WO1995034672A1 - GENE A DESHYDROGENASE α-CETOGLUTARIQUE - Google Patents

GENE A DESHYDROGENASE α-CETOGLUTARIQUE Download PDF

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WO1995034672A1
WO1995034672A1 PCT/JP1995/001131 JP9501131W WO9534672A1 WO 1995034672 A1 WO1995034672 A1 WO 1995034672A1 JP 9501131 W JP9501131 W JP 9501131W WO 9534672 A1 WO9534672 A1 WO 9534672A1
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glu
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PCT/JP1995/001131
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Yoko Asakura
Yoshihiro Usuda
Nobuharu Tsujimoto
Eiichiro Kimura
Chizu Abe
Yoshio Kawahara
Tsuyoshi Nakamatsu
Osamu Kurahashi
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine

Definitions

  • the present invention relates to breeding and utilization of coryneform bacteria used for fermentative production of L-glutamic acid and L-lysine. More specifically, the present invention relates to a coryneform L-glutamic acid-producing bacterium lacking ⁇ -ketoglutinoleate dehydrogenase ( ⁇ -KGDH) activity, a method for producing L-glutamic acid using the bacterium, A gene encoding an enzyme having ⁇ -KGDH activity derived from a glutamic acid-producing bacterium—a KGDH gene), a recombinant DNA containing the gene, a coryneform bacterium having the recombinant DNA, and having the recombinant DNA.
  • ⁇ -KGDH ⁇ -ketoglutinoleate dehydrogenase
  • L-glutamic acid has been industrially produced by a fermentation method using a coryneform bacterium belonging to the genus Brevibacterium or Corynebacterium.
  • An object of the present invention is to obtain a KGD gene derived from a coryneform L-glutamic acid-producing bacterium, prepare a recombinant DN gene containing the gene, and transform a microorganism transformed with the recombinant DNA.
  • the purpose of the present invention is to clarify the effect of KGDH activity level on L-glutamic acid fermentative production, thereby providing a new methodology for breeding coryneform L-glutamic acid-producing bacteria. .
  • an object of the present invention is to obtain a coryneform L-glutamic acid-producing bacterium in which ⁇ -KGD ⁇ activity is deleted by disrupting the KGDH gene present on a chromosome
  • An object of the present invention is to provide a method for producing L-glutamic acid used.
  • the present invention provides a coryneform bacterium having a recombinant DN DN containing an ⁇ -KGDH gene, and an L-lysine using a coryneform bacterium having the recombinant DNA and having an L-lysine-producing ability. It is to provide a manufacturing method of the.
  • the present inventors obtained an ⁇ -KGDH gene derived from a coryneform L-glutamic acid-producing bacterium, clarified the structure thereof, and transformed a coryneform L-glutamic acid-producing bacterium with a recombinant plasmid incorporating the gene.
  • ⁇ -KGDH activity As a result of examining the level of ⁇ -KGDH activity and the ability to produce L-glutamic acid of the resulting transformant, it was found that the activity of NGD-1KGD ⁇ significantly affects the production of L-glutamic acid. .
  • the present inventors have found that in a coryneform L-glutamic acid-producing bacterium, a strain in which a KGD activity has been deleted by disrupting the ⁇ -KGD gene present on the chromosome can produce an excessive amount of biotin. It was found that when cultivating in a medium containing the same, a significant amount of L-glutamic acid was produced and accumulated without adding a surfactant and a substance inhibiting a biotin action such as benicillin to the medium. Further, the present inventors have introduced recombinant D ⁇ containing the ⁇ -KGDH gene into a coryneform bacterium having L-lysine-producing ability. The L-lysine-producing ability of the recombinant was significantly improved, and the present invention was completed based on these findings.
  • a coryneform bacterium having the recombinant DNA described in (5) and having L-lysine-producing ability is cultured in a liquid medium, L-lysine is produced and accumulated in the culture solution, and collected.
  • a method for producing L-lysine characterized by:
  • the coryneform L-glutamic acid-producing bacterium referred to in the present invention includes a bacterium which has been conventionally classified into the genus Brevipacterium, but is now integrated into the genus Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1980) and also includes bacteria of the genus Brevibacterium very closely related to the genus Corynebacterium Examples of such coryneform L-glutamic acid-producing bacteria include the following.
  • Brevipacterium dibaricatum (Corynebacterium glutamicum) Brevipacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) Brevipacterium immariofilum
  • Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum) AT C C 15990
  • Flavum Cornynebacterium glutamicum AT CC 14067
  • Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869
  • the ⁇ -KGDH gene of the present invention can be obtained from a chromosome DNN of a wild-type coryneform L-glutamic acid-producing bacterium as described above or a mutant derived therefrom as follows.
  • the ⁇ -KGD ⁇ complex of Escherichia coli is ⁇ 1 (a-ketoglutarate dehydrogenase: EC 1.2.2.4)> E 2 (dihydrolipoamide succinyltransf erase: EC 2.3.1.61), E 3 (lipoamide dehydrogenase: 1 6.4. 3) is composed of three subunits, E1 and E2 genes form an operon structure, and E3 is composed of pyruvate dehydrogenase (EC 1.2.4.1) and It is known to share.
  • the nucleotide sequences of the E1 and E2 genes of Escherichia coli have been elucidated (Eur. J. Biochem., 141. 351 (1984), Eur. J. Biochem., 141. 361 (1984)).
  • the nucleotide sequence of the El and E2 genes has been determined for Bacillus subtilis (J. Bacteriol., 171, 3667 (1989), Gene, 61.217 (1987), etc.).
  • the present inventors used the homology of the E1 gene sequences of Escherichia coli and Bacillus subtilis to isolate and integrate ⁇ -KGD ⁇ gene derived from coryneform L-glutamic acid-producing bacteria. Succeeded. The steps are as follows.
  • primers are synthesized from the sequences at both ends. Any primer can be used as long as it has a random base composition, a G + C content of around 50%, does not form a special secondary structure, and is complementary to each other. Such an arrangement may be used. Usually, a length of 20 to 30 bases is often used. Specific examples include those shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 in the sequence listing.
  • a probe consisting of a part of the B. subtilis a-KGDH gene is prepared from the primer and the B. subtilis chromosome DNA by the polymerase chain reaction method (PCR method).
  • the probe can be used as long as it has a length of about 200 bases or more, but preferably has a length of about 100 bases or more.
  • the nucleotide sequence of the probe is preferably complementary to the sequence of the target gene, but any probe having high homology can be used.
  • the chromosomal DNA of coryneform L-glutamic acid-producing bacteria was extracted and converted to restriction enzymes.
  • the DNA fragment obtained by further digestion is ligated to a vector to prepare a recombinant DNA, and Escherichia coli is transformed with the recombinant DNA.
  • a restriction enzyme for example, BamHI, EcoRI, XhoI, or the like is used.
  • a vector a vector derived from Escherichia coli, for example, pUC19, pBR322, or the like is used.
  • the recipient bacteria for the prepared recombinant DNA any strains suitable for vector replication or strains that are suitable may be used, and for example, Escherichia coli strains such as HB101, JM109, and DH5 are used.
  • a strain that hybridizes to the probe DNA is selected by colony hybridization, and the recombinant DNA is recovered from the transformant, and the coryneform ligated to the vector is recovered.
  • the structure of the restriction enzyme fragment of chromosome DNA is analyzed.
  • the obtained DNA fragment does not always contain the full length of the gene encoding the enzyme of interest.
  • the chromosomal DNA of the coryneform L-glutamic acid-producing bacterium is digested with another restriction enzyme, ligated to a vector to prepare a recombinant DNA, and the recombinant DNA is transformed with the recombinant DNA.
  • a DNA fragment containing the full length of the KGDH gene can be obtained by performing selection by colony hybridization and analysis of restriction enzyme fragments. At this time, colony hybridization can be performed more easily by using the initially obtained DNA fragment as a probe.
  • the DNA fragment containing the ⁇ -KGDH gene can be recombined into another appropriate vector and introduced into a coryneform L-glutamic acid producing bacterium.
  • the vector used is, for example, a plasmid capable of autonomous replication in Corynebacterium bacteria.
  • Specific examples include pAM330 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-67699), pHM519 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-77895), pAJ655, pAJ611, and pAJ1844 (all of which are described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 192900), pCG1 (Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • the above vector and the ⁇ -KGDH gene of the coryneform L-glutamic acid producing bacterium To prepare a recombinant DNA by ligation, cut the vector using a restriction enzyme in advance.
  • the chromosomal DNA is cleaved with the same restriction enzyme used to cut it, or cut with a restriction enzyme that produces a cut surface complementary to the cut surface of the chromosomal DNA fragment.
  • Ligation is usually performed using a ligase such as T4 DNA ligase.
  • Various recombinant DNAs can be introduced into recipient bacteria according to the transformation methods reported so far. For example, a method of increasing DNA permeability by treating recipient cells with calcium chloride, as reported for Escherichia coli K-12 (J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)). Yes, there is a method of preparing a competent cell from cells at the growth stage and introducing DN ⁇ as reported for Bacillus subtilis (CH Gene, 1, 153 (1977)).
  • the cells of a DNA-receptive bacterium such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast, are transformed into protoplasts or soup X-mouth plaques that readily incorporate recombinant DNA, and the recombinant DNA (Molec. Gen. Genet., 168. Ill (1979), Nature, 274. 398 (1 978), Pro Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)).
  • a sufficiently high frequency can be obtained even by the method used in Bacillus subtilis.
  • Corynebacterium spp. A method in which DNA is taken in a state in which protoplasts of bacterial cells are brought into contact with one of polyethylene glycol or polyvinyl alcohol and a divalent metal ion can also be used. Incorporation of carboxymethylcellulose, dextran, ficoll, Bruronic F68 (manufactured by Selva) or the like in place of polyethylene glycol or polyvinyl alcohol can promote the uptake of DNA.
  • the method of transformation used in the examples of the present invention is the electric pulse method (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-27971).
  • the strain into which the recombinant DN containing the ⁇ -KGD gene derived from the coryneform L-glutamic acid-producing bacterium thus obtained has been introduced contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and if necessary, an organic trace amount. By culturing in a normal medium containing nutrients, an enzyme having ⁇ -KGD ⁇ activity can be produced at a high level in the cells.
  • Carbon sources include glucose, sucrose, molasses, and starch hydrolysates.
  • organic acids such as acetic acid and citric acid, and alcohols such as ethanol are used, and urea, ammonium salts, aqueous ammonia, ammonia gas, etc. are used as nitrogen sources.
  • inorganic salts phosphates, potassium salts, magnesium salts, iron salts, manganese salts and the like are used.
  • organic micronutrients amino acids, vitamins, fatty acids, nucleic acids, and peptones, yeast extracts, and soybean protein hydrolysates containing these are used.
  • the cultivation is performed under aerobic conditions at a temperature of 25 to 37 for 10 to 40 hours while controlling the pH to 5 to 9.
  • L-glutamic acid produced and accumulated in the culture solution is quantified, and the level of ⁇ -KGD ⁇ activity of the cells is measured.
  • the cells recovered from the culture by centrifugation or the like are crushed by ultrasonic treatment, French press treatment, etc., and then centrifuged to remove cell residues, and low molecular substances are removed by gel filtration.
  • the method can be carried out by the method described in Agric. Biol. Chem., 44. 1897 (1980).
  • This gene includes the acquisition of ⁇ -KGD ⁇ activity-deficient strains by insertion of drug genes, acquisition of strains with reduced activity due to in vitro mutation, and acquisition of strains with reduced expression due to promoter modification. As a result, it is possible to efficiently breed strains having improved L-glutamic acid producing ability as compared with L-glutamic acid producing bacteria.
  • strains lacking KGDH activity can be obtained by a method using a chemical agent to induce mutation or a method using genetic recombination.
  • a method for modifying or destroying the ⁇ -KGD K gene present on the chromosome by gene homologous recombination has been proposed. It is advantageous. Gene disruption by homologous recombination has already been established, and methods using linear DNA and methods using temperature-sensitive plasmid can be used.
  • the site-directed mutagenesis method is a method using a synthetic oligonucleotide, and is a method capable of introducing an arbitrary substitution, deletion, insertion, addition or inversion into only an arbitrary limited base pair.
  • a plasmid having the target gene whose DNA base sequence has been cloned is denatured to prepare a single strand.
  • a synthetic oligonucleotide complementary to the portion to be mutated is synthesized, but at this time, the synthetic oligonucleotide is not completely complementary, and any base substitution, deletion, insertion, addition, or Have an inversion.
  • a DNA fragment containing the target gene is directly treated with sodium hyposulfite, hydroxylamine, etc. to randomly substitute, delete, insert, add or invert bases in the DNA fragment.
  • the modified or disrupted gene into which the mutation obtained in this way has been introduced
  • a method of replacing a normal gene on the chromosome of a type L-glutamic acid producing bacterium a method using homologous recombination (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); atsuyama, S. and Mizushima , S., J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)).
  • homologous recombination when a plasmid or the like having a sequence homologous to a sequence on a chromosome is introduced into a bacterial cell, recombination occurs at a frequency of the homologous sequence at a certain frequency. The entire code is integrated on the chromosome. Thereafter, when recombination occurs at the location of the homologous sequence on the chromosome, the plasmid falls off the chromosome again.At this time, the gene into which the mutation was introduced is located on the chromosome depending on the recombination position. The fixed, original normal gene may fall off the chromosome along with the plasmid.
  • a strain in which a gene having a base substitution, deletion, insertion, addition or inversion or a modified or disrupted gene introduced by a mutation and having been replaced with a normal gene on the chromosome can be obtained. Can be obtained.
  • coryneform L-glutamic acid-producing bacterium lacking ⁇ -KGDH activity is particularly effective in a medium containing an excessive amount of biotin as compared to a strain in which ⁇ -KGD ⁇ activity is partially reduced.
  • the acid production capacity is remarkably excellent.
  • a liquid medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions and other nutrients must be prepared. Incubate.
  • the biotin-inhibiting substance as described above can be used even when culturing in a liquid nutrient medium containing a high concentration of biotin of 10 to 1000 agino1.
  • L-glutamic acid can be produced and accumulated with high yield and high accumulation without the addition of L-glutamic acid. That is, as a carbon source, in addition to glucose, fructose, starch saccharified solution, acetic acid, etc., raw materials containing an excess of biotin, such as sweet potato, sugar juice from sugar beet, and molasses, etc., are used. can do.
  • ammonium salt, aqueous ammonia, ammonia gas, urea, etc. used in normal L-glutamic acid fermentation are used, and other inorganic ions such as phosphates, magnesium salts, etc. are used as appropriate. . If necessary, trace nutrients such as thiamine are added to the medium as appropriate.
  • the cultivation is preferably performed under aerobic conditions, the cultivation temperature should be 24 to 42, the pH during cultivation should be controlled to 5 to 9, and the pH should be adjusted by using inorganic or organic acidic or Further, urea, calcium carbonate, ammonia gas and the like can be used.
  • the method for collecting L-glutamic acid from the culture solution is performed by appropriately combining known methods such as ion exchange resin treatment and crystallization.
  • enhanced glutamate biosynthesis genes include glycolytic phosphofructokinase (PFK, JP-A-63-102692) and anaplerotic pathway phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC, JP-A 60-87788, JP-A-62-55089), citrate synthase of the TCA cycle (CS, JP-A-62-201585, JP-A-63-119688), aconitate hydratase (ACO, JP-A 62-294806), isoquenate dehydrogenase (ICDH, JP-A-62-166890, JP-A-63-214189), and glutamate dehydrogenase (GDH, JP-A-61-268185) as an amination reaction ) And so on.
  • PFK glycolytic phosphofructokinase
  • PEPC anaplerotic pathway phosphoenolpyruvate carboxylase
  • CS citrate synthase of the T
  • the gene fragment containing the target gene is converted to the chromosome of a coryneform bacterium by the type III PCR method (polymerase 'chain • The method of obtaining by the reaction method.
  • the chromosome acquisition method used here can use the above method.
  • the host vector system may be any vector system that can be used for coryneform bacteria, and those described above are used.
  • the method (3) described above, which is effective when the nucleotide sequence has already been clarified, was used.
  • the target gene can be expressed.
  • a strong promoter Among the strong promoters that function in the cells of coryneform bacteria, the strongest ones are the 1 ac promoter, the tac promoter, and the trp promoter of E. coli (Y. orinaga, M. Tsuchiya, K. Miwa and K. Sano, J. Biotec h., 5, 305-312 (1987)).
  • the trp promoter of a bacterium belonging to the genus Corynebacterium is also a suitable promoter (Japanese Patent Application Laid-open No. Sho 62-195294).
  • the coryneform bacterium trp promoter was used for the expression of the PEPC gene.
  • the amplification of the ⁇ -KGDH gene of the present invention is useful for improving the productivity of a coryneform bacterium capable of producing L-lysine.
  • various artificial mutants have been used as L-lysine-producing bacteria, and the L-lysine-producing ability can be improved by using these as a host to harbor the recombinant DDNA of the present invention.
  • Such artificial mutants include the following. S- (2-aminoethyl) monocysteine (hereinafter abbreviated as "AEC") resistant mutant, mutant that requires an amino acid such as L-homoserine for its growth (Japanese Patent Publication No. 48-28007) No. 8, No. 56-649 9), resistant to AEC, L-leucine, L-homoserine, L-proline, L-serine, L-arginine, L-alanine, L-parin, etc.
  • AEC S- (2-aminoethyl) monocysteine
  • JP-A-53-86089 JP-A-55-9783, JP-A-55-9759, JP-A-56-32995, JP-A-56-39778, JP-B-53-43591, JP-B-53-43591 53-1833
  • L-lysine-producing mutants that require inositol or acetic acid (Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 55-9784 and 56-18692), fluorpyruvic acid or L that is sensitive to temperatures of 34 or higher.
  • the gene may be ligated to an appropriate vector as described above.
  • the medium for producing L-lysine used is a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions and other organic micronutrients as required.
  • carbon sources include sugars such as glucose, lactose, galactose, and fructose-starch hydrolyzate, alcohols such as ethanol and inositol, acetic acid, fumaric acid, and quenched acid.
  • Organic acids such as acid and succinic acid can be used.
  • As a nitrogen source inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate, organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, and ammonia water can be used.
  • inorganic ions small amounts of potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ions, manganese ions and the like are added.
  • organic trace nutrients it is desirable to include required substances such as vitamins, yeast extract, and the like in appropriate amounts.
  • the culture is preferably performed under aerobic conditions for 16 to 72 hours, and the culture temperature is controlled to 30 to 45, and the pH is controlled to 5 to 8.5 during the culture.
  • an inorganic or organic acidic substance, an alkaline substance, and ammonia gas can be used.
  • FIG. 1 is a restriction map of a D ⁇ fragment containing the ⁇ -KGD D gene.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
  • a commercially available restriction enzyme (Takara Shuzo) was used.
  • Example 1 Isolation and structure determination of ⁇ -KGD D gene
  • Bacillus subtilis NA64 prepared by a conventional method as ⁇ -type (the strain is Bacillus dienete Chromosome of the Isk. Stock Center (obtained from Ohio State University, USA)
  • T-Y medium pH 7.2 containing 1% Bacto-tripton (Difco), 0.5% Bacto yeast extract (Difco) and 0.5% sodium chloride in 50 Om1, Brevi Bacterium lactofermentum ATC C 13869 was inoculated and cultured at 31.5 and 6 hours to obtain a culture. This culture was centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes to obtain 2 g of wet cells as a precipitate. Chromosome DNA was extracted from the cells by the method of Saito and Miura (Biochem. Biophys. Acta., 72, 619, (1963)). This chromosome DNA2 ⁇ g and restriction enzyme!
  • _e_Q_RI 200 units of _e_Q_RI were mixed with 5 OmM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 1 OmM magnesium chloride, 100 mM sodium chloride and ImM dithiothreitol, and reacted at a temperature of 37 for 15 hours.
  • the reaction-finished solution was subjected to phenol extraction treatment in a conventional manner, and ethanol precipitation treatment to obtain a chromosomal DNA fragment of Brevinocterium lactofermentum ATCC 13869 digested with JL_Q-RI.
  • Plasmid vector pUC18 (Takara Shuzo) 1 ug and restriction enzyme ⁇ _Q_Q_RI 20 units were mixed with 5 OmM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 1 OmM magnesium chloride, 100 mM sodium chloride, and 1 mM dithiothreitol, and reacted at a temperature of 37 for 2 hours.
  • 5 OmM Tris-HCl buffer pH 7.5
  • 1 OmM magnesium chloride 100 mM sodium chloride
  • 1 mM dithiothreitol was obtained, and the solution was subjected to phenol extraction and ethanol precipitation by a conventional method. Thereafter, in order to prevent recombination of the DNA fragment derived from the plasmid vector, Molecular Cloning 2nd edition (J. Sambrook,
  • the PUC18 digested with JL0_Q_RI was 0.1 fg, 1 ng of the chromosomal DNA fragment of Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 digested with EcoRI obtained in (2) and One unit of T4 DNA ligase (Takara Shuzo) was added to a 66 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 6.6 mM magnesium chloride, 1 OmM dithiothreitol and 1 OmM adenosine triphosphate, and the temperature was adjusted. The reaction was performed at 16 for 8 hours to ligate the DNA.
  • Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was transformed with the DNA mixture according to a conventional method, and this was spread on an L agar medium containing 100 // g / m1 of ampicillin. 00 transformants were obtained.
  • Transformants that hybridize with the probe DNA obtained in (1) were selected by the method of F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pi. 90 (1989)).
  • Plasmid was obtained from the transformant obtained by (3) by the alkaline lysis method described in Molecular Cloning 2nd edition (J. Sambrook, EF Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pi. 25 (1989)). DNA was prepared. The plasmid DNA was Brevibacterium lactofermentum ATCC 1 - ⁇ 7-
  • the plasmid was cleaved with the restriction enzyme ⁇ RI and lLL in the reaction composition of (3), subjected to agarose gel electrophoresis according to a conventional method, and subjected to Southern hybridization in the same manner as in (3) to obtain a probe DNA. Hybridizing fragments were identified. As a result, it was found that the cut fragment of about 3 kilobases cleaved by EcoRI and iLQj hybridized. The DNA fragment was ligated to a plasmid vector PHSG397 (Takara Shuzo) cut with EcoRI and XJ3_QLI as in (3) and cloned.
  • the nucleotide sequence of the obtained DNA fragment was determined using the obtained plasmid DNA.
  • the nucleotide sequence was determined according to the method of Sanger (J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)) using Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (manufactured by Applied Biochemicals).
  • the Brevipacterium lactofermentum was used as described in (3).
  • the chromosomal DNA of ATCC 13869 was cut with HLQJ and transformed with the recombinant plasmid ligated to pHSG 397.
  • the resulting Brevibacterium lactofermentum obtained in (2) was derived from the chromosomal DNA of ATCC 13869 derived from chromosome DNA.
  • a transformant that hybridized was selected using, as a probe, a 3-kilobase EcoR K Xh0I digested fragment labeled in accordance with the method of (1).
  • the plasmid contained in the obtained transformant contained a DNA fragment of about 9 kilobase.
  • Fig. 1 shows a restriction map of the gene containing this DNA fragment.
  • the plasmid was cleaved with restriction enzymes ⁇ I and XhoI with the reaction composition of (3), and subjected to agarose gel electrophoresis according to a conventional method. As a result, the fragment which hybridized was identified by the method of (3). It turned out to be a fragment of the base.
  • the DNA fragment was ligated to the plasmid vector pHSG397 cut with Sa1I and XhoI as in (3) and cloned. This plasmid was named pHSGS-X.
  • the gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing is the ⁇ -KGDH gene of Brevipacterium lactofermentum ATC C13869.
  • the methionine residue at the ⁇ -terminus of the protein is derived from the initiation codon, ATG, and is often unrelated to the original function of the protein. Therefore, methionine residues may be removed even in the case of the above-mentioned proteins. Homology comparisons of known nucleotide sequences and amino acid sequences with known sequences were performed. The database used was EMBL and SWI 35—? 10.
  • the protein encoded by this gene consists of 1,257 amino acids including the N-terminal methionine residue, and has characteristics that are significantly different from those of KGDH, which has already been reported. That is, about 900 amino acids at the C-terminal side showed high homology with various E1 subunits, but 300 amino acids at the N-terminal side were not found in ⁇ -KGDH of other species. Has a special function. Homology comparison of the N-terminal 300 amino acid portion with a known sequence revealed homology with the E2 subunit of a bacterium belonging to the genus Escherichia coli. This suggests that this protein may have both El and E2 activities, unlike one other KGDH.
  • Example 1 One unit of the pHSGS-X plasmid DNA obtained in Example 1 and 20 units of each of the restriction enzymes Sa1I and iml were mixed in the buffer described in Example 1 (3). Reacted for hours.
  • 1 ug of plasmid PKP4 (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-7491) capable of autonomous replication in Brevibacterium bacteria and Sa1I of 20 units were described in Example 1 (3). The mixture was mixed in a buffer and reacted at a temperature of 37 for 3 hours. Both reaction solutions were extracted with ethanol and precipitated with ethanol in a conventional manner.
  • the DNA fragment is dephosphorylated by bacterial alkaline phosphatase treatment according to the method of Example 1 (3), followed by a conventional method.
  • a conventional method for ethanol extraction, and ethanol precipitation.
  • the DNA mixture was subjected to a conventional method of transformation using the electric pulse method (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-2077791), and Brevipacterium lactofermentum AJ111060 (Japanese Patent Publication No. 59-10797). No.).
  • This was spread on an agar medium containing 1% of polypeptone, 1% of yeast extract, 0.5% of sodium chloride, 0.5% of glucose, and 25 g / m1 of kanamycin, and the transformant AJ1106 OZpP KS-X was transformed. Obtained.
  • the transformant was Brevipacterium lactofermentum
  • Plasmid DNA was extracted from the obtained transformant according to Example 1 (4), Agarose gel electrophoresis was performed according to a conventional method to select a recombinant DNA in which plasmid pPK4 was linked to a Sa1I-iLQj fragment derived from Brevipacterium lactophanmentum ATCC 13869.
  • the plasmid was named pPKS-X.
  • ATC C13869ZpPKS—X was obtained using Brevibacterium terium lactofermentum ATC C13869 as a host.
  • Brevipacterium lactofermentum AJ106 OZp PKS-X and ATC C13869 / p PKS-X obtained in (1) were glucose 8%, potassium dihydrogen phosphate 0. 1%, magnesium sulfate 0.004%, ammonium sulfate 3%, ferrous sulfate 0.01%, manganese sulfate 0.01%, soybean hydrolysate 0.05%, vitamin B! 200, Piotin 300 ⁇ g / l ⁇ Inoculate 50 ml of medium (pH 8.0) consisting of 5% calcium carbonate 5% / kanamycin 25 mg / l, and culture for 18 hours at 31.5 did. The culture was centrifuged according to a conventional method to collect the cells.
  • the cells were suspended in a 0.2% aqueous potassium chloride solution and centrifuged twice to wash the cells.
  • the cells were suspended in 0.1 M buffer (pH 7.7) containing 30% glycerol in N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid (TES), followed by ultrasonication.
  • TES N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid
  • the supernatant was obtained by centrifugation at 150,000 rpm for 30 minutes.
  • the cell lysate was subjected to column chromatography on Sephadex G-25 (Pharmacia) to remove the low molecular weight substances to obtain a crude enzyme solution.
  • the KGDH activity of the obtained crude enzyme solution was determined using the reaction composition described in Agric. Biol. Chem., 44. 1897 (1980) to obtain 3-acetylacetylpyridine adenine 'dinucleotide.
  • Glucose 8% potassium dihydrogen phosphate 0.1%, magnesium sulfate 0.04%, ammonium sulfate 3%, ferrous sulfate 0.001%, manganese sulfate 0.001%, soybean hydrolyzate 1.5% , 200 mg / zg / 1 of siamin hydrochloride, 300 ⁇ g / K of biotin, 25 mgZ1 of Kanamycin and 5% of CaCOs (separately sterilized) Production medium (pH 8.0) 20 ml 1 dispensed into a 500 ml 1 volume flask Heat sterilization did.
  • AJ 1106 OZp PK4 and AJ 11060 / p PK S—X were each added to polypeptone (Nippon Pharmaceutical) 1%, Bacto Eastextract (Difco) 1%, sodium chloride 0.5%, glucose 0
  • the cells obtained by culturing on a plate medium (pH 7.2) containing 5% and kanamycin 25 mgZl were inoculated, and cultured with shaking at 31.5 for 18 hours to obtain a seed culture.
  • Seed culture was prepared in the same manner as in Reference Example 1, and the seed culture was added to a production medium containing 0.4 units / m1 of benicillin or a production medium to which benicillin was not added so that the dry weight of the cells was about 2%. Each was inoculated, and shaking culture was performed at 31.5 ⁇ for about 25 hours.
  • Example 3 Preparation of g-KGD H gene deficient strain L-glutamic acid production was suppressed by amplification of ⁇ -KGD H gene, and conversely, glutamate yield was improved by disrupting ⁇ -KGD ⁇ gene It was expected to be done.
  • the gene-disrupted strain was obtained by a homologous recombination method using a temperature-sensitive plasmid disclosed in JP-A-5-7491. Specifically, in the ⁇ -KGDH gene, there are two sites at the 1340th position and the 3266th position in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, which are digested with ⁇ _ ⁇ I.
  • Example 1 the pHSGS-X obtained in Example 1 was partially digested with JLBJlI and then self-ligated to prepare a plasmid pHSGS-1 ⁇ in which the 1926 base pair of the ⁇ Hi fragment was deleted.
  • the ⁇ -KGD ⁇ gene on p HSGS—X It has a structure with the central part deleted.
  • a replication origin of a mutant type whose self-renewal ability obtained from a plasmid capable of self-replication by a coryneform bacterium has become temperature-sensitive was introduced into the PHSGS-BamHI recognition site of ⁇ , and the plasmid pBTS— Created XK.
  • a restriction enzyme was used to obtain a plasmid, pHSC4 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 5-7491) having a mutant replication origin whose self-renewal ability became temperature-sensitive, obtained from a plasmid capable of self-replication in coryneform bacteria. Plasmid obtained by digestion with KpnI, blunt-ending using a DNA blunt-end kit (Takara Shuzo, Blunting kit), binding to BamHI linker (Takara Shuzo), and self-ligating.
  • This plasmid was introduced into Brevipacterium lactofermentum ATCC 13869, a wild strain of coryneform L-glutamic acid producing bacterium, using the electric pulse method (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-207791).
  • the ⁇ -KGDH gene on the chromosome was replaced with the deletion type by the method described above.
  • ATCC 13869 / pBTS with plasmid introduced-— ⁇ was converted to CM2G (polypeptone 196, yeast extract 1%, sodium chloride 0.5%, glucose 0.5%, ⁇ 7.2) liquid medium.
  • Brevipacterium 'Lactofamentum gdh, g1tA and icd remains The gene was cloned by the PCR method. Primers used in the PCR method were the gdh gene (Molecular Microbiology, 6 (3), 317-326 (1992)) and g1tA gene (Miclobiology, 140 , 181-17-1828 (1994)) and the icd gene (J. Bacteriol. (1995), 177, 774-782).
  • the primers for amplification of the g dh gene include the oligonucleotides shown in SEQ ID NO: 5 (5 'side) and SEQ ID NO: 6 (3' side) in the Sequence Listing, and the primers for amplification of the glt A gene include SEQ ID NO: 7 (5 'side).
  • the oligonucleotides shown in SEQ ID NO: 9 (5 'side) and SEQ ID NO: 10 (3' side) were synthesized and used as primers for amplifying the icd gene. did.
  • a chromosome DNA was prepared from Brevipacterium lactofermentum ATCC 13869 by the method of Example 1, and this was used as a ⁇ -type, and the PCR method was performed using the above oligonucleotide as a primer. Both ends of the obtained amplification product were blunt-ended using a commercially available DNA-end blunting kit (Takara Shuzo Co., Ltd., Blunting kit), and placed at the ⁇ m ⁇ J site of Vector Plasmid pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Cloning was performed to obtain plasmids pHSG-gdh, pHSG-g1tA and pHSG-icd.
  • a chromosome DNA of Brevipacterium lactofermentum ATCC 13869 was prepared according to the method of Example 1, and a DNA fragment of about 3.4 Kbp containing the ppc gene encoding PEPC was obtained by PCR using the DNA as a type III. did.
  • Primers used in the PCR method were synthesized based on the previously reported sequence of the Corynebacterium glutamicum P pc gene (Gene, 77, 237-251 (1989)), and the PCR reaction was the same as above. I went.
  • the sequences of the primers are shown in SEQ ID NO: 11 (5 'side) and SEQ ID NO: 12 (3' side).
  • the amplification product of the PCR reaction was digested with restriction enzyme II (Takara Shuzo) to obtain a plasmid pHSG-ppc 'inserted into the Sa1I site of plasmid pHSG399.
  • DHS G PEPC gene of ppc 'is 1 ac of pHSG 399 Inserted in the opposite direction to the promoter.
  • the promoter of the tributane operon (Gene, 53, 191-200 (1987)), which is known to function in Brevipacterium lactofermentum, was added to the ppc gene on pHSG-ppc '. Inserted upstream.
  • This promoter is known to exhibit activity with a sequence consisting of 51 bases shown in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing. It has the sequence shown in SEQ ID NO: 13 so that a double-stranded DNA containing 51 base pairs having this promoter activity and having both ends coinciding with the fragments cut by restriction enzymes ⁇ I and XbaI can be obtained.
  • a nucleotide chain having a sequence of SEQ ID NO: 14 and a nucleotide chain complementary thereto was synthesized.
  • Plasmids were prepared by linking three types of genes, gdh, g1 tA and icd. Specifically, the plasmid pHSG-gdh is digested with the restriction enzyme _i_Q_o_RI, and both ends are blunt-ended using a commercially available DNA end blunting kit (Takara Shuzo, Blunting kit). The PCR amplification product of the g1tA gene thus obtained was ligated to obtain a plasmid pHSG-gdh + g1tA.
  • the plasmid pH SG-gdh + g1tA was digested with restriction enzymes ⁇ and ⁇ I and blunt-ended in the same manner, and the above-mentioned PCR-amplified product of the icd gene having both ends blunt-ended was ligated. Then, plasmid pHSG-gdh + gltA + icd was obtained.
  • plasmid KpHSG-g dh + glt A is digested with the restriction enzyme JLB__I
  • plasmid pHSG-ppc is digested with the restriction enzymes KD nI and Sa1I
  • the upstream A ppc gene fragment having a promoter was obtained, and the obtained fragment was blunt-ended using a DNA blunting kit (Takara Shuzo Co., Ltd., Blunting kit), and then ⁇ II linker (Takara Shuzo Co., Ltd.).
  • pHSG-gdh, pHSG-1 tA, pHSG-ppc, pHSG-icd, pHSG-gdh + gltA + icd and pHSG-gdh + 1tA + ppc enable autonomous replication in coryneform bacterial cells
  • the replication origin derived from the plasmid pHMl 519 (Agric. Biol. Chem., 482 901-2903 (1984)), which has already been obtained and is autonomously replicable in coryneform bacteria, is used as a P.
  • digested plasmid pHK4 having a replication origin derived from PHMl 519 a JP-A-5 74 91 No.
  • restriction enzyme B AMH I and K P n I restriction enzyme B AMH I and K P n I
  • the resulting fragment was blunt-ended using DN ⁇ blunting kit (Takara Shuzo, Blunting kit), and then pHSG-1 g dh, pHSG—g 1 t using Kpn I linker (Takara Shuzo).
  • pHS Gp pc and pH SG-icdh were inserted into the Kpn I site, respectively, to obtain pGDH, pGLTA, p PPC and p ICD.
  • a Sa1I linker (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was similarly used for the Sa1I site. Origins of replication from 519 were respectively inserted to obtain pGDH + GLTA + ICD and pGDH + GLTA + PPC. Further, as a control, plasmid PHSG 399 not having these genes was used, and a Sa11 linker (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was similarly used at the Sa1I site to insert a replication origin derived from PHM1519. SAC 4 was also created.
  • Example 7 Confirmation of Expression of Each Gene on pGDH, PGLTA, PPPC, pICD, pGDH + GLTA + ICD and DGDH + GLTA + PPC pGDH, pGLTA, pPPC, pICD, pGDH +
  • Each gene on GLTA + ICD and pGDH + GLTA + PPC was expressed in Brevibacterium lactofamentum cells, and it was confirmed that these plasmids functioned as gene amplification. Specifically, each plasmid was introduced into Brevipacterium lactophamentum ATCC 13869 by the electric pulse method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-207791).
  • the obtained transformant was a CM 2 G plate medium containing 4 g / ml of chloramphenicol (10 g of polypeptone, 10 g of yeast extract, 5 g of glucose, 15 g of NaC and 15 g of agar were added to pure water 11). It was selected in pH 7.2).
  • the resulting transformant was cultured in the CM2G agar medium, glucose 80 g, KH 2 P0 4 1 g, Mg SO 4 0. 4 g, (NH 4) 2 SO 4 30 g, F e S 0 4 ⁇ 7 H2O 0. 01 Mn S 04 ⁇ 7 H2O 0.
  • ATCC 13869 / p GLTA and ATCC 13869 / GDH + GLTA + ICD and ATCC 13869 / p GDH + GLTA + ⁇ ⁇ ⁇ 5 activity are described in Miclobiology, 140, 1817-1828 (1994).
  • ICD H activity of 869 / p I CD and ATCC 13869ZGDH + GLTA + I CD was determined by J. BacterioL, 177, 774-782 (1995), ATCC 13869 / pPP C and ATCC 13869 6011 + 01 ⁇ + +? of? £? ⁇ activity is 0 € 11 ⁇ 2, 77, 237-251 (1989). Tables 5 to 7 show the measurement results.
  • Example 8 L-glutamic acid production of the mums S strain and the mums S strain which amplified the gdh, g1tA, DDC and icd genes
  • PGDH, pGLTA, pPPC, pICD, pGDH + GLTA + ICD or pGDH + GLTA + PPC prepared above as described above, and transformants into which each plasmid has been introduced.
  • Plasmid was introduced into Brevipa's tertiary lactofermentum cells by the electric pulse method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-207791).
  • the obtained transformant was a CM 2 G plate medium containing 4 g / ml of chloramphenicol (10 g of polypeptone, 10 g of yeast extract, 5 g of glucose, 15 g of NaC, and 15 g of agar in pure water 11). It was selected in pH 7.2).
  • CM2 G plate medium (10 g of polypeptone, 10 g of yeast extract, 5 g of glucose, 15 g of NaC, and 15 g of agar in pure water 11. pH 7.2) containing 25 mg / 1 namycin. Selected.
  • L-lysine productivity was performed as follows. Glucose 100 g, KH 2 P0 4 lg , MgS0 4 0. 4g, (NH 4) 2 S0 4 30 g, F e S0 4 ⁇ 7H 2 0 0. 01 g, MnS0 4 ⁇ 7H 2 0 0. 01 g, Soybean hydrolyzate 15 m1, Samine hydrochloride 200 g, Piotin 300 ⁇ g, Kanamycin 25 mg and C a A medium containing 50 g of COs in pure water 11 (pH adjusted to 7.0 using KOH) was dispensed in 2 Oml portions into a 50-Om 1-volume flask and sterilized by heating.
  • the cells were inoculated with AJ12435Zp PK4 and AJ12435p PKS-X cells obtained by culturing in a CM2G plate medium containing 25 mgZ1 kanamycin, and cultured at 37 for 20 hours. After completion of the culture, the amount of L-lysine and the concentration of the bacterial cells produced and accumulated in the culture solution were measured. Table 10 shows the results. Table 10 Strain L-Lysine Cell concentration
  • ATC AAG GTC TCC CTG ACT GCT AAC CCG TCC CAC CTG GAA GCT GTT AAC 2392 lie Lys Val Ser Leu Thr Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn
  • Val Thr Lys Phe Gin Ser Val lie Asp Asp Pro Asn Val Ala Asp Ala

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Description

明細書 α—ケトグル夕ノレ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 技術分野 本発明は、 L一グルタミン酸及び L一リジンの発酵生産に用いられるコリネ型 細菌の育種と利用に関する。 更に詳しくは、 本発明は、 α—ケトグル夕ノレ酸デヒ ドロゲナーゼ （α— KGDH)活性が欠失したコリネ型 L一グルタミン酸生産菌、 該菌を用いた L一グルタミン酸の製造法、 コリネ型 L一グルタミン酸生産菌由来 の α— KGDH活性を有する酵素をコードする遺伝子 — KGDH遺伝子） 、 該遺伝子を含む組換え DNA、 該組換え DNAを保有するコリネ型細菌、 及び該 組換え DN Aを保有し、 Lーリジン生産能を有するコリネ型細菌を用いた L一リ ジンの製造法に関する。 背景技術 従来より L一グルタミン酸はブレビバクテリゥム属又はコリネバクテリゥム属 に属するコリネ型細菌を用 ^、た発酵法により工業的に生産されている。
近年、 α— K G D Η活性が欠損もしくは低下し、 かつ L一グルタミン酸分解活 性が低下した大腸菌変異株が、 高い Lーグルタミン酸生産能を持つことが明らか となった （特開平 5— 244970公報） 。
これに対し、 ブレビバクテリウム属の細菌においては、 α— KGDH活性の低 下した変異株の L—グルタミン酸生産能は親株とほぼ同じであつたとの報告があ り （Agric. Biol. Chem. , 44. 1897 (1980)、 Agric. Biol. Chem. , 46. 493 (19 82))、 コリネ型細菌では、 な一 KG DH活性のレベルは L一グルタミン酸の生産 に重要ではないものと考えられていた。
一方、 α— KGDH活性が低下し、 かつ L一グルタミン酸生産能を有する変異 株をピオチン過剰原料を炭素源とする培地中で培養すると、 ベニシリン類ゃ界面 活性剤等のビォチン作用抑制物質を培地に添加することなく、 高収率で L一グル タミン酸が生産されることが見い出されている （最大収率 53%) (特開平 6— 23779号公報） 。 しかしながら、 上述したようにコリネ型細菌では、 α— K G D Η活性のレベルは L一グルタミン酸の生産に重要ではないものと考えられて いたため、 コリネ型 L一グルタミン酸生産菌の a— KGDH遺伝子をクローニン グし解析した例はなかった。 また、 α— KGDHを欠失したコリネホルム細菌の 変異株も知られていなかった。 発明の開示 本発明の目的は、 コリネ型 L—グルタミン酸生産菌由来のな一 K G D Η遺伝子 を取得し、 該遺伝子を含む組換え DN Αを作製し、 該組換え DNAで形質転換し た微生物を用いてな一 KGDH活性のレベルが L一グルタミン酸の発酵生産に及 ぼす影響を明らカ、にし、 もってコリネ型 L一グル夕ミン酸生産菌の育種において 新たな方法論を提供することにある。 より具体的には、 本発明の目的は、 染色体 上に存在するな一 K G D H遺伝子を破壊することにより α— KGD Η活性を欠失 させたコリネ型 Lーグルタミン酸生産菌を取得し、 該菌を用いた Lーグルタミン 酸の製造法を提供することにある。 また、 本発明は、 α— KGDH遺伝子を含む 組換え DN Αを保有するコリネ型細菌、 及び該組換え DN Aを保有し、 L—リジ ン生産能を有するコリネ型細菌を用いた L一リジンの製造法を提供することにあ る。
本発明者らは、 コリネ型 L一グルタミン酸生産菌由来の α— KGDH遺伝子を 取得しその構造を明らかにするとともに、 該遺伝子を組み込んだ組換え体ブラス ミ ドでコリネ型 L一グルタミン酸生産菌を形質転換し、 得られた形質転換体の α 一 KGDH活性のレベルと L—グルタミン酸の生産能を調べた結果、 な一 KGD Η活性が L—グルタミン酸の生産に顕著な影響を及ぼすことを見いだした。 また、 本発明者らは、 コリネ型 Lーグルタミン酸生産菌において染色体上に存在する α -KGD Η遺伝子を破壊することにより な一 KGD Η活性を欠失させた株が、 過 剰量のピオチンを含有する培地に培養する際、 界面活性剤やべニシリンのような ピオチン作用抑制物質を培地に添加することなく著量の L一グルタミン酸を生成 蓄積することを見いだした。 更に、 本発明者らは、 α— KGDH遺伝子を含む組 換え D Ν Αを Lーリジン生産能を有するコリネ型細菌に導入した結果、 得られた 組換え体の Lーリジン生産能が顕著に向上することを見 L、だし、 これらの知見に 基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
(1)染色体上に存在する α— K G D Η活性を有する酵素をコードする遺伝子又はそ のプロモーターの塩基配列中に 1又は 2以上の塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加又 は逆位が生じたことにより、 α— K G D Η活性が欠損したコリネ型 L一グルタミ ン酸生産菌、
(2)上記 (1)記載のコリネ型 L一グルタミン酸生産菌を液体培地中に培養し、 培養 液中に L一グルタミン酸を生成蓄積させ、 これを採取することを特徴とする L一 グルタミン酸の製造法、
(3)コリネ型 L一グルタミン酸生産菌由来の α— K G D Η遺伝子、
(4)コリネ型 L一グルタミン酸生産菌由来の α— K G D Η遺伝子とコリネ型細菌で 機能するベクターが連結されて得られる組換え D N A、
(5)上記 (4)記載の組換え D N Aを保有するコリネ型細菌、 及び
(6)上記 (5)記載の組換え D N Aを保有し、 かつ Lーリジン生産能を有するコリネ 型細菌を液体培地に培養し、 培養液中に L一リジンを生成蓄積させ、 これを採取 することを特徴とする Lーリジンの製造法、
を提供するものである。
以下、 本発明をさらに詳細に説明する。
本発明でいうコリネ型 L一グルタミン酸生産菌とは、 従来ブレビパクテリゥム 属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み （Int. J. Syst. Bacteriol. , 41, 255 (1980) 、 またコリネバクテリウム属と非常に 近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。 このようなコリネ型 L一グルタミン酸 生産菌の例として以下のものが挙げられる。
コリネパ、クテリゥム ァセトァシドフィラム
コリネパ、クテリウム ァセトグルタミカム
コリネパ 'クテリゥム カルナェ
コリネパ'クテリウム グルタミカム
コリネパ、クテリゥム リリウム （コリネバクテリゥム ·グルタミカム） コリネバクテリゥム ·メラセコーラ
ブレビパクテリゥム ·ディバリカタム （コリネバクテリゥム ·グルタミカム） ブレビパクテリゥム ·フラバム （コリネバクテリゥム ·グルタミカム） ブレビパクテリゥム ·インマリオフィラム
ブレビバ、クテリゥム ·ラクトファーメンタム （コリネバクテリゥム ·グノレタミ カム）
ブレビバ'クテリウム ·ロゼゥム
ブレビバ、クテリゥム ·サッカロリティカム
ブレビパ'クテリウム ·チォゲ二タリス
コリネバクテリゥム *サ一モアミノゲネス
具体的には、 下記のような菌株を例示することができる。
コリネパ、クテリゥム ·ァセトァシドフィラム ATC C 13870
コリネバクテリゥム .ァセトグル夕ミカム ATCC 15806
コリネバクテリウム ·カルナェ ATCC 15991
コリネパ、クテリゥム ·グルタミカム ATCC 13020
コリネバクテリゥム · リリウム （コリネバクテリゥム ·グルタミカム） AT C C 15990
コリネバクテリゥム .メラセコーラ ATCC 17965
ブレビパ'クテリゥム ·ディバリカタム （コリネバクテリゥム ·グノレ夕ミカム） ATCC 14020
ブレビパ、クテリゥム .フラバム （コリネバクテリゥム ·グルタミカム） AT CC 14067
ブレビパクテリゥム 'インマリオフィラム ATCC 14068
ブレビバクテリウム ·ラクトフエルメンタム （コリネバクテリゥム ·グルタミ カム） ATCC 13869
ブレビバクテリウム ·ロゼゥム ATCC 13825
ブレビパクテリゥム ·サッカロリティカム ATCC 14066
ブレビパクテリゥム，チォゲ二夕リス ATCC 19240
コリネバクテリウム ·サ一モアミノゲネス AJ 12340 (FERM BP 一 1 5 3 9 )
本発明の α— K G D H遺伝子は、 上記のようなコリネ型 L—グルタミン酸生産 菌の野生株又はこれらから誘導される変異株の染色体 D N Αから、 以下のように して得ることができる。
大腸菌の α— K G D Η複合体は、 Ε 1 ( a -ketoglutarate dehydrogenase： EC 1. 2.4. 2) > E 2 (dihydrolipoamide succinyltransf erase： EC 2. 3. 1. 61) 、 E 3 (lipoamide dehydrogenase： 1. 6.4. 3) の 3つのサブュニットで構成され、 E 1、 E 2遣伝子はオペロン構造を成し、 E 3はピノレビン酸脱水素酵素 （pyruvate dehydrogenase： EC 1. 2. 4. 1) と共有していることが知られている。 大腸菌の E 1、 E 2遺伝子のヌクレオチド配列は明らかにされている （Eur. J. Biochem. , 141. 351 (1984)、 Eur. J. Biochem. , 141. 361 (1984)) 。
また、 枯草菌についても同様に、 E l、 E 2遺伝子のヌクレオチド配列が明ら かにされている （J. Bacteriol. , 171, 3667 (1989)、 Gene, 61. 217 (1987)等） 。 そこで、 大腸菌と枯草菌の E 1遺伝子の塩基配列との相同性を利用して、 コリ ネ型 L—グルタミン酸生産菌由来の α— K G D Η遺伝子の単離及びク口一ン化に 本発明者らは成功した。 その工程は以下の通りである。
まず、 大腸菌と枯草菌の α— K G D H · Ε 1サブュニット遺伝子間で相同性の 高い領域を選び両端の配列からプライマーを合成する。 プライマーとしては、 塩 基組成がランダムで G + C含量が 5 0 %付近であり、 特殊な 2次構造を形成せず、 互いに相補的でな L、、 との条件を満たすものであればどのような配列でもよい。 長さは通常 2 0ないし 3 0塩基のものがよく用いられる。 具体的に例示すると、 配列表配列番号 3及び 4に示すようなものが挙げられる。
ついで、 本プライマーと枯草菌染色体 D N Aからポリメラーゼ'チヱイン · リ アクション法 （P C R法） により枯草菌 a—K G D H遺伝子の一部分から成るプ ローブを作成する。 プローブとしては、 2 0塩基程度以上の長さであれば用いる ことが可能であるが、 1 0 0塩基程度以上の長さのものであることが望ましい。 また、 プローブの塩基配列は、 目的とする遺伝子の配列と相補的であることが望 ましいが、 高い相同性を有しているものであれば用いることができる。
一方、 コリネ型 L一グルタミン酸生産菌の染色体 D N Aを抽出し、 制限酵素に より消化して得られた D N A断片をべクタ一に連結して組換え体 D N Aを作成し、 該組換え体 DN Aで大腸菌を形質転換する。 制限酵素としては、 例えば、 Bam H I、 E c oR I、 Xho I等が用いられ、 また、 ベクターとしては大腸菌由来 のベクター、 例えば、 pUC 19、 p BR 322等が用いられる。 作成した組換 え体 D N Aの受容菌としては、 べクターの複製に好適なものであればし、ずれの菌 株でもよく、 例えば HB 101、 JM109、 DH 5等の大腸菌菌株が用いられ る。
かくして得られる形質転換体の中からコロニー ·ハイブリダィゼーシヨンによ りプローブ D N Aとハイブリダイズする株を選択し、 当該形質転換体より組換え 体 DNAを回収し、 ベクターに連結されているコリネ型 L一グルタミン酸生産菌 染色体 DN Aの制限酵素断片の構造を解析する。
得られた DNA断片は、 必ずしも目的とする酵素をコードする遺伝子の全長を 含んでいるとは限らない。 この場合、 コリネ型 L—グルタミン酸生産菌の染色体 DN Aを別の制限酵素で切断し、 ベクターに連結して組換え体 DN Aを作製し、 該組換え体 D N Aにより形質転換を行 、、 上記と同様にコロニー ·ハイプリダイ ゼーシヨンによる選択と制限酵素断片の解析を行うことによりな— KGDH遺伝 子の全長を含む DN A断片を取得することができる。 この時、 プローブとして初 めに取得した DN A断片を用いることにより、 コロニーハイブリダィゼーシヨン をより容易に行うことができる。
α-KGD H遺伝子を含む D N A断片は、 他の適当なべクターに再度組換えて コリネ型 Lーグルタミン酸生産菌に導入することができる。 用いられるベクター は、 例えばコリネバクテリゥム属細菌で自律複製できるプラスミ ドである。 具体 的に例示すれば、 pAM330 (特開昭 58 - 67699号公報） 、 pHMl 5 19 (特開昭 58— 77895号公報） 、 pAJ 655、 pAJ 611、 p A J 1844 (以上、 特開昭 58 - 192900号公報） 、 p CG 1 (特開昭 57- 134500号公報） 、 p CG2 (特開昭 58— 35197号公報） 、 p CG4、 p CG 11 (特開昭 57 - 183799号公報） 、 pHK4 (特開平 5— 749 1号公報） 等が挙げられる。
上記ベクターと、 コリネ型 L—グルタミン酸生産菌の α— KGDH遺伝子とを 連結して組換え体 D N Aを調製するには、 あらかじめ制限酵素を用いてべクタ一 を切断する。 染色体 D N Aを切断するときに用いる制限酵素と同じものにより切 断し、 又は染色体 D N A断片の切断面に相補する切断面を生じる制限酵素を用い て切断する。 連結は、 T 4 D N Aリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通で める。
各種組換え D N Aを受容菌に導入するには、 これまでに報告されている形質転 換法に従って行う。 例えば、 ェシヱリヒア 'コリ K一 1 2について報告されてい るような、 受容菌細胞を塩化カルシウムで処理して D N Aの透過性を増す方法 (J. Mol. Biol. , 53, 159 (1970)) があり、 枯草菌について報告されているよう な、 増殖段階の細胞からコンビテントセルを調製して D N Αを導入する方法 （C. H. Gene, 1, 153 (1977)) がある。 あるいは、 枯草菌、 放線菌類及び酵母につい て知られているような、 D N A受容菌の細胞を、 組換え D N Aを容易に取り込む プロトプラスト又はスフ X口プラス卜の状態にして組換え D N Aを D N A受容菌 に導入する方 (Molec. Gen. Genet. , 168. Ill (1979)、 Nature, 274. 398 (1 978)、 Pro Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)) も応用できる。
プロトプラスト法では上記の枯草菌において使用されている方法でも充分高い 頻度を得ることができるが、 特開昭 5 7— 1 8 3 7 9 9号公報に開示されるよう に、 コリネバクテリゥム属細菌細胞のプロトプラストをポリエチレングリコール 又はポリビニルアルコールの一方及び二価金属イオンに接触させた状態で D N A をとり込ませる方法も利用できる。 ポリエチレングリコーノレ又はポリビニルアル コールの代りに、 カルボキシメチルセルロース、 デキストラン、 フイコール、 ブ ルロニック F 6 8 (セルバ社製） などの添加によっても D N Aのとり込みを促進 させることができる。 本発明の実施例で用いた形質転換の方法は、 電気パルス法 (特開平 2— 2 0 7 7 9 1号公報参照） である。
このようにして得たコリネ型 L一グルタミン酸生産菌由来の α— K G D Η遺伝 子を含む組換え体 D N Αを導入した菌株は、 炭素源、窒素源、 無機塩類、 さらに 必要に応じて有機微量栄養素を含有する通常の培地に培養することにより α— K G D Η活性を有する酵素を高レベルで菌体内に生成させることができる。
炭素源としては、 グルコース、 シュクロース、 廃糖蜜、 澱粉加水分解物などの 糖類の他、 酢酸、 クェン酸などの有機酸類、 エタノールなどのアルコール類が使 用され、 窒素源としては、 尿素、 アンモニゥム塩、 アンモニア水、 アンモニアガ スなどが使用される。 無機塩類としては、 リン酸塩、 カリウム塩、 マグネシウム 塩、 鉄塩、 マンガン塩などが使用される。 有機微量栄養素としては、 アミノ酸類、 ビタミン類、 脂肪酸類、 核酸類、 その他これらのものを含有するペプトン、 酵母 エキス、 大豆蛋白加水分解物などが使用される。
培養は、 温度 2 5ないし 3 7 にて p Hを 5ないし 9に制御しつつ、 1 0ない し 4 0時間好気的条件下にて行う。
培養終了後、 培養液中に生成蓄積した L—グルタミン酸を定量するとともに、 菌体の α— K G D Η活性のレベルを測定する。 活性測定は、 遠心分離などの操作 により培養物から回収した菌体を、 超音波処理、 フレンチプレス処理などにより 破砕した後遠心分離して菌体残渣を除去し、 ゲル濾過にて低分子物質を除いたも のを用いて、 Agric. Biol. Chem. , 44. 1897 (1980)記載の方法等により行うこと ができる。
かくして遺伝子が増幅されたコリネ型 L—グルタミン酸生産菌と増幅されてい ない菌について、 α— K G D H活性のレベルと Lーグルタミン酸の生産能の関係 を調べた結果、 後述の参考例 1に示すとおり、 遺伝子の増幅によりな— K G D H 活性のレベルが上昇した菌では L—グルタミン酸生産能が低下していることが明 らカヽとなった。
本遺伝子の利用としては、 薬剤遺伝子の挿入等による α— K G D Η活性欠失株 の取得、 in vitro変異による活性弱化株の取得、 プロモーターの改変による発現 低下株の取得等により、 従来のコリネ型 L一グルタミン酸生産菌と比較してさら に L一グルタミン酸生産能が向上した菌株を効率よく育種することが可能となる。
な一 K G D H活性が欠失した株の取得は、 化学薬剤を用 t、て変異を誘導する方 法でも、 遺伝子組換えによる方法でも取得可能である。 しかし、 化学薬剤による 変異誘導法では 一 K G D H活性が低下した株を得ることは比較的容易であるが 該活性が完全に欠失した株の取得は困難であり、 このような株を取得するには上 記のようにして明らかとなった α— K G D Η遺伝子の構造を基に、 遺伝子相同組 換え法により染色体上に存在する α— K G D Η遺伝子を改変又は破壊する方法が 有利である。 相同組換えによる遺伝子破壊は既に確立しており直鎖 D N Aを用い る方法や温度感受性プラスミ ドを用いる方法などが利用できる。
具体的には、 部位特異的変異法 （Kramer, W. and Frits, H. J. , Methods in
Enzymology, 154, 350 (1987)) や次亜硫酸ナトリウム、 ヒドロキシルァミン等の 化学薬剤による処理 (Shortle, D. and Nathans, D. , Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A. , 75, 270(1978)) によって、 α— K G D H遺伝子のコーディング領域又は プロモーター領域の塩基配列の中に 1つ又は複数個の塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加又は逆位を起こさせ、 このようにして改変又は破壊した遺伝子を染色体上の 正常な遺伝子と置換することにより遺伝子産物である a - K G D Hの活性を欠失 させるか a— K G D H遺伝子の転写を消失させることができる。
部位特異的変異法は、 合成オリゴヌクレオチドを用いる方法であり、 任意の限 定された塩基対だけに、 任意の置換、 欠失、 挿入、 付加又は逆位を導入できる手 法である。 この方法を利用するには、 まず、 クローン化され、 D N A塩基配列が 決定されている目的遺伝子を持つプラスミ ドを変性させて一本鎖を調製する。 次 に、 変異を起こさせたい部分に相補的な合成ォリゴヌクレオチドを合成するが、 この時合成ォリゴヌクレオチドを完全に相補的な配列にせず、 任意の塩基置換、 欠失、 挿入、 付加又は逆位を持つようにしておく。 この後一本鎖 D N Aと任意の 塩基置換、 欠失、 挿入、 付加又は逆位を持つ合成オリゴヌクレオチドをァニール させ、 さらに D N Aポリメラーゼ Iのクレノウフラグメントと T 4リガーゼを用 いて完全な 2本鎖プラスミ ドを合成し、 これをェシヱリヒア ·コリのコンビテン トセルに導入する。 このようにして得られた形質転換体の幾つかは、 任意の塩基 置換、 欠失、 挿入、 付加又は逆位が固定された遺伝子を含むプラスミ ドを持って いる。 遺伝子の変異を導入し、 改変又は破壊することができる同様な手法には、 リコンビナント P C R法 （PCR Technology, Stockton press (1989)) がある。 また、 化学薬剤処理を用いる方法は、 目的の遺伝子を含む D N A断片を直接次 亜硫酸ナトリゥム、 ヒドロキシルアミン等で処理することにより D N A断片中に ランダムに塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加又は逆位を持つ変異を導入する方法で このようにして取得した変異が導入されて改変又は破壊された遺伝子をコリネ 型 L一グルタミン酸生産菌の染色体上の正常な遺伝子と置換する方法としては、 相同性組換えを利用した方法 (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spri ng Harbor Laboratory press (1972) ; atsuyama, S. and Mizushima, S. , J. Ba cteriol. , 162, 1196(1985)) がある。 相同性組換えは、 染色体上の配列と相同性 を有する配列を持つプラスミ ド等が菌体内に導入されると、 ある頻度で相同性を 有する配列の箇所で組換えを起こし、 導入されたプラスミ ド全体を染色体上に組 み込む。 この後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こすと、 再びプラスミ ドが染色体上から抜け落ちるが、 この時組換えを起こす位置により 変異が導入された遺伝子の方が染色体上に固定され、 元の正常な遺伝子がプラス ミ ドと一緒に染色体上から抜け落ちることもある。 このような菌株を選択するこ とにより、 塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加又は逆位を持つ変異が導入されて改変 又は破壊された遺伝子が染色体上の正常な遺伝子と置換された菌株を取得するこ とができる。
かくして得られる α— K G D H活性が欠失したコリネ型 L—グルタミン酸生産 菌は、 α— K G D Η活性が部分的に低下した株に比べて特に過剰量のビォチンを 含有する培地において L一グル夕ミン酸生産能が顕著に優れている。
α - K G D H活性が欠失したコリネ型 L—グルタミン酸生産菌を用いて L一グ ルタミン酸を生成蓄積させるには、 炭素原、 窒素源、 無機イオン及びその他の栄 養素を含有する液体培地に培養する。 従来、 ピオチンを過剰に含む液体培地中に 培養を行う場合にはピオチン作用抑制物質、 すなわちペニシリン G、 F、 K、 0、 V、 X等のペニシリン類又はシユークロースモノパルミテート、 ポリオキシェチ レンソルビタンモノパルミテート等の高級脂肪酸もしくはその誘導体より成る界 面活性剤を培地に添加することが L一グルタミン酸を高収率で生産するために必 要であつたが、 α— K G D H活性が欠失した本発明のコリネ型 L一グルタミン酸 生産菌を使用する場合、 1 0乃至 1 0 0 0 a gノ 1の高濃度のピオチンを含む液 体栄養培地で培養する際においても上記のようなビォチン作用抑制物質の添加を 行うことなく高収率、 高蓄積で Lーグルタミン酸を生成蓄積させることができる。 即ち、 炭素源としては、 グルコース、 フラクトース、 澱粉糖化液、 酢酸等の他、 甘藷、 甜菜からの糖汁あるいは廃糖蜜等のビォチンを過剰に含有する原料も使用 することができる。 窒素源としては、 通常の L—グルタミン酸発酵に用いられる アンモニゥム塩、 アンモニア水、 アンモニアガス、 尿素等が用いられ、 その他リ ン酸塩、 マグネシウム塩等の無機イオンが必要に応じて適宜使用される。 また、 必要により、 サイアミン等の微量栄養素が適宜培地に添加される。
培養は好気的条件下で行うのがよく、 培養温度 24〜42 、 培養中 pHは 5 〜 9に制御するのがよく、 p Hの調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアル カリ性物質、 さらには尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニアガス等を使用すること ができる。
培養液からの L一グルタミン酸を採取する方法は、 イオン交換樹脂処理、 晶析 等公知の方法を適宜組み合わせることにより行われる。
なお、 L—グルタミン酸生産性を向上させるには、 グルタミン酸生合成系遺伝 子を強化することが有利である。 グルタミン酸生合成系遺伝子を強化した例とし ては、 解糖系のホスフォフルクトキナーゼ （PFK、 特開昭 63 - 102692 号） 、 アナプレロティック経路のホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ (PEPC、 特開昭 60— 87788号、 特開昭 62— 55089号） 、 TCA 回路のクェン酸合成酵素 （CS、 特開昭 62— 201585号、 特開昭 63— 1 19688号） 、 アコニット酸ヒドラターゼ （ACO、 特開昭 62- 29408 6号） 、 イソクェン酸デヒドロゲナーゼ （ I CDH、 特開昭 62 - 166890 号、 特開昭 63 - 214189号） 、 アミノ化反応としてはグルタミン酸デヒド ロゲナーゼ （GDH、 特開昭 61 -268185号） 等がある。
上記の遺伝子を取得するためには以下に示す様な方法が考えられる。
(1)目的遺伝子に変異が起こり特徴的な形質を示す変異株で、 目的遺伝子を導入す ることによりその形質が消失するような変異株を取得し、 その変異株の形質を相 補するような遺伝子をコリネ型細菌の染色体から取得する方法。
(2)目的遺伝子が他の生物において既に取得され塩基配列が明らかになつている場 合、 相同性の高い領域の DNAをプローブとしてハイブリダィゼーシヨンの手法 により目的の遺伝子を取得する方法。
(3)目的遺伝子の塩基配列がかなり詳細に判明している場合は目的遺伝子を含む遺 伝子断片をコリネ型細菌の染色体を铸型とし P C R法（ポリメラーゼ 'チェーン • リアクション法） により取得する方法。
ここで用いる染色体の取得方法は上記の方法を用いることができる。 また、 宿 主一ベクター系としては、 コリネ型細菌で利用可能なものであればよく、 上記で 述べたものが用いられる。 本発明の実施例においては塩基配列が既に明らかにな つている場合に有効である上記 (3)の方法を用いた。
また、 上記 (2)及び (3)の方法で遺伝子を取得する場合、 目的遺伝子が独自のプ 口モーターを持たない時にはコリネ型細菌でプロモーター活性を持つ D N A断片 を目的遺伝子の上流に挿入することにより目的遺伝子を発現させることができる。 目的遺伝子の発現を強化するには、 強力なプロモーターの下流に目的遺伝子を連 結することが考えられる。 コリネ型細菌の細胞内で機能するプロモーターのうち 強力なものとしては、 大腸菌の 1 a cプロモーター、 t a cプロモーター、 t r pプロモータ一等力ある (Y. orinaga, M. Tsuchiya, K. Miwa and K. Sano, J. Biotec h.， 5, 305- 312(1987)) 。 また、 コリネバクテリゥム属細菌の t r pプロモーター も好適なプロモーターである （特開昭 6 2 - 1 9 5 2 9 4号公報） 。 本発明の実 施例においては、 P E P C遺伝子の発現にコリネ型細菌の t r pプロモーターを 用いた。
また、 本発明の α— K G D H遣伝子の増幅は、 L一リジン生産能を有するコリ ネ型細菌において、 その生産能を向上させる上で有用である。
従来より種々の人工変異株が L一リジン生産菌として用いられており、 これら を宿主として本発明の組換え D Ν Αを保有させることによりその Lーリジン生産 能を向上させることができる。 このような人工変異株としては次のようなものが ある。 S— （2—アミノエチル） 一システィン （以下、 「A E C」 と略記する） 耐性変異株、 その生育に L—ホモセリンのようなアミノ酸を必要とする変異株 (特公昭 4 8— 2 8 0 7 8号、 特公昭 5 6 - 6 4 9 9号） 、 A E Cに耐性を示し、 更に L -ロイシン、 L -ホモセリン、 L一プロリン、 L—セリン、 L—アルギニ ン、 Lーァラニン、 L一パリン等のアミノ酸を要求する変異株 （米国特許第 3 7 0 8 3 9 5号及び第 3 8 2 5 4 7 2号） 、 D L— α—アミノー ε力プロラクタム、 α—アミノーラウリルラクタム、 ァスパラギン酸アナログ、 サルファ剤、 キノィ ド、 Ν—ラウロイルロイシンに耐性を示す L一リジン生産変異株、 ォキザ口酢酸 脱炭酸酵素または呼吸系酵素阻害剤に耐性を示す Lーリジン生産変異株 （特開昭 50— 53588号、 特開昭 50— 31093号、 特開昭 52— 102498号、 特開昭 53 - 9394号、 特開昭 53 - 86089号、 特開昭 55 - 9783号、 特開昭 55— 9759号、 特開昭 56— 32995号、 特開昭 56- 39778 号、 特公昭 53— 43591号、 特公昭 53— 1833号） 、 イノシトールまた は酢酸を要求する Lーリジン生産変異株 （特開昭 55— 9784号、 特開昭 56 一 8692号） 、 フルォロピルビン酸または 34 以上の温度に対して感受性を 示す L—リジン生産変異株 （特開昭 55- 9783号、 特開昭 53- 86090 号） 、 エチレングリコールに耐性を示し、 L一リジンを生産するブレビバクテリ ゥムまたはコリネバクテリゥムの変異株 （米国特許第 441 1997号参照） 等。 具体的には、 以下のような株を例示することができる。
ブレビバクテリウム ·ラクトフアーメンタム AJ 12031 (FERM-B P 277、 特開昭 60— 62994号公報）
ブレビバクテリウム ·ラクトフアーメンタム ATCC 39134 (特開昭 6 0-62994号公報）
コリネバクテリゥム .グルタミカム AJ 3463 (FERM— P 1987、 特公昭 51 -34477号公報）
ブレビパクテリゥム 'ラクトフアーメンタム AJ 12435 (FERM B P— 2294、 米国特許第 5, 304， 476号)
ブレビバクテリウム ·ラクトフアーメンタム AJ 12592 (FERM B P— 3239、 米国特許第 5， 304, 476号)
コリネバクテリゥム .グルタミカム AJ 12596 (FERM BP— 32
42、 米国特許第 5， 304, 476号）
このような Lーリジン生産菌に α— K G D Η遺伝子を導入するには、 既に述べ たように適当なベクターと連結して行えばよい。
使用する L一リジン生産用の培地は、 炭素源、 窒素源、 無機イオン及び必要に 応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地である。 炭素源としては、 グ ルコース、 ラクトース、 ガラクトース、 フラクトースゃ澱粉加水分解物などの糖 類、 エタノールやイノシトールなどのアルコーノレ類、 酢酸、 フマール酸、 クェン 酸、 コハク酸等の有機酸類を用いることができる。 窒素源としては、 硫酸アン モニゥム、 塩化アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム等の無機アンモニゥム塩、 大 豆加水分解物などの有機窒素、 アンモニアガス、 アンモニア水等を用いることが できる。 無機イオンとしては、 リン酸カリウム、 硫酸マグネシウム、 鉄イオン、 マンガンイオン等が少量添加される。 有機微量栄養素としては、 ビタミン など の要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。 培養は好気的条件下で 1 6〜 7 2時間実施するのがよく、 培養温度は 3 0 〜 4 5 に、 培養中 p Hは 5〜8 . 5に制御する。 尚、 p H調整には無機あるいは 有機の酸性ある 、はアル力リ性物質、 更にァンモニァガス等を使用することがで さる。
発酵液からの L—リジンの採取は通常イオン交換樹脂法、 沈澱法その他の公知 の方法を組み合わせることにより実施できる。 図面の簡単な説明 図 1は、 α— K G D Η遺伝子を含む D Ν Α断片の制限酵素地図である。 発明を実施するための最良の形態 以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 なお、 制限酵素は市販 品 （宝酒造社製） を用いた。 実施例 1 α - K G D Η遺伝子の単離及び構造決定
( 1 ) プローブの調製
大腸菌と枯草菌のな— K G D H · Ε 1サブュニッ ト遺伝子間で相同性の高い領 域を選び、 配列表配列番号 3及び 4に示すオリゴヌクレオチドをホスホアミダイ ド法により D N A合成装置 （アプライドバイオシステム社製モデル 3 9 4 ) を用 いて合成した。
プライマーとして該オリゴヌクレオチド 0 . 2 5 μ τη ο 1 e、 铸型として常法 によって調製したバチルス ズブチリス N A 6 4 (同株はバチルス 'ジエネテ イツク .ストック ·センター （米国オハイオ州立大学） より入手した） の染色体
DNA0. 1 u g及びタック DNAポリメラーゼ （宝酒造社製） 2. 5ユニッ ト を dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP各 200 Μ、 塩化カリウム 50m M、 塩化マグネシウム 1. 5mM及びゼラチン 0. 0001 %を含有する 10m Mトリスー塩酸緩衝液 （pH 8. 3) 0. 1mlに添加し、 94 を 1分、 55 を 2分、 72 を 3分のサイクルを 30回繰り返す PCR法を行った。 反応液 をァガロースゲル電気泳動に供し、 目的とする DNA断片をグラスパウダー （宝 酒造社製） を用いて回収した。 この DN A断片をクレノウフラグメント （アマシ ャム社製） と [α—32 P]dCTP (アマシャム社製） を用いたラベル化の常法に 従って標識し、 プローブとして用いた。
(2) ブレビパクテリゥム ·ラクトファーメンタム ATCC 13869の染色 体 DN A断片の調製
バクト · トリプトン （ディフコ社製） 1%、 バクト ·イーストエキストラクト (ディフコ社製） 0. 5%及び塩化ナトリウム 0. 5%から成る T— Y培地 （p H7. 2) 50 Om 1に、 ブレビバクテリウム ·ラクトフアーメンタム ATC C 13869を接種し、 31. 5てで 6時間培養し培養物を得た。 この培養物を 5, OO O rpmで 10分間遠心分離処理し沈澱物として湿菌体 2 gを得た。 該菌体から斉藤、三浦の方法 （Biochem. Biophys. Acta. , 72， 619， (1963)) により染色体 D N Aを抽出した。 この染色体 D NA2^g及び制限酵素！ _e_Q_R I 200ュニットを 1 OmM塩化マグネシウム、 100 mM塩化ナトリゥム及び ImMジチオスレィトールを含有する 5 OmMトリスー塩酸緩衝液 （pH7. 5) におのおの混合し、 温度 37 で 15時間反応させた。 反応終了液を常法により フエノール抽出処理し、 エタノーノレ沈澱処理して JL£_Q-R Iで消化されたブレビ ノ クテリゥム ·ラクトファーメンタム ATCC 13869の染色体 DNA断片 を得た。
(3) ブレビパクテリゥム 'ラクトフアーメンタム ATCC 13869の α— KGDH遺伝子の単離
プラスミ ドベクター p U C 1 8 (宝酒造社製） 1 u g及び制限酵素^ _Q_Q_R I 20ユニットを 1 OmM塩化マグネシウム、 1 00 mM塩化ナトリゥム及び 1 m Mジチオスレィトールを含有する 5 OmMトリスー塩酸緩衝液 （pH 7. 5) に 混合し、 温度 37 で 2時間反応させて消化液を得、該液を常法によりフエノー ル抽出及びエタノール沈澱した。 この後、 プラスミ ドベクター由来の DNA断片 が再結合するのを防止するため、 Molecular Cloning 2nd edition (J. Sambrook,
E. F. Fritsch and T. aniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, pi. 60 (1989)) の方法でパ'クテリアル'アルカリフォスファターゼ処理により DNA 断片の脱リン酸化を行い、 常法によりフエノール抽出処理し、 エタノール沈澱を 行なつた 0
この JL0_Q_R Iで消化された PUC 1 8を 0. 1 f g、 (2) で得られた E c o.R Iで消化されたブレビバクテリゥム ·ラクトファーメンタム ATCC 1 3 869の染色体 DNA断片 1 n g及び T4DNAリガーゼ 1ュニッ卜 （宝酒造社 製） を 6. 6 mM塩化マグネシウム、 1 OmMジチオスレィトール及び 1 OmM アデノシン三リン酸を含有する 66mMトリスー塩酸緩衝液 （pH7. 5) に添 加し、 温度 1 6 で 8時間反応し、 DNAを連結させた。 次いで該 DNA混合物 で、 常法によりェシヱリヒア ·コリ JM1 09 (宝酒造社製） を形質転換し、 これを 1 00 // g/m 1のアンピシリンを含む L寒天培地上にまき、 約 1 0, 0 00個の形質転換体を得た。
得られた形質転換体から、 olecular Cloning 2nd edition (J. Sambrook, E.
F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, pi.90 (1989)) の方法により、 （1) で得られたプローブ DNAとハイブリダィズする 形質転換体を選択した。
(4) ブレビパクテリゥム 'ラクトフアーメンタム ATCC 1 3869のな一 KGD H遺伝子の塩基配列の決定
(3) により得られた形質転換体から Molecular Cloning 2nd edition (J. Sa mbrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Pr ess, pi.25(1989))記載のアルカリ溶菌法によりプラスミ ド DNAを調製した。 該プラスミ ド DNAはブレビバクテリゥム ·ラクトファーメンタム ATCC 1 - ί7 -
3869の染色体 DNA由来の約 6キロベースの DNA断片を含んでいた。 該プ ラスミ ドを （3) の反応組成で制限酵素^^ R I及び lL lで切断し、 常法 に従いァガロースゲル電気泳動を行い （3) と同様にしてサザンハイブリダィゼ ーシヨンを行いプローブ DNAとハイブリダィズする断片を同定した。 その結果、 E c oR I及び iLQjに切断された約 3キロベースの切断断片がハイブリダィ ズすることが判明した。 該 DNA断片を （3) で行ったように E c oR I及び X J3_QL Iで切断したプラスミ ドベクター P H S G 397 (宝酒造社製） に連結しク ローン化した。 得られたプラスミ ド DN Aを用いて該 DN A断片の塩基配列の決 定を行った。 塩基配列の決定は、 Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing K it (アプライドバイォケミカル社製） を用い Sangerの方法 （J. Mol. Biol. , 143, 161 (1980)) に従って行った。
得られた DN A断片は完全なオープン · リーディング'フレームを含んでいな かったため、 （3) で行ったようにブレビパクテリゥム ·ラクトファーメンタム
ATCC 1 3869の染色体 DNAを HLQJで切断し pHSG 397に連結 した組換え体プラスミ ドで形質転換を行い、 （2) で得られたブレビバクテリウ ム 'ラクトフアーメンタム ATCC 1 3869の染色体 DN A由来の約 3キロ ベースの E c oR K Xh 0 I切断断片を (1) の方法に従いラベル化したもの をプローブとしてハイブリダィズする形質転換体を選択した。 得られた形質転換 体の有するプラスミ ドは約 9キロベースの DN A断片を含んでいた。 この DNA 断片を含む遺伝子の制限酵素地図を図 1に示した。 該プラスミ ドを （3) の反応 組成で制限酵素 丄 I及び Xh o Iで切断し、 常法に従いァガロースゲル電気 泳動を行い （3) の方法によりハイブリダィズする断片を同定した結果、 約 4. 4キロベースの断片であることが判明した。 該 DNA断片を （3) で行ったよう に S a 1 I及び Xh o Iで切断したプラスミ ドベクター pHSG 397に連結し クローン化した。 このプラスミ ドを pHSGS— Xと命名した。 該プラスミ ドが 含む S a 1 I及び Xh o I切断断片中 S a 1 I切断点から E c oR I切断点まで の約 1. 4キロベースの DN A断片の塩基配列の決定を上記と同様にして行った。 こうして得られた S a 1 I及び Xh o I切断遺伝子断片の塩基配列は配列表配 列番号 1に示す通りである。 オープン · リーディング'フレームを推定し、 その 塩基配列より推定される産物のァミノ酸配列を配列表配列番号 1及び配列番号 2 に示した。 すなわち、 配列表配列番号 1に示されるアミノ酸配列から成る蛋白質 をコードする遺伝子が、 ブレビパクテリゥム ·ラクトファーメンタム ATC C 13869の α— KGDH遺伝子である。 なお、 蛋白質の Ν末端にあるメチォ二 ン残基は開始コドンである A T Gに由来するため蛋白質本来の機能とは無関係で あることが多く、 翻訳後べプチダーゼの働きにより除去されることがよく知られ ており、 上記蛋白質の場合にもメチォニン残基の除去が生じている可能性がある。 塩基配列、 アミノ酸配列おのおのについて既知の配列との相同性比較を行った。 用いたデータベースは EMBL及び SWI 35—？1 0丁でぁる。 その結果、 配 列表配列番号 1に示される DNA及びそれにコードされる蛋白質は、 既に報告済 みの大腸菌及び枯草菌のな— KG DH · E 1サブュニット遺伝子等と相同性を持 っコリネ型細菌では新規な遺伝子及び蛋白質であることが判明した。
本遣伝子のコードする蛋白質は、 N末端のメチォニン残基を含めて 1， 257 個のアミノ酸から成り、 既に報告のあるな一 KGDHとは大きく異なる特徴を有 していた。 すなわち、 C末端側の約 900アミノ酸は種々の E 1サブユニットと 高い相同性を示したが、 N末端側の 300アミノ酸は他種 α— KG DHには見ら れないものであり、 本蛋白質が特殊な機能を持つことを示唆するものである。 こ の N末端側 300アミノ酸部分を既知の配列との相同性比較を行うと大腸菌ゃァ ゾトパ 'クター属細菌の E 2サブュニッ卜との相同性が認められた。 これは、 本蛋 白質が他種な一 KGDHとは異なり、 El、 E 2両方の活性を持つ可能性を示唆 するものである。
また、 本遺伝子オープン ' リーディング'フレーム上流には大腸菌に見られる プロモーター共通配列に類似した配列 （281- 286及び 307- 312)及びコリネ型細菌 のリボゾーム結合配列と類似した配列 (422-428)が見いだされた。 本遺伝子ォ一 プン · リ一ディング ·フレーム下流には、 耘写の終結シグナルと類似したステム &ループ構造 (4243-4281)がみられた。 これらの配列は本遺伝子が独立して転写、 翻訳を受けており、 他種な— KGDHとは異なつた遺伝子構造を持っていること を示唆するものである。 実施例 2 ブレビパクテリゥム 'ラクトフアーメンタム ATCC 1 3869 由来のな一 K G D H遺伝子の発現による α— K G D Η活性の増幅
(1) な一 KGDH遺伝子のブレビパクテリゥム ·ラクトフアーメンタム AT CC 1 3869及び A J 1 1 060への導入
実施例 1で得られた pHSGS—Xプラスミ ド DNA 1 fi g, 制限酵素 S a 1 I及び imlそれぞれ 20ユニットを実施例 1 (3) に記載した緩衝液中で混 合し、 温度 37 で 3時間反応した。 一方、 ブレビパクテリゥム属細菌内で自律 複製可能なプラスミ ド P PK4 (特開平 5— 749 1号公報参照） DNA 1 u g と 20ュニットの S a 1 Iを実施例 1 (3) に記載した緩衝液中で混合し、 温度 37 で 3時間反応した。 両反応液を常法によりフ Xノール抽出及びエタノール 沈澱した。 この後、 プラスミ ドベクター由来の DN A断片が再結合するのを防止 するため、 実施例 1 (3) の方法でバクテリアル'アルカリフォスファターゼ処 理により DN A断片の脱リン酸化を行い、 常法によりフヱノール抽出処理し、 ェ タノール沈澱を行なった。 この S a 1 Iで消化された P PK4を 0· 1 g、 上 記で得られた S a 1 I及び Xh o Iで消化された pHSGS— Xプラスミ ド DN AO. 5〃 g及び T4DNAリガーゼ （宝酒造社製） 1ユニッ トを実施例 1 (3) 記載の緩衝液中で混合し、 温度 1 6 で 8時間反応し、 DNAを連結させた。 次 いで該 DN A混合物を電気パルス法を用いた形質転換の常法 （特開平 2— 207 79 1号公報） に従い、 ブレビパクテリゥム ·ラクトファーメンタム A J 1 1 060 (特公昭 59- 1 0797号公報） に導入した。 これをポリペプトン 1 %、 酵母エキス 1 %、 塩化ナトリウム 0. 5%、 グルコース 0. 5%及びカナマイシ ン 25 g/m 1から成る寒天培地上にまき、 形質転換体 A J 1 106 OZpP KS— Xを得た。 本形質転換体は、 ブレビパクテリゥム ·ラクトファーメンタム
A J 1 2999と命名され、 平成 6年 6月 3日付けで通商産業省工業技術院生 命工学工業技術研究所に受託番号 FERM P- 14349で寄託され、 平成 7 年 6月 2日にブダぺスト条約に基づく国際寄託に移管され、 受託番号 FERM BP— 51 23が付与されている。
得られた形質転換体から実施例 1 (4) に従ってプラスミ ド DNAを抽出し、 常法に従ってァガロースゲル電気泳動を行うことにより、 プラスミ ド p PK4に ブレビパクテリゥム ·ラクトファ一メンタム ATCC 1 3 8 6 9由来の S a 1 I— iLQj断片が結合した組換え体 DNAを選択した。 該プラスミ ドを p PK S— Xと命名した。
また、 同様にしてブレビバ'クテリウム ·ラク卜ファーメンタム ATC C 1 3 8 6 9を宿主として形質転換体 ATC C 1 3 86 9 Zp P K S— Xを取得した。
(2) α— KG DH遺伝子増幅株の酵素活性
( 1 ) で得られたブレビパクテリゥム ·ラクトフアーメンタム A J 1 1 0 6 OZp PKS—X及び ATC C 1 3 8 6 9 /p P K S— Xをグルコース 8 %、 リ ン酸 2水素カリウム 0. 1 %、 硫酸マグネシウム 0. 0 04 %、 硫酸アンモニゥ ム 3%、 硫酸第一鉄 0. 0 0 1 %、 硫酸マンガン 0. 0 0 1 %、 大豆加水分解液 0. 0 5 %、 ビタミン B! 20 0 1、 ピオチン 3 0 0 ^ g/ l ^ 炭酸カルシ ゥム 5%及びカナマイシン 2 5mg/ lから成る培地（pH 8. 0) 5 0m lに 接種し、 3 1. 5 で 1 8時間培養した。 該培養液を常法に従って遠心分離し、 菌体を集めた。
この菌体を 0. 2%塩化カリウム水溶液で懸濁し、遠心分離する操作を 2回繰 り返し菌体を洗浄した。 該菌体を 30%グリセロールを含む N—トリス （ヒドロ キシメチル） メチルー 2—アミノエタンスルフォン酸（以下 TE S) 0. 1 M緩 衝液 （pH 7. 7) に懸濁し、 超音波処理した後、 1 5, 0 0 0 r pm、 3 0分 遠心分離して上清を得た。 この細胞破砕液をセフアデクス G— 2 5 (Pharmacia社 製） カラムクロマトグラフィーに供し、 低分子量物質を除いたものを粗酵素液と した。
得られた粗酵素液のな一 KGDH活性を Agric. Biol. Chem. , 44. 1897 (1980) 記載の反応組成液を用いて 3—ァセチルピリジン ·アデニン 'ジヌクレオチドの
3 6 5 nmの吸光度の上昇を測定した。 また、 粗酵素液の蛋白質濃度はゥシ血清 アルブミンを標準としてバイオ ·ラッド社製キットを用いて測定し、 酵素の比活 性を算出した。 対照として、 プラスミ ド p PK 4で同様に形質転換して得た A J
1 1 06 0/p PK4及び ATC C 1 3 8 6 9 /p P K 4の比活性を求めた。 そ の結果を表 1に示した。 AJ 11060ノ pPKS— Xと ATCC13869ノ p PKS— Xはそれぞれ A J 11060ZpPK4と ATCC 13869ZpP K 4の 2倍もしくはそれ以上の比活性を有しており、 この結果から取得した遺伝 子断片が α— K G D Η活性を有する酵素をコードしていることが示された。
Figure imgf000023_0001
また、 粗酵素液を SDSポリアクリルアミ ドゲル電気泳動に供した結果、 取得 された遺伝子から予想される酵素の分子量 139キロダルトンに見合った約 13 5キロダル卜ンのバンドの増幅が観察された。 これは取得した遺伝子が形質転換 株において実際に発現していることを示すものである。 参考例 1 α— KGDH活性と Lーグノレタミン酸生産能との関係 ブレビパクテリゥム 'ラクトフアーメンタム AJ 11060ZpPK4及び A J 1106 OZpPKS— Xを Lーグルタミン酸生産培地に培養し、 培養液中 に生成蓄積した L一グルタミン酸を測定した。 培養は界面活性剤を添加する方法 で以下の様に行った。
グルコース 8%、 リン酸 2水素カリウム 0. 1 %、 硫酸マグネシウム 0. 04 %、 硫酸アンモニゥム 3 %、 硫酸第一鉄 0. 001 %、 硫酸マンガン 0. 001 %、 大豆加水分解液 1. 5%、 サイアミン塩酸塩 200 /z g/ 1、 ピオチン 30 0 ^ g/ K カナマイシン 25mgZ 1及び C a COs (別殺菌） 5%から成る 生産培地 （pH8. 0) 20m 1を 500m 1容坂ロフラスコに分注し加熱殺菌 した。 これにあらかじめ A J 1106 OZp PK4及び A J 11060/p PK S— Xのそれぞれをポリペプトン （日本製薬社製） 1%、 バクト ·イーストェキ ストラクト （ディフコ社製） 1%、 塩化ナトリウム 0. 5%、 グルコース 0. 5 %及びカナマイシン 25mgZlから成る平板培地 （pH7. 2) にて培養して 得た菌体を接種し、 31. 5 にて 18時間振とう培養し、 種培養を得た。
ついで、 界面活性剤 (Twe e n40 ：シグマ社製） を 3 g/ 1添加した生産 培地又は添加していない生産培地に得られた種培養をそれぞれ 5 %量接種し、 同 様にして 31. 5 にて約 20時間振とう培養した。
培養終了後、 培養液中の L一グルタミン酸蓄積量及び残グルコース濃度を旭化 成社製バイオテックアナライザー AS— 210を用いて測定した。 菌体増殖量は、 0. 02規定塩酸で培養物を 51倍希釈した液の 620 nmにおける吸光度を測 定することにより求めた。 その結果を表 2に示す。 表 2
Figure imgf000024_0001
いずれの菌株も界面活性剤を添加しない培地では、 L—グルタミン酸の生成は 全く認められず、 界面活性剤を添加した場合のみグルタミン酸は培養液中に生成 蓄積した。 この際、 な一 KGDH遺伝子を含むプラスミ ド pPKS— Xを導入し た株では、 対照となる pPK4導入株に対して著しい L—ダルタミン酸収率の低 下を起こした。 このことは α— KGD Η活性のレベルが界面活性剤添加による L 一グルタミン酸生産に大きな影響を及ぼすことを示すものである。 参考例 2 ぺニシリン添加法による L—グルタミン酸生産能の比較 α-KGD H遺伝子増幅の L一グルタミン酸生成に及ぼす効果をぺニシリン添 加法により調べた。
参考例 1と同様に種培養を調製し、 0. 4ュニット /m 1のべニシリンを添加 した生産培地又は添加しない生産培地に、 菌体乾燥重量で約 2 %になる様に種培 養をそれぞれ接種し、 31. 5^にて約 25時間振とう培養を行った。
培養終了後、 培養液中の L一グルタミン酸蓄積量及び残グルコース濃度を参考 例 1と同様に測定した。 結果を表 3に示した。 この結果は、 α— KGDH活性の レベルがベニシリン添加による L一グルタミン酸生産においても大きな影響を及 ぼすことを示すものである。 表 3
Figure imgf000025_0001
卖施例 3 g-KGD H遣伝子欠損株の作製 α-KGD H遺伝子増幅により L一グルタミン酸生成が抑制されたことから、 逆に α— K G D Η遺伝子を破壊する事によりグルタミン酸収率を向上させること が期待された。 遺伝子破壊株は、 特開平 5— 7491号に示される温度感受性プ ラスミ ドを用いた相同組換え法により取得した。 具体的には、 α— KGDH遺伝 子内には配列表配列番号 1の 1340番目と 3266番目の 2箇所に ϋ_Εϋΐ Iで消化され る部位が存在する。 そこで、 実施例 1で得られた pHSGS— Xを JLBJlIで部 分消化したのち自己結合させ、 ϋ Hi断片の 1926塩基対を欠失したプラスミ ド pHSGS一 ΧΔΚを作成した。 p H S G S— X厶 K上の α— K G D Η遺伝子は 中央部分を欠失した構造になっている。 次に PHSGS— ΧΔΚの B amH I認 識部位に、 コリネ型細菌で自己複製可能なプラスミ ドから取得した自己複製能が 温度感受性になった変異型の複製起点を導入し、 プラスミ ド p BTS— X厶 Kを 作成した。 具体的には、 コリネ型細菌で自己複製可能なプラスミ ドから取得した 自己複製能が温度感受性になつた変異型の複製起点を持つブラスミ ド p H S C 4 (特開平 5— 7491号） を制限酵素 K p n Iで消化し、 D N A平滑末端化キッ ト （宝酒造社製、 Blunting kit) を用い平滑末端化した後、 B amH I リンカー (宝酒造社製） を結合させた後自己結合させて得たプラスミ ドを制限酵素 B am H Iで消化し、 自己複製能が温度感受性になつた変異型の複製起点を含む遺伝子 断片を取得し、 これを pHSGS— ΧΔΚの旦^ jnH I部位に挿入しプラスミ ド pBTS— X厶 Kを取得した。
このプラスミ ドをコリネ型 Lーグルタミン酸生産菌の野生株であるブレビパク テリゥム ·ラクトファーメンタム ATCC 1 3869に電気パルス法 （特開平 2— 20779 1号） を用いて導入し、 特開平 5— 7491号の方法で染色体上 の α— KGDH遺伝子を欠失型に置換した。 具体的には、 プラスミ ドが導入され た ATCC 1 3869/pBTS— ΧΔΚを CM2 G (ポリペプトン 196、 酵母 エキス 1 %、 塩化ナトリウム 0. 5%、 グルコース 0. 5%、 ρΗ7. 2) 液体 培地で 25^にて 6時間振とう培養した後、 5 g/m 1のクロラムフエニコー ルを含む CM 2 G寒天培地上に撒き、 34 で培養して形成したコロニーをブラ スミ ド組み込み株として取得した。 次に、 この株から 34 でクロラムフヱニコ 一ルに対して感受性になつた株をレプリカ法により取得した。 この感受性株から 染色体上の α— K G D Η遺伝子の塩基配列を調べ、 α— K G D Η遺伝子が欠失型 に置換されていることを確認し、 これを厶 S株と命名した。 厶 S株の a- KGDH 活性を実施例 2に記した方法により測定したところ、 活性は全く検出されなかつ
実施例 4 g d h、 g i t A及び i c d遺伝子増幅用プラスミ ドの作製
(1) g dh、 g 1 t A及び i c d遺伝子のクローニング
ブレビパクテリゥム 'ラクトフアーメンタムの g dh、 g 1 t A及び i c d遺 伝子を PC R法でクローニングした。 PCR法に用いるプライマーは、 既に報告 されているコリネバクテリゥム 'グル夕ミカムの g d h遺伝子 （Molecular Micr obiology, 6(3), 317-326 (1992))、 g 1 t A遺伝子（Miclobiology, 140, 181 7-1828 (1994)) 及び i c d遺伝子 (J. Bacteriol. (1995), 177, 774-782) の配 列をもとに合成した。 g dh遺伝子の増幅用のプライマーとしては、 配列表配列 番号 5 (5' 側） と配列番号 6 (3' 側） に示すオリゴヌクレオチド、 g l t A 遺伝子増幅用プライマーとしては、 配列番号 7 (5' 側） と配列番号 8 (3' 側） に示すオリゴヌクレオチド、 icd遺伝子増幅用プライマーとしては、 配列番号 9 (5' 側） と配列番号 10 (3' 側） に示すオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成 し使用した。
ブレビパクテリゥム ·ラクトファーメンタム ATCC 13869から実施例 1の方法により染色体 DN Aを調製し、 これを铸型とし上記オリゴヌクレオチド をプライマーとして用い P C R法を行つた。 得られた増幅産物の両末端を市販の DN A末端平滑化キット （宝酒造社製、 Blunting kit) を用い平滑末端化した後、 ベクタープラスミ ド pHSG399 (宝酒造社製） の^ m^J部位にそれぞれクロ 一二ングし、 プラスミ ド pHSG— gdh、 pHSG-g 1 t A及び pHSG— i c dを得た。
(2) pp c遺伝子のクローニングと発現
実施例 1の方法によりブレビパクテリゥム ·ラクトファーメンタム ATCC 13869の染色体 DN Aを調製し、 これを铸型として P E P Cをコードする p p c遺伝子を含む約 3.4Kbpの DNA断片を PCR法を用いて取得した。 PCR法 に用いるプライマーは、 既に報告されているコリネバクテリゥム ·グルタミカム の P p c遺伝子の配列 (Gene, 77, 237-251 (1989)) をもとに合成し、 PCR反 応は上記と同様にして行った。 プライマーの配列を配列番号 1 1 (5' 側） と配 列番号 12 ( 3 ' 側） に示す。
P C R反応の増幅産物を制限酵素 丄 I (宝酒造社製） を用いて消化し、 プ ラスミ ド pHSG 399の S a 1 I部位に揷入したプラスミ ド pHSG— pp c ' を取得した。 DHS G— p p c' の PEPC遺伝子は pHSG 399の 1 a c プロモーターと逆向きに挿入されている。
次に、 ブレビパクテリゥム ·ラクトファーメンタムで機能するプロモーターと して知られているトリブトファンオペロンのプロモーター （Gene, 53， 191-200 (1987)) を pHSG— pp c' 上の p p c遺伝子の上流に挿入した。 このプロモ 一ターは配列表配列番号 13に示す 51塩基からなる配列で活性を示すことが知ら れている。 このプロモーター活性を持つ 51塩基対を含み、 かつ両端が制限酵素 ϋ ρ η I及び Xb a Iによる切断断片と一致するような 2本鎖 D N Aが得られる様 に、 配列番号 13に示す配列を持つヌクレオチド鎖及びこれの相補鎖となる配列 番号 14の配列を持つヌクレオチド鎖を合成した。
合成した両 DNAを約 10pmol/tzlずつの濃度になるように混合し、 100 、 10分 加熱した後、 室温で放冷しアニーリングさせた。 pHSG— pp c' を制限酵素 Kpn I及び Xb a I (宝酒造社製） により消化し、 上記のプロモーターと結合 させた。 結合反応は宝酒造社製ライゲ一シヨンキットを用いて行った。 これによ り、 p p c遺伝子の上流にトリプトフアンオペロンのプロモーターが 1コピー挿 入されたプラスミ ド pHSG— pp cを得た。
(3) gdh、 g 1 t A及び i c dの 3種類の遺伝子を連結したプラスミ ドの作 製
gdh、 g 1 tA及び i c dの 3種類の遺伝子を連結したプラスミ ドを作製し た。 具体的には、 プラスミ ド pHSG— gdhを制限酵素 _i_Q_o_RIで消化し、 市 販の DNA末端平滑化キット （宝酒造社製、 Blunting kit)を用い平滑末端化し たものに上記の両末端を平滑末端化した g 1 t A遺伝子の PC R増幅産物を連結 し、 プラスミ ド pHSG— gdh + g 1 t Aを取得した。 更に、 プラスミ ド pH SG-gdh + g 1 t Aを制限酵素 ϋ且 ϋ Iで消化し、 同様にして平滑末端化し たものに上記の両末端を平滑末端化した i c d遺伝子の P C R増幅産物を連結し、 プラスミ ド pHSG— gdh + g l t A+ i c dを取得した。
(4) gdh、 g 1 t A及び p p cの 3種類の遺伝子を連結したプラスミ ドの作 製
gdh、 g 1 t A及び pp cの 3種類の遺伝子を連結したプラスミ ドを作製し た。 具体的にはプラスミ KpHSG—g dh + g l t Aを制限酵素 JLB_ _Iで消 化し、 プラスミ ド pHSG— p p cを制限酵素 KD n I及び S a 1 Iで消化し、 上流にトリブトファンオペ口ンのプロモーターを持つ p p c遺伝子断片を取得し、 得られた断片を DNA平滑末端化キッ ト （宝酒造社製、 Blunting kit) を用い平 滑末端化した後、 ΚΡ Π I リンカ一（宝酒造社製） を用いてプラスミ ド pHSG -g dh + 1 t Aの Kp n I部位に挿入し、 プラスミ ド pHSG—g dh + g 1 t A + p p cを取得した。
(5)上記プラスミ ドへのコリネバクテリゥムでの複製起点の導入
pHSG— gdh、 pHS G - 1 t A、 pHSG— pp c、 pHSG - i c d、 pHSG-g dh + g l t A+ i c d及び pHSG— g d h + 1 t A + p p c をコリネ型細菌細胞内で自律複製可能にするために、 既に取得されているコリネ 型細菌で自律複製可能なプラスミ ド pHMl 519 (Agric. Biol. Chem. , 482 901-2903 (1984)) 由来の複製起点 （特開平 5— 7491号） を PH SG-g dh, pH S G - 1 t A、 pHSG— pp c、 pHSG— i c d、 pHSG-gdh + g 1 t A+ i c d及び pHSG— gdh + g 1 t A + p p cに導入した。 具体的に は、 pHMl 519由来の複製起点を持つプラスミ ド pHK4 (特開平 5— 74 91号） を制限酵素 B amH I及び KPn Iで消化し、 複製起点を含む遺伝子断 片を取得し、 得られた断片を DN Α平滑末端化キット （宝酒造社製、 Blunting k it) を用い平滑末端化した後、 Kpn Iリンカー （宝酒造社製） を用いて pHSG 一 g dh、 pHSG— g 1 t A、 pHS G-p p c及び pH S G - i c d hの Kp n I部位にそれぞれ挿入し、 pGDH、 pGLTA、 p P P C及び p I C Dを取得 した。 また、 pHSG— g dh + g l t A+ i c d及び p H S G - g d h + g 1 t A + pp cには、 その S a 1 I部位に同様に S a 1 I リンカ一 （宝酒造社製） を用い、 pHMl 519由来の複製起点をそれぞれ挿入し、 pGDH + GLTA + I C D及び p GDH + G LT A + P PCを取得した。 更に、 対照として、 これ らの遺伝子を持たないプラスミ ド PHSG 399を用い、 その S a 1 I部位に同 様に S a 11リンカー (宝酒造社製） を用い、 PHM1519由来の複製起点を挿入した p SAC 4も作成した。 実施例 7 pGDH、 P GLTA, P P P C、 p I CD, p GDH + GLTA + I CD及び D GDH + GLTA + P P C上の各遺伝子の発現の確認 pGDH、 pGLTA、 pPPC、 p I CD、 p GD H + G L T A + I C D及 び pGDH + GLTA + PPC上の各遺伝子がブレビバクテリウム ·ラクトファ ーメンタムの細胞内で発現し、 これらのプラスミ ドが遺伝子増幅の機能を果たし ていることの確認を行った。 具体的には、 ブレビパクテリゥム ·ラクトファ一メ ンタム ATCC 13869に、 電気パルス法 （特開平 2— 207791号） に よりそれぞれのプラスミ ドを導入した。 得られた形質転換体は 4 g/mlのクロラ ムフヱ二コールを含む CM 2 Gプレート培地 （ポリペプトン 10g、 酵母エキス 10 g、 グルコース 5 g、 N a C 15 g及び寒天 15 gを純水 1 1に含む。 pH 7. 2) にて選択した。 得られた形質転換体を CM2G寒天培地上にて培養し、 グルコース 80 g、 KH2P041 g、 Mg SO40. 4 g、 （NH4) 2SO430 g、 F e S 04 · 7 H2O 0. 01 Mn S 04 · 7 H2O 0. 01 大豆加 水分解液 15m 1、 サイアミン塩酸塩 200 g、 ピオチン 300 ^ g及び C a C0350 gを純水 1 1中に含む培地 （1^011を用ぃて 11は8. 0に調整されて いる） に接種し、 31. 5 にて 16時間培養した。該培養液を常法に従って遠 心分離し、 菌体を集めた。
菌体を破砕して得た粗抽出液を用いて、 ATCC 13869ZpGDH、 AT CC 13869ZGDH + GLTA+ I CD及び AT C C 13869 ZpGDH + GLTA + P PCの GDH活性を Molecular Microbiology, 6(3), 317-326 (1 992)記載の方法に従い測定したところ、 これらの形質転換体では、 各々、 対照の ATCC 13869ノ pSAC4に比べて約 13倍の GDH活性を有することが 分かった （表 4) 。 また、 ATCC 13869/p G L T A及び AT C C 138 69/GDH + GLTA+ I CD及び ATCC 13869/p GDH + GLTA + ??じのじ5活性は、 Miclobiology, 140, 1817-1828 (1994)に、 ATCC 13 869/p I CD及び ATCC 13869ZGDH + GLTA+ I CDの I CD H活性は、 J.BacterioL, 177, 774-782 (1995)に、 ATCC 13869/pPP C及び ATCC 13869 6011 + 01^丁 + ??〇の？£?〇活性は0€1½， 77, 237-251 (1989)に記載された方法に従って測定した。 測定結果を表 5〜7に 示す。 いずれの形質転換体も目的の酵素について、 対照の ATCC 13869/ p S A C 4に比べて約 2〜 20倍の活性を有することが分かった。 このことから、 pGDH、 pGLTA、 pPPC、 p I CD、 p GDH + G L T A+ I C D及び pGDH+GLTA+PPC上の各遺伝子はブレビバクテリゥム ·ラクトファー メンタム細胞内で発現しその機能を果たしていることが確認された。
表 4 菌株 GDH活性
(AAbs/min/mg protein)
ATC C 13869/p GDH 1. 36
ATCC 13869/pGDH+GLTA+ I CD 1. 28
ATCC 13869 pGDH+GLTA+PPC 1. 33
ATCC 13869/pSAC4 0. 11
表 5 菌株 cs活性
( μ mol/min/mg protein)
ATCC 13869/pGLTA 5. 5
ATCC 13869ノ pGDH + GLTA+ I CD 4. 8
ATC C 13869/p GDH+GLTA+PP C 4. 8
ATCC 13869/p S AC4 0. 7 表 6 菌株 PEPC活性
(units/min/mg protein)
ATCC 1 3869/p PPC 1. 1 2
ATCC 1 3869/p GDH+GLTA+PPC 1. 04
ATCC 1 3869/p S AC4 0. 1 1
菌株 I CDH活性
(units/min/mg protein)
ATC C 1 3869/p I CD 3. 5
ATC C 1 3869/p GDH + GLTA+ I CD 2. 8
ATC C 1 3869/p SAC 4 1. 0
実施例 8 厶 S株と、 g dh、 g 1 t A、 D D C及び i c d遺伝子を増幅した 厶 S株の Lーグルタミン酸生産
(1) AS株のジャーファーメンターを用いた L—グルタミン酸生産評価 グルコース 60 g、 KH2PO4 1 g MgS04 0. 4 g、 (ΝΗ4) aSO^ 30 g F e S04 · 7H20 0. 01 MnS04 · 7H20 0. O l g、 大 豆加水分解液 1 5m 1、 サイアミン塩酸塩 20 0 μ g及びピオチン 450 U gを 純水 1 1中に含む培地 300m 1を 1 1容ジャーフアーメンターに入れ加熱殺菌 した。 これに CM 2 G寒天培地上にて培養して得た AS株の菌体を接種し、 3 1. 5 にて、 pHをアンモニアガスで 7. 0、 7. 2又は 7. 5に制御しながら 3 0時間培養した。
培養終了後、 菌体濃度及び培地中に蓄積された L一グルタミン酸の量を測定し た。 Lーグルタミン酸の定量には、 旭化成 （株） 製バイオテックアナライザー A S— 210を使用し、 菌体濃度は、 純水で 51倍に希釈した培養液の 660 n m における吸光度 （OD66C) により測定した。 結果を表 8に示す。 表 8
PH 菌体濃度 L一グルタミン酸
(OD) (g/1 )
7. 0 0. 84 35
7. 2 0. 85 34
7. 5 1. 07 32
過剰量のピオチンを含有する培地で培養したにもかかわらず、 △ S株は高い収 率で L一グル夕ミン酸を生成蓄積することが確認された。
(2) 厶 S株と、 gdh、 g 1 t A、 pp c及び i c d遺伝子を増幅した Δ S株 の L一グルタミン酸生産のジャーファーメンターを用いた培養による評価
厶 S株に上記の様にして作製した pGDH、 pGLTA、 pPPC、 p I CD、 p GDH + GLTA+ I C D又は p G D H + G L T A+ P P Cを導入し、 それぞ れのプラスミ ドが導入された形質転換体の L一ダルタミン酸生産性を評価した。 ブレビパ'クテリゥム ·ラクトファーメンタム細胞へのプラスミ ドの導入は電気ハ° ルス法 （特開平 2— 207791号） により行った。得られた形質転換体は 4 g/mlのクロラムフエ二コールを含む CM 2 Gプレート培地 （ポリペプトン 10 g、 酵母エキス 10 g、 グルコース 5 g、 Na C 15 g及び寒天 15 gを純水 1 1に 含む。 pH7. 2) にて選択した。
厶 S株と、 得られた形質転換体の L—グルタミン酸の生産性の評価は、 上記 (1) と同様にして行った。 培養後の菌体濃度、 及び培地中に蓄積された Lーグ ルタミン酸の量を上記と同様に測定した。 結果を表 9に示す。 表 9 菌株 菌体濃度 L-ク レタミン酸
(OD) (g/1) 厶 s 0. 84 35
厶 SZp GDH 1. 01 35
厶 SZp GLTA 0. 83 37
厶 SZp I CD 0. 83 37
厶 S/pPPC 0. 75 37
厶 S/pGDH+GLTA+ I CD 0. 95 38
厶 S/pGDH+GLTA+PPC 0. 85 40
AS/p S AC4 0. 83 35
実施例 9 α-KGD H遺伝子を増幅した Lーリジン生産菌による
Lーリジンの生産 ブレビパクテリゥム ·ラクトファーメンタム ATCC 13869から変異誘 導された S— （2—アミノエチル） —L—システィンに耐性を示し、 L—リジン 生成能を有するブレビパクテリゥム ·ラクトファーメンタム A J 12435 (FERM BP— 2294) に上記の様にして作成した p P K S— Xと p P K 4とをそれぞれ導入しその L—リジン生産性を評価した。 プラスミ ドの導入は電 気パルス法 （特開平 2— 207791号） を用いた。 形質転換体は 25mg/ 1の力 ナマイシンを含む CM2 Gプレート培地 （ポリペプトン 10g、 酵母エキス 10 g、 グルコース 5 g、 Na C 15 g、 寒天 15 gを純水 1 1に含む。 pH7. 2) にて選択した。
Lーリジンの生産性の評価は以下の様にして行った。 グルコース 100 g、 K H2P04l g、 MgS04 0. 4g、 (NH4) 2S04 30 g、 F e S04 · 7H 20 0. 01 g、 MnS04 · 7H20 0. 01 g、 大豆加水分解液 15 m 1、 サ ィァミン塩酸塩 200 g、 ピオチン 300〃g、 カナマイシン 25mg及び C a COs 50 gを純水 1 1中に含む培地 （KOHを用いて pHは 7. 0に調整さ れている） を 50 Om 1容フラスコに 2 Omlずつ分注し、 加熱殺菌した。 これ に 25mgZ 1のカナマイシンを含む CM 2 Gプレート培地にて培養して得た A J 12435Zp PK4及び A J 12435 p P K S— Xの菌体を接種し、 3 7 にて 20時間培養した。 培養終了後、 培養液中に生成蓄積した L一リジンの 量及び菌体濃度を測定した。 その結果を表 10に示す。 表 10 菌 株 L一リジン 菌体濃度
(g/1) (OD)
A J 12435/p PK4 26 1. 15
A J 12435/pPKS-X 31 0. 92
産業上の利用性 コリネ型 L一グルタミン酸生産菌の α— K G D Η活性のレベルが L一グルタミ ン酸の発酵生産に影響を及ぼすことが明らかとなった。 従って、 薬剤遺伝子の挿 入等による α— KGDH遺伝子活性欠失株の取得、 in vitro変異による活性弱化 株の取得、 プロモーターの改変による発現低下株の取得等により、 従来のコリネ 型 L一グルタミン酸生産菌と比較してさらに L—グルタミン酸生産能が向上した 菌株を効率よく育種することが可能となる。
配列表
(1)一般情報
(i) 出願人： 味の素株式会社
(ii)発明の名称： αーケトグル夕ノレ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 (iii)配列数： 14
(iv)連絡先：
(A)宛名
(B)番地
(C)市
(D)州
(E)国
(F) ZIP：
(V) コンピュータ読取り可能形式
(A)媒体：フロッピーディスク
(B)コンピュータ： IBM PC互換
(C)操作システム ： PC- OS/MS-DOS
(D)ソフ トウェア ： FastSEQ Version 1. 5
(vi)現行出願データ
(A)出願番号
(B)出願日
(C)分類
(viii)代理人 事務所情報
(A)名前：
(B)登録番号：
(C)整理番号：
(ix)通信情報
(A)電話番号：
(B)ファクシミ リ番号：
(2) 配列番号 1の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ: 4394 base pairs
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 2本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： Genomic DNA
(iii) ハイポセティカル： NO
(iv) アンチセンス： NO
(vi)起源：
(A) 生物名： ブレビパ'クテリゥム ·ラクトファーメンタム
(B)株名： ATCC13869
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号： CDS
(B) 存在位置： 443. .4213
(C)特徴を決定した方法： E
(ix) 配列の特徴：
(A)特徴を表す記号： -35 signal
(B) 存在位置： 281. . 287
(C)特徴を決定した方法： S
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号： -10 signal
(B) 存在位置： 307. .312
(C)特徴を決定した方法： S
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号： RBS
(B)存在位置： 421. .428
(C)特徴を決定した方法： S
(ix) 配列の特徴：
(A)特徴を表す記号： terminator
(B) 存在位置： 4243. . 4281
(C)特徴を決定した方法： S
(xi)配列： SEQ ID N0:1 :
GTCGACAAGC AAAATCGAAG CGGCAGCACG CCGCGTCGGA GCCTTAAACG CCATCGCCGC 60 CATCCCTGAT GGITTCAATC ATCAAGTCGG TGAACGCGGG CGCAACCTGT CATCCGGACA 120 GCGCCAACTG ATCGCGCTGG CGCGCGCCGA ACTCATCGAG CCTTCCATCA TGCTTCTCGA 180 CGAAGCCACC TCCACCCTCG ACCCCGCCAC CGAAGCCGTT ATCCTCAACG CCTCCGATCG 240 AGTCACTAAG GGACGCACCA GCATCATCGT CGCGCACCGC TTGGCAACCG CTAAAAGGGC 300 CGACCGTATT CTTGTTGTTG AACAAGGACG TATCATTGAG GACGGATCTC ACGACGCGTT 360 GTTGTCTGCT AACGGCACCT ACGCCCGCAT GTGGCATTTA ATGGCCTGAC ACGTTATTTT 420 TAGGAGAACT GTCAACAAAT TA ATG CTA CAA CTG GGG CTT AGG CAT AAT CAG 472
Met Leu Gin Leu Gly Leu Arg His Asn Gin
1 5 10
CCA ACG ACC AAC GTT ACA GTG GAT AAA ATA AAG CTC AAT AAA CCC TCA 520 Pro Thr Thr Asn Val Thr Val Asp Lys lie Lys Leu Asn Lys Pro Ser
15 20 25
AGA AGC AAG GAA AAG AGG CGA GTA CCT GCC GTG AGC AGC GCT AGT ACT 568 Arg Ser Lys Glu Lys Arg Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr
30 35 40
TTC GGC CAG AAT GCG TGG CTG GTA GAC GAG ATG TTC CAG CAG TTC CAG 616 Phe Gly Gin Asn Ala Trp Leu Val Asp Glu Met Phe Gin Gin Phe Gin
45 50 55
AAG GAC CCC AAG TCC GTG GAC AAG GAA TGG AGA GAA CTC TTT GAG GCG 664 Lys Asp Pro Lys Ser Val Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala
60 65 70
CAG GGG GGA CCA AAT GCT ACC CCC GCT ACA ACA GAA GCA CAG CCT TCA 712 Gin Gly Gly Pro Asn Ala Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gin Pro Ser
75 80 85 90
GCG CCC AAG GAG TCT GCG AAA CCA GCA CCA AAG GCT GCC CCT GCA GCC 760 Ala Pro Lys Glu Ser Ala Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala
95 100 105
AAG GCA GCA CCG CGC GTA GAA ACC AAG CCG GCC GCC AAG ACC GCC CCT 808 Lys Ala Ala Pro Arg Val Glu Thr Lys Pro Ala Ala Lys Thr Ala Pro
110 115 120 AAG GCC AAG GAG TCC TCA GTG CCA CAG CAA CCT AAG CTT CCG GAG CCA 856 Lys Ala Lys Glu Ser Ser Val Pro Gin Gin Pro Lys Leu Pro Glu Pro
125 130 135
GGA CAA ACC CCA ATC AGG GGT ATT TTC AAG TCC ATC GCG AAG AAC ATG 904 Gly Gin Thr Pro lie Arg Gly lie Phe Lys Ser lie Ala Lys Asn Met
140 145 150
GAT ATC TCC CTG GAA ATC CCA ACC GCA ACC TCG GTT CGC GAT ATG CCA 952 Asp lie Ser Leu Glu lie Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro
155 160 165 170
GCT CGC CTC ATG TTC GAA AAC CGC GCG ATG GTC AAC GAT CAG CTC AAG 1000 Ala Arg Leu Met Phe Glu Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gin Leu Lys
175 180 185
CGC ACC CGC GGT GGC AAG ATC TCC TTC ACC CAC ATC λΊΊ GGC TAC GCC 1048 Arg Thr Arg Gly Gly Lys lie Ser Phe Thr His lie He Gly Tyr Ala
190 195 200
ATC GTG AAG GCA GTC ATG GCT CAC CCG GAC ATG AAC AAC TCC TAC GAC 1096 Met Val Lys Ala Val Met Ala His Pro Asp Met Asn Asn Ser Tyr Asp
205 210 215
GTC ATC GAC GGC AAG CCA ACC CTC ATC GTG CCT GAG CAC ATC AAC CTG 1144 Val lie Asp Gly Lys Pro Thr Leu lie Val Pro Glu His lie Asn Leu
220 225 230
GGC CTT GCC ATC GAC CTT CCT CAG AAG GAC GGC TCC CGC GCA CTT GTC 1192 Gly Leu Ala lie Asp Leu Pro Gin Lys Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val
235 240 245 250
GTA GCA GCC ATC AAG GAA ACC GAG AAG ATG AAC TTC TCC GAG TTC CTC 1240 Val Ala Ala lie Lys Glu Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu
255 260 265
GCA GCA TAC GAA GAC ATC GTG ACA CGC TCC CGC AAG GGC AAG CTC ACC 1288 Ala Ala Tyr Glu Asp lie Val Thr Arg Ser Arg Lys Gly Lys Leu Thr
270 275 280 on g οε
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- 88 -
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- 6S -
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605 610 615
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620 625 630
ATC AAG GTC TCC CTG ACT GCT AAC CCG TCC CAC CTG GAA GCT GTT AAC 2392 lie Lys Val Ser Leu Thr Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn
635 640 645 650
CCA GTG ATG GAA GGT ATC GTC CGC GCA AAG CAG GAC TAC CTG GAC AAG 2440 Pro Val Met Glu Gly lie Val Arg Ala Lys Gin Asp Tyr Leu Asp Lys
655 660 665
GGC GTA GAC GGC AAG ACT GTT GTG CCA CTG CTC CTC CAC GGT GAC GCT 2488 Gly Val Asp Gly Lys Thr Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala
670 675 680
GCA TTC GCA GGC CTG GGC ATC GTG CCA GAA ACC ATC AAC CTC GCT AAG 2536 Ala Phe Ala Gly Leu Gly lie Val Pro Glu Thr lie Asn Leu Ala Lys
685 690 695
CTG CGT GGC TAC GAC GTC GGA GGC ACC ATC CAC ATC GTG GTG AAC AAC 2584 Leu Arg Gly Tyr Asp Val Gly Gly Thr lie His lie Val Val Asn Asn
700 705 710
CAG ATC GGC TTC ACC ACC ACC CCA GAC TCC AGC CGC TCC ATG CAC TAC 2632 Gin lie Gly Phe Thr Thr Thr Pro Asp Ser Ser Arg Ser Met His Tyr
715 720 725 730
GCA ACC GAC TAC GCC AAG GCA TTC GGC TGC CCA GTC TTC CAC GTC AAT 2680 Ala Thr Asp Tyr Ala Lys Ala Phe Gly Cys Pro Val Phe His Val Asn
735 740 745
GGT GAT GAC CCA GAG GCA GTT GTC TGG GTT GGC CAG CTG GCA ACC GAG 2728 Gly Asp Asp Pro Glu Ala Val Val Trp Val Gly Gin Leu Ala Thr Glu
750 755 760 TAC CGT CGT CGC TTC GGC AAG GAC GTC TTC ATC GAC CTC GTT TGC TAC 2776 Tyr Arg Arg Arg Phe Gly Lys Asp Val Phe lie Asp Leu Val Cys Tyr
765 770 775
CGC CTC CGC GGC CAC AAC GAA GCT GAT GAT CCT TCC ATG ACC CAG CCA 2824 Arg Leu Arg Gly His Asn Glu Ala Asp Asp Pro Ser Met Thr Gin Pro
780 785 790
AAG ATG TAT GAG CTC ATC ACC GGC CGC GAG ACC GTT CGT GCT CAG TAC 2872 Lys Met Tyr Glu Leu lie Thr Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Gin Tyr
795 800 805 810
ACC GAA GAC CTG CTC GGA CGT GGA GAC CTC TCC AAC GAA GAT GCA GAA 2920 Thr Glu Asp Leu Leu Gly Arg Gly Asp Leu Ser Asn Glu Asp Ala Glu
815 820 825
GCA GTC GTC CGC GAC TTC CAC GAC CAG ATG GAA TCT GTG TTC AAC GAA 2968 Ala Val Val Arg Asp Phe His Asp Gin Met Glu Ser Val Phe Asn Glu
830 835 840
GTC AAG GAA GGC GGC AAG AAG CAG GCT GAG GCA CAG ACC GGC ATC ACC 3016 Val Lys Glu Gly Gly Lys Lys Gin Ala Glu Ala Gin Thr Gly lie Thr
845 850 855
GGC TCC CAG AAG CTT CCA CAC GGC CTT GAG ACC AAC ATC TCC CGT GAA 3064 Gly Ser Gin Lys Leu Pro His Gly Leu Glu Thr Asn lie Ser Arg Glu
860 865 870
GAG CTC CTG GAA CTG GGA CAG GCT TTC GCC AAC ACC CCA GAA GGC TTC 3112 Glu Leu Leu Glu Leu Gly Gin Ala Phe Ala Asn Thr Pro Glu Gly Phe
875 880 885 890
AAC TAC CAC CCA CGT GTG GCT CCA GTT GCT AAG AAG CGC GTC TCC TCT 3160 Asn Tyr His Pro Arg Val Ala Pro Val Ala Lys Lys Arg Val Ser Ser
895 900 905
GTC ACC GAA GGT GGC ATC GAC TGG GCA TGG GGC GAG CTC CTC GCC TTC 3208 Val Thr Glu Gly Gly lie Asp Trp Ala Trp Gly Glu Leu Leu Ala Phe
910 915 920 GGT TCC CTG GCT AAC TCC GGC CGC TTG GTT CGC CTT GCA GGT GAA GAT 3256
Gly Ser Leu Ala Asn Ser Gly Arg Leu Val Arg Leu Ala Gly Glu Asp
925 930 935
TCC CGC CGC GGT ACC TTC ACC CAG CGC CAC GCA GTT GCC ATC GAC CCA 3304
Ser Arg Arg Gly Thr Phe Thr Gin Arg His Ala Val Ala lie Asp Pro
940 945 950
GCG ACC GCT GAA GAG TTC AAC CCA CTC CAC GAG CTT GCA CAG TCC AAG 3352
Ala Thr Ala Glu Glu Phe Asn Pro Leu His Glu Leu Ala Gin Ser Lys
955 960 965 970
GGC AAC AAC GGT AAG TTC CTG GTC TAC AAC TCC GCA CTG ACC GAG TAC 3400
Gly Asn Asn Gly Lys Phe Leu Val Tyr Asn Ser Ala Leu Thr Glu Tyr
975 980 985
GCA GGC ATG GGC TTC GAG TAC GGC TAC TCC GTA GGA AAC GAA GAC TCC 3448
Ala Gly Met Gly Phe Glu Tyr Gly Tyr Ser Val Gly Asn Glu Asp Ser
990 995 1000
GTC GTT GCA TGG GAA GCA CAG TTC GGC GAC TTC GCC AAC GGC GCT CAC 3496
Val Val Ala Trp Glu Ala Gin Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gin
1005 1010 1015
ACC ATC ATC GAT GAG TAC GTC TCC TCA GGC GAA GCT AAG TGG GGC CAG 3544
Thr lie lie Asp Glu Tyr Val Ser Ser Gly Glu Ala Lys Trp Gly Gin
1020 1025 1030
ACC TCC AAG CTG ATC CTT CTG CTG CCT CAC GGC TAC GAA GGC CAG GGC 3592
Thr Ser Lys Leu He Leu Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly Gin Gly
1035 1040 1045 1050
CCA GAC CAC TCT TCC GCA CGT ATC GAG CGC TTC CTG CAG CTG TGC GCT 3640
Pro Asp His Ser Ser Ala Arg lie Glu Arg Phe Leu Gin Leu Cys Ala
1055 1060 1065
GAG GGT TCC ATG ACT GTT GCT CAG CCA TCC ACC CCA GCA AAC CAC TTC 3688
Glu Gly Ser Met Thr Val Ala Gin Pro Ser Thr Pro Ala Asn His Phe
1070 1075 1080 CAC CTG CTG CGT CGT CAC GCT CTG TCC GAC CTG AAG CGT CCA CTG GTT 3736 His Leu Leu Arg Arg His Ala Leu Ser Asp Leu Lys Arg Pro Leu Val
1085 1090 1095
ATC TTC ACC CCG AAG TCC ATG CTG CGT AAC AAG GCT GCT GCC TCC GCA 3784 lie Phe Thr Pro Lys Ser Met Leu Arg Asn Lys Ala Ala Ala Ser Ala
1100 1105 1110
CCA GAA GAC TTC ACT GAG GTC ACC AAG TTC CAA TCC GTG ATC GAC GAT 3832 Pro Glu Asp Phe Thr Glu Val Thr Lys Phe Gin Ser Val lie Asp Asp
1115 1120 1125 1130
CCA AAC GTT GCA GAT GCA GCC AAG GTG AAG AAG GTC ATG CTG GTC TCC 3880 Pro Asn Val Ala Asp Ala Ala Lys Val Lys Lys Val Met Leu Val Ser
1135 1140 1145
GGC AAG CTG TAC TAC GAA KG GCA AAG CGC AAG GAG AAG GAC GGA CGC 3928 Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu Leu Ala Lys Arg Lys Glu Lys Asp Gly Arg
1150 1155 1160
GAC GAC ATC GCG ATC GTT CGT ATC GAA ATG CTC CAC CCA ATT CCG TTC 3976 Asp Asp lie Ala lie Val Arg lie Glu Met Leu His Pro lie Pro Phe
1165 1170 1175
AAC CGC ATC TCC GAG GCT CTT GCC GGC TAC CCT AAC GCT GAG GAA GTC 4024 Asn Arg lie Ser Glu Ala Leu Ala Gly Tyr Pro Asn Ala Glu Glu Val
1180 1185 1190
CTC TTC GTT CAG GAT GAG CCA GCA AAC CAG GGC CCA TGG CCG TTC TAC 4072 Leu Phe Val Gin Asp Glu Pro Ala Asn Gin Gly Pro Trp Pro Phe Tyr
1195 1200 1205 1210
CAG GAG CAC CTC CCA GAG CTG ATC CCG AAC ATG CCA AAG ATG CGC CGC 4120 Gin Glu His Leu Pro Glu Leu He Pro Asn Met Pro Lys Met Arg Arg
1215 1220 1225
GTT TCC CGC CGC GCT CAG TCC TCC ACC GCA ACT GGT GTT GCT AAG GTG 4168 Val Ser Arg Arg Ala Gin Ser Ser Thr Ala Thr Gly Val Ala Lys Val
1230 1235 1240 CAC CAG CTG GAG GAG AAG CAG CTT ATC GAC GAG GCT TTC GAG GCT 4213 His Gin Leu Glu Glu Lys Gin Leu lie Asp Glu Ala Phe Glu Ala
1245 1250 1255
TAAGTCTTTA TAGTCCTGCA CTAGCCTAGA GGGCCTTATG CAGTGTGAAT CACACAGCAT 4273 AAGGCCCTTT HGCTGCCGT GGTTGCCTAA GGTGGAAGGC ATGAAACGAA TCTGTGCGGT 4333 CACGATCTCT TCAGTACTTT TGCTAAGTGG CTGCTCCTCC ACTTCCACCA CGCAGCTCGA 4393 G 4394
(2) 配列番号 2の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 1257アミノ酸
(B) 配列の型： アミノ酸
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： タンパク質
(xi)配列： SEQ ID NO:2:
Met Leu Gin Leu Gly Leu Arg His Asn Gin Pro Thr Thr Asn Val Thr
1 5 10 15
Val Asp Lys lie Lys Leu Asn Lys Pro Ser Arg Ser Lys Glu Lys Arg
20 25 30
Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr Phe Gly Gin Asn Ala Trp
35 40 45
Leu Val Asp Glu Met Phe Gin Gin Phe Gin Lys Asp Pro Lys Ser Val
50 55 60
Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala Gin Gly Gly Pro Asn Ala
65 70 75 80
Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gin Pro Ser Ala Pro Lys Glu Ser Ala
85 90 95
Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala Lys Ala Ala Pro Arg Val
100 105 110
Glu Thr Lys Pro Ala Ala Lys Thr Ala Pro Lys Ala Lys Glu Ser Ser 115 120 125
Val Pro Gin Gin Pro Lys Leu Pro Glu Pro Gly Gin Thr Pro lie Arg
130 135 140
Gly He Phe Lys Ser lie Ala Lys Asn Met Asp He Ser Leu Glu lie 145 150 155 160
Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro Ala Arg Leu Met Phe Glu
165 170 175
Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gin Leu Lys Arg Thr Arg Gly Gly Lys
180 185 190 lie Ser Phe Thr His lie lie Gly Tyr Ala Met Val Lys Ala Val Met
195 200 205
Ala His Pro Asp Met Asn Asn Ser Tyr Asp Val lie Asp Gly Lys Pro
210 215 220
Thr Leu He Val Pro Glu His lie Asn Leu Gly Leu Ala lie Asp Leu 225 230 235 240
Pro Gin Lys Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val Val Ala Ala lie Lys Glu
245 250 255
Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu Ala Ala Tyr Glu Asp lie
260 265 270
Val Thr Arg Ser Arg Lys Gly Lys Leu Thr Met Asp Asp Tyr Gin Gly
275 280 285
Val Thr Val Ser Leu Thr Asn Pro Gly Gly lie Gly Thr Arg His Ser
290 295 300
Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Gin Gly Thr He lie Gly Val Gly Ser 305 310 315 320
Met Asp Tyr Pro Ala Glu Phe Gin Gly Ala Ser Glu Asp Arg Leu Ala
325 330 335
Glu Leu Gly Val Gly Lys Leu Val Thr lie Thr Ser Thr Tyr Asp His
340 345 350
Arg Val lie Gin Gly Ala Val Ser Gly Glu Phe Leu Arg Thr Met Ser Αχο UTO ηΐΟ " O ^ΤΟ "TO 3¾d ηχο usy aqd an s BTV naq OJJ
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998 096 S6
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Gin lie Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr His Leu Gly Ser Glu Gly
610 615 620
Gin His Leu Gin Met Phe Gly Asp Gly Glu lie Lys Val Ser Leu Thr 625 630 635 640
Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn Pro Val Met Glu Gly lie
645 650 655
Val Arg Ala Lys Gin Asp Tyr Leu Asp Lys Gly Val Asp Gly Lys Thr
660 665 670
Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala Ala Phe Ala Gly Leu Gly
675 680 685
lie Val Pro Glu Thr lie Asn Leu Ala Lys Leu Arg Gly Tyr Asp Val
690 695 700
Gly Gly Thr lie His lie Val Val Asn Asn Gin He Gly Phe Thr Thr 705 710 715 720
Thr Pro Asp Ser Ser Arg Ser Met His Tyr Ala Thr Asp Tyr Ala Lys
725 730 735
Ala Phe Gly Cys Pro Val Phe His Val Asn Gly Asp Asp Pro Glu Ala
740 745 750
Val Val Trp Val Gly Gin Leu Ala Thr Glu Tyr Arg Arg Arg Phe Gly
755 760 765
Lys Asp Val Phe lie Asp Leu Val Cys Tyr Arg Leu Arg Gly His Asn
770 775 780
Glu Ala Asp Asp Pro Ser Met Thr Gin Pro Lys Met Tyr Glu Leu lie 785 790 795 800
Thr Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Gin Tyr Thr Glu Asp Leu Leu Gly
805 810 815
Arg Gly Asp Leu Ser Asn Glu Asp Ala Glu Ala Val Val Arg Asp Phe
820 825 830
His Asp Gin Met Glu Ser Val Phe Asn Glu Val Lys Glu Gly Gly Lys 835 840 845
Lys Gin Ala Glu Ala Gin Thr Gly lie Thr Gly Ser Gin Lys Leu Pro
850 855 860
His Gly Leu Glu Thr Asn lie Ser Arg Glu Glu Leu Leu Glu Leu Gly 865 870 875 880
Gin Ala Phe Ala Asn Thr Pro Glu Gly Phe Asn Tyr His Pro Arg Val
885 890 895
Ala Pro Val Ala Lys Lys Arg Val Ser Ser Val Thr Glu Gly Gly He
900 905 910
Asp Trp Ala Trp Gly Glu Leu Leu Ala Phe Gly Ser Leu Ala Asn Ser
915 920 925
Gly Arg Leu Val Arg Leu Ala Gly Glu Asp Ser Arg Arg Gly Thr Phe
930 935 940
Thr Gin Arg His Ala Val Ala lie Asp Pro Ala Thr Ala Glu Glu Phe 945 950 955 960
Asn Pro Leu His Glu Leu Ala Gin Ser Lys Gly Asn Asn Gly Lys Phe
965 970 975
Leu Val Tyr Asn Ser Ala Leu Thr Glu Tyr Ala Gly Met Gly Phe Glu
980 985 990
Tyr Gly Tyr Ser Val Gly Asn Glu Asp Ser Val Val Ala Trp Glu Ala
995 1000 1005
Gin Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gin Thr lie lie Asp Glu Tyr
1010 1015 1020
Val Ser Ser Gly Glu Ala Lys Trp Gly Gin Thr Ser Lys Leu lie Leu 025 1030 1035 1040
Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly Gin Gly Pro Asp His Ser Ser Ala
1045 1050 1055
Arg lie Glu Arg Phe Leu Gin Leu Cys Ala Glu Gly Ser Met Thr Val
1060 1065 1070
Ala Gin Pro Ser Thr Pro Ala Asn His Phe His Leu Leu Arg Arg His 1075 1080 1085
Ala Leu Ser Asp Leu Lys Arg Pro Leu Val lie Phe Thr Pro Lys Ser
1090 1095 1100
Met Leu Arg Asn Lys Ala Ala Ala Ser Ala Pro Glu Asp Phe Thr Glu 105 1110 1115 1120
Val Thr Lys Phe Gin Ser Val lie Asp Asp Pro Asn Val Ala Asp Ala
1125 1130 1135
Ala Lys Val Lys Lys Val Met Leu Val Ser Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu
1140 1145 1150
Leu Ala Lys Arg Lys Glu Lys Asp Gly Arg Asp Asp lie Ala lie Val
1155 1160 1165
Arg He Glu Met Leu His Pro He Pro Phe Asn Arg lie Ser Glu Ala
1170 1175 1180
Leu Ala Gly Tyr Pro Asn Ala Glu Glu Val Leu Phe Val Gin Asp Glu 185 1190 1195 1200
Pro Ala Asn Gin Gly Pro Trp Pro Phe Tyr Gin Glu His Leu Pro Glu
1205 1210 1215
Leu lie Pro Asn Met Pro Lys Met Arg Arg Val Ser Arg Arg Ala Gin
1220 1225 1230
Ser Ser Thr Ala Thr Gly Val Ala Lys Val His Gin Leu Glu Glu Lys
1235 1240 1245
Gin Leu He Asp Glu Ala Phe Glu Ala
1250 1255
(2) 配列番号 3の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A)配列の長さ： 20 base pairs
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： 他の核酸 合成 D N A (iii) ハイポセティカル： NO
(iv) アンチセンス： NO
(xi) 配列： SEQ ID NO: 3:
CTGTCTGAAG GATCGGTTCT 20
(2) 配列番号 4の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 29 base pairs
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数'. 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成 D N A (iii) ハイポセティカル： NO
(iv) アンチセンス： YES
(xi) 配列： SEQ ID N0:4:
GAGTGCTCAG GCCCCTGTCC CTCGTAACC 29
(2) 配列番号 5の配列の情報：
(i)配列の性質：
(A) 配列の長さ： 20 base pairs
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii)配列の種類： 他の核酸 合成 D N A (iii) ハイポセティカル： NO
(iv) アンチセンス： NO
(xi) 配列： SEQ ID N0:5:
GCTAGCCTCG GGAGCTCTAG 20 (2) 配列番号 6の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 20 base pairs
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成 D N A (iii)ハイポセティカル： NO
(iv) アンチセンス： YES
(xi) 配列： SEQ ID NO: 6:
GATCTTTCCC AGACTCTGGC 20
(2) 配列番号 7の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A)配列の長さ： 20 base pairs
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成 D N A (iii) ハイポセティカル： NO
(iv) アンチセンス： NO
(xi) 配列： SEQ ID NO: 7：
TAATGCCACC GACACCCACC 20
(2) 配列番号 8の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 20 base pairs
(B)配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： 他の核酸 合成 D N A (iii)ハイポセティカル： NO
(iv) アンチセンス： YES
(xi) 配列： SEQ ID N0:8:
TCAACGCCCA CATAGTGGAC 20
(2) 配列番号 9の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 20 base pairs
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成 D N A (iii) ハイポセティカル： NO
(iv) アンチセンス： NO
(xi) 配列： SEQ ID NO: 9：
GAATTCGCTC CCGGTGACGC 20
(2) 配列番号 10の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 20 base pairs
(B)配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成 D N A (iii)ハイポセティカル： NO
(iv) アンチセンス： YES
(xi) 配列： SEQ ID NO: 10:
GATGCAGAAT TCCTTGTCGG 20 (2) 配列番号 11の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 20 base pairs
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成 D N A (iii) ハイポセティカル： NO
(iv) アンチセンス： NO
(xi) 配列： SEQ ID NO: 11 :
GTCGACGGCG GACTTGTCGG 20
(2) 配列番号 12の配列の情報：
(i)配列の性質：
(A) 配列の長さ： 20 base pairs
(B)配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii)配列の種類： 他の核酸 合成 D N A (iii)ハイポセティカル： NO
(iv) アンチセンス： YES
(xi)配列： SEQ ID NO: 12：
GTCGACAAAA CCCAAAAAAA 20
(2) 配列番号 13の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 51 base pairs
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： 他の核酸 合成 D N A
(iii) ハイポセティカル： NO
(iv) アンチセンス： NO
(xi)配列： SEQ ID NO: 13：
CTGCGGAAAC TACACAAGAA CCCAAAAATG ATTAATAATT GAGACAAGCT T 51
(2) 配列番号 14の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 59 base pairs
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成 D N A
(iii) ハイポセティカル： NO
(iv) アンチセンス： YES
(xi) 配列： SEQ ID N0:51 :
CTAGAAGCTT GTCTCAAm TTAATCATTT TTGGGTTCn GTGTAGTTTC CGCAGGTAC 59

Claims

請求の範囲
1 . 染色体上に存在するなーケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を有する 酵素をコードする遺伝子又はそのプロモーターの塩基配列中に 1又は 2以上の塩 基の置換、 欠失、 挿入、 付加又は逆位が生じたことにより、 α—ケトグルタル酸 デヒドロゲナーゼ活性が欠損したコリネ型 L一グルタミン酸生産菌。
2 . 請求項 1記載のコリネ型 L _グルタミン酸生産菌を液体培地中に培養し、 培養液中に L一グルタミン酸を生成蓄積させ、 これを採取することを特徴とする L一グノレ夕ミン酸の製造法。
3 . コリネ型 Lーグルタミン酸生産菌由来の α—ケトグルタル酸デヒドロゲ ナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子。
4 . α—ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列 が配列表配列番号 1に示されるァミノ酸配列又はこのァミノ酸配列において a一 ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性に影響を与えない 1又は 2以上のァミノ酸 残基の置換、 欠失あるいは挿入を有するアミノ酸配列を含む請求項 3記載の遺伝 子。
5 . コリネ型 L一グルタミン酸生産菌由来の α—ケトグル夕ノレ酸デヒドロゲ ナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子とコリネ型細菌で機能するベクター が連結されて得られる組換え D N A。
6 . 請求項 5記載の組換え D N Aを保有するコリネ型細菌。
7 . 請求項 5記載の組換え D N Aを保有し、 かつ L一リジン生産能を有する コリネ型細菌を液体培地に培養し、 培養液中に L一リジンを生成蓄積させ、 これ を採取することを特徴とする L—リジンの製造法。
PCT/JP1995/001131 1994-06-14 1995-06-07 GENE A DESHYDROGENASE α-CETOGLUTARIQUE WO1995034672A1 (fr)

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DE69522690T DE69522690T2 (de) 1994-06-14 1995-06-07 alpha-ketogultarsäure dehydrogenasegen
EP95921119A EP0771879B1 (en) 1994-06-14 1995-06-07 alpha-ketoglutaric dehydrogenase gen
JP50192696A JP3716427B2 (ja) 1994-06-14 1995-06-07 α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
BR9508022-8A BR9508022A (pt) 1994-06-14 1995-06-07 Bactéria corineforme produtora de ácido l-glutâmico, processo para produzir ácido l-glutâmico, gene codificando para uma enzima, dna recombinante, bactéria corineforme, e, processo para produzir l-lisina

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JP6/131744 1994-06-14
JP13174494 1994-06-14

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