning filtreredes varm. Filtratet afkøledes og omrørtes som ovenfor. Det udfældede glucagon opsamledes ved centrifugering og lyophiliseredes, hvilket gav 1,84 g oprenset glucagon. Dette svarer til 74% af det glucagon, der var tilgængeligt før fibrildannelsen og 39% af det glucagon, der var tilgængeligt efter fældning af protein fra den alkaliske krystalli s at i ons overvæske .

EKSEMPEL 2

Trin A. Isoelektrisk fældning

Den alkaliske krystallisationsmodervæske fra tre krystallisationer af insulin, hvor der anvendtes 29 601 kg, 37 198 kg og 49 169 kg af en 2:1 blanding af okse/svine-pancreas, separeredes fra insulinkrystaller ved centrifugering. De respektive modervæsker fyldte 460 liter, 515 liter og 680 liter, hvortil sattes henholdsvis 52, 57,2 og 75,5 liter absolut alkohol, hvorefter opløsningerne indstilledes til pH 5,0 med 3 N saltsyre, omrørtes 15 minutter og afkøledes i mindst 24 timer. Analyser på modervæskerne før udfældning og opløsning af bundfaldene gav (1) 1150 /Ug glucagon og 103,4 enheder insulin pr. kg original pancreas (O.P.) i modervæsken, 839 /ug glucagon og 132 enheder.insulin/kg O.P. 27,1 mg faststof /kg 0.P i opløsningen af bundfaldet, 158 liter; (2) 736 /Ug glucagon og 63 enheder insulin/kg O.P. i modervæsken, 345 /ug glucagon og 56 enheder insulin/kg O.P. og 12,6 mg faststof pr. kg O.P. i opløsningen af bundfaldet, 158 liter; (3) 1214 /Ug glucagon og 99 enheder insulin/kg O.P. i modervæsken, 946 /ug og 87 enheder insulin/kg O.P. og 26,8 mg faststof/kg O.P. i opløsningen af bundfaldet, 156 liter. Bundfaldene op- 143707 16 samledes ved filtrering og opløstes i syrephenolvand (fremstillet som beskrevet i eksempel 1).

Trin B. Glucagonfibrildannelse

Opløsninger af pH 5,0 bundfaldene kombineredes, hvilket gav 464 liter (12,570 g faststof), og fortyndedes til 630 liter med syrephenolvand, hvilket gav et fast stof indhold på 2,0% og pH indstilledes til 2,1 ved tilsætning af 3 N saltsyre. Opløsningen behandledes med 0,5% ammoniumsulfat, der blev tilsat som en 50% opløsning (6 ml/liter, 3 780 ml), og der omrørtes langsomt i 24 timer ved 25°C under fibrildannelsen, hvorefter opløsningen henstod 48 timer ved 15°C. Glucagon-fibrillerne separeredes fra den tilbageblevne opløsning ved centrifugering. Den ovenstående opløsning blev analyseret (den indeholdt 222 ^ug glucagon og 52 enheder insulin pr. kg O.P.) og blev recirkuleret til insulinprocessen. Glucagon-fibrillerne suspenderedes i 450 liter koldt vand indeholdende 0,2% phenol, 2 700 ml 50% ammoniumsulfatopløsning blev tilsat, og blandingen omrørtes langsomt i 30 minutter for at vaske fibrillerne. Disse opsamledes igen ved centrifugering, og vaskevandet blev kasseret. Glucagonfibrillerne suspenderedes i 275 liter vand indeholdende 0,2% phenol, og pH indstilledes til 3,85, idet der anvendtes 10% phosphor syre, og der opnåedes følgende analyser: Faststof 2,49 mg/kg O.P. (0,52 %, 1 404 g fra 115 967 kg O.P.), glucagon 96 ^ug pr. kg O.P.

(54,2 g).

Trin C. Krystallisation 275 liter af glucagonfibrilsuspensionen deltes i to portioner på (l) 135 liter og (2) 140 liter til den første krystallisation. Den første portion fortyndedes til 140 liter med 0,2% phenolvand, hvilket gav 0,5% fast stof koncentration, medens den anden portion indeholdt 0,52% faststof. Hver fibrilsuspension opvarmedes til 60°C og indstilledes til pH 9,0-11,0 [(1): 9,9 og (2): 9,7] med 10% kaliumhydroxid til opnåelse af 17 143707 klare opløsninger. Der tilsattes 281 g "Norit A" (0,4 g/g faststof), og efter 10 minutters omrøring blev hver opløsning genindstillet til pH 5,0 under anvendelse af 10% phosphorsyre, og filtreredes, medens den var varm, på tragte med ED nr. 613 filterpapir. Hvert filtrat (krystallisationsopløsning) omrørtes yderligere langsomt i 16-20 timer under afkøling, til 4°C til fremme af ensartet glu-cagonkrystallisation. Bundfaldene, der var frasepareret ved filtreringen ved pH 5,0 og 60°C, og som bestod af urenheder og en mindre mængde glucagon, blev behandlet igen til udvinding af glucagonkrystaller, der var afsat på filtrerpapiret, ved suspendering i 120 liter 0,2% phenolvand til en faststofkoncentration på 0,5% (8 g faststof), opvarmning til 60°C, indstilling af pH til 10,0 til opløsning af den totale mængde faststof, omrøring i 10 minutter og genindstilling af pH til 5,0 (hvor glucagon er opløseligt) med 10% phosphorsyre og filtrering varmt under anvendelse af gravitetsfiltrering. Filtratet omrørtes langsomt i 16-20 timer under afkøling til 4°C. Krystallisationen er sædvanligvis tilendebragt efter 72-120 timer. Bundfaldet fra den anden filtrering ved pH 5,0, som kun bestod af urenheder, blev kasseret. De to krystallisationsmodervæsker fra første og modervæsken fra anden krystallisationsblanding dekanteredes fra og sugefiltreredes hver for sig. Den anden modervæske, der kun indeholder spor af glucagon, bortkastedes, og hver af de første modervæsker blev behandlet med 20% (vægt/volumen) natriumchlorid til udfældelse af glucagon, der ikke allerede var krystalliseret. De herved opnåede bundfald blandedes og blev genoparbejdet efter genudfældning ved pH 4,6 ved en anden krystallisation til opnåelse af yderligere glucagonkrystaller. Glucagonkrystalleme fra de to portioner, der udgjorde det første pH 5 filtrat, og krystallerne opnået ved genoparbejdning af de kombinerede første pH 5 bundfald opsamledes ved centrifugering i 3 minutter, separeredes fra modervæsken, overførtes til lyophiliseringsbeholdere under anvendelse af koldt vand som suspensionsmedium og frysetørredes. Glucagonkrystalleme fra krystallisationen blev vejet, og prøverne blev analyseret. Glucagonmellemproduktkrystaller: 18 T 43 7-07

Udbytter (1. pH 5 filtrater) (l) 41,0 g (renhedsgrad 91,7$) og (2) 44,0 g (renhedsgrad 86,8$), hvilket ialt giver 85,0 g (89,1$ rent) produkt, hvilket svarer til 75,8 g glucagon, 132 ^ug/kg O.P. (rent) eller 151 /Ug/kg O.P. (som råprodukt). De første genoparbejdade krystaller (1. pH 5 bundfald) gav 19,0 g (100$ rent), 34 /Ug/kg O.P.

. og andet hold genoparbejdede krystaller (første modervæsker) gav 22,0 g (46$ rent) eller 9,9 g svarende til 18 /Ug/kg O.P. (rent) svarende til 38 /ug/kg O.P. (som råprodukt).

Det totale udbytte blev 126 g fast stof (216 yug/kg O.P.) med en renhedsgrad på 83,1$ svarende til 104,7 g glucagon (186 yug/kg O.P·)·

Omkrystallisation udførtes i forbindelse med andre opsamlede mellemproduktkrystaller. De endelige glucagonkrystaller repræsenterede 85$ af glucagonmængden, der var til stede i mellemproduktkrystallerne. Omkrystallisation blev udført ved pH 7,5 efter opløsning af mellemproduktkrystallerne ved pH 8,0-10,0 med 10$ kaliumhydroxid, ved en temperatur på 40°C og ved et faststofindhold på 1$. Herefter genindstilledes pH til 7,5 med 10$ phosphorsyre, der filtreredes og afkøledes.

De endelige krystaller blev opsamlet ved centrifugering efter dekantering af modervæsken (der blev oparbejdet igen for yderligere udbytte), udvasket to gange med 0,001$ natriumchlorid-opløsning, en gang med koldt destilleret vand og frysetørret.

Det beregnede udbytte var 89,0 g eller 158 yug/kg O.P., og udbytte fra den alkaliske krystallisationsmodervæske var 33,2$.

EKSEMPEL 3

Det glucagonholdige bundfald fra en isoelektrisk fældning analogt med trin A (1) i eksempel 1 genopløstes i et vandigt medium, hvis pH var indstillet til 7,5 med NaOH.

Opløsningen underkastedes i onbytningschromato graf i analogt med USA patentskrift nr. 3 715 345 over en kolonne af 4 liter sulfoneret macrotværbundet styren-divinylbenzen-copolymerhar-piks på kaliumsaltform (opnået ved ækvilibrering mod 0,005 M kaliumphosphatpuffer ved pH 7,5) ved under 5°C. Kolonnen elue- 19 143707 redes med 0,005 M phosphatpuffer ved pH 7,5, og eluatet, der blandt andet indeholder insulin, kan recirkulres til den alkaliske krystallisationsproces. Det adsorberede glucagon og andre basiske proteiner elueredes fra harpiksen med to portioner på henholdsvis 8 og 16 liter 0,1 N ammo-niumhydroxid, afbrudt af en mellemliggende henstandsperiode på 2 timer for at ækvilibrere pufferen og eluenten, hvorpå det samlede eluats pH indstilledes til 2,5, hvorpå der om ønsket efter en mellemliggende udsaltning og genopløsning, gennemførtes en glucagonfibrildannelse og krystallisation analogt med eksempel 1. Der opnåedes glucagon i et udbytte og renhed af samme størrelsesorden som eksempel 1.