JP7311634B2 - ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ変異型ポリペプチド及びそれを用いたl-スレオニン生産方法 - Google Patents
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Description
本出願のもう一つの目的は、上記ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dihydrodipicolinate reductase)変異型ポリペプチドを含むコリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)微生物を提供することにある。
本出願の更に他の一つの目的は、L-スレオニン(Threonine)を生産するための上記微生物の使用を提供することにある。
上記ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、変異型ポリペプチドについては上記説明した通りである。
本出願において用語、「ベクター」とは、適した宿主内で目的ポリペプチドを発現させるように適した調節配列に作動可能に連結された上記目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するDNA製造物を意味する。上記調節配列は、転写を開始できるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレータ配列、適したmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムと関係なく複製されたり機能することができ、ゲノムそのものに統合されることができる。
本出願において用語「形質転換」とは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で上記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは宿主細胞内で発現できさえすれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置したり染色体外に位置したりに関係なく、これらをいずれも含んでもよい。また、上記ポリヌクレオチドは、標的ポリペプチドをコードするDNAまたはRNAを含む。上記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、如何なる形態で導入されても問題ない。例えば、上記ポリヌクレオチドは、独自に発現されるのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット(expression cassette)の形態で宿主細胞に導入されてもよい。上記発現カセットは、通常、上記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター(promoter)、転写終結信号、リボソーム結合部位及び翻訳終結信号を含んでもよい。上記発現カセットは、自体複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、上記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに限定されない。上記形質転換する方法は、核酸を細胞内に導入する如何なる方法も含まれ、宿主細胞により当分野において公知となった通り、適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、電気穿孔法(electroporation)、リン酸カルシウム(Ca(H2PO4)2、CaHPO4またはCa3(PO4)2)沈殿、塩化カルシウム(CaCl2)沈殿、マイクロインジェクション法(microinjection)、ポリエチレングリコール(PEG)法、DEAE-デキストラン法、カチオンリポソーム法、及び硝酸リチウム-DMSO法などがあるが、これに制限されない。
本出願において用語、「微生物」とは、野生型微生物や、自然なまたは人為的に遺伝的変形が起こった微生物をいずれも含み、外部遺伝子が挿入されたり内在的遺伝子の活性が強化されたり弱化されるなどの原因により特定機序が弱化されたり強化された微生物をいずれも含む概念である。
具体的には、本出願のジヒドロジピコリン酸レダクターゼ変異型ポリペプチドを含む微生物は、自然にL-アミノ酸生産能を有している微生物またはL-アミノ酸の生産能がない親株にL-アミノ酸の生産能が付与された微生物を意味する。具体的には、上記ジヒドロジピコリン酸レダクターゼを含む微生物は、配列番号1または配列番号51のアミノ酸配列で13番目のアミノ酸がアスパラギン(Asparagine)、スレオニン(Threonine)、システイン(Cysteine)、チロシン(Tyrosine)、セリン(Serine)、リシン(Lysine)またはグルタミン(Glutamine)で置換された変異型ジヒドロジピコリン酸レダクターゼを発現する微生物であってもよく、一具体例として、上記アミノ酸配列で13番のアミノ酸であるアルギニンがアスパラギンで置換された変異型ジヒドロジピコリン酸レダクターゼを発現する微生物であってもよいが、これに制限されない。
また、L-スレオニンと共通した前駆体を有するL-リシンの生合成経路に作用する遺伝子であるdapA(ジヒドロピコリン酸シンターゼ:dihydrodipicolinate synthase)、1ysA(ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ:Diaminopimelate decarboxylase)、またはddh(ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ:diaminopimelate dehydrogenase)遺伝子を弱化させることができる。
本出願において、用語「強化/増加」とは、内在的活性に比べて活性が増加することをいずれも含む概念である。
このような遺伝子活性の不活性化または弱化は、当該分野においてよく知られている多様な方法の適用により達成される。上記方法の例として、上記遺伝子の活性が除去された場合を含めて染色体上の遺伝子の全体または一部を欠失させる方法; 当該ポリペプチドの活性が減少するように突然変異された遺伝子で、染色体上の上記ポリペプチドをコードする遺伝子に代替する方法;上記ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子の発現調節の配列に変異を導入する方法;上記ポリペプチドをコードする遺伝子の発現調節配列を活性が弱かったり、ない配列に交替する方法(例えば、上記遺伝子のプロモーターを内在的プロモーターより弱いプロモーターに交替する方法);上記ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子の全体または一部を欠失させる方法;上記染色体上の遺伝子の転写体に相補的に結合して上記mRNAからポリペプチドへの翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、アンチセンスRNA)を導入する方法;上記ポリペプチドをコードする遺伝子のSD配列の前段にSD配列と相補的な配列を人為的に付加し、2次構造物を形成させてリボソーム(ribosome)の付着を不可能にさせる方法及び当該配列のORF(open reading frame)の3’末端に逆転写されるようにプロモーターを付加するRTE(Reverse transcription engineering)方法などがあり、これらの組合わせでも達成できるが、上記例により特に制限されるものではない。
上記さらに含まれる変異型ポリペプチドは、配列番号80のアミノ酸配列で119番目のアミノ酸がチロシンからフェニルアラニンに置換されたジヒドロピコリン酸シンターゼ(dihydrodipicolinate synthase)変異型ポリペプチド、配列番号81のアミノ酸配列で302番目のアミノ酸がアルギニンからアラニンに置換されたジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(Diaminopimelate decarboxylase)変異型ポリペプチド;及び配列番号82のアミノ酸配列で169番目のアミノ酸がスレオニンからロイシンに置換されたジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(diaminopimelate dehydrogenase)変異型ポリペプチドの中から選択されるいずれか一つ以上であってもよい。
また、上記生産方法は、上記培養された微生物または培養された培地からスレオニンまたはスレオニン由来L-アミノ酸を回収する段階をさらに含む、スレオニンまたはスレオニン由来L-アミノ酸の生産方法を提供する。
上記微生物は、コリネバクテリウム属であってもよく、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムであってもよいが、これに制限されない。これについては前述した通りである。
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)のdapB遺伝子の発現量またはその活性が弱化した変異体を発掘するための目的で下記の方法でライブラリを製作した。
野生型のコリネバクテリウム・グルタミカムグルタミカムATCC13032でdapB遺伝子が欠損した菌株を製作するために、下記の通りdapB遺伝子が欠損したベクターpDZ-ΔdapBを製造した。具体的には、dapB遺伝子の5’及び3’末端に位置したDNA断片が(各300bp)pDZベクター(大韓民国特許第2009-0094433号)に連結された形態で製作された。報告されたdapB遺伝子の塩基配列(配列番号2)に基づいて5’断片及び3’断片に制限酵素SalI認識部位を挿入したプライマー配列番号7及び8とこれらからそれぞれ300bp離れた位置でプライマー配列番号9及び10を合成した。コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032の染色体を鋳型として5’末端の遺伝子断片は、プライマー配列番号7及び9を用いてPCRを通じて製作した。同様の方法でgltA遺伝子の3’末端に位置した遺伝子断片は、配列番号8及び10を用いてPCRを通じて製作した。PCR条件は94℃で2分間の変性後、94℃で1分間の変性、56℃で1分間のアニーリング、72℃で40秒間の重合を30回繰り返した後、72℃で10分間の重合反応を行った。
ブドウ糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆タンパク質2.5g、トウモロコシ浸漬固形分(Corn Steep Solids) 5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミン塩酸塩1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド3000μg、CaCO3 30g(蒸溜水1リットル基準)。
実施例3:dapB変異株6種の塩基配列の確認
6種の選別菌株13032::dapB(mt)-1~6のdapB遺伝子塩基配列を確認するために、実施例1に明示されたプライマーを(配列番号5及び6)用いて染色体内dapB遺伝子を含むDNA断片をPCR増幅した。PCR条件は、94℃で2分間の変性後、94℃で1分間の変性、56℃で1分間のアニーリング、72℃で40秒間の重合を30回繰り返した後、72℃で10分間の重合反応を行った。
上記アミノ酸配列1で13番目のアミノ酸の位置に、野生型が有するアルギニンを除いた他のproteogenicアミノ酸への置換を試みた。
まず、WT菌株から抽出したゲノムDNAを鋳型としてdapB遺伝子の36~39番目の位置で前後にそれぞれ約600bp離れた位置に5’断片及び3’断片に制限酵素SalI認識部位を挿入したプライマー配列番号11及び12を合成した。19種の異種性塩基置換変異を導入するためにdapB遺伝子の36~39番目の塩基配列を置換するためのプライマー配列番号13~50を合成した。
KCCM11016P菌株を対照群として用いて選別菌株19種を下記のような方法で培養して糖消耗速度、リシン生産収率、スレオニン生産収率を測定した。
ブドウ糖20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、 KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミンHCl 1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド2000μg(蒸溜水1リットル基準)
<生産培地(pH7.0)>
ブドウ糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆タンパク質2.5g、トウモロコシ浸漬固形分(Corn Steep Solids) 5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミン塩酸塩1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド3000μg、CaCO3 30g(蒸溜水1リットル基準)。
13番目のアミノ酸がアスパラギンで置換された変異体の効果を野生型菌株で再確認するために、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032が内在的に有するジヒドロジピコリン酸レダクターゼのアミノ酸配列(配列番号1)で13番目のアミノ酸であるアルギニンをアスパラギンで置換した。
実施例1で用いた13032::ΔdapB菌株とコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032菌株を対照群として用いて上記実施例6で製作された13032::dapB(R13N)菌株を下記のような方法で培養し、糖消耗速度、スレオニン及びリシン生産収率を測定した。
ブドウ糖20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミンHCl 1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド2000 μg(蒸溜水1リットル基準)
L-スレオニン生産培地(pH7.2)
ブドウ糖30g、KH2PO4 2g、Urea 3g、(NH4)2SO4 40g、Peptone 2.5g、CSL(Sigma) 5g(10 ml)、MgSO4・7H2O 0.5g、Leucine 400mg、CaCO3 20g(蒸溜水1リットル基準)。
13番目のアミノ酸がアスパラギンで置換された変異体の効果を野生型菌株で再確認するために、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869微生物が内在的に有するジヒドロジピコリン酸レダクターゼのアミノ酸配列(配列番号51)で13番目のアミノ酸であるアルギニンをアスパラギンで置換した(配列番号53)。
実施例1で製作したpDZ-ΔdapBをコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869に電気パルス法(Van der Rest et al.,Appl. Microbial. Biotecnol. 52:541-545,1999)で形質転換し、相同染色体の組換えによりdapB遺伝子が欠損した菌株を製作した。このように、dapB遺伝子が欠損した菌株をコリネバクテリウム・グルタミカム13869::ΔdapBと命名した。
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869及び実施例9で製作した13869::ΔdapB菌株を対照群として用いて実施例8で製作された13869::dapB(R13N)菌株を先の実施例と同様な方法で培養し、糖消耗速度、スレオニン及びリシン生産収率を測定した。
dapB(R13N)変異導入によるL-スレオニン生産能の変化を明確に確認するために、スレオニン生産菌株を製作した。具体的には、スレオニン生合成経路で最初の重要な酵素として作用するaspartate kinase(lysC)のフィードバック阻害(feedback inhibition)の解消のために、lysC(L377K)変異が導入された菌株を製作した(大韓民国特許第2009-0094433号)。変異導入のための組換えベクターは、下記のような方法で製作された。
実施例10で製作したCA09-0900菌株を対照群としてCA09-0903菌株を実施例7と同様な方法で培養し、スレオニン及びリシン生産収率を測定した。
リシン生合成経路の追加弱化によるL-スレオニン生産能の変化を明確に確認するために、リシン生合成経路の遺伝子に対する追加弱化をさせて実験を進めた。まず、リシンとスレオニンの共通前駆体であるアスパルチルセミアルデヒド(Aspartyl semialdehyde)からリシンを生合成するための最初の作用酵素であるジヒドロピコリン酸シンターゼ(dihydrodipicolinate synthase,dapA)の活性を弱化させることと文献に報告された変異を導入するための菌株を製作した(J Mol Biol. 2004 Apr 23;338(2):329-39)。具体的には、dihydrodipicolinate synthase(dapA)に配列番号65のように355~357番目の塩基配列が既存のTACからTTTに変わってN末端から119番目のアミノ酸であるチロシンがフェニルアラニンで置換された形態の変異体dapA(Y119F)変異が導入された菌株を製作した(配列番号80)。変異導入のための組換えベクターは、下記のような方法で製作された。
実施例11で製作したCA09-0903菌株を対照群としてCA09-0903/dapA(Y119F)菌株を実施例7と同様な方法で培養してスレオニン及びリシン生産収率を測定した。
リシン生合成経路の追加弱化によるL-スレオニン生産能の変化を明確に確認するために、リシン生合成経路の遺伝子に対する追加弱化を進行した。リシン生合成に作用する最後の酵素であるジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(Diaminopimelate decarboxylase,lysA)の活性を弱化させることと文献に報告された変異を導入するための菌株を製作した(Biochem Biophys Res Commun. 2018 Jan 8;495(2):1815-1821)。具体的には、Diaminopimelate decarboxylase(lysA)に配列番号70のように904~906番目の塩基配列が既存のCGCからGCAに変わってN末端から302番目のアミノ酸であるアルギニンがアラニンで置換された形態の変異体lysA(R302A)変異が導入された菌株を製作した(配列番号81)。変異導入のための組換えベクターは、下記のような方法で製作された。
実施例11で製作したCA09-0903菌株を対照群としてCA09-0903/1ysA(R302A)菌株を実施例7と同様な方法で培養してスレオニン及びリシン生産収率を測定した。
リシン生合成経路の追加弱化によるL-スレオニン生産能の変化を明確に確認するために、リシン生合成経路の遺伝子に対する追加弱化を進行した。リシン生合成に作用する酵素であるジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(diaminopimelate dehydrogenase,ddh)の活性を弱化させるための菌株を製作した。具体的には、 diaminopimelate dehydrogenase(ddh)に配列番号75のように505~507番目の塩基配列が既存のACCからCTCに変わってN末端から169番目のアミノ酸であるスレオニンがロイシンで置換された形態の変異体ddh(T169L)変異が導入された菌株を製作した(配列番号82)。変異導入のための組換えベクターは、下記のような方法で製作した。
実施例11で製作したCA09-0903菌株を対照群としてCA09-0903/ddh(T169L)菌株を実施例7と同様な方法で培養してスレオニン及びリシン生産収率を測定した。
Claims (14)
- ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dihydrodipicolinate reductase)活性を有する変異型ポリペプチドであって、前記変異型ポリペプチドにおいて、配列番号1のアミノ酸配列またはこれと98%以上の同一性を有するアミノ酸配列で13番目の位置に対応するアミノ酸がアスパラギン(Asparagine)、スレオニン(Threonine)、システイン(Cysteine)、チロシン(Tyrosine)、セリン(Serine)、リシン(Lysine)またはグルタミン(Glutamine)で置換されており、前記変異型ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列またはこれと98%以上の同一性を有するアミノ酸配列と少なくとも90%以上かつ100%未満の配列同一性を有し、
前記変異型ポリペプチドのジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性は、配列番号1のアミノ酸配列またはこれと98%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する野生型ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性より弱化している、変異型ポリペプチド。 - 配列番号1のアミノ酸配列と98%以上の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号51で記載されるアミノ酸配列である、請求項1に記載の変異型ポリペプチド。
- 前記変異型ポリペプチドは、配列番号3または配列番号53のアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の変異型ポリペプチド。
- 請求項1に記載の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドは、配列番号4または配列番号54の塩基配列からなる、請求項4に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1に記載の変異型ポリペプチド;前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターのいずれか一つ以上を含むコリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)微生物。
- 前記配列番号1のアミノ酸配列と98%以上の同一性を有するアミノ酸配列は配列番号51である、請求項6に記載のコリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)微生物。
- 前記コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)微生物は、さらに次の(1)~(3)の変異型ポリペプチドから選択されるいずれか一つ以上を含む、請求項6に記載のコリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)微生物:
(1)ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(dihydrodipicolinate synthase)活性が弱化した変異型ポリペプチド;
(2)ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(Diaminopimelate decarboxylase)活性が弱化した変異型ポリペプチド;及び
(3)ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(diaminopimelate dehydrogenase)活性が弱化した変異型ポリペプチド。 - 前記変異型ポリペプチドは、(1)~(3)の変異型ポリペプチドから選択されるいずれか一つ以上を含む、請求項8に記載のコリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)微生物:
(1)配列番号65のアミノ酸配列で119番目のアミノ酸がチロシン(Tyrosine)からフェニルアラニン(Phenylalanine)に置換されたジヒドロジピコリン酸シンターゼ(dihydrodipicolinate synthase)変異型ポリペプチド;
(2)配列番号70のアミノ酸配列で302番目のアミノ酸がアルギニン(Arginine)からアラニン(Alanine)に置換されたジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(Diaminopimelate decarboxylase)変異型ポリペプチド;及び
(3)配列番号75のアミノ酸配列で169番目のアミノ酸がスレオニン(Threonine)からロイシン(Leucine)に置換されたジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(diaminopimelate dehydrogenase)変異型ポリペプチド。 - 前記微生物は、非変異型菌株に比べてL-スレオニン(Threonine)生産能が増加したものである、請求項6に記載のコリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)微生物。
- 前記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)である、請求項6に記載の微生物。
- 請求項1に記載の変異型ポリペプチドを含むコリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)微生物を培地で培養する段階を含む、L-スレオニン(Threonine)を生産する方法。
- 前記配列番号1のアミノ酸配列と98%以上の同一性を有するアミノ酸配列は配列番号51である、請求項12に記載のL-スレオニン(Threonine)を生産する方法。
- 前記微生物を培養する段階に培養した培地及び微生物からL-スレオニン(Threonine)を回収する段階をさらに含む、請求項12に記載のL-スレオニン(Threonine)を生産する方法。
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