JPH02264797A - Ｎａ，Ｋ―ＡＴＰａｓｅ阻害作用を有する新規ペプタイド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、Ｎａ、　Ｋ−ＡＴＰａｓｅ阻害作用を有する
新規ベブタイドに関し、詳しくはブタ十二指腸より見い
出された、医薬品の分野において有効に利用される新規
ベプタイドに関するものである。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕１９６
０年代にＮａ利尿を調節する新しい因子が体液中に存在
することが報告されて以来、多くの研究者によってこの
ような因子を有する生体物質がアプローチされてきた。

その後の研究で食塩負荷を受けた動物の尿、血液中にＮ
ａ、　Ｋ−ＡＴＰａｓｅ活性を抑制し、Ｎａ、　Ｋ−Ａ
ＴＰａｓｅの特異的阻害剤であるジゴキシンに対する抗
体と交叉反応を示し、！ｔａ利尿活性を有する物質が存
在することが報告された。

また、Ｎａ、　Ｋ−ＡＴＰａｓｅはジギタリスの生体内
でのレセプター（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と考えられており
・この物質は内因性ジギタリス様物質（ｅｎｄｏｇｅｎ
ｏｕｓｄｉｇｉｔａｌｉｓ　−１ｉｋｅ　ｆａｃｔｏｒ
＋　ＥＤＦ）として近年、注目されている。

Ｎａ、　Ｋ−ＡＴＰａｓｅはＮａ”とにゝのバランスを
調節している酵素の一種であり、腎機能、心機能に対し
重要な働きを存し、更に脳内においても重要な働きを有
し、生体の恒常性維持に深く関与している。

例えば、高血圧患者の尿中や血中において、そのような
物質が正常人より多く検出されていることから高血圧症
との相関性、更にジギタリスの心臓、腎臓に対する作用
等から各種疾患と強い関係を有するものとして病理学的
にも注目されている。

ＥＤＦはヒト尿、ヒト血漿、ブタ血漿、モルモット心臓
等に存在することが下記に示す文献等に報告されている
。しかしながら、本物質はいまだ単離、構造決定はされ
ておらず、未だ本体は不明である。

−Ｋｒａｔａｅｒ　Ｈ，Ｊ、、　Ｒｅｎａｌ　Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ、＋　　８．８０（１９８５）・　にｅｌｌｙ　
　Ｒ，Ａ、、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｗ−＋
　　２６０．　１１３９６・　Ｈａｍｌｙｎ　　Ｊ、　
　Ｍ、ｌ　　Ｈｅｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ＋　　　’Ｌ　
　８４７（１９８５）・　Ｔａｍｕｒａ　　Ｍ、、　　
Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｗ、、　　２６０　　９
６７２（１９８５）・　Ｆａｇｏｏ　　Ｍ、、　　Ｂｉ
ｏｃｈｅａｍ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ、　　
Ｃｏｍｍｕｍ、。

Ｕ五５５３　（１９８５） 弓１ａｌｐｅｒｉｎ　Ｊ、　Ａ、、　　Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｗ、、　２６０　６４６（１９８Ｂ） ０Ｇｏｔｏ　Ａ、、Ｂｉｏｐｈｅｓ＋、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、＋■虹８４７　（１９８Ｂ） 【課題を解決するための手段〕 本発明者は、ブタ十二指腸抽出物中にＮａ、　ＫＡＴＰ
ａｓｅ阻害作用を有する物質が存在することを発見した
。そこで更に精製単離し、得られた物質について化学構
造を解明したところ、新規なペブタイドであることを知
り、本発明を完成するに至った。

即ち本発明は、−次槽造式 （式中、ＸはＡｒｇ又はｃｔｙであり、ＸがＡｒｇのと
きＹはＳｅｒ、　ＸがＧｌｙのときＹはｃｔｙである。

）によって示されるＮａ＋　Ｋ−ＡＴＰａｓｅ阻害作用
を有する新規ベブタイドを提供するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明のベブタイドは、ブタ十二指腸より抽出精製され
る。抽出精製は、従来一般に公知の方法を準用して行え
ばよいが、例えば以下のごとき概要の方法を示すことが
できる。

先ず、ブタ十二指腸よりＶＩＰ分割物を用意する。ＶＩ
Ｐ分割物をブタ十二指腸より得るためには、例えば、鈴
木、荒木、橘；薬学雑誌１皿。

１７２　（１９７９）に記載の方法を使用することがで
きる０次にＶＩＰ分割物を側−セファデックスカラムク
ロマトグラフィー、ＳＰ−セファデックスカラムクロマ
トグラフィー及び側−セルロースカラムクロマトグラフ
ィー等の陽イオン充填クロマトグラフィーの各精製処理
によりそれぞれ溶出液のｐＨ及び塩濃度を変化させ溶出
させる。なお、この間における活性画分の追跡は、Ｎａ
、　Ｋ−ＡＴＰａｓｅ阻害作用を測定することによって
行う。

Ｎａ、　Ｋ−ＡＴＰａｓｅ阻害作用を有する活性成分を
集める０次に、望ましくはセファデックスＧあるいはバ
イオゲルＰを用いてゲル濾過を行ってから、逆相クロマ
トグラフィーはヌクレオジルＣＩ８．ヌクレオジルＣＮ
の如く疎水基修飾したシリカゲル担体を使用し、濃度勾
配のある親水性有機溶媒の水溶液で溶出させ、活性を測
定して目標画分を集める。親水性有機溶媒の例としては
、エタノール、メタノール、プロピルアルコールのごと
き低級脂肪族アルコールやアセトニトリルのごとき低級
脂肪族ニトリルを挙げることができるが、特に好ましく
はアセトニトリルである。

ここに記した抽出精製において操作の順序は適宜変更し
てもよい。

本発明のベブタイドはブタ十二指腸を原料として抽出精
製することによって製造することができるが、固相法あ
るいは液相法を使用した合成によって製造することも可
能である。また、遺伝子組換技術によって製造してもよ
い。

本発明のベブタイドの構造解析は後述の実施例に示され
るごとく、次のように行えばよい。

まず、アミノ酸分析によりアミノ酸組成を確認する。

本発明のベプタイドはシスティンが８個存在し、Ｓ−８
結合が４個存在することが知られる。

次に、ジチオスレイトールにて還元処理し、Ｓ−５結合
を開裂してからカルボキシメチル（ＣＭ）化して側−ベ
ブタイドを得る。更にその一部についてキモトリプシン
又はリジルエンドペプチダーゼで処理し、それぞれのフ
ラグメントを得る。　ＣＭ−ベブタイド及びキモトリプ
シン又はリジルエンドペプチダーゼフラグメントのアミ
ノ酸配列をシークエンサーにて解析する。Ｃ端部はカル
ボキシペプチダーゼＹにて分析する。

以上、総合して全アミノ酸配列を決定する。

〔実施例〕

以下に記載する実施例をもって本発明を更に具体的に説
明する。

実施例１ 新鮮ブタ十二指腸２０ｋｇを、沸騰水中で５分間処理し
た後、０．１Ｍ酢酸にてホモジナイズし、抽出する。上
清をＣＭ−セルロースに吸着させた後、０．ＩＮ塩酸溶
液で溶出し、塩析により沈澱を得る。これを９５％イソ
プロピルアルコール、次いでメタノールにて抽出し、イ
ソプロピルアルコール層及びメタノール層を濃縮乾固す
る。

これを０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐ）１６．５）
にてよく緩衝化したけ一セルロースに流し、吸着させ、
０．０６Ｍ食塩を含む０．０１Ｍクエン酸リン酸緩衝液
（ｐ）１６　、５）にてセクレチンを溶出させた後、溶
出しない吸着物質を０．ＩＮ塩酸溶液にて溶出し、塩析
にて得られた物質を原料とする。

得られた原料３０ｇを５００−の水に溶解し、ｐＨ６，
０に調整した。これを０．０５Ｍ蟻酸アンモニウム緩衝
液（ｐＨ６，５）で平衡化したＣＭ−セファデックスＧ
−２５カラムに流して吸着させる０次に０．５Ｍ蟻酸ア
ンモニウム緩衝液（ｐＨ６，５）にて溶出させた後、２
Ｍ蟻酸アンモニウム（ｐｔ１８．ｏ）にて吸着している
物質を溶出する。この画分にＮａ、　Ｋ−ＡＴＰａｓｅ
　　阻害活性物質が含まれる。得られた溶出液を凍結乾
燥した。得られた物質１．８ｇを３０−の０．１Ｍ酢酸
に溶解し、これを０．１Ｍ酢酸で平衡化したセファデッ
クスＧ−２５カラムに流し、Ｎａ。

Ｋ−ＡＴＰａｓｅ阻害活性画分を集め、凍結乾燥した。

得られた物質９５０ｍｇを０．１Ｍ酢酸に溶解し、これ
を１０％アセトニトリル溶液（０，１％トリフルオロ酢
酸含有）で平衡化したヌクレオジルＣＩ。

カラム（直径１０１１１１×長さ３００　ａｍ）の逆相
カラムに流し、同上溶液と６０％アセトニトリル溶液（
０，１％トリフルオロ酢酸含有）とによる濃度勾配溶出
を行った。Ｎａ、　Ｋ−ＡＴＰａｓｅ阻害活性を有する
活性画分を集め、凍結乾燥した。

得られた物質１０５ｍｇを０．１Ｍ酢酸に溶解し、これ
を１０％アセトニトリル溶液（０，１％トリフルオロ酢
酸含有）で平衡化したヌクレオジルＣＮ（直径４．６　
ｍｓＸ長さ２５０ｓｎ）に流し、同上溶液と８０％アセ
トニトリル溶液（０，１％トリフルオロ酢酸含有）とに
よる濃度勾配溶出を行った。　Ｎａ。

Ｋ−ＡＴＰａｇｅ阻害活性画分を集め凍結乾燥した。

得られた物質を０．１　Ｍ酢酸に溶解し、これを２５％
アセトニトリル（０，１％トリフルオロ酢酸含有）で平
衡化したヌクレオジルＣｌ１１カラム（直径４．６１曽
×長さ２５０ｍ５　）に流し、同上溶液を連続して流し
、活性物質を溶出させる。

溶出曲線を図１に示す。

図の横軸は試料を注入してからの経過時間（分）を表し
、縦軸は吸光度（２８０ｎｍ）を表す。

図中実線は溶出曲線を示し、Ｎａ、　Ｋ−＾ＴＰａｓｅ
阻害作用をもつ活性画分（図１の斜線部分に相当する両
分（Ａ）、百分（Ｂ）１両分（Ｃ））を集め、それぞれ
凍結乾燥した。

得られた物質についてヌクレオジルＣ１ｌ逆相クロマト
グラフィーを行ったところ、いずれも単一ピークを示し
、活性物質（Ｂ）についてアミノ酸分析を行ったところ
表１に示す組成比であった。

表１ アミノ酸組成比 更に下記の要領で構造解析を行い、本発明のベブタイド
が得られたことを確認した。

盪遣■扼 活性物質（Ｂ）　２０ｎｍｏｌを１％ジチオスレイトー
ル溶液で還元し、Ｓ−Ｓ結合を開裂させカルボキシメチ
ル（ＣＭ）化した。

逆相クロマトグラフィーで精製したＣＭ−ベブタイドｌ
　ｎｍｏｌをとり、気相シークエンサー（アプライドバ
イオシステム）にてアミノ酸配列を分析した。

次にＣＭ−ペプタイド２ｎｓｏｌをキモトリプシンによ
り分解し、ヌクレオジルＣ１，カラム（直径４．６５ｕ
ｉＸ長さ２５０ｍｍ）を使用し、１％〜６０％アセトニ
トリル溶液（０，１％トリフルオロ酢酸含有）を用い、
濃度勾配溶出を行い、４個のフラグメントを分取した。

また、ＣＭ−ペプタイド２０ｍｏｌをリジルエンドペプ
チダーゼにより分解し同じ操作によって６個のフラグメ
ントを分取した。

各々の一部をとり、アミノ酸分析を行い、残りは気相シ
ークエンサーによってアミノ酸配列を解析した。

Ｃ端部のアミノ酸配列の確認は、Ｑ、５ｎａ＋ｏｌのＣ
Ｍ−ベブタイドを用い、カルボキシペプチダーゼＹによ
り分解した０反応１０分後、３０分後、１時間後、２時
間後、４時間後、１２時間後に反応液の一部を分取し、
遊離したアミノ酸をピタコグシステム（日本ウォーター
スリミテツド）（Ｃｏｈｅｎ　Ｓ、　Ａ、、　Ｎａｔｕ
ｒｅ、　３２０７６９　（１９８６））にて分析した。

全構造とアミノ酸配列の手順をまとめて図２に示した。

図中りはりジルエンドペプチダーゼフラグメント、ＫＰ
はキモトリプシンフラグメントを示し、→、仲、→印は
気相シークエンサーによる配列決定も示し、←印はカル
ボキシペプチダーゼＹ（ＣＰ−Ｙ）による配列決定を示
す。

また、活性物質（Ａ）は気相シークエンサーによるアミ
ノ酸配列解析の結果、活性物質（Ｂ）の１３位のアミノ
酸であるロイシンから始まり、以下間り配列を示す類偵
ベブタイドであるこ・とを活性物質（Ｂ）と同じ方法に
より確認した。

活性物質（Ｃ）については、カルボキシメチル化したの
ち気相シークエンサーによるアミノ酸配列解析の結果、
Ｎ端部１８位まで活性物質（Ｂ）と同じであることを確
認した。次いでカルボキシメチル化したベブタイドをリ
ジルエンドペプチダーゼにて分解したのち生じたフラグ
メントをＨＰＬＣにて解析・分取した結果、一つだけ活
性物’ｌ　（Ｂ）では見られない新しいフラグメントが
確認され他のフラグメントは活性物質（Ｂ）のそれとＨ
ＰＬＣでのＲｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　　とアミノ
酸分析値が一致した。活性物質（Ｃ）で新しく確認され
たフラグメントを気相シークエンサーを用いてアミノ酸
配列を解析した結果、１７位から３５位のベプタイドに
相当し活性物質（Ｂ）の２２位のアルギニンと３０位の
セリンがそれぞれグリシンに置き換わり他のアミノ酸配
列は同じである新規構造を有することを確認した。

Ｎａ、　Ｋ−＾ＴＰａｓｅ阻害作用を有する新規なベブ
タイド（活性物質（Ｂ）及び（Ｃ））は下記薄層クロマ
トグラフィーの条件でいずれもモノスポットであった。

薄層板；　５ｉｌｉｃａ　ｇｅｌ　６０　Ｆ−２５４プ
レート展開溶媒；ｎ−ブタノール：酢酸：水−ｔ：ｉ：
を活性物質（Ｂ）　Ｒｒ”０．０５ 活性物質（Ｃ）　Ｒｖ−０，０２ ｎ−ブタノール：ピリジン：酢酸：水 −１５：１０：３：１２ 活性物質（ａ）　Ｒｔ−０，３２ 活性物質（Ｃ）　Ｒｒ−０，３０ 検出：ニンヒドリン試薬 〔発明の効果〕 本発明のベブタイドがＮａ、　Ｋ−ＡＴＰａｓｅ阻害活
性を有することを下記の実験例によって示す。

実験例 反応溶液の組成は下記のものを使用する。

〈反応溶液組成〉 ０．０５Ｍ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）、０．１
３Ｍ塩化ナトリウム、３ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ
エチレンジアミンテトラ酢酸、３ＩＩＭアデノシントリ
ホスフェイト、２０ａ＋Ｍ塩化カリウム。

この組成の溶液０．２−にＮａ、　Ｋ−ＡＴＰａｓｅ　
Ｏ，０１ユニツトを加え、３７℃で３０分間反応させた
後、６０％過塩素酸０．０４−を加え反応を停止させる
。

遊離した無機リン酸をマラカイトグリーンとモリブデン
酸アンモニウムにより発色させ、６６０ｎ−の吸光度を
測定することによりＮａ、　Ｋ−ＡＴＰａｓｅ活性を測
定することができる。

皿定少慧来 本発明のベブタイド２．５ｒｖｏｌ／＠ｊの濃度で約５
０％ＮＢ、　［−ＡＴＰａｓｅ阻害作用を有することが
わかった。

【図面の簡単な説明】

図１は実施例１で得られたＮａ、　Ｋ−ＡＴＰａｓｅ阻
害活性画分のヌクレオジルＣ１ｌカラムの溶出曲線を示
し、図２は活性物質（Ｂ）の全構造とアミノ酸配列を示
す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 一次構造式 【遺伝子配列があります。】 （式中、ＸはＡｒｇ又はＧｌｙであり、ＸがＡｒｇのと
   きＹはＳｅｒ、ＸがＧｌｙのときＹはＧｌｙである。）
   によって示されるＮａ、Ｋ−ＡＴＰａｓｅ阻害作用を有
   する新規ペプタイド。