CN1327049A - 产l－谷氨酸棒状细菌及生产l－谷氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

公开内容为α－酮戊二酸脱氢酶缺陷的产L－谷氨酸棒状杆菌,一种用该细菌生产L－谷氨酸的方法,编码来源于产L－谷氨酸棒状杆菌具有α－KGDH活性的酶的基因,含有该基因的重组DNA,携带该重组DNA的棒状杆菌,以及一种用携带该重组DNA并具有L－赖氨酸生产能力的细菌生产L－赖氨酸的方法。

Description

产L-谷氨酸棒状细菌及生产L-谷氨酸的方法
本申请是申请日为1995年6月7日，申请号为95194559.9，发明名称为“α-酮戊二酸脱氢酶基因”的发明专利申请的分案申请。
                      技术领域
本发明涉及用于L-谷氨酸和L-赖氨酸发酵生产的棒状杆菌的培育和利用。特别地，本发明涉及α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)有缺陷的棒状产L-谷氨酸细菌，一种利用该细菌生产L-谷氨酸的方法，一种编码具有α-KGDH活性的酶并来源于棒状产α-谷氨酸细菌的基因(α-KGDH基因)，含有该基因的重组DNA，携带该重组DNA的棒状杆菌以及一种利用携带该重组DNA并具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌生产L-赖氨酸的方法。
                      背景技术
迄今为止在工业上利用短杆菌或棒状杆菌属的棒状杆菌采用发酵方法生产L-谷氨酸。
最近公开一种大肠杆菌突变株，其中α-KGDH活性缺陷或降低并且谷氨酸分解活性降低，具有高的L-谷氨酸生产能力(日本公开专利：5-244970号)。
相反地，据报道一种短杆菌属的细菌突变株与其母本菌株相比，α-KGDH活性降低，L-谷氨酸生产能力却近似相等(农业生物化学，44，1897(1980)，农业生物化学，46，493(1982))。因此认为α-KGDH活性水平对棒状杆菌中L-谷氨酸的生产并不重要。
另一方面，发现一种短杆菌属的产L-谷氨酸细菌的突变株，其α-KGDH活性降低，将该细菌培养于以过量生物素为碳源且不加入如青霉素及表面活性剂的有抑制生物素效应的物质的培养基中，细菌高效地生产L-谷氨酸(最大产率53％)(日本公开专利6-23779号)。然而，如上述已认为α-KGDH活性水平对棒状杆菌中L-谷氨酸的生产并不重要，却没有已将产L-谷氨酸棒状杆菌的α-KGDH基因克隆并分析的例子。并且并未发现α-KGD)H完全缺陷的棒状杆菌突变株。
                   发明内容
本发明的一个目的是得到来源于产L-谷氨酸棒状杆菌的α-KGDH基因，制备含有该基因的重组DNA，利用该重组DNA转化的微生物搞清α-KGDH活性对L-谷氨酸发酵生产的影响，并因而提供一种培育产L-谷氨酸棒状杆菌的新方法。具体地，本发明的一个目的是通过破坏染色体DNA上α-KGDH基因得到α-KGDH活性缺陷的产L-谷氨酸棒状杆菌，并提供一种用该细菌生产L-谷氨酸的方法。而且，本发明试图提供一种携带含有α-KGDH基因的重组DNA的棒状杆菌，和一种利用携带该重组DNA并具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌生产L-赖氨酸的方法。
本发明人得到一种来源于产L-谷氨酸棒状杆菌的α-KGDH基因，阐明其结构，用已引入该基因的质粒转化一种产L-谷氨酸棒状杆菌，并研究得到的转化体的α-KGDH活性水平与L-谷氨酸生产能力。结果发现α-KGDH活性显著影响L-谷氨酸的生产。而且，本发明人发现一种菌株，其中通过破坏产L-谷氨酸棒状杆菌染色体上α-KGDH基因消除了α-KGDH活性，该菌株培养于含有过量生物素且不加入如表面活性剂和青霉素的任何抑制生物素作用的物质的培养基中，生产并积累相当量的L-谷氨酸。另外，本发明人将含有α-KGDH基因的重组DNA导入具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌。结果发现，得到转化体的L-赖氨酸生产能力显著提高，于是本发明在这些发现的基础上完成。
换句话说，本发明提供：
(1)一种产L-谷氨酸棒状杆菌，它由于染色体上编码具有α-KGDH活性的酶的基因及其启动子的核苷酸序列中一个或几个核苷酸的替换、缺失、插入、加入或倒位而造成α-KGDH活性缺失。
(2)一种生产L-谷氨酸的方法，包括：在液体培养液中培养上述(1)款的产L-谷氨酸棒状杆菌，在培养液中生产并积累L-谷氨酸，再收集。
(3)一种来源于产L-谷氨酸棒状杆菌的α-KGDH基因。
(4)通过将来源于产L-谷氨酸棒状杆菌的α-KGDH基因与在棒状杆菌中起作用的载体相连接得到的重组DNA。
(5)携带上述(4)款的重组DNA的棒状杆菌。
(6)一种生产L-赖氨酸的方法，包括：在液体培养基中培养携带上述(4)款的重组DNA并具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌，在培养液中生产并积累L-赖氨酸，再收集。
本发明进一步如下详述，
本发明的产L-谷氨酸棒状杆菌包括以前归类于短杆菌属但现在属于棒状杆菌属的细菌(国际系统微生物学杂志，41，255，(1981))，还包括属于短杆菌属但与棒状杆菌属亲缘关系近的细菌。这样的产L-谷氨酸棒状细菌举例如下：
嗜乙酰酸棒状杆菌
乙酰谷氨酸棒状杆菌
颈棒状杆菌
谷氨酸棒状杆菌
百合棒状杆菌(谷氨酸棒状杆菌)
melassecola棒状杆菌
扩展短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)
黄色短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)
immariophilum短杆菌
乳发酵短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)
玫瑰色短杆菌
糖分解短杆菌
生硫短杆菌
嗜热产氨(thermoaminogenes)棒状杆菌
特别地，举下列菌株为例：
嗜乙酰酸棒状杆菌ATCC13870
乙酰谷氨酸棒状杆菌ATCC15806
颈棒状杆菌ATCC15991
谷氨酸棒状杆菌ATCC13020
百合棒状杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC15990
melassecola棒状杆菌ATCC17965
扩展短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC14020
黄色短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC14067
immariophilum短杆菌ATCC14068
乳发酵短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC13869
玫瑰色短杆菌ATCC13825
糖分解短杆菌ATCC14066
生硫短杆菌ATCC19240
嗜热产氨棒状杆菌AJ12340(FERM BP1539)
本发明的α-KGDH基因可以如下述那样从上述产L-谷氨酸棒状杆菌野生菌株或其突变株的染色体DNA中获得。
已知大肠杆菌的α-KGDH复合体由三个亚基E1(α-酮戊二酸脱氢酶：EC1.2.4.2)，E2(二氢硫辛胺琥珀酰氨转移酶：EC2.3.161)，和E3(硫辛胺脱氢酶：1.6.4.3)组成，E1和E2基因形成操纵子结构，E3与丙酮酸脱氢酶(EC1.2.4.1)共用。大肠杆菌E1与E2基因的核苷酸序列已搞清(欧洲生物化学杂志，141，351(1984)，细菌学杂志，141，361(1984))。
对枯草芽孢杆菌，E1和E2基因的核苷酸序列也已搞清(细菌学杂志，171，3667(1989)，基因，61，217(1987)，等)。
于是通过利用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌E1基因核苷酸序列的同源性，本发明人成功地分离并克隆了来源于产L-谷氨酸棒状杆菌的α-KGDH基因。并且给出下述步骤。
首先，选择大肠杆菌和枯草芽孢杆菌α-KGDH的E1亚基基因中有高度同源性的区段，根据其两端的序列合成引物，只要满足下列条件：具有随机核苷酸组成，E＋C的含量约50％，不形成特殊的二级结构，相互之间不互补，任何序列均可用作引物。常用20-30个核苷酸长的序列。特别地，序列表中SEQ ID NOS：3和4中的序列用作例子。
其次，利用聚合酶链式反应法(PCR法)从引物和枯草芽孢杆菌染色体DNA制备含有部分枯草芽孢杆菌α-KGDH基因的探针。任何长度不小于20个核苷酸的探针均可应用，不过，探针长度最好不小于约100个核苷酸。探针最好具有与目的基因序列互补的核苷酸序列，不过，具有高度同源性的探针也可采用。
另一方面，提取产L-谷氨酸棒状细菌的染色体DNA，用限制性内切酶消化染色体DNA得到的DNA片段与载体相连接，制备重组DNA，重组DNA用来转化大肠杆菌。可用例如Bam HI，EcoRI，XhoI的限制性内切酶。采用来源于大肠杆菌的载体，如pUC19和pBR322。任何适于载体复制的菌株均可用做重组DNA的受体菌株。例如可用大肠杆菌菌株如HB101，JW109和DH5。
从这样得到的转化体中用菌落杂交手段选择与探针DNA杂交的菌株，从该转化体中回收重组DNA。分析与载体连接的产L-谷氨酸棒状杆菌染色体DNA的限制性内切酶片段的结构。
得到的DNA片段并不一定包含编码目的酶的基因的全长。这种情况下，用另一种限制性内切酶切割产L-谷氨酸棒状杆菌的染色体DNA，并使之与载体连接。制备重组DNA。重组DNA用来进行转化。用上面的方法利用菌落杂交选择并分析限制性内切酶片段。于是可得到含有α-KGDH基因全长的DNA片段。操作过程中，可方便地利用第一次得到的DNA片段作探针进行菌落杂交。
含有α-KGDH基因的DNA片段与另一适当载体重组后导入产L-谷氨酸棒状杆菌。可用的载体例如在棒状杆菌属细菌中自主复制的质粒。特别地，例子有pAM330(日本公开专利58-67699号)，pHM1519(日本公开专利58-77895号)，pAJ655，pAJ611，pAJ1844(日本公开专利58-192900号)，前三者，pCG1(日本公开专利57-134500号)，pCG2(日本公开专利58-35197号)，pCG4，pCG11(日本公开专利57-183799号)，pHK4(日本公开专利5-7491号)等。
为了通过将上述载体与产L-谷氨酸棒状杆菌α-KGDH基因相连接制备重组DNA，事先用限制性内切酶切割载体。用来切割的限制性内切酶与用来切割染色体DNA的相同。备选地，用可产生与染色体DNA片段切割面互补的切割面的限制性内切酶来切割。通常用例如74DNA连接酶连接。
用迄今见于报道的转化方法将不同的重组DNA导入受体。例如对大肠杆菌K-12报导有一种方法用氯化钙处理受体细胞增加DNA通透能力(分子生物学杂志，53，159，(1970))。对枯草芽孢杆菌报导有一种方法用增殖期细胞制备转化态细胞以导入DNA(C.H.基因，1，153，(1977)。备选地，也可用一种方法将DNA受体细胞转化成可容易地导入重组DNA的原生质体或原生质状态后将重组DNA导入DNA受体，已知该法用于枯草芽孢杆菌、放线菌和酵母(分子基因遗传学，168，111(1979)，Nature，274，398(1978)美国国家科学院院刊，75，1929(1978))。
用原生质体方法，既使在上述用于枯草芽孢杆菌的方法的情况下也能得到足够高的频率，不过，日本公开专利57-183799号公开，也可利用一种方法，其中棒状杆菌属细菌细胞的原生质体接触二价金属离子和聚乙二醇与聚乙烯醇二者任一种的状态下导入DNA。不加聚乙二醇和聚乙烯醇而加入羧甲基纤维素、葡聚糖、Ficoll.Bruronic F68(Selva公司制造)等也协助DNA导入。本发明实施例应用的转化方法是电脉冲法(见日本公开专利2-207791号)。
这样得到的细菌菌株，其中导入了含有来源于产L-谷氨酸棒状杆菌α-KGDH基因的重组DNA培养于含有碳源、氮源、无机盐和可选的有机微量营养的普通培养基。于是可以在细胞中高水平地生产具有α-KGDH活性的酶。
糖类如葡萄糖、蔗糖、糖蜜废料、淀粉水解物或有机酸如乙酸和柠檬酸，以及醇类如乙醇用作碳源，脲、铵盐、液氧、氨气等用作氮源，磷酸盐、钾盐、镁盐、铁盐、锰盐等用作无机盐。氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸以及含有它们蛋白胨、酵母提取物、大豆蛋白水解物等用作有机微量营养。
供氧条件下培养10-40小时，温度5-37℃，pH控制在5-9。
培养完成后，定量确定培养液中生产并积累的L-谷氨酸，并测量细菌细胞中α-KGDH活性水平。用农业生物化学，44，1897(1980)中描述的方法等测量活性：通过离心等方法从培养物中回收的细菌细胞用超声处理(Frech Prees处理等粉碎，然后离心去除细胞残片，凝胶过滤去除小分子量物质得到测量用样本。
于是对含有扩增基因的产L-谷氨酸棒状杆菌和一种不含扩增基因的细菌研究α-KGDH活性水平与L-谷氨酸生产能力的关系。结果表明，在由于基因扩增而α-KGDH活性水平升高的细菌中L-谷氨酸生产能力降低，见下述参考实施例1。
本发明的基因的利用包括通过插入药物相关基因等制备α-KGDH活性缺陷菌株，通过修饰启动子等制备表达下降的菌株，从而可能有效地培育一种细菌菌株，其L-谷氨酸生产能力与普通产L-谷氨酸棒状杆菌相比进一步提高。
用利用化学试剂诱变的方法或基于基因重组的方法得到α-KGDH活性缺陷的菌株。然而在利用化学试剂引入突变的方法中，获得α-KGDH活性降低的菌株相对容易，获得该活性完全缺失的菌株难。为得到后一种菌株，由于如上述α-KGDH基因的结构已阐明，通过基因同源重组修饰或破坏染色体上α-KGDH基因，这样的方法可能是有利的。通过同源重组破坏基因的方法已被建立，可以用利用线性DNA的方法，利用温度敏感性质的方法等。
特别地，用定点突变生成方法(Kramer，W和Frits.H.J.，酶学方法，154，350(1987))或用化学试剂如次硫酸钠和羟胺处理(Shortle，D与Nathans，D.，美国国家科学院院刊，75，270，(1978))在α-KGDH基因编码区或启动子区域的核苷酸序列中造成一个或多个核苷酸的替换、缺失、插入、增加或倒位。这样修饰或破坏的基因用来替代染色体上的正常基因。因而可能去除α-KGDH作为基因产物的活性或使α-KGDH基因不能转录。
定点突变生成方法利用一段合成寡聚核苷酸。该技术实现在可选的有限碱基对中引入可选的替换、缺失、插入、加入或倒位，用该方法，首先，具有确定的DNA核苷酸序列的目的基因并被克隆的质粒变性，制备单链。然后合成一段与将要产生突变的部分互补的合成寡聚核苷酸。不过，合成寡聚核苷酸不该具有完全互补的序列，而且有可选的核苷酸替换、缺失、插入、加入或倒位。单链DNA然后与具有可选的核苷酸替换、缺失、插入、加入或倒位的合成寡聚核苷酸退火。用DNA聚合酶1的Klenow片段和T4连接酶合成完整的双链质粒。导入大肠杆菌的转化态细胞。这样得到的一些转化体含有其中可选核苷酸替换、缺失、插入、加入或倒位被固定的基因。一种能将突变引入基因来修饰或破坏的相似方法包括重组PCR方法(PCR技术，Stockton press(1989))。
另一方面，利用化学试剂处理的方法中，含有目的基因的DNA片段直接用次亚硫酸钠，一羟胺等处理，具有核苷酸替换、缺失、插入、加入或倒位的突变随机引入DNA片段。
用通过引入突变来修饰或破坏得到的基因替换产L-谷氨酸棒状杆菌染色体上正常基因的方法包括利用同源重组的方法(分子遗传学实验，冷泉港实验室出版社(1972)；Matsuyama，S.和Mizushima，S.，微生物学杂志，162，1196(1985))。同源重组中，含有一段与染色体上序列同源的序列的质粒等引入细菌细胞，在有同源性的序列部分以一定频率发生重组，引入的整个质粒就导入染色体。若后来在染色体上有同源性的序列部分进一步发生重组，质粒又会从染色体上分离脱落。这时，根据重组发生的位置，带有引入突变的基因有时会固定到染色体上，而原来的正常基因随质粒从染色体上去掉并脱落。选择这样的细菌菌株，可得到细菌菌株，其中染色体上的一个正常基因被一个引入了核苷酸替换、缺失、插入、加入或倒位以修饰或破坏的基因所替代。
这样得到的α-KGDH活性缺陷的产L-谷氨酸棒状杆菌特别是含有过量生物素的培养基中比具有部分降低的α-KGDH活性的菌株有明显优异的L-谷氨酸生产能力。
为了利用α-KGDH活性缺陷的产L-谷氨酸棒状杆菌生产并积累L-谷氨酸，该细菌培养于含有碳源、氮源、无机离子和其它养分的液体培养基中。常规地，若培养在含有过量生物素的液体培养基中进行，有必要添加抑制生物素作用的物质，即青霉素如青霉素G、F、K、O、V或X，或者富含脂肪酸的表面活性剂如蔗糖单软脂酰或聚氧乙烯甘梨糖单软脂酸或其衍生物，到培养基中，以高产率地生产L-谷氨酸。
然而，用本实验的α-KGDH活性缺陷的产L-谷氨酸棒状杆菌时，既使培养在含有10-100μg/l的高浓度生物素的液体营养培养基中进行而不加任何上述抑制生物素作用的物质，生产和积累的L-谷氨酸也产率高，积累高。
换句话说，对碳源，亦可用富含生物素的原材料如甜马钤薯和甜菜的糖汁或糖蜜废料，除了(常用的)葡萄糖、果糖、糖化淀粉溶液，乙酸等。用于普通L-谷氨酸发酵的铵盐，液氨、氨气、脲等用作氮源。另外，视需要适当添加无机离子如磷酸盐和镁盐。视需要适当加微量养分如硫胺素到培养基中。
优选地在有氧条件下培养。培养过程中培养温度优选地控制在24-42℃，pH优选地控制在5-9。无机或有机、酸性或碱性物质，以及脲、碳酸钙、氨气等用来调节pH。
从培养液中收集L-谷氨酸的方法是适当地综合已知方法如离子交换树脂处理与结晶。
为了提高L-谷氨酸生产能力，增强谷氨酸生物合成的基因是有利的。增强谷氨酸生物合成系统基因的例子包括糖酵解途径中的磷酸果糖激酶(PFK，日本公开专利63-102692号)，回补途径中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC，日本公开专利60-87788和62-55089号)，TCA循环中的柠檬酸合成酶(CS，日本公开专利62-201585和63-119688号)，顺乌头酸水解酶(ACO，日本公开专利62-294086号)，异柠檬酸脱氢酶(ICDH，日本公开专利62-166890和63-214189号)。胺化反应的谷氨酸脱氢酶(GDH，日本公开专利61-268185号)等。
为得到上述基因，可用下述方法。
(1)对于一突变株，其中一目的基因发生突变并表达特定性状，得到一突变株，其中由于引入目的基因该性状消失。从棒状杆菌染色体得到与突变株性状互补的基因。
(2)若目的基因已由另一生物体获得并已阐明其核苷酸序列，利用具有高度同源性的区域的DNA作探针用杂交技术得到目的基因。
(3)若目的基因的一段核苷酸序列在细节上已相当清楚，用PCR方法(聚合酶链式反应方法)利用棒状杆菌染色体做模板得到含有目的基因的基因片段。
上述方法可用于获得此处应用的染色体。只要适用于上述方法应用的棒状杆菌，任何宿主-载体系统无可应用。在本发明的实施例中利用上述方法(3)，它当核苷酸序列已阐明时有效。
若用上述方法(2)和(3)得到基因，而目的基因原来没有启动子，可以将在棒状杆菌中具有启动子活性的DNA片段插入目的基因上游某一位置来表达目的基因。为了增强目的基因的表达可以将目的基因连到强启动子下游某一位置。在棒状杆菌中起作用的强启动子包括大肠杆菌的lac启动子tac启动子，trp启动子等(Y.Morinaga，M.Tsuchiya，K.Miwa和K.Sano，J.Biotech，5，305-312(1987))，此外，棒状杆菌属细菌的trp启动子也是优选的启动子(日本公开专利，62-195294号)。在本发明的实施例中，棒状杆菌的trp启动子用于表达PEPC基因。
本发明的α-KGDH基因的扩增有利于在具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌中提高其生产能力。
迄今有多种人工突变株用做产L-赖氨酸细菌。用它们作宿主以携带本发明的重组DNA可提高其L-赖氨酸生产能力，这样的人工突变株包括：对S(2-氨乙基)-半胱氨酸(以后缩写为“AEC”)有抗性的突变株；生长需要氨基酸如L-高丝氨酸的突变株(日本专利出版物48-28078和56-6499号)；对AEC表现抗性并需要氨基酸如L-亮氨酸，L-高丝氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-精氨酸，L-丙氨酸和L-缬氨酸的突变株(美国专利3,708,395和3,825,472号)；对DL-α-氨基-ε-(己内酰胺，α-氨基-ω-十二碳内酰胺，天冬氨酸类似物，磺胺药物，醌和N-月桂酰亮氨酸表现抗性的产L-赖氨酸突变株；对草酰乙酸脱羧酶或呼吸系统酶的抑制剂表现抗性的产L-赖氨酸酶(日本公开专利50-53588,5-31093,52-102498,53-9394,53-86089,55-9783,55-9759,56-32995,56-39778号和日本专利出版物53-43591,53-1833号)；需要肌醇或乙酸的产L-赖氨酸突变株(日本公开专利55-9784和56-8692号)；对氟丙酮酸敏感或温度不能低于34℃的产L-赖氨酸突变株(日本公开专利55-9783和53-86090号)；对乙二醇表现抗性并生产L-赖氨酸的短杆菌或棒状杆菌的突变株(见美国专利4,411,997号)等。
特别地，举下列菌株为例。
乳发酵短杆菌AJ12031(FERM-BP277，特开昭60-62994公报)
乳发酵短杆菌ATCC39134(特开昭60-62994公报)
谷氨酸棒状杆菌AJ3463(FERM-P1987，特公昭51-34477公报)
乳发酵短杆菌AJ12435(FERM-BP-2294美国专利5,304,476)
乳发酵短杆菌AJ12592(FERM-BP-3239美国专利5,304,476)
谷氨酸棒状杆菌AJ12596(FERM-BP-3242美国专利5,304,476)
可通过与上述适当载体连接将α-KGDH基因导入这样的产L-赖氨酸细菌。
用于L-赖氨酸生产的培养基是含有碳源、氮源、无机离子和可选的其它有机微量养分的普通培养基。糖类如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉水解物，醇类如乙醇和肌醇，有机酸如乙酸、延胡索酸、柠檬酸和琥珀酸用作碳源。无机铵盐如硫酸铵，氯化铵和磷酸氨，有机氮如大豆水解物，氨气，液氨等用作氮源。小量的磷酸钾，硫酸镁，铁离子，锰离子等加入用作无机离子。适量的必需物质如维生素B1。酵母提取物等如需要最好也包括在内，用作有机微量养分。
优选地在有氧条件下培养16-72小时，培养过程中培养温度控制在30-45℃，pH控制在5-8.5，无机或有机、酸性或碱性物质，以及氨气可用来调整pH。
通常可通过综合已知方法如离子交换树脂法、沉淀法等从发酵液中收集L-赖氨酸。
                    附图简述
图1是含有α-KGDH基因的DNA片段的限制性内切酶图谱。
               优选实施方案描述
本发明将在下面参考实施例更清楚地说明。对限制性内切酶，用商业产品(酒宝造公司制造)
实施例1：α-KGDH基因的分离与结构确定(1)制备探针
选择大肠杆菌和枯草芽孢杆菌α-KGDH的E1亚基基因之间有高度同源性的区域，磷酰胺法用DNA合成仪(Model 394，应用生物系统制造)合成序列表中SEQ ID NOS.3和4给出的寡聚核苷酸。
寡聚核苷酸(0.25μmole)作引物，枯草芽孢杆菌NA64的染色体DNA(0.1μg)用普通方法制备(该菌株得自Bacillus Genetic StockCenter(Ohio大学，美国)作模板，Taq DNA聚合酶(2.5单位)(酒宝造公司制造)加到0.1ml的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3)中，缓冲液含有dATP，dCTP，dGTP，dTTp各200μM，50mM氯化钾，1.5mM氯化镁和0.0001％明胶。用PCR方法，每轮包括94℃1分钟，55℃分钟2分钟，72℃3分钟，重复30次。反应溶液走琼脂糖凝胶电泳，目的DNA片段用玻璃粉(酒宝造公司制造)回收。用Klenow片段(Amersham制造)和[α-32dCTP](Amersham制造)以普通方法标记DNA片段，用作探针。(2)乳酸发酵短杆菌ATCC13869染色体DNA片段的制备
乳酸发酵短杆菌ATCC13869接种到500ml含1％细菌培养用胰蛋白胨(Difco制造)，0.5％细菌培养用酵母提取物(Difco制造)和0.5％氯化钠的F-Y培养基(pH7.2)。31.5℃培养6小时得到培养物。培养物5000 vpm离心10分钟，得到2g湿细胞沉淀物。
用Saito和Miura的方法(Biochem.BiophvsActa.，72，619(1963))从细胞片状沉淀物中提取染色体DNA。染色体DNA(2μg)和限制性内切酶EcoRI(200单位)分别与50mM含有10mM氯化镁，100mM氢化钠和1mM二硫苏糖醇的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)混合，37℃反应15小时。反应结束后，用普通方法将溶液酚提取处理，并乙醇沉淀处理得到EcoRI消化的乳酸发酵短杆菌ATCC13869染色体DNA片段。(3)乳酸发酵短杆菌ATCC13869 α-KGDH基因的分离
质粒载体pUC18(酒宝造公司制造)(1μg)和限制性内切酶EcoRI(20单位)与50mM含有10mM氯化镁，100mM氯化钠和1mM二硫苏糖醇的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)混合。用普通方法对溶液酚抽提和乙酸沉淀。然后，为防止来源于质粒载体的DNA片段重新连接，用分子克隆，第二版(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社，p1.60(1989)的方法用细菌碱性磷酸酶处理将DNA片段脱磷，接着用普通方法酚抽提和乙醇沉淀。
用EcoRI消化的pUC18(0.1μg)，第(2)步得到的用EcoRI消化的乳酸发酵短杆菌ATCC13869染色体DNA片段(1μg)和74DNA(1单位)(Takara Shuzo Co.Ltd.制造)加到含有6.6mM氯化锰，10mM二硫苏糖醇和10mM三磷酸腺苷的66mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，16℃反应8小时连接DNA。然后DNA混合物用来用普通方法转化大肠杆菌JM109(Takara Shuzo Co.，Ltd.制造)。将细菌铺到含100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂培养基，得到约10,000转化体。
用分子克隆，第二版(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社，p1.90(1989)的方法与第(1)步得到的探针DNA杂交，从得到的转化体中筛选出一个转化体。(4)乳酸发酵短杆菌ATCC13869 α-KGDH基因核苷酸序列的确定
用分子克隆，第二版(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社，p1.25(1989)中碱性细菌水解方法从第(3)步得到的转化体体制取质粒DNA，质粒DNA含有来源于乳酸发酵短杆菌AT 13869染色体DNA的约6千碱基的DNA片段。在(3)中反应组成用限制性内切酶EcoRI和XhoI消化质粒，然后用普通方法琼脂糖凝胶电泳。与(3)相同进行Southern杂交确定与探针DNA杂交的片段。结果表明一段用EcoRI和XhoI消化的约3千碱基的切割片段杂交。如(3)那样，该DNA片段与用EcoRI和XhoI消化的质粒载体pHS397(Takara Shuzo Co.，Ltd.制造)连接并克隆。得到的质粒DNA用来确定DNA片段的核苷酸序列。用Sanger的方法(J，Mol.Biol，143,161(1980)用Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing试剂盒(应用生物系统制造)确定核苷酸序列。
由于得到的DNA片段不含有完整的开放阅读框架，用XhoI切割乳酸发酵短杆菌ATCC13869的染色体DNA，将它与pHSG397连接，如(3)那样，得到重组质粒，用重组质粒进行转化。用(1)的方法将从(2)得到的来源于乳酸发酵短杆菌ATCC13869染色体DNA的约3千碱基EcoRI-XhoI切割片段标记，得到的探针用来筛选杂交转化体。得到的转化体所携带的质粒含有一段约6千碱基的DNA片段。含有该DNA片段的基因的限制性图谱由图1给出。用(3)的反应组分用限制性内切酶SalI和XhoI消化质粒，然后用普通方法琼脂糖凝胶电泳，用(3)的方法确定杂交片段。结果发现一段约4.4千碱基的片段。用如(3)那样SalI和XhoI消化的质粒载体pHSG 397与DNA片段连接并克隆。该质粒命名为pHSG-X。用与上述相同的在确定质粒中SalI-XhoI切割片段从SalI切割位点到EcoRI切割位点约1.4千碱基的DNA片段的核苷酸序列。
得到的SalI-XhoI切割基因片段的核苷酸序列由序列表中SEQ IDNO：1给出。估计有开放阅读框架，由该核苷酸序列得到的一种产品的氨基酸序列由序列表中SEQ ID NOS：1和2给出。即，编码含有序列表中SEQ ID NO：1给出的氨基酸序列的蛋白质的基因是乳酸发酵短杆菌ATCC13869的α-KGDH基因。蛋白质N末端的蛋氨酸来源于作为起始密码子的ATG，因此它与蛋白质原来的功能常无关。众所周知翻译后该蛋氨酸残基被肽酶作用去除。相应地，上述蛋白质也可能以蛋氨酸残基去除形式出现。
该核苷酸序列和氨基酸序列就同源性分别与已知序列比较。所用数据库为EMBL和SWISS-PROT。结果表明序列表SEQ ID NO：1给出的DNA及其编码的蛋白质是棒状杆菌中的新基因和新蛋白质。与已报导的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的E1亚基基因及其编码蛋白质有同源性。
本发明的基因编码的蛋白质有1,257个氨基酸N-末端有蛋氨酸残基，与已报导的α-KGDH特征明显不同。也就是说，C末端的约900个氨基酸与各种E1亚基有高度同源性。然而，N末端的300个氨基酸不见于其它种的α-KGDH，这表明本发明的蛋白质有特殊的功能。将N-末端300个氨基酸的部分与已知序列进行同源性比较，发现该部分与大肠杆菌和固氮菌属细菌的E2亚基有同源性。这说明有可能本发明的蛋白质与其它种的α-KGDH不同，兼具E1和E2的活性。
另外，与见于大肠杆菌的普通启动子序列相似的序列(281-286和307-312)以及与棒状杆菌核糖体结合序列相似的序列(422-428)在本发明的基因的开放阅读框架上游找到。与转录终止信号相似的基环结构(4243-4281)在本发明的基因的开放阅读框架下游找到。这些序列表明本发明的基因独立地转录和翻译并具有与其它种α-KGDH不同的遗传结构。
实施例2：通过来源于乳酸发酵短杆菌ATCC13869的α-KGDH基因的表达增加α-KGDH活性(1)将α-KGDH基因导入乳酸发酵短杆菌ATCC13869和AJ11060
实施例(1)得到的pHSGS-X质粒DNA(1μg)和限制性内切酶SalI和XhoI(各20单位)混合于实施例(1)中(3)的缓冲液，37℃反应3小时。另一方面，在短杆菌属细菌中自主转录的质粒pPK4(参考日本公开专利5-7491号)DNA(1μg)和SalI(20单位)混合于实施例1中(3)的缓冲液中，37℃反应3小时。用普通方法对两种反应溶液进行酚抽提与乙醇沉淀。然后，为防止来源于质粒载体的DNA片段重新连接，用实施例1(3)的方法用细菌碱性磷酸酶处理将DNA片段去磷酸化，接着用普通方法酚抽提和乙醇沉淀。SalI消化的pPK4(0.1μg)，由上述得到的SalI-知XhoI消化的pHSGS-X pHSGS-X质粒DNA(0.5μg)和T4 DNA连接酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.制造)混合于实施例1(3)的缓冲液中，16℃反应8小时以连接DNA。接下来，用普通转化方法用电脉冲法(日本公开专利2-207791号)将DNA混合物导入乳酸发酵短杆菌AJ11060(日本专利出版物59-10797号)。得到的溶液铺到含有1％多聚蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％氯化钠，0.5％葡萄糖和25μg/ml卡那霉素的琼脂培养基上得到转化体AJ11060/pPKS-X。该转化体命名为乳酸发酵短杆菌AJ12999，于1994年6月3日贮存于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(1-3，Higashi l-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken305，日本)，贮存号FERMP-14349，并根据布达佩斯条约(协定)于1995年6月2日从原贮存处转到国际贮存处，贮存号FERM BP-5123。
依据实施例1(4)从得到的转化体提取质粒DNA，用普通方法进行琼脂糖凝胶电泳。于是选择到来源于乳酸发酵短杆菌ATCC13869的SalI和XhoI片段与质粒pPK4连接的重组DNA。得到的质粒命名为pPKS-X。
用乳酸发酵短杆菌ATCC13869用同样方法得到转化体ATCC13869/pPKS-X。(2)带有扩增α-KGDH基因的菌株的酶活性
(1)中得到的乳酸发酵短杆菌AJ11060/pPKS-X和ATCC13869/pPKS-X接种到50ml含有8％葡萄糖，0.1％磷酸二氢钾，0.004％硫酸镁，3％硫酸铵，0.001％硫酸亚铁，0.001％硫酸锰，0.05％大豆水解物溶液，200μg/l维生素B1，300μg/l生物素，5％碳酸钙和25mg/l卡那霉素的培养基(pH8.0)，31.5℃培养18小时。用普通方法离心培养液，收集细胞沉淀物。
将细胞沉淀物悬浮于0.2％氯化钾溶液，离心，重复操作两次清洗细胞沉淀物。细胞沉淀物用含有30％甘油的N-Tris(羟甲基)甲基-2-氨基乙酰磺酸(以后称为TES)的0.1M缓冲液(pH7.7)，超声处理，然后15,000vpm离心30分钟得到上清。该细胞裂解物进行SephadexE-15(Pharmara制造)柱层析，去除低分子量物质，制备粗酶溶液。
得到的粗酶溶液的α-KGDH活性利用Aqric.Biol.Chem.，44，1987(1980)描述的反应溶液组分根据365nm 3-乙酰嘌呤腺嘌呤二核苷酸吸收增加来测量。使用Bio-Rad制造的试剂盒以牛血清清蛋白为标准测量粗酶溶液的蛋白质浓度，并计算酶的比活。作为对照，用同样方法确定用质粒pPK4转化得到的AJ11060/pPK4和ATCC13869/pPK4的比活。结果由表一给出。AJ11060/pPKS-X和ATCC13869/pPKS-X的比活分别是AJ11060/pPK4和ATCC13869/pPK4的比活的两倍或更多。结果证明得到的基因片段编码具有α-KGDH活性的酶。
          表1
细菌菌株          α-KGDH比活
              (Δ吸收/分钟/mg蛋白)
AJ11060/pPK4         0.029
AJ11060/pPKS-X       0.055
ATCC13869/pPK4       0.019
ATCC13689/pPKS-X     0.060
粗酶溶液的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果观察到约135千道尔顿的带的扩增对应于所得基因预计的分子量为139千道尔顿的酶。这表明所得基因确实在转化菌株内表达。
参者例1：α-KGDH活性与L-谷氨酸生产能力的关系
乳酸发酵短杆菌AJ11060/pPK4和AJ11060pPKS-X培养于产L-谷氨酸培养基，测量生产并积累于培养液中的L-谷氨酸。如下用加入表面活性剂的方法进行培养。
含有8％葡萄糖，0.1％磷酸二氢钾，0.004％硫酸镁，3％硫酸铵，1.5％大豆水解物溶液，200μg/l盐酸硫胺素，300μg/l生物素，25mg/l卡那霉素和5％CaCO3(分别灭菌)的生产培养基(pH8.0，20ml)配好后倒入容积500ml的坂口烧瓶，加热灭菌。先前由分别培养于含有1％多聚蛋白胨(日本制药公司制造)1％细菌培养用酵母提取物(Difco制造)，0.5％氯化钠，0.5％葡萄糖和25mg/l卡那霉素的平板培养基(pH7.2)的AJ11060/pPK4和AJ11060/pPKS-X得到的细菌细胞接种到该培养基中，31.5℃振荡培养18小时，得到种培养物。
得到的种培养物按5％量接种到加了3g/l表面活性剂(Tween40：Sigma制造)的生产培养基和不加表面活性剂的生产培养基，用同样方法31.5℃培养20小时。
培养完毕，用旭化成公司制造的Biotech Analyaer As-210测量培养液中积累的L-谷氨酸的量及剩余的葡萄糖浓度。将培养物用0.02N盐酸稀释至51倍得到的溶液测620nm吸收，确定细菌细胞的生长量。结果由表2给出。
                      表2
菌株        表面    生长量    残留的糖    积累量    产率
           活性剂    (OD)      (g/dl)     (g/dl)    (％)AJ11060/pPK4    -       1.72       0.45         0        0
             +       0.78       1.80        2.46    42.4AJ11060/pPKS-X  -       1.31       1.89         0        0
             +       0.78       3.69        0.37    9.4
在未加表面活性剂的培养基中任何细菌菌株均未发现有L-谷氨酸的生产。只有当加入表面活性剂后培养液中才生产并积累L-谷氨酸。本实验中，在导入了含有α-KGDH基因的pPKS-X质粒的菌株中，比作为对照的导入pPK4的菌株L-谷氨酸产率显著降低。该事实表明加入表面活性剂后α-KGDH活性水平强烈影响L-谷氨酸的生产。
参考例2：用添加青霉素法比较L-谷氨酸生产能力
用添加青霉素法研究α-KGDH基因扩增对L-谷氨酸生产的效应。
用与参考实施例1相同的方法制备种培养物，种培养物分别接种到加了0.4单位/ml青霉素的生产培养基和不加青霉素的生产培养基，使细胞片状沉淀物干重约为2％，31.5℃振荡培养25小时。
培养完毕，用跟参考实施例相同的方法测量培养液中积累的L-谷氨酸的量及残留葡萄糖浓度。结果由表3给出。结果显示加入青霉素后α-KGDH活性水平强烈影响L-谷氨酸的生产。
                     表3
菌株             青霉素    生长量    残留的糖    积累量    产率
                  (OD)     (g/dl)     (g/dl)      (％)AJ11060/pPK4     -   1.84       0.0         0         0
              +   0.72       0.0        3.90      49.2AJ11060/pPKS-X   -   1.87       0.0         0         0
              +   1.07       0.0        2.39      30.1
实施例3：α-KGDH基因缺陷菌株的制备
根据L-谷氨酸的生产被α-KGDH基因扩增抑制这一事实，预期相反地，破坏α-KGDH基因应能提高L-谷氨酸产率。利用日本公开专利5-7491号描述的温度敏感型质粒用同源重组方法得到基因破坏的菌株。特别地，该α-KGDH基因含有两个被KpnI在序列表中SEQ IDNO：1的第1340和3266位消化的位点。实施例(1)得到的pHSGS-X用KpnI部分消化，然后自连接制备缺陷1926个碱基对的KpnI片段的质粒pHSGS-XΔK。pHSGS-XΔK的α-KGDH基因结构上缺少中间部分。下一步，将一种得自在棒状杆菌中自主复制并具有温度敏感型自主复制能力的质粒的突变型复制原点导入pHSGS-XAK的BamHI识别位点制备质粒pBTS-XΔK。特别的，一种得自在棒状杆菌中自主复制并具有温度生敏感型自主复制能力的质粒的质粒pHSC4(日本公开专利5-7491号)。用限制性内切酶KpnI消化。用DNA平未端形成试剂盒(酒宝造公司制造，Blunting试剂盒)得到平末端，然后与BamHI衔接物连接(酒宝造公司制造)。自连接得到一质粒，用限制性内切酶BamHI消化制备含有具有温度敏感型自主复制能力的突变型复制原点的基因片段。该基因片段导入pHSGS-XAK的BamHI位点制备质粒pBTS-XΔK。
用电脉冲法(日本公开专利2-207791号)将该质粒导入作为产L-谷氨酸棒状杆菌的野生菌株的乳酸发酵短杆菌ATCC13869，用日本公开专利5-7491号描述的方法将染色体上α-KGDH基因由缺陷型替代。特别地，导入了质粒的ATCC13869/pBTS-XΔK25℃在CM2G液体培养基(1％多聚蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％NaCl，0.5％葡萄糖，pH7.2)中振荡培养6小时，然后铺到含有5μg/ml氯霉素的CM2G琼脂培养基上，34℃培养形成菌落，得到质粒导入的菌株。用复制板法从众菌株中得到34℃对氯霉素敏感的菌株。用敏感型菌株研究染色体上α-KGDH基因的核苷酸序列，说明α-KGDH基因已替换成缺陷型。该菌株命名为ΔS菌株。用实施例2描述的方法测量ΔS菌株的α-KGDH活性未检测到任何活性。
实施例4：制备用于扩增gdh，gltA和icd基因的质粒(1)gdh，gltA和icd基因的克隆
用PCR方法克隆乳酸发酵短杆菌的gdh.gltA和icd基因。在已报导的谷氨酸棒状杆菌的gdh基因)分子微生物学，6(3)，317-326(1992))，gltA基因(微生物学，140，1817-1828(1994))。和icd基因(J.Batteriol.，177，774-782(1995))的序列的基础上合成用于PCR方法的引物。序列表中SEQ ID NOS：5(5′段)和6(3′段)给出的寡聚核苷酸用作扩增gdh基因的引物，SEQ ID NOS：7(5′段)和8(3′段)给出的寡聚核苷酸用作扩增gltA基因的引物，SEQ ID NOS：9(5′段)和10(3′段)给出的寡聚核苷酸用作扩增icd基因的引物，上述引物分别合成并应用。
用实施例1的方法从乳酸发酵短杆菌ATCC13869制备染色体DNA，用作模板用前述寡聚核苷酸作引物进行PCR。得到的扩增产物用商业上可购得的DNA平末端形成试剂盒(酒宝造公司制造，Blunting试剂盒)在两端得到平末端，然后克隆到载体质粒pHSG399(酒宝造公司制造)的SamI位点，分别得到质粒pHSG-gdh，pHSG-gltA，和pHSG-icd。(2)ppc基因的克隆与表达
用实施例1的方法制备乳酸发酵短杆菌ATCC13869的染色体DNA，用作模板利用PCR方法得到含有编码PEPC的ppc基因的约3.4Kbp的DNA片段。在已报导的谷氨酸棒状杆菌的ppc基因序列的基础上(基因，77，237-251(1989)合成用于PCR方法的引物，与上述相同程序进行PCR反应。引物序列由SEQ ID NOS：11(5′段)和12(3′段)给出。
PCR反应的扩增产物用限制性内切酶SalI(酒宝造公司制造)消化，再插入质粒pHSG399的SalI位点，得到质粒pHSG-ppc′。pHSG-ppc′的PEPC基因插入方法与pHSG399的lac启动子方向相反。
下一步，将一种能在乳酸发酵短杆菌中起作用的色氨酸操纵子的启动子(基因，53，191-200(1987)插入pHSG-ppc′上ppc基因的上游位置。已知该启动子具有序列表中SEQ ID NO：13给出的含有51个核苷酸的序列，并表现活性。合成具有SEQ ID NO：13给出的序列的核苷酸链和具有SEQ ID NO：14序列的核苷酸链作为其互补链，得到具有启动子活性并且其两端对应限制性内切酶KpnI和XbaI的切割片段的含有51个碱基对的双链DNA。
两条合成DNA混合浓度各为10 pmol/μg，100℃加热10分钟，静置室温冷却退火。pHSG-ppc′用限制性内切酶KnII和XbaI(酒宝造公司制造)消化，与上述启动子连接。用酒宝造公司制造的连接试剂盒进行连接反应。于是得到质粒pHSG-ppc，其中一拷贝的色氨酸操纵子启动子插入到ppc基因的上游位置。(3)通过连接三种基因gdh，gltA和icd构建的质粒的制备
连接三种基因gdh，gltA和icd制备一质粒。特别的，质粒pHSG-gdh用限制性内切酶EcoRI消化，购得的DNA平末端形成试剂盒(酒宝造公司制造，Blunting试剂盒)得到平末端，然后与上述两端平末端化的gltA基因的PCR扩增产物连接得到质粒pHSG-gdh+gltA。接下来，质粒pHSG-gdh+gltA用限制性内切酶KpnI消化。用同样方法得到平末端，与上述两端平末端化的icd基因的PCR扩增产物连接得到质粒pHSG-gdh+gltA+icd。(4)通过连接三种基因gdh，gltA和ppc构建的质粒的制备
连接三种基因gdh，gltA和ppc制备一质粒。特别的，质粒pHSG－gdh＋gltA用限制性内切酶KpnI消化。质粒pHSG-ppc用限制性内切酶KpnI和SalI消化得到在上游位置具有色氨酸操纵子启动子的ppc基因片段。得到的片段用DNA平末端形成试剂盒(酒宝造公司制造，Blunting试剂盒)得到平末端，然后用Kpn I衔接物(酒宝造公司制造)将其插入质粒pHSG－ghd＋gltA的KpnI位点，得到质粒pHSG－gdh＋gltA＋ppc。(5)将棒状杆菌的复制原点导入上述质粒
为使pHSG－gdh，pHSG－gltA，pHSG－ppc，pHSG－icd，pHSG－gdh＋gltA＋icd和pHSG－gdh＋gltA＋ppc在棒状杆菌细胞中自主复制，将已得到的来源于在棒状杆菌中自主复制的质粒pHM1519(Agric.Biol.Chem.，48，2901-2903(1984)的复制起点(日本公开专利5-7491号)导入pHSG－gdh，pHSG－gltA，pHSG－ppc，pHSG－icd，pHSG－ghd＋gltA＋icd和pHSG－gdh＋gltA＋ppc。特别的具有来源于pHM1519的复制起点的质粒pHK4(日本公开专利5-7491号)用限制性内切酶BamHI和KpnI消化，得到含有复制起点的基因片段。得到的片段用DNA平末端形成试剂盒(酒宝造公司制造，Blunting试剂盒)得到平末端，然后用Kpn I衔接物(酒宝造公司制造)分别插入pHSG－gdh，pHSG－gltA， pHSG－ppc和pHSG－icd的KpnI位点，得到pGDH，pGLTA，pPPC和pICD。接下来，相似地用SalI衔接物(酒宝造公司制造)将来源于pHM1519的复制起点分别插入到 pHSG－gdh＋gltA＋icd和pHSG－gdh＋gltA＋ppc的SalI位点，得到pGDH＋GLTA＋ICD和pGDH＋GLTA＋ppc。另外，相似地用SalI衔接物(酒宝造公司制造)将来源于pHM1519的复制起点插入不含这些基因的质粒pHSG 399的SalI位点，制备pSAC4作为对照。
实施例7：    pGDH，pGLTA，pPPC，pICD，pGDH+GLTA+ICD
             和pGDH＋GLTA＋PPC各基因的表达的确证
pGDH，pGLTA，pPPC，pICD，pGDH＋GLTA＋ICD和pGDH＋GLTA＋PPC上各基因在乳酸发酵短杆菌细胞中是否表达，以及这些质粒是否进行基因扩增得到确证。特别地用电脉冲法(日本公开专利2-207791号)将各质粒导入乳酸发酵短杆菌ATCC13869。得到的转化体用1升纯水中含有10g多聚蛋白胨，10g酵母提取物，5g葡萄糖，5g NaCl和15g琼脂(pH7.2)以及4μg/ml氯霉素的CM2G平板培养基进行选择。得到的转化体培养于CM2G琼脂培养基，然后接种到1升纯水含有80g葡萄糖，1gKH2PO4，0.4g MgSO4、30g(NH4)2SO4，0.01g FeSO4·7H2O，0.01g MnSO4·7H2O，15ml大豆水解物溶液，200μg盐酸硫胺素，300μg生物素和50g CaCO3的培养基(用KOH调pH至8.0)中，31.5℃培养16小时。用普通方法离心培养液，收集细菌细胞。
磨碎细菌细胞得到粗提取物，用来利用分子微生物学，6(3)，317-326(1992)中描述的方法测量ATCC13869/pGDH，ATCC13869/GDH＋GLTA＋ICD和ATCC13869/pGDH＋GLTA＋ppc的GDH活性。结果发现这些转化体的每一种与ATCC13869/pSAC4对照相比有13倍的GDH活性(表4)。用微生物学，140，1817-1828(1994)的方法测量ATCC 13869/pGLTA，ATCC13869/pGDH＋GLTA＋ICD，和ATCC13869/pGDH＋GLTA＋ppc的CS活性。用J.Bacteriol，177，774-782(1995)的方法测量ATCC13869/pICD和ATCC13869/GDH＋GLTA＋ICD的ICDH活性。用基因，77，237-251(1989)的方法测量ATCC13869/pPPC和ATCC13869/pGDH＋GLTA＋ppc的PEPC活性。测量结果由表5-7给出。发现任何转化体与ATCC13869/pSAC4对照相比均有2到20倍的目的酶活性。该事实证明pGDH，pGLTA，pPPC，pICD，pGDH＋GLTA＋ICD和pGDH＋GLTA＋PPC的各基因在乳酸发酵短杆菌中表达并执行功能。
                  表4
     细菌菌株              GDH活性
                      ΔAbs/min/mg蛋白)
ATCC13869/pGDH               1.36
ATCC13869/pGDH＋GLTA＋ICD    1.28
ATCC13869/pGDH＋GLTA＋PPC    1.33
ATCC13869/pSAC4              0.11
                 表5
     细菌菌株              CS活性
                    (umole/min/mg蛋白)
ATCC13869/pGLTA              5.5
ATCC13869/pGDH＋GLTA＋ICD    4.8
ATCC13869/pGDH＋GLTA＋PPC    4.8
ATCC13869/pSAC4              0.7
                 表6
   细菌菌株               PEPC活性
                     (units/min/mg蛋白)
ATCC13869/pPPC               1.12
ATCC13869/pGDH＋GLTA＋PPC    1.04
ATCC13869/pSAC4              0.11
                 表7
    细菌菌株             ICDH活性
                     (units/min/mg蛋白)
ATCC13869/pICD              3.5
ATCC13869/pGDH＋GLTA＋ICD   2.8
ATCC13869/pSAC4             1.0
实施例8：ΔS菌株的L谷氨酸生产，以及具有扩增的gdh，
          gltA，ppc和icd基因的ΔS菌株(1)发酵罐中ΔS菌株L-谷氨酸生产的评价
在1升纯水中含有60g葡萄糖，1g KH2SO4，0.4MgSO4，30g(NH4)2SO4，0.01g FeSO4·7H2O，0.01g MnSO4·7H2O，15ml大豆水解物溶液，200μg盐酸硫胺素和450μg生物素的培养基(300ml)加入1升容积的发酵罐，加热灭菌。在CM2G琼脂培养基上培养得到的ΔS菌株的细菌细胞接种于其中，31.5℃培养30小时，用氨气调整pH至7.0，7.2或7.5。
培养完毕，测量培养基中细菌细胞浓度和积累的L-谷氨酸的量。用旭化成公司制造的Biotech Analyzer AS-210定量确定L-谷氨酸。将培养液用纯水稀释至51倍，用660nm处吸收(OD660)测量细菌细胞浓度。结果由表8给出。
           表8
pH       细菌细胞浓度    L-谷氨酸
            (OD)          (g/l)
7.0         0.84            35
7.2         0.85            34
7.5         1.07            32
已确证尽管ΔS菌株培养于含过量生物素的培养基中，仍能高产率地生产并积累L-谷氨酸。(2)发酵罐培养的ΔS菌株以及带有扩增的gdh，gltA，ppc和icd基因的ΔS菌株L-谷氨酸生产的评价
将上述制备的pGDH，pGLTA，pPPC，pICD，pGDH＋GLTA＋ICD或pGDH＋GLTA＋PPC导入ΔS菌株以评价导入各质粒的转化体的L-谷氨酸生产能力，用电脉冲法(日本公开专利2-207791号)将质粒导入乳酸发酵短杆菌的细胞中。用1升纯水中含有10g多聚蛋白胨，10g酵母提取物，5g葡萄糖，5g NaCl和15g琼脂及含有4μg/ml氯霉素的CM2G平板培养基(pH7.2)选择得到的转化体。
如上述(1)款那样评价ΔS菌株及得到的转化体的L-谷氨酸生产能力。
用与上述相同的方法测量培养后培养基中细菌细胞浓度和积累的L-谷氨酸的量。结果由表9给出。
              表9
菌株                 细胞浓度    L-谷氨酸
                       (OD)        (g/l)
ΔS                    0.84         35
ΔS/pGDH               1.01         35
ΔS/pGLTA              0.83         37
ΔS/pICD               0.83         37
ΔS/pPPC               0.75         37
ΔS/pGDH＋GLTA＋ICD    0.95         38
ΔS/pGDH＋GLTA＋PPC    0.85         40
ΔS/pSAC4              0.83         35
实施例9：具有扩增α-KGDH基因的产L-赖氨酸细菌的
         L-赖氨酸生产
上述制备的pPKS-X和pPK4分别导入乳酸发酵短杆菌AJ 12435(FERM BP-2294)，该菌对S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸表现抗性并具有通过诱变乳酸发酵短杆菌ATCC 13869得到的L-赖氨酸生产能力。评价其L-赖氨酸生产能力，用电脉冲法(日本公开专利2-207791号)导入质粒。用在1升纯水中含有10g多聚蛋白胨，10g酵母提取物，5g葡萄糖，5gNaCl和15g琼脂并含有25μg/ml卡那霉素的CM2G平板培养基(pH7.2)选择转化体。
如下评价L-赖氨酸生产能力。一种在1升纯水中含有100g葡萄糖，1g KH2PO4，0.4g MgSO4，30g(NH4)2SO4，0.01g FeSO4·7H2O，0.01g MnSO4·7H2O，15ml大豆水解物溶液，200μg盐酸硫胺素，300μg生物素，25mg卡那霉素和50g CaCO3(用KOH调pH至7.0)的培养基(各20ml)配好后倒入500ml容积的烧瓶，加热灭菌。将在含有4mg/l卡那霉素的CM2G平板培养基上培养得到的AJ 12435/pPK4和AJ12435/pPKS-X的细菌细胞接种于其中，37℃培养20小时，培养完毕，测量培养液中生产和积累的L-赖氨酸的量以及细菌细胞浓度。结果由表10给出。
        表10
菌株            L-赖氨酸    细胞浓度
                (g/l)         (OD)
AJ 12435/pPK4     26          1.15
AJ 12435/pPKS-X   31          0.92
                工业应用性
已表明产L-谷氨酸棒状杆菌的α-KGDH活性水平影响L-谷氨酸的发酵生产。因而可能通过插入抗药相关基因等制备α-KGDH基因活性缺陷菌株，通过体外突变制备活性渗漏菌株，通过修饰启动子制备表达降低的菌株等有效地培育与常规产L-谷氨酸棒状杆菌相比L-谷氨酸生产能力进一步提高的细菌菌株。
                 序列表(1)一般资料：
(i)申请人：味之素株式会社
(ii)发明名称：α-酮戊二酸脱氢酶基因
(iii)序列数目：14
(iv)通讯地址：
   (A)收信人：
   (B)街道：
   (C)城市：
   (E)国家：
   (F)邮政编码：
(v)计算机可读形式：
   (A)介质类型：软磁盘
   (B)计算机：IBMPC兼容型
   (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
   (D)软件：Fast SEQ 1.5版
(vi)当前申请资料
   (A)申请号：
   (B)提交日：
   (C)分类：
(vii)律师/代理人资料
   (A)名称：
   (B)注册号：
(ix)通讯资料：
   (A)电话：
   (B)传真：(2)SEQ ID NO：1的资料：
(i)序列特征
   (A)长度：4394碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：双链
   (D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：基因组DNA
(iii)假设：无
(iv)反义：非
(vi)来源：
   (A)生物体：乳发酵短杆菌
   (B)菌株：ATCC 13869
(ix)特征：
   (A)名称/关键：CDS
   (B)位置：443..4213
(C)识别方法：E
(ix)特征：
   (A)名称/关键：-35信号
   (B)位置：281..287
   (C)识别方法：S
(ix)特征：
   (A)名称/关键：-10信号
   (B)位置：307..312
   (C)识别方法：S
(ix)特征：
   (A)名称/关键：RBS
   (B)位置：421..428
   (C)识别方法：S
(ix)特征：
   (A)名称/关键：终止子
   (B)位置：4243..4281
   (C)识别方法：S
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GTCGACAAGC AAAATCGAAG CGGCAGCACG CCGCGTCGGA GCCTT4AACG CCATCGCCGC    60CATCCCTGAT GGTTTCAATC ATCAAGTCGG TGAACGCGGG CGCAACCTGT CATCCGGACA    120GCGCCAACTG ATCGCGCTGG CGCGCGCCGA ACTCATCGAG CCTTCCATCA TGCTTCTCGA    180CGAAGCCACC TCCACCCTCG ACCCCGCCAC CGAAGCCGTT ATCCTCAACG CCTCCGATCG    240AGTCACTAAG GGACGCACCA GCATCATCGT CGCGCACCGC TTGGCAACCG CTAAAAGGGC    300CGACCGTATT CTTGTTGTTG AACAAGGACG TATCATTGAG GACGGATCTC ACGACGCGTT    360GTTGTCTGCT AACGGCACCT ACGCCCGCAT GTGGCATTTA ATGGCCTGAC ACGTTATTTT    420TAGGAGAACT GTCAACAAAT TA ATG CTA CAA CTG GGG CTT AGG CAT AAT CAG     472
                     Met Leu Gln Leu Gly Leu Arg His Asn Gln
                       1               5                  10CCA ACG ACC AAC GTT ACA GTG GAT AAA ATA AAG CTC AAT AAA CCC TCA      520Pro Thr Thr Asn Val Thr Val Asp Lys Ile Lys Leu Asn Lys Pro Ser
             15                  20                  25AGA AGC AAG GAA AAG AGG CGA GTA CCT GCC GTG AGC AGC GCT AGT ACT      568Arg Ser Lys Glu Lys Arg Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr
         30                  35                  40TTC GGC CAG AAT GCG TGG CTG GTA GAC GAG ATG TTC CAG CAG TTC CAG      616Phe Gly Gln Asn Ala Trp Leu Val Asp Glu Met Phe Gln Gln Phe Gln
     45                  50                  55AAG GAC CCC AAG TCC GTG GAC AAG GAA TGG AGA GAA CTC TTT GAG GCG      664Lys Asp Pro Lys Ser Val Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala
 60                  65                  70CAG GGG GGA CCA AAT GCT ACC CCC GCT ACA ACA GAA GCA CAG CCT TCA      712Gln Gly Gly Pro Asn Ala Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gln Pro Ser75                  80                  85              90GCG CCC AAG GAG TCT GCG AAA CCA GCA CCA AAG GCT GCC CCT GCA GCC      760Ala Pro Lys Glu Ser Ala Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala
             95                 100                 105AAG GCA GCA CCG CGC GTA GAA ACC AAG CCG GCC GCC AAG ACC GCC CCT      808Lys Ala Ala Pro Arg Val Glu Thr Lys Pro Ala Ala Lys Thr Ala Pro
        110                 115                 120AAG GCC AAG GAG TCC TCA GTG CCA CAG CAA CCT AAG CTT CCG GAG CCA     856Lys Ala Lys Glu Ser Ser Val Pro Gln Gln Pro Lys Leu Pro Glu Pro
    125                 130                 135GGA CAA ACC CCA ATC AGG GGT ATT TTC AAG TCC ATC GCG AAG AAC ATG     904Gly Gln Thr Pro Ile Arg Gly Ile Phe Lys Ser Ile Ala Lys Asn Met
140                 145                 150GAT ATC TCC CTG GAA ATC CCA ACC GCA ACC TCG GTT CGC GAT ATG CCA     952Asp Ile Ser Leu Glu Ile Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro155                 160                 165                 170GCT CGC CTC ATG TTC GAA AAC CGC GCG ATG GTC AAC GAT CAG CTC AAG     1000Ala Arg Leu Met Phe Glu Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gln Leu Lys
            175                 180                 185CGC ACC CGC GGT GGC AAG ATC TCC TTC ACC CAC ATC ATT GGC TAC GCC     1048Arg Thr Arg Gly Gly Lys Ile Ser Phe Thr His Ile Ile Gly Tyr Ala
        190                 195                 200ATG GTG AAG GCA GTC ATG GCT CAC CCG GAC ATG AaC AAC TCC TAC GAC     1096Met Val Lys Ala Val Met Ala His Pro Asp Met Asn Asn Ser Tyr Asp
    205                 210                 215GTC ATC GAC GGC AAG CCA ACC CTG ATC GTG CCT GAG CAC ATC AAC CTG     1144Val Ile Asp Gly Lys Pro Thr Leu Ile Val Pro Glu His Ile Asn Leu
220                 225                 230GGC CTT GCC ATC GAC CTT CCT CAG AAG GAC GGC TCC CGC GCA CTT GTC     1192Gly Leu Ala Ile Asp Leu Pro Gln Lys Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val235                 240                 245                 250GTA GCA GCC ATC AAG GAA ACC GAG AAG ATG AAC TTC TCC GAG TTC CTC     1240Val Ala Ala Ile Lys Glu Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu
            255                 260                 265GCA GCA TAC GAA GAC ATC GTG ACA CGC TCC CGC AAG GGC AAG CTC ACC     1288Ala Ala Tyr Glu Asp Ile Val Thr Arg Ser Arg Lys Gly Lys Leu Thr
        270                 275                 280ATG GAT GAC TAC CAG GGC GTT ACC GTT TCC TTG ACC AAC CCA GGT GGC    1336Met Asp Asp Tyr Gln Gly Val Thr Val Ser Leu Thr Asn Pro Gly Gly
    285                 290                 295ATC GGT ACC CGC CAC TCT GTC CCA CGT CTG ACC AAG GGC CAG GGC ACC     1384Ile Gly Thr Arg His Ser Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Gln Gly Thr
300                 305                 310ATC ATC GGT GTC GGT TCC ATG GAT TAC CCA GCA GAG TTC CAG GGC GCT    1432Ile Ile Gly Val Gly Ser Met Asp Tyr Pro Ala Glu Phe Gln Gly Ala315                 320                 325                 330TCC GAA GAC CGC CTT GCA GAG CTC GGC GTT GGA AAG CTT GTC ACC ATC    1480Ser Glu Asp Arg Leu Ala Glu Leu Gly Val Gly Lys Leu Val Thr Ile
            335                 340                 345ACC TCC ACC TAC GAT CAC CGC GTG ATC CAG GGT GCT GTG TCC GGT GAA    1528Thr Ser Thr Tyr Asp His Arg Val Ile Gln Gly Ala Val Ser Gly Glu
        350                 355                 360TTC CTG CGT ACC ATG TCT CGC CTG CTC ACC GAT GAT TCC TTC TGG GAT    1576Phe Leu Arg Thr Met Ser Arg Leu Leu Thr Asp Asp Ser Phe Trp Asp
    365                 370                 375GAG ATC TTC GAC GCA ATG AAC GTT CCT TAC ACC CCA ATG CGT TGG GCA    1624Glu Ile Phe Asp Ala Met Asn Val Pro Tyr Thr Pro Met Arg Trp Ala
380                 385                 390CAG GAC GTT CCA AAC ACC GGT GTT GAT AAG AAC ACC CGC GTC ATG CAG    1672Gln Asp Val Pro Asn Thr Gly Val Asp Lys Asn Thr Arg Val Met Gln395                 400                 405                 410CTC ATT GAG GCA TAC CGC TCC CGT GGA CAC CTC ATC GCT GAC ACC AAC    1720Leu Ile Glu Ala Tyr Arg Ser Arg Gly His Leu Ile Ala Asp Thr Asn
            415                 420                 425CCA CTT TCA TGG GTT CAG CCT GGC ATG CCA GTT CCA GAC CAC CGC GAC    1768Pro Leu Ser Trp Val Gln Pro Gly Met Pro Val Pro Asp His Arg Asp
        430                 435                 440CTC GAC ATC GAG ACC CAC AGC CTG ACC ATC TGG GAT CTG GAC CGT ACC    1816Leu Asp Ile Glu Thr His Ser Leu Thr Ile Trp Asp Leu Asp Arg Thr
    445                 450                 455TTC AGC GTC GGT GGC TTC GGC GGC AAG GAG ACC ATG ACC CTG CGC GAG    1864Phe Ser Val Gly Gly Phe Gly Gly Lys Glu Thr Met Thr Leu Arg Glu
460                 465                 470GTA CTG TCC CGC CTG CGC GCT GCC TAC ACC TTG AAG GTC GGC TCC GAA    1912Val Leu Ser Arg Leu Arg Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Val Gly Ser Glu475                 480                 485                 490TAC ACC CAC ATC CTG GAC CGC GAC GAG CGC ACC TGG CTG CAG GAC CGC    1960Tyr Thr His Ile Leu Asp Arg Asp Glu Arg Thr Trp Leu Gln Asp Arg
            495                 500                 505CTC GAA GCC GGA ATG CCA AAG CCA ACC CAG GCA GAG CAG AAG TAC ATC    2008Leu Glu Ala Gly Met Pro Lys Pro Thr Gln Ala Glu Gln Lys Tyr lle
        510                 515                 520CTG CAG AAG CTG AAC GCC GCA GAG GCT TTC GAG AAC TTC CTG CAG ACC    2056Leu Gln Lys Leu Asn Ala Ala Glu Ala Phe Glu Asn Phe Leu Gln Thr
    525                 530                 535AAG TAC GTC GGC CAG AAG CGC TTC TCC CTC GAA GGT GCA GAA GCT CTC    2104Lys Tyr Val Gly Gln Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Ala Glu Ala Leu
540                 545                 550ATC CCA CTG ATG GAC TCC GCC ATC GAC ACC GCC GCA GGC CAG GGC CTC    2152lle Pro Leu Met Asp Ser Ala lle Asp Thr Ala Ala Gly Gln Gly Leu555                 560                 565                 570GAC GAA GTT GTC ATC GGT ATG CCA CAC CGT GGT CGC CTC AAC GTG CTG    2200Asp Glu Val Val Ile Gly Met Pro His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu
            575                 580                 585TTC AAC ATC GTG GGC AAG CCA CTG GCA TCC ATC TTC AAC GAG TTT GAA    2248Phe Asn Ile Val Gly Lys Pro Leu Ala Ser Ile Phe Asn Glu Phe Glu
        590                 595                 600GGC CAA ATG GAG CAG GGC CAG ATC GGT GGC TCC GGT GAC GTG AAG TAC    2296Gly Gln Met Glu Gln Gly Gln Ile Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr
    605                 610                 615CAC CTC GGT TCC GAA GGC CAG CAC CTG CAG ATG GGC GAC GAC GGC GAG    2344His Leu Gly Ser Glu Gly Gln His Leu Gln Met Phe Gly Asp Gly Glu
620                 625                 630ATC AAG GTC TCC ACG ACT GCT AAC CCG TCC CAC GTG GAA GCT GTT AAC    2392Ile Lys Val Ser Leu Thr Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn635                 640                 645                 650CCA GTG ATG GAA GGT ATC GTC CGC GCA AAG CAG GAC TAC CTG GAC AAG    2440Pro Val Met Glu Gly Ile Val Arg Ala Lys Gln Asp Tyr Leu Asp Lys
            655                 660                 665GGC GTA GAC GGC AAG ACT GTT GTG CCA CTG CTG CTC CAC GGT GAC GCT    2488Gly Val Asp Gly Lys Thr Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala
        670                 675                 680GCA TTC GCA GGC CTG GGC ATC CTG CCA GAA ACC ATC AAC GTG GCT AAG    2536Ala Phe Ala Gly Leu Gly Ile Val Pro Glu Thr Ile Asn Leu Ala Lys
    635                 690                 695CTG CGT GGC TAC GAC GTC GGA GGC ACC ATC CAC ATC GTG GTG AAC AAC    2584Leu Arg Gly Tyr Asp Val Gly Gly Thr Ile His Ile Val Val Asn Asn
700                 705                 710CAG ATC GGC TTC ACC ACC ACC CCA GAC TCC AGC CGC TCC ATG CAC TAC    2632Gln Ile Gly Phe Thr Thr Thr Pro Asp Ser Ser Arg Ser Met His Tyr715                 720                 725                 730GCA ACC GAC TAC GCC AAG GCA TTC GGC TGC CCA GTC TTC CAC GTC AAT    2680Ala Thr Asp Tyr Ala Lys Ala Phe Gly Cys Pro Val Phe His Val Asn
            735                 740                 745GGT GAT GAC CCA GAG GCA GTT GTC TGG GTT GGC CAG CTG GCA ACC GAG    2728Gly Asp Asp Pro Glu Ala Val Val Trp Val Gly Gln Leu Ala Thr Glu
        750                 755                 760TAC CGT CGT CGC TTC GGC AAG GAC GTC TTC ATC GAC CTC GTT TGC TAC    2776Tyr Arg Arg Arg Phe Gly Lys Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr
    765                 770                 775CGC CTC CGC GGC CAC AAC GAA GCT GAT GAT CCT TCC ATG ACC CAG CCA    2824Arg Leu Arg Gly His Asn Glu Ala Asp Asp Pro Ser Met Thr Gln Pro
780                 785                 790AAG ATG TAT GAG CTC ATC ACC GGC CGC GAG ACC GTT CGT GCT CAG TAC    2872Lys Met Tyr Glu Leu Ile Thr Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Gln Tyr795                 800                 805                 810ACC GAA GAC CTG CTC GGA CGT GGA GAC CTC TCC AAC GAA GAT GCA GAA    2920Thr Glu Asp Leu Leu Gly Arg Gly Asp Leu Ser Asn Glu Asp Ala Glu
            815                 820                 825GCA GTC GTC CGC GAC TTC CAC GAC CAG ATG GAA TCT GTG TTC AAC GAA    2968Ala Val Val Arg Asp Phe His Asp Gln Met Glu Ser Val Phe Asn Glu
        830                 835                 840GTC AAG GAA GGC GGC AAG AAG CAG GCT GAG GCA CAG ACC GGC ATC ACC    3016Val Lys Glu Gly Gly Lys Lys Gln Ala Glu Ala Gln Thr Gly Ile Thr
    845                 850                 855GGC TCC CAG AAG CTT CCA CAC GGC CTT GAG ACC AAC ATC TCC CGT GAA    3064Gly Ser Gln Lys Leu Pro His Gly Leu Glu Thr Asn Ile Ser Arg Glu
860                 865                 870GAG CTC CTG GAA CTG GGA CAG GCT TTC GCC AAC ACC CCA GAA GGC TTC    3112Glu Leu Leu Glu Leu Gly Gln Ala Phe Ala Asn Thr Pro Glu Gly Phe875                 880                 885                 890AAC TAC CAC CCA CGT GTG GCT CCA GTT GCT AAG AAG CGC GTC TCC TCT    3160Asn Tyr His Pro Arg Val Ala Pro Val Ala Lys Lys Arg Val Ser Ser
            895                 900                 905GTC ACC GAA GGT GGC ATC GAC TGG GCA TGG GGC GAG CTC CTC GCC TTC    3208Val Thr Glu Gly Gly Ile Asp Trp Ala Trp Gly Glu Leu Leu Ala Phe
        910                 915                 920GGT TCC CTG GCT AAC TCC GGC CGC TTG GTT CGC CTT GCA GGT GAA GAT    3256Gly Ser Leu Ala Asn Ser Gly Arg Leu Val Arg Leu Ala Gly Glu Asp
    925                 930                 935TCC CGC CGC GGT ACC TTC ACC CAG CGC CAC GCA GTT GCC ATC GAC CCA    3304Ser Arg Arg Gly Thr Phe Thr Gln Arg His Ala Val Ala Ile Asp Pro
940                 945                 950GCG ACC GCT GAA GAG TTC AAC CCA CTC CAC GAG CTT GCA CAG TCC AAG    3352Ala Thr Ala Glu Glu Phe Asn Pro Leu His Glu Leu Ala Gln Ser Lys955                 960                 965                 970GGC AAC AAC GGT AAG TTC CTG GTC TAC AAC TCC GCA CTG ACC GAG TAC    3400Gly Asn Asn Gly Lys Phe Leu Val Tyr Asn Ser Ala Leu Thr Glu Tyr
            975                 980                 985GCA GGC ATG GGC TTC GAG TAC GGC TAC TCC GTA GGA AAC GAA GAC TCC    3448Ala Gly Met Gly Phe Glu Tyr Gly Tyr Ser Val Gly Asn Glu Asp Ser
        990                 995                 1000GTC GTT GCA TGG GAA GCA CAG TTC GGC GAC TTC GCC AAC GGC GCT CAG    3496Val Val Ala Trp Glu Ala Gln Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln
    1005                1010                1015ACC ATC ATC GAT GAG TAC GTC TCC TCA GGC GAA GCT AAG TGG GGC CAG    3544Thr Ile Ile Asp Glu Tyr Val Ser Ser Gly Glu Ala Lys Trp Gly Gln
1020                1025                1030ACC TCC AAG CTG ATC CTT CTG CTG CCT CAC GGC TAC GAA GGC CAG GGC    3592Thr Ser Lys Leu Ile Leu Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly1035                1040                1045                1050CCA GAC CAC TCT TCC GCA CGT ATC GAG CGC TTC CTG CAG CTG TGC GCT    3640Pro Asp His Ser Ser Ala Arg Ile Glu Arg Phe Leu Gln Leu Cys Ala
            1055                1060                1065GAG GGT TCC ATG ACT GTT GCT CAG CCA TCC ACC CCA GCA AAC CAC TTC    3688Glu Gly Ser Met Thr Val Ala Gln Pro Ser Thr Pro Ala Asn His Phe
        1070                1075                1080CAC CTG CTG CGT CGT CAC GCT CTG TCC GAC CTG AAG CGT CCA CTG GTT    3736His Leu Leu Arg Arg His Ala Leu Ser Asp Leu Lys Arg Pro Leu Val
    1085                1090                1095ATC TTC ACC CCG AAG TCC ATG CTG CGT AAC AAG GCT GCT GCC TCC GCA    3784Ile Phe Thr Pro Lys Ser Met Leu Arg Asn Lys Ala Ala Ala Ser Ala
1100                1105                1110CCA GAA GAC TTC ACT GAG GTC ACC AAG TTC CAA TCC GTG ATC GAC GAT    3832Pro Glu Asp Phe Thr Glu Val Thr Lys Phe Gln Ser Val Ile Asp Asp1115                1120                1125                1130CCA AAC GTT GCA GAT GCA GCC AAG GTG AAG AAG GTC ATG CTG GTC TCC    3880Pro Asn Val Ala Asp Ala Ala Lys Val Lys Lys Val Met Leu Val Ser
            1135                1140                1145GGC AAG CTG TAC TAC GAA TTG GCA AAG CGC AAG GAG AAG GAC GGA CGC    3928Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu Leu Ala Lys Arg Lys Glu Lys Asp Gly Arg
        1150                1155                1160GAC GAC ATC GCG ATC GTT CGT ATC GAA ATG CTC CAC CCA ATT CCG TTC    3976Asp Asp Ile Ala Ile Val Arg Ile Glu Met Leu His Pro Ile Pro Phe
    1165                1170                1175AAC CGC ATC TCC GAG GCT CTT GCC GGC TAC CCT AAC GCT GAG GAA GTC    4024Asn Arg Ile Ser Glu Ala Leu Ala Gly Tyr Pro Asn Ala Glu Glu Val
1180                1185                1190CTC TTC GTT CAG GAT GAG CCA GCA AAC CAG GGC CCA TGG CCG TTC TAC    4072Leu Phe Val Gln Asp Glu Pro Ala Asn Gln Gly Pro Trp Pro Phe Tyr1195                1200                1205                1210CAG GAG CAC CTC CCA GAG CTG ATC CCG AAC ATG CCA AAG ATG CGC CGC    4120Gln Glu His Leu Pro Glu Leu Ile Pro Asn Met Pro Lys Met Arg Arg
            1215                1220                1225GTT TCC CGC CGC GCT CAG TCC TCC ACC GCA ACT GGT GTT GCT AAG GTG    4168Val Ser Arg Arg Ala Gln Ser Ser Thr Ala Thr Gly Val Ala Lys Val
        1230                1235                1240CAC CAG CTG GAG GAG AAG CAG CTT ATC GAC GAG GCT TTC GAG GCT    4213His Gln Leu Glu Glu Lys Gln Leu Ile Asp Glu Ala Phe Glu Ala
    1245                1250                1255TAAGTCTTTA TAGTCCTGCA CTAGCCTAGA GGGCCTTATG CAGTGTGAAT CACACAGCAT   4273AAGGCCCTTT TTGCTGCCGT GGTTGCCTAA GGTGGAAGGC ATGAAACGAA TCTGTGCGGT   4333CACGATCTCT TCAGTACTTT TGCTAAGTGG CTGCTCCTCC AGTTCCACCA CGCAGCTCGA   4393G                                                                   4394(2)SEQ ID NO：2的资料：
(i)序列特征
   (A)长度：1257氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (D)拓扑类型：线型
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Leu Gln Leu Gly Leu Arg His Asn Gln Pro Thr Thr Asn Val Thr1               5                  10                  15Val Asp Lys Ile Lys Leu Asn Lys Pro Ser Arg Ser Lys Glu Lys Arg
         20                 25                  30Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr Phe Gly Gln Asn Ala Trp
     35                 40                  45Leu Val Asp Glu Met Phe Gln Gln Phe Gln Lys Asp Pro Lys Ser Val
50                  55                  60Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala Gln Gly Gly Pro Asn Ala65                  70                  75                  80Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gln Pro Ser Ala Pro Lys Glu Ser Ala
            85                  90                  95Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala Lys Ala Ala Pro Arg Val
        100                 105                 110Glu Thr Lys Pro Ala Ala Lys Thr Ala Pro Lys Ala Lys Glu Ser Ser
    115                 120                 125Val Pro Gln Gln Pro Lys Leu Pro Glu Pro Gly Gln Thr Pro Ile Arg
130                 l35                 140Gly Ile Phe Lys Ser Ile Ala Lys Asn Met Asp Ile Ser Leu Glu Ile145                 150                 155                 160Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro Ala Arg Leu Met Phe Glu
            165                 170                 175Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gln Leu Lys Arg Thr Arg Gly Gly Lys
        180                 185                 190Ile Ser Phe Thr His Ile Ile Gly Tyr Ala Met Val Lys Ala Val Met
    195                 200                 205Ala His Pro Asp Met Asn Asn Ser Tyr Asr Val Ile Asp Gly Lys Pro
210                 215                 220Thr Leu Ile Val Pro Glu His lle Asn Leu Gly Leu Ala lle Asp Leu225                 230                 235                 240Pro Gln Lys Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val Val Ala Ala Ile Lys Glu
            245                 250                 255Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu Ala Ala Tyr Glu Asp Ile
        260                 265                 270Val Thr Arg Ser Arg Lys Gly Lys Leu Thr Met Asp Asp Tyr Gln Gly
    275                 280                 285Val Thr Val Ser Leu Thr Asn Pro Gly Gly lle Gly Thr Arg His Ser
290                 295                 300Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Gln Gly Thr Ile Ile Gly Val Gly Ser305                 310                 315                 320Met Asp Tyr Pro Ala Glu Phe Gln Gly Ala Ser Glu Asp Arg Leu Ala
            325                 330                 335Glu Leu Gly Val Gly Lys Leu Val Thr Ile Thr Ser Thr Tyr Asp His
        340                 345                 350Arg Val Ile Gln Gly Ala Val Ser Gly Glu Phe Leu Arg Thr Met Ser
    355                 360                 365Arg Leu Leu Thr Asp Asp Ser Phe Trp Asp Glu Ile Phe Asp Ala Met
370                 375                 380Asn Val Pro Tyr Thr Pro Met Arg Trp Ala Gln Asp Val Pro Asn Thr385                 390                 395                 400Gly Val Asp Lys Asn Thr Arg Val Met Gln Leu Ile Glu Ala Tyr Arg
            405                 410                 415Ser Arg Gly His Leu Ile Ala Asp Thr Asn Pro Leu Ser Trp Val Gln
        420                 425                 430Pro Gly Met Pro Val Pro Asp His Arg Asp Leu Asp Ile Glu Thr His
    435                 440                 445Ser Leu Thr Ile Trp Asp Leu Asp Arg Thr Phe Ser Val Gly Gly Phe
450                 455                 460Gly Gly Lys Glu Thr Met Thr Leu Arg Glu Val Leu Ser ARg Leu Arg465                 470                 475                480Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Val Gly Ser Glu Tyr Thr His Ile Leu Asp
            485                 490                 495Arg Asp Glu Arg Thr Trp Leu Gln Asp Arg Leu Glu Ala Gly Met Pro
        500                 505                 510Lys Pro Thr Gln Ala Glu Gln Lys Tyr Ile Leu Gln Lys Leu Asn Ala
    515                 520                 525Ala Glu Ala Phe Glu Asn Phe Leu Gln Thr Lys Tyr Val Gly Gln Lys
530                 535                 540Arg Phe Ser Leu Glu Gly Ala Glu Ala Leu Ile Pro Leu Met Asp Ser545                 550                 555                 560Ala Ile Asp Thr Ala Ala Gly Gln Gly Leu Asp Glu Val Val Ile Gly
            565                 570                 575Met Pro His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Phe Asn Ile Val Gly Lys
        580                 585                 590Pro Leu Ala Ser Ile Phe Asn Glu Phe Glu Gly Gln Met Glu Gln Gly
    595                 600                 605Gln Ile Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr His Leu Gly Ser Glu Gly
610                 615                 620Gln His Leu Gln Met Phe Gly Asp Gly Glu Ile Lys Val Ser Leu Thr625                 630                 635                 640Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn Pro Val Met Glu Gly Ile
            645                 650                 655Val Arg Ala Lys Gln Asp Tyr Leu Asp Lys Gly Val Asp Gly Lys Thr
        660                 665                 670Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala AIa Phe Ala Gly Leu Gly
    675                 680                 685Ile Val Pro Glu Thr Ile Asn Leu Ala Lys Leu Arg Gly Tyr Asp Val
690                 695                 700Gly Gly Thr Ile His Ile Val Val Asn Asn Gln Ile Gly Phe Thr Thr705                 710                 715                 720Thr Pro Asp Ser Ser Arg Ser Met His Tyr Ala Thr Asp Tyr Ala Lys
            725                 730                 735Ala Phe Gly Cys Pro Val Phe His Val Asn Gly Asp Asp Pro Glu Ala
        740                 745                 750Val Val Trp Val Gly Gln Leu Ala Thr Glu Tyr Arg Arg Arg Phe Gly
    755                 760                 765Lys Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Leu Arg Gly His Asn
770                 775                 780Glu Ala Asp Asp Pro Ser Met Thr Gln Pro Lys Met Tyr Glu Leu Ile785                 790                 795                 800Thr Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Gln Tyr Thr Glu Asp Leu Leu Gly
            805                 810                 815Arg Gly Asp Leu Ser Asn Glu Asp Ala Glu Ala Val Val Arg Asp Phe
        820                 825                 830His Asp Gln Met Glu Sar Val Phe Asn Glu Val Lys Glu Gly Gly Lys
    835                 840                  845Lys Gln Ala Glu Ala Gln Thr Gly Ile Thr Gly Ser Gln Lys Leu Pro
850                 855                  860His Gly Leu Glu Thr Asn Ile Ser Arg Glu Glu Leu Leu Glu Leu Gly865                 870                 875                 880Gln Ala Phe Ala Asn Thr Pro Glu Gly Phe Asn Tyr His Pro Arg Val
            885                 890                 895Ala Pro Val Ala Lys Lys Arg Val Ser Ser Val Thr Glu Gly Gly Ile
        900                 905                 910Asp Trp Ala Trp Gly Glu Leu Leu Ala Phe Gly Ser Leu Ala Asn Ser
    915                 920                 925Gly Arg Leu Val Arg Leu Ala Gly Glu Asp Ser Arg Arg Gly Thr Phe
930                 935                 940Thr Gln Arg His Ala Val Ala Ile Asp Pro Ala Thr Ala Glu Glu Phe945                 950                 955                 960Asn Pro Leu His Glu Leu Ala Gln Ser Lys Gly Asn Asn Gly Lys Phe
            965                 970                 975Leu Val Tyr Asn Ser Ala Leu Thr Glu Tyr Ala Gly Met Gly Phe Glu
        980                 985                 990Tyr Gly Tyr Ser Val Gly Asn Glu Asp Ser Val Val Ala Trp Glu Ala
    995                 1000                1005Gln Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Thr Ile Ile Asp Glu Tyr
1010                10l5                1020Val Ser Ser Gly Glu Ala Lys Trp Gly Gln Thr Ser Lys Leu Ile Leu1025                1030                1035                1040Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Asp His Ser Ser Ala
            1045                1050                1055Arg Ile Glu Arg Phe Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gly Ser Met Thr Val
        1060                1065                1070Ala Gln Pro Ser Thr Pro Ala Asn His Phe His Leu Leu Arg Arg His
   1075                1080                1085Ala Leu Ser Asp Leu Lys Arg Pro Leu Val Ile Phe Thr Pro Lys Ser1090                1095                1100Met Leu Arg Asn Lys Ala Ala Ala Ser Ala Pro Glu Asp Phe Thr Glu105                1110                1115                1120Val Thr Lys Phe Gln Ser Val Ile Asp Asp Pro Asr Val Ala Asp Ala
           1125                1130                1135Ala Lys Val Lys Lys Val Met Leu Val Ser Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu
       1140                1145                1150Leu Ala Lys Arg Lys Glu Lys Asp Gly Arg Asp Asp Ile Ala Ile Val
   1155                1160                1165Arg Ile Glu Met Leu His Pro Ile Pro Phe Asn Arg Ile Ser Glu Ala1170                1175                1180Leu Ala Gly Tyr Pro Asn Ala Glu Glu Val Leu Phe Val Gln Asp Glu1185               1190                1195                1200Pro Ala Asn Gln Gly Pro Trp Pro Phe Tyr Gln Glu His Leu Pro Glu
           1205                1210                1215Leu lle Pro Asn Met Pro Lys Met Arg Arg Val Ser Arg Arg Ala Gln
       1220                1225                1230Ser Ser Thr Ala Thr Gly Val Ala Lys Val His Gln Leu Glu Glu Lys
   1235                1240                1245Gln Leu Ile Asp Glu Ala Phe Glu Ala1250                1255(2)SEQ ID NO：3的资料：
(i)序列特征
   (A)长度：20碱基对
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(i)序列特征
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(i)序列特征
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(i)序列特征
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(i)序列特征
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(i)序列特征
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(i)序列特征
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(i)序列特征
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(i)序列特征
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Claims (3)

1.一种产L-谷氨酸棒状细菌，它由于染色体上编码具有α-酮戊二酸脱氢酶活性的酶的基因的启动子的核苷酸序列中一个或几个核苷酸的替换、缺失、插入、加入或倒位而造成α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷，所述酶具有包含SEQ ID No：2所示氨基酸序列的氨基酸序列，或具有在上述氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基发生替换、缺失或插入但不影响α-酮戊二酸脱氢酶活性的氨基酸序列。
2.权利要求1的细菌，其中所述基因包含SEQ ID No：1所示核苷酸序列中碱基443-4213的核苷酸序列。
3.一种生产L-谷氨酸的方法，其包括：在含有碳源、氮源、无机离子和其它营养成分的液体培养基中培养权利要求1或2的产L谷氨酸棒状细菌，在培养液中生产并积累L-谷氨酸，再收集L-谷氨酸。
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