Der
Erfindung lag die Aufgabe zugrunde weitere Promotoren und/oder Expressionseinheiten
mit vorteilhaften Eigenschaften zur Verfügung zustellen.
Demgemäß wurde
gefunden, dass man Nukleinsäuren
mit Promotoraktivität,
enthaltend
- A) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 oder
- B) eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder
Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens
90 % auf Nukleinsäureebene
mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 1 aufweist oder
- C) eine Nukleinsäuresequenz,
die mit der Nukleinsäuresequenz
SEQ. ID. NO. 1 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder
- D) funktionell äquivalente
Fragmente der Sequenzen unter A), B) oder C)
zur Transkription
von Genen verwenden kann.
Unter „Transkription" wird erfindungsgemäß der Prozess
verstanden, durch den ausgehend von einer DNA-Matrize ein komplementäres RNA-Molekül hergestellt
wird. An diesem Prozess sind Proteine wie die RNA-Polymerase sogenannte
Sigma-Faktoren und transkriptionelle Regulatorproteine beteiligt.
Die synthetisierte RNA dient dann als Matrize im Prozess der Translation,
der dann zum biosynthetisch aktiven Protein führt.
Die
Bildungsrate, mit der ein biosynthetsich aktives Protein hergestellt
wird, ist ein Produkt aus der Rate der Transkription und der Translation.
Beide Raten können
erfindungsgemäß beeinflusst
werden und damit die Rate der Bildung von Produkten in einem Mikroorganismus
beeinflussen.
Unter
einem „Promotor" oder einer „Nukleinsäure mit
Promotoraktivität" wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure verstanden,
die in funktioneller Verknüpfung
mit einer zu trankripierenden Nukleinsäure, die Transkription dieser
Nukleinsäure
reguliert.
Unter
einer „funktionellen
Verknüpfung" versteht man in
diesem Zusammenhang beispielsweise die sequentielle Anordnung einer
der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität
und einer zu transkribierenden Nukleinsäuresequenz und ggf. weiterer
regulativer Elemente wie zum Beispiel Nukleinsäureseugenzen, die die Transkription
von Nukleinsäuren
gewährleisten,
sowie zum Beipsiel einen Terminator derart, dass jedes der regulativen
Elemente seine Funktion bei der Transkription der der Nukleinsäuresequenz
erfüllen
kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im
chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie
zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von
weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus
auf die Zielsequenz ausüben.
Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die zu trankribierende Nukleinsäuresequenz
hinter (d.h. am 3'-Ende)
der erfindungsgemäßen Promotorsequenz
positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander
verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz
und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200
Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz
besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.
Unter „Promotoraktivität" wird erfindungsgemäß die in
einer bestimmten Zeit durch den Promotor gebildete Menge RNA, also
die Trankriptionsrate verstanden.
Unter „spezifischer
Promotoraktivität" wird erfindungsgemäß die in
einer bestimmten Zeit durch den Promotor gebildete Menge RNA pro
Promotor verstanden.
Unter
dem Begriff "Wildtyp" wird erfindungsgemäß der entsprechende
Ausgangsmikroorganismus verstanden.
Je
nach Zusammenhang kann unter dem Begriff "Mikroorganismus" der Ausgangsmikroorganismus (Wildtyp)
oder ein erfindungsgemäßer, genetisch
veränderter
Mikroorganismus oder beides verstanden werden.
Vorzugsweise
und insbesondere in Fällen,
in denen der Mikroorganismus oder der Wildtyp nicht eindeutig zugeordnet
werden kann, wird unter "Wildtyp" für die Veränderung
oder Verursachung der Promotoraktivität oder Trankriptionsrate, für die Veränderung
oder Verursachung der Expressionsaktivität oder Expressionsrate und
für die
Erhöhung
des Gehalts an biosynthetischen Produkten jeweils ein Referenzorganismus
verstanden.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist dieser Referenzorganismus Corynebakterium glutamicum ATCC 13032.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden Ausgangsmikroorganismen verwendet die bereits in der Lage
sind, die gewünschte
Feinchemikalie herzustellen. Besonders bevorzugt sind dabei unter
den besonders bevorzugten Mikroorganismen der Bakterien der Gattung
Corynebacterien und den besonders bevorzugten Feinchemikalien L-Lysin, L-Methionin
und L-Threonin, diejenigen Ausgangsmikroorganismen die bereits in der
Lage sind, L-Lysin, L-Methionin und/oder L-Threonin herzustellen.
Dies sind besonderes bevorzugt Corynebakterien bei denen beispielsweise
das Gen kodierend für
eine Aspartokinase (ask-Gen) dereguliert ist oder die feed-back-Inhibierung
aufgehoben oder reduziert ist. Beispielsweise weisen solche Bakterien
im ask-Gen eine Mutation auf, die zu einer Reduzierung oder Aufhebung
der feed-back-Inhibierung führen,
wie beispielsweise die Mutation T311I.
Bei
einer „verursachten
Promotoraktivität" oder Transkriptionsrate
im Bezug auf ein Gen im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich
zum Wildtyp die Bildung einer RNA verursacht, die im Wildtyp so
nicht vorhanden war.
Bei
einer veränderten
Promotoraktivität
oder Transkriptionsrate im Bezug auf ein Gen im Vergleich zum Wildtyp
wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit die
gebildete Menge der RNA verändert.
Unter „verändert" wird in diesem Zusammenhang
bevorzugt erhöht
oder erniedrigt verstanden.
Dies
kann beispielsweise durch Erhöhung
oder Reduzierung der spezifischen Promotoraktivität des endogenen
erfindungsgemäßen Promotors,
beispielsweise durch Mutation des Promotors oder durch Stimmulierung
oder Hemmung des Promotors erfolgen.
Weiterhin
kann die erhöhte
Promotoraktivität
oder Transkriptionsrate beispielsweise durch Regulation der Transkription
von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit Promotoraktivität oder durch
Nukleinsäuren
mit erhöhter
spezifischer Promotoraktivität
erreicht werden, wobei die Gene in Bezug auf die Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität
heterolog sind.
Vorzusgweise
wird die Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganismus
durch erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität
oder durch Nukleinsäuren
mit erhöhter
spezifischer Promotoraktivität
dadurch erreicht, dass man eine oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität, gegebenenfalls
mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität,
in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Transkription
eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten
erfindungsgemäßen Nukleinsäure mit
Promotoraktivität
gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität,
erfolgt oder ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus
einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer der eingebrachten
Gene unter der Kontrolle der endogenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität,
gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität,
erfolgt oder ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine
erfindungsgemäße Nukleinsäure mit
Promotoraktivität,
gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität,
und funktionell verknüpft
eine oder mehrere, zu transkribierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus
einbringt.
Die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität
enthalten
- A) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 oder
- B) eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder
Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens
90 % auf Nukleinsäureebene
mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 1 aufweist oder
- C) eine Nukleinsäuresequenz,
die mit der Nukleinsäuresequenz
SEQ. ID. NO. 1 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder
- D) funktionell äquivalente
Fragmente der Sequenzen unter A), B) oder C)
Die
Nukleinsäuresequenz
SEQ. ID. NO. 1 stellt die Promotorsequenz einer hypothetischen Permease (P1-34) aus Corynebakterium glutamicum dar.
SEQ. ID. NO. 1 entspricht der Promotorsequenz des Wildtyps.
Die
Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuren mit Promotoraktivität enthaltend
eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion
von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens
90 % auf Nukleinsäureebene
mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 1 aufweist.
Weitere
natürliche
erfindungsgemäße Beispiele
für erfindungsgemäße Promotoren
lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische
Sequenz bekannt ist, durch Identitätsvergleiche der Nukleinsäuresequenzen
aus Datenbanken mit der vorstehend beschriebenen Sequenzen SEQ ID
NO: 1 leicht auffinden.
Künstliche
erfindungsgemäße Promotor-Sequenzen
lassen sich ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 1 durch künstliche
Variation und Mutation, beispielsweise durch Substitution, Insertion
oder Deletion von Nukleotiden leicht auffinden.
Unter
dem Begriff "Substitution" ist in der Beschreibung
der Austausch einer oder mehrerer Nukleotide durch ein oder mehrere
Nukleotide zu verstehen. „Deletion" ist das Ersetzen
eines Nukleotides durch eine direkte Bindung. Insertionen sind Einfügungen von
Nukleotiden in die Nukleinsäuresequenz,
wobei formal eine direkte Bindung durch ein oder mehrere Nukleotide
ersetzt wird.
Unter
Identität
zwischen zwei Nukleinsäuren
wird die Identität
der Nukleotide über
die jeweils gesamte Nukleinsäurelänge verstanden,
insbesondere die Identität
die durch Vergleich mit Hilfe der Vector NTI Suite 7.1 Software
der Firma Informax (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins
DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on
a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151-1) unter
Einstellung folgender Parameter berechnet wird: Multiple alignment
parameter:
Gap opening penalty 10
Gap extension penalty
10
Gap separation penalty range 8
Gap separation penalty
off % identity for alignment delay 40
Residue specific gaps
off
Hydrophilic residue gap off Transition weighing 0
Pairwise
alignment parameter:
FAST algorithm on
K-tuplesize 1
Gap
penalty 3
Window size 5
Number of best diagonals 5
Unter
einer Nukleinsäuresequenz,
die eine Identität
von mindestens 90 % mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweist, wird
dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz
verstanden, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz
SEQ ID NO: 1, insbesondere nach obigen Programmlogarithmus mit obigem
Parametersatz eine Identität
von mindestens 90 % aufweist.
Besonders
bevorzugte Promotoren weisen mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 eine
Identität von
91 %, bevorzugter 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, besonders bevorzugt
99% auf.
Weitere
natürliche
Beispiele für
Promotoren lassen sich weiterhin ausgehend von den vorstehend beschriebenen
Nukleinsäuresequenzen,
insbesondere ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 1 aus verschiedenen
Organismen, deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungstechniken
in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft daher Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität,
enthaltend eine Nukleinsäuresequenz,
die mit der Nukleinsäuresequenz
SEQ. ID. No. 1 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Diese
Nukleinsäuresequenz
umfasst mindestens 10, bevorzugter mehr als 12,15,30,50 oder besonders
bevorzugt mehr als 150 Nukleotide.
Die
Hybridisierung erfolgt erfinungsgemäß unter stringenten Bedingungen.
Solche Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise bei Sambrook,
J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual),
2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57
oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989),
6.3.1-6.3.6 beschrieben:
Unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen
werden insbesondere verstanden: Die über Nacht Inkubation bei 42°C in einer
Lösung
bestehend aus 50 % Formamid, 5 × SSC
(750 mM NaCl, 75 mM Tri-Natrium Citrat), 50 mM Natrium Phosphat
(ph7,6), 5× Denhardt
Lösung,
10% Dextransulfat und 20 g/ml denaturierte, gescheerte Lachsspermien-DNA,
gefolgt von einem Waschen der Filter mit 0,1 × SSC bei 65°C.
Unter
einem „funktionell äquivalenten
Fragment" werden
für Nukleinsäuresequenzen
mit Promotoraktivität,
Fragmente verstanden die im wesentlichen die gleiche oder eine höhere spezifische
Promotoraktivität aufweisen
wie die Ausgangssequenz.
Unter „im wesentlichen
gleich" wird eine
spezifische Promotoraktivität
verstanden die mindestens 50%, vorzugsweise 60%, bevorzugter 70%,
bevorzugter 80%, bevorzugter 90%, besonders bevorzugt 95% der spezifischen
Promotoraktivität
der Ausgangssequenz aufweist.
Unter „Fragmente" werden Teilsequenzen
der durch Ausführungsform
A), B) oder C) beschriebenen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität verstanden.
Vorzusgweise weisen diese Fragmente mehr als 10, bevorzugter aber
mehr als 12,15, 30, 50 oder besonders bevorzugts mehr als 150 zusammenhängende Nukleotide der
Nukleinsäuresequenz
SEQ. ID. NO. 1 auf.
Besonders
bevorzugt ist die Verwendung der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 als
Promotor, d.h. zur Transkriptiion von Genen.
Die
SEQ. ID. NO. 1 ist ohne Funktionszuordnung im Genbank-Eintrag AP005283
beschrieben worden. Daher betrifft die Erfindung ferner die neuen,
erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
mit Promotoraktivität.
Insbesondere
betrifft die Erfindung eine Nukleinsäure mit Promotoraktivität, enthaltend
- A) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 oder
- B) eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder
Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens
90 % auf Nukleinsäureebene
mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 1 aufweist oder
- C) eine Nukleinsäuresequenz,
die mit der Nukleinsäuresequenz
SEQ. ID. NO. 1 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder
- D) funktionell äquivalente
Fragmente der Sequenzen unter A), B) oder C),
mit der
Maßgabe,
dass die Nukleinsäure
mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 1 ausgenommen ist.
Alle
vorstehend erwähnten
Nukleinsäuren
mit Promotoraktivität
sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese
aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation
einzelner überlappender,
komplementärer
Nukleinsäurebausteine
der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden
kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode
(Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, S. 896-897) erfolgen.
Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von
Lücken
mithilfe des Klenow-Fragmentes
der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren
werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory
manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
Die
Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer Expressionseinheit,
enthaltend eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität
und zusätzlich
funktionell verknüpft
eine Nukleinsäuresequenz, die
die Translation von Ribonukleinsäuren
gewährleistet,
zur Expression von Genen.
Unter
einer Expressioneinheit wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure mit
Expressionsaktivität
verstanden, also eine Nukleinsäure
verstanden, die in funktioneller Verknüpfung mit einer zu exprimierenden
Nukleinsäure
oder Gens, die Expression, also die Transkription und die Translation
dieser Nukleinsäure
oder dieses Gens reguliert.
Unter
einer „funktionellen
Verknüpfung" versteht man in
diesem Zusammenhang beispielsweise die sequentielle Anordnung einer
der erfindungsgemäßen Expressionseinheit
und einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz und ggf. weiterer
regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass
jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der transgenen
Expression der Nukleinsäuresequenz erfüllen kann.
Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich.
Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen,
können
ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von
anderen DNA-Molekülen
aus auf die Zielsequenz ausüben.
Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende
Nukleinsäuresequenz
hinter (d.h. am 3'-Ende)
der erfindungsgemäßen Expressionseinheitssequenz
positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander
verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Expressionseinheitssequenz
und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200
Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz
besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.
Unter „Expressionsaktivität" wird erfindungsgemäß die in
einer bestimmten Zeit durch die Expressionseinheit gebildete Menge
Protein, also die Expressionsrate verstanden.
Unter „spezifischer
Expressionsaktivität" wird erfindungsgemäß die in
einer bestimmten Zeit durch die Expressionseinheit gebildete Menge
Protein pro Expressionseinheit verstanden.
Bei
einer „verursachten
Expressionsaktivität" oder Expressionsrate
im Bezug auf ein Gen im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich
zum Wildtyp die Bildung eines Proteins verursacht, das im Wildtyp
so nicht vorhanden war.
Bei
einer „veränderten
Expressionsaktivität" oder Expressionsrate
im Bezug auf ein Gen im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich
zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit die gebildete Menge des Proteins verändert.
Unter „verändert" wird in diesem Zusammenhang
bevorzugt erhöht
oder erniedrigt verstanden.
Dies
kann beispielsweise durch Erhöhung
oder Reduzierung der spezifischen Aktivität der endogenen Expressionseinheit,
beispielsweise durch Mutation der Expressionseinheit oder durch
Stimmulierung oder Hemmung der Expressionseinheit erfolgen.
Weiterhin
kann die erhöhte
Expressionsaktivität
oder Expressionsrate beispielsweise durch Regulation der Expression
von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten oder
durch Expressionseinheiten mit Erhöhter spezifischer Expressionsaktivität erreicht
werden, wobei die Gene im Bezug auf die Expressionseinheiten heterolog
sind.
Vorzugsweise
wird die Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus
durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten
oder durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten
mit Erhöhter
spezifischer Expressionsaktivitätdadurch
erreicht, dass man
eine oder mehrere erfindungsgemäße Expressionseinheiten,
gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Expressionsaktivität,
in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Expression
eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten
erfindungsgemäßen Expressionseinheiten,
gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Expressionsaktivität,
erfolgt oder
ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus
einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten
Gene unter der Kontrolle der endogenen, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten, gegebenenfalls
mit veränderter
spezifischer Expressionsaktivität,
erfolgt oder
ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine
erfindungsgemäße Expressionseinheit,
gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Expressionsaktivität,
und funktionell verknüpft
eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus
einbringt.
Die
erfindungsgemäßen Expressionseinheiten,
enthalten eine erfindungsgemäße, vorstehend
bechriebene Nukleinsäure
mit Promotoraktivität
und zusätzlich
funktionell verknüpft
eine Nukleinsäuresequenz, die
die Translation von Ribonukleinsäuren
gewährleistet.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
enthält
die erfindungsgemäße Expressionseinheit:
- E) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder
- F) eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder
Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens
90 % auf Nukleinsäureebene
mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist oder
- G) eine Nukleinsäuresequenz,
die mit der Nukleinsäuresequenz
SEQ. ID. NO. 2 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder
- H) funktionell äquivalente
Fragmente der Sequenzen unter E), F) oder G).
Die
Nukleinsäuresequenz
SEQ. ID. NO. 2 stellt die Nukleinsäuresequenz der Expressionseinheit
einer hypothetischen Permease (P1-34) aus
Corynebakterium glutamicum dar. SEQ. ID.NO. 2 entspricht der Sequenz der
Expressionseinheit des Wildtyps.
Die
Erfindung betrifft weiterhin Expressionseinheiten, enthaltend eine
von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von
Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens
90 % auf Nukleinsäureebene
mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist.
Weitere
natürliche
erfindungsgemäße Beispiele
für erfindungsgemäße Expressionseinheiten
lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische
Sequenz bekannt ist, durch Identitätsvergleiche der Nukleinsäuresequenzen
aus Datenbanken mit der vorstehend beschriebenen Sequenzen SEQ ID
NO: 2 leicht auffinden.
Künstliche
erfindungsgemäße Sequenzen
der Expressionseinheiten lassen sich ausgehend von der Sequenz SEQ
ID NO: 2 durch künstliche
Variation und Mutation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder
Deletion von Nukleotiden leicht auffinden.
Unter
einer Nukleinsäuresequenz,
die eine Identität
von mindestens 90 % mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 aufweist, wird
dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz
verstanden, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz
SEQ ID NO: 2, insbesondere nach obigen Programmlogarithmus mit obigem
Parametersatz eine Identität
von mindestens 90 % aufweist.
Besonders
bevorzugte Expressionseinheiten weisen mit der Nukleinsäuresequenz
SEQ. ID. NO. 2 eine Identität
von 91 %, bevorzugter 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, besonders
bevorzugt 99% auf.
Weitere
natürliche
Beispiele für
Expressionseinheiten lassen sich weiterhin ausgehend von den vorstehend
beschriebenen Nukleinsäuresequenzen,
insbesondere ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO: 2 aus verschiedenen
Organismen, deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungstechniken
in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft daher Expressionseinheiten,
enthaltend eine Nukleinsäuresequenz,
die mit der Nukleinsäuresequenz
SEQ. ID. No. 2 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Diese
Nukleinsäuresequenz
umfasst mindestens 10, bevorzugter mehr als 12,15,30,50 oder besonders
bevorzugt mehr als 150 Nukleotide.
Unter "hybridisieren" versteht man die
Fähigkeit
eines Poly- oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an
eine nahezu komplementäre
Sequenz zu binden, während
unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern
unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen vorzugsweise zu 90-100%,
komplementär
sein. Die Eigenschaft komplementärer
Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise
in der Northern- oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in
PCR oder RT-PCR zunutze.
Die
Hybridisierung erfolgt erfinungsgemäß unter stringenten Bedingungen.
Solche Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise bei Sambrook,
J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual),
2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57
oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989),
6.3.1-6.3.6 beschrieben: Unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen
werden insbesondere verstanden:
Die über Nacht Inkubation bei 42°C in einer
Lösung
bestehend aus 50 % Formamid, 5 × SSC
(750 mM NaCl, 75 mM Tri-Natrium Citrat), 50 mM Natrium Phosphat
(ph7,6), 5× Denhardt
Lösung,
10% Dextransulfat und 20 g/ml denaturierte, gescheerte Lachsspermien-DNA,
gefolgt von einem Waschen der Filter mit 0,1 × SSC bei 65°C.
Die
erfindungsgemäß Nukleotidsequenzen
ermöglichen
ferner die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung
und/oder Klonierung von homologer Sequenzen in anderen Zelltypen
und Mikroorganismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen
gewöhnlich
einen Nukleotidsequenzbereich, der unter stringenten Bedingungen
an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z.B. etwa
40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges
einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz
oder eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert.
Erfindungsgemäß umfasst
sind auch solche Nukleinsäuresequenzen,
die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der
Codon-Nutzung eins speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich
zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende
Varianten, wie z.B. Spleißvarianten
oder Allelvarianten, davon.
Unter
einem „funktionell äquivalenten
Fragment" werden
für Expressionseinheiten,
Fragmente verstanden die im wesentlichen die gleiche oder eine höhere spezifische
Expressionsaktivität
aufweisen wie die Ausgangssequenz.
Unter „im wesentlichen
gleich" wird eine
spezifische Expressionsaktivität
verstanden die mindestens 50%, vorzugsweise 60%, bevorzugter 70%,
bevorzugter 80%, bevorzugter 90%, besonders bevorzugt 95% der spezifischen
Expressionsaktivität
der Ausgangssequenz aufweist.
Unter „Fragmente" werden Teilsequenzen
der durch Ausführungsform
E), F) oder G) beschriebenen Expressionseinheiten verstanden. Vorzusgweise
weisen diese Fragmente mehr als 10, bevorzugter aber mehr als 12,15,
30, 50 oder besonders bevorzugts mehr als 150 zusammenhängende Nukleotide
der Nukleinsäuresequenz
SEQ. ID. NO. 1 auf.
Besonders
bevorzugt ist die Verwendung der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 als
Expressionseinheit, d.h. zur Expression von Genen.
Die
Erfindung betrifft ferner die neuen, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten.
Insbesondere
betrifft die Erfindung eine Expressionseinheit, enthaltend eine
erfindungsgemäße Nukleinsäure mit
Promotoraktivität
zusätzlich
funktionell verknüpft
eine Nukleinsäuresequenz,
die die Translation von Ribonukleinsäuren gewährleistet.
Besonders
bevorzugt betrifft die Erfindung eine Expressionseinheit, enthaltend
- E) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder
- F) eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder
Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens
90 % auf Nukleinsäureebene
mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist oder
- G) eine Nukleinsäuresequenz,
die mit der Nukleinsäuresequenz
SEQ. ID. NO. 2 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder
- H) funktionell äquivalente
Fragmente der Sequenzen unter E), F) oder G),
mit der
Maßgabe,
dass die Nukleinsäure
mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 ausgenommen ist.
Die
erfindungsgemäßen Expressionseinheiten
umfassen ein oder mehrere der folgenden genetischen Elemente: eine
Minus 10 ("–10") Sequenz; eine Minus
35 ("-35") Sequenz; einen
Transkriptionsstart, eine Enhancer Region; und eine Operator Region.
Vorzugsweise
sind diese genetischen Elemente spezifisch für die Spezies Corynebakterien,
speziell für
Corynbacterium glutamicum.
Alle
vorstehend erwähnten
Expressionseinheiten sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch
chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise
durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine
der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden
kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode
(Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, S. 896-897) erfolgen.
Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von
Lücken
mithilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen
sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al.
(1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, beschrieben.
Für die Erfindungen
in diesem Patent wurden Methoden und Techniken genutzt, die dem
Fachmann, der in mikrobiologischen und rekombinanten DNA-Techniken
geübt ist,
bekannt sind. Methoden und Techniken für das Wachstum von Bakterienzellen,
das Einschleusen von isolierten DNA-Molekülen in die Wirtszelle, und die
Isolierung, Klonierung und Sequenzierung von isolierten Nukleinsäuremolekülen usw.
sind Beispiele für solche
Techniken und Methoden. Diese Methoden sind in vielen Standardliteraturstellen
beschrieben: Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986);
J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1972); J.H. Miller,
A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, New York (1992); M. Singer and P. Berg,
Genes & Genomes,
University Science Books, Mill Valley, Carlifornia (1991); J. Sambrook,
E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, New York (1989); P.B. Kaufmann et al., Handbook
of Molcular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press,
Boca Raton, Florida (1995); Methods in Plant Molecular Biology and
Biotechnology, B.R. Glick and J.E. Thompson, eds., CRC Press, Boca
Raton, Florida (1993); and P.F. Smith-Keary, Molecular Genetics
of Escherichia coli, The Guilford Press, New York, NY (1989).
Alle
Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden
Erfindung liegen bevorzugt in Form eines isolierten Nukleinsäuremoleküls vor.
Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von
anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt,
die in der natürlichen
Quelle der Nukleinsäure
zugegen sind und kann überdies
im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium
sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder
frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn
es chemisch synthetisiert wird.
Die
Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequenzen
komplementären
Nukleinsäuremoleküle oder
einen Abschnitt davon.
Die
erfindungsgemäßen Promotoren
und/oder Expressionseinheiten lassen sich beispielsweise besonders
vorteilhaft in verbesserten Verfahren zur fermentativen Herstellung
von biosynthetischen Produkten wie nachstehend beschrieben verwenden.
Die
erfindungsgemäßen Promotoren
und/oder Expressionseinheiten weisen insbesondere den Vorteil auf,
dass sie in Mikroorganismen durch Stress induziert werden. Durch
geeignete Steuerung des Fermentationsprozesses lässt sich diese Stress-Induktion gezieit
für eine
Erhöhung
der Trankritptions/Expressionsrate gewünschter Gene steuern. Insbesondere
bei der Produktion von L-Lysin wird diese Stressphase sehr früh erreicht,
so das hier sehr früh
eine erhöhte
Transkriptions/Expressionsrate von gewünschten Genen erreicht werden
kann.
Die
erfindungesgemäßen Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität
können
zur Veränderung,
also zur Erhöhung
oder Reduzierung, oder zur Verursachung der Transkriptionsrate von
Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp verwendet werden.
Die
erfindungsgemäßen Expressionseinheiten
können
zur Veränderung,
also zur Erhöhung
oder Reduzierung, oder zur Verursachung der Expressionsrate von
Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp verwendet werden.
Ferner
können
die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität
und die erfindungesgemäßen Expressionseinheiten
zur Regulation und Verstärkung
der Bildung von verschiedenen biosynthetischen Produkten, wie beispielsweise
Feinchemikalien, Proteinen, inbesondere Aminosäuren, in Mikroorganismen, insbsondere
in Corynebacterium species dienen.
Die
Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Veränderung oder Verursachung der
Transkriptionsrate von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum
Wildtyp durch
- a) Veränderung der spezifischen Promotoraktivität im Mikroorganismus
von endogenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität,
die die Transkription von endogenen Genen regulieren, im Vergleich
zum Wildtyp oder
- b) Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganismus
durch erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität
oder durch Nukleinsäuren
mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität
gemäß Ausführungsform
a), wobei die Gene in Bezug auf die Nukleinsäuren mit Promotoraktivität heterolog
sind.
Gemäß Ausführungsform
a) kann die Veränderung
oder Verursachung der Transkriptionsrate von Genen in Mikroorganismen
im Vergleich zum Wildtyp dadurch erfolgen, dass im Mikroorganismus
die spezifische Promotoraktivität
verändert,
also erhöht
oder erniedrigt wird. Dies kann beispielsweise durch gezielte Mutation der
erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz
mit Promotoraktivität,
also durch gezielte Substitution, Deletion oder Insertion von Nukleotiden
erfolgen. Eine erhöhte
bzw. erniedrigte Promotoraktivität
kann dadurch erreicht werden,dass Nukleotide in der Bindungsstelle
des RNA-Polymerase-Holoenzym-Bindungsstellen
(dem Fachmann auch als – 10-Region
und – 35
Region bekannt) ausgetauscht werden. Weiterhin dadurch dass der
Abstand der beschriebenen RNA-Polymerase-Holoenzym-Bindungsstellen
zueinander durch Deletionen von Nukleotiden oder Insertionen von
Nukleotiden verkleinert oder vergrößert werden. Weiterhin dadurch
dass Bindungsstellen (dem Fachmann auch als – Operatoren bekannt) für Regulatiosproteine
(dem Fachmann bekannt als Repressoren und Aktiviatoren) in räumliche
Nähe an
die Bindungsstellen des RNA-Polymerase-Holoenzyms gebracht werden, dass diese
Regulatoren nach Bindung an eine Promotor-Sequenz die Bindung des
und Transkriptionsaktivität
des RNA-Polymerase-Holoenzyms
abschwächen
oder verstärken,
oder auch unter einen neuen regulatorischen Einfluss stellen.
In
Bezug auf die „spezifische
Promotoraktivität" wird unter Erhöhung oder
Reduzierung im Vergleich zum Wildtyp eine Erhöhung oder Reduzierung der spezifischen
Aktivität
gegenüber
der erfindungsgemäßen Nukleinsäure mit
Promotoraktivität
des Wildtyps, also beispielsweise gegenüber der SEQ. ID. NO. 1 verstanden.
Gemäß Ausführungsform
b) kann die Veränderung
oder Verursachung der Transkriptionsrate von Genen in Mikroorganismen
im Vergleich zum Wildtyp dadurch erfolgen, dass man die Transkription
von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit Promotoraktivität oder durch
Nukleinsäuren mit
veränderter
spezifischer Promotoraktivität
gemäß Ausführungsform
a) reguliert, wobei die Gene in Bezug auf die Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität
heterolog sind.
Dies
wird bevorzugt dadurch erreicht, dass man
- b1)
eine oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität,
gebenenfalls mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität,
in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Transkription eines
oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten
Nukleinsäure
mit Promotoraktivität,
gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität,
erfolgt oder
- b2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt,
so dass die Transkription eines oder mehrerer der eingebrachten
Gene unter der Kontrolle der endogenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität,
gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität,
erfolgt oder
- b3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine
erfindungsgemäße Nukleinsäure mit
Promotoraktivität,
gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität,
und funktionell verknüpft
eine oder mehrere, zu transkribierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus
einbringt.
Es
ist somit möglich,
die Transkriptionsrate eines endogenen Gens des Wildtyps zu verändern, also zu
erhöhen
oder zu erniedrigen indem man
gemäß Ausführungsform b1) eine oder mehrere
erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität,
gebenenfalls mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität,
in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Transkription
eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten
Nukleinsäure
mit Promotoraktivität,
gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität,
erfolgt oder
gemäß Ausführungsform
b2) ein oder mehrere endogene Gene in das Genom des Mikrorganismus
einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer der eingebrachten,
endogenen Gene unter der Kontrolle der endogenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität,
gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität,
erfolgt oder
Gemäß Ausführungsform
b3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte,
enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure mit
Promotoraktivität,
gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität,
und funktionell verknüpft
eine oder mehrere, zu transkribierende endogene Nukleinsäuren, in
den Mikroorganismus einbringt.
Ferner
ist es somit möglich,
die Transkriptionsrate eines exogenen Gens im Vergleich zum Wildtyps zu
verursachen, indem man
gemäß Ausführungsform
b2) ein oder mehrere exogene Gene in das Genom des Mikrorganismus
einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer der eingebrachten,
exogenen Gene unter der Kontrolle der endogenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität,
gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität,
erfolgt oder
Gemäß Ausführungsform
b3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte,
enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure mit
Promotoraktivität,
gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität,
und funktionell verknüpft
eine oder mehrere, zu transkribierende exogene Nukleinsäuren, in
den Mikroorganismus einbringt.
Die
Insertion von Genen gemäß Ausführungsform
b2) kann dabei so erfolgen, dass das Gen in kodierende Bereiche
oder nicht-kodierende Bereiche integriert wird. Vorzugsweise erfolgt
die Insertion in nicht-kodierende Bereiche.
Die
Insertion von Nukleinsäurekonstrukten
gemäß Ausführungsform
b3) kann dabei chromosomal oder extrachromosomal erfolgen. Vorzugsweise
erfolgt die Insertion der Nukleinsäurekonstrukte chromosomal.
Eine „chromosomale" Integration ist
die Insertion eines exogenen DNA-Fragmentes in das Chromosom einer
Wirtszelle. Dieser Begriff wird auch für die homologe Rekombination
zwischen einem exogenen DNA-Fragment
und der entsprechenden Region auf dem Chromosom der Wirtszelle genutzt.
In
Ausführungsform
b) werden bevorzugt auch erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität
gemäß Ausführungsform
a) eingesetzt. Diese können
in Ausführungsform
b), wie in Ausführungsform
a) beschrieben im Mikroorganismus vorliegen und hergestellt werden
oder in isolierter Form in den Mikroorganismus eingebracht werden.
Unter „endogen" werden genetische
Informationen, wie beispielsweise Gene, verstanden, die bereits im
Wildtypgenom enthalten sind.
Unter „exogen" werden genetische
Informationen, wie beispielsweise Gene, verstanden, die im Wildtypgenom
nicht enthalten sind.
Unter
dem Begriff „Gene" in Bezug auf Regulation
der Transkription durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität
werden vorzugsweise Nukleinsäuren
verstanden, die einen zu transkripierenden Bereich, also beispielsweise
einen Be reich der die Translation reguliert, einen kodierenden Bereich,
sowie gegebenenfalls weitere Regulationselemente, wie beispielsweise
einen Terminator, enthalten.
Unter
dem Begriff „Gene" in Bezug auf die
nachstehend beschriebene Regulation der Expression durch die erfindungsgemäßen Expressionseinheiten
werden vorzugsweise Nukleinsäuren
verstanden, die einen kodierenden Bereich, sowie gegebenenfalls
weitere Regulationselemente, wie beispielsweise einen Terminator,
enthalten.
Unter
einem „kodierenden
Bereich" wird eine
Nukleinsäuresequenz
verstanden, die ein Protein kodiert.
Unter „heterolog" in Bezug auf Nukleinsären mit
Promotoraktivität
und Gene wird verstanden, dass die verwendeten Gene im Wildtyp nicht
unter Regulation der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität
transkribiert werden, sondern das eine neue, im Wildtyp nicht vorkommende
funktionelle Verknüpfung entsteht
und die funktionelle Kombination aus erfindungsgemäßer Nukleinsäure mit
Promotoraktivität
und spezifisches Gen im Wildtyp nicht vorkommt.
Unter „heterolog" in Bezug auf Expressionseinheiten
und Gene wird verstanden, dass die verwendeten Gene im Wildtyp nicht
unter Regulation der erfindungsgemäßen Expressionseinheiten exprimiert
werden, sondern das eine neue, im Wildtyp nicht vorkommende funktionelle
Verknüpfung
entsteht und die funktionelle Kombination aus erfindungsgemäßer Expressionseinheit
und spezifisches Gen im Wildtyp nicht vorkommt.
Die
Erfindung betrifft ferner in einer bevorzugten Ausführungsform
ein Verfahren zur Erhöhung
oder Verursachung der Transkriptionsrate von Genen in Mikroorganismen
im Vergleich zum Wildtyp indem man
- ah) die
spezifische Promotoraktivität
im Mikroorganismus von erfindungsgemäßen endogenen Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität
, die die Transkription von endogenen Genen regulieren, im Vergleich
zum Wildtyp erhöht
oder
- bh) die Transkription von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität
oder durch Nukleinsäuren
mit erhöhter
spezifischer Promotoraktivität
gemäß Ausführungsform a)
reguliert, wobei die Gene in Bezug auf die Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität
heterolog sind.
Vorzugsweise
wird die Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganismus
durch erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität
oder durch erfindungs gemäße Nukleinsäuren mit
erhöhter
spezifischer Promotoraktivität
gemäß Ausführungsform
ah) dadurch erreicht wird, dass man
- bh1) eine
oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität,
gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Promotoraktivität,
in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Transkription eines
oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten
erfindungsgemäßen Nukleinsäure mit
Promotoraktivität,
gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Promotoraktivität,
erfolgt oder
- bh2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt,
so dass die Transkription eines oder mehrerer der eingebrachten
Gene unter der Kontrolle der erfindungsgemäßen, endogenen Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität,
gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Promotoraktivität,
erfolgt oder
- bh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine
erfindungsgemäße Nukleinsäure mit
Promotoraktivität,
gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Promotoraktivität,
und funktionell verknüpft
eine oder mehrere, zu transkribierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus
einbringt.
Die
Erfindung betrifft ferner in einer bevorzugten Ausführungsform
ein Verfahren zur Reduzierung der Transkriptionsrate von Genen in
Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp, indem man
- ar) die spezifische Promotoraktivität im Mikroorganismus von endogenen
erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität,
die die Transkription der endogenen Gene regulieren, im Vergleich
zum Wildtyp reduziert oder
- br) Nukleinsäuren
mit reduzierter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausführungsform a) in das Genom des
Mikroorganismus einbringt, so dass die Transkription endogene Gene
unter der Kontrolle der eingebrachten Nukleinsäure mit reduzierter Promotoraktivität erfolgt.
Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Veränderung oder Verursachung der
Expressionsrate eines Gens in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp
durch
- c) Veränderung der spezifischen Expressionsaktivität im Mikroorganismus
von erfindungsgemäßen, endogenen
Expressionseinheiten, die die Expression der endogenen Gene regulieren,
im Vergleich zum Wildtyp oder
- d) Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus durch
erfindungsgemäße Expressionseinheiten
oder durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten
mit veränderter
spezifischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform
c), wobei die Gene im Bezug auf die Expressionseinheiten heterolog
sind.
Gemäß Ausführungsform
c) kann die Veränderung
oder Verursachung der Expressionsrate von Genen in Mikroorganismen
im Vergleich zum Wildtyp dadurch erfolgen, dass im Mikroorganismus
die spezifische Expressionsaktivität verändert, also erhöht oder
erniedrigt wird. Dies kann beispielsweise durch gezielte Mutation
der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz
mit Promotoraktivität,
also durch gezielte Substitution, Deletion oder Insertion von Nukleotiden
erfolgen. Beispielsweise führt
die Verlängerung
des Abstandes zwischen Shine-Dalgarno-Sequenz und dem translationellen
Startcodon in der Regel zu einer Änderung, einer Verkleinerung
oder aber auch einer Verstärkung
der spezifischen Expressionsaktivität. Eine Veränderung der der spezifischen
Expressionsaktivität
kann auch dadurch erreicht werden, dass die Sequenz der Shine-Dalgarno-Region
(Ribosomale Bindungsstelle) in seinem Abstand zum translationellen
Startcodon durch Deletionen oder Insertionen von Nukleotiden entweder
verkürzt
oder verlängert
wird. Aber auch dadurch dass die Sequenz der Shine-Dalgarno-Region so verändert wird,
dass die Homologie zu komplementären
3' Seite 16S rRNA
entweder verstärkt
oder aber auch verringert wird.
In
Bezug auf die „spezifische
Expressionsaktivität" wird unter Erhöhung oder
Reduzierung im Vergleich zum Wildtyp eine Erhöhung oder Reduzierung der spezifischen
Aktivität
gegenüber
der erfindungsgemäßen Expressionseinheit
des Wildtyps, also beispielsweise gegenüber der SEQ. ID. NO. 2 verstanden.
Gemäß Ausführungsform
d) kann die Veränderung
oder Verursachung der Expressionsrate von Genen in Mikroorganismen
im Vergleich zum Wildtyp dadurch erfolgen, dass man die Expression
von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten oder
durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten
mit veränderter
spezifischer Expressionsaktivität
gemäß Ausführungsform
c) reguliert, wobei die Gene in Bezug auf die Expressionseinheiten
heterolog sind.
Dies
wird bevorzugt dadurch erreicht, dass man
- d1)
eine oder mehrere erfindungsgemäße Expressionseinheiten,
gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Expressionsaktivität,
in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Expression
eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten
Expressionseinheiten erfolgt oder
- d2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt,
so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene
unter der Kontrolle der erfindungsgemäßen, endogenen Expressionseinheiten,
gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Expressionsaktivität,
erfolgt oder
- d3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine
erfindungsgemäße Expressionseinheit,
gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Expressionsaktivität,
und funktionell verknüpft
eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus
einbringt.
Es
ist somit möglich,
die Expressionsrate eines endogenen Gens des Wildtyps zu verändern, also
zu erhöhen
oder zu erniedrigen indem man
gemäß Ausführungsform d1) eine oder mehrere
erfindungsgemäße Expressionseinheiten,
gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Expressionsaktivität,
in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Expression
eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten
Expressionseinheiten erfolgt oder
gemäß Ausführungsform d2) ein oder mehrere
Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Expression
eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der
erfindungsgemäßen, endogenen
Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt
oder
gemäß Ausführungsform
d3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte,
enthaltend eine erfindungsgemäße Expressionseinheit,
gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Expressionsaktivität,
und funktionell verknüpft
eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus
einbringt.
Ferner
ist es somit möglich,
die Expressionssrate eines exogenen Gens im Vergleich zum Wildtyps
zu verursachen, indem man
gemäß Ausführungsform d2) ein oder mehrere
exogene Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass
die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter
der Kontrolle der erfindungsgemäßen, endogenen
Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt
oder
gemäß Ausführungsform
d3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte,
enthaltend eine erfindungsgemäße Expressionseinheit,
gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Expressionsaktivität,
und funktionell verknüpft
eine oder mehrere, zu exprimierende, exogene Nukleinsäuren, in
den Mikroorganismus einbringt.
Die
Insertion von Genen gemäß Ausführungsform
d2) kann dabei so erfolgen, dass das Gen in kodierende Bereiche
oder nicht-kodierende Bereiche integriert wird. Vorzugsweise erfolgt
die Insertion in nicht-kodierende Bereiche.
Die
Insertion von Nukleinsäurekonstrukten
gemäß Ausführungsform
d3) kann dabei chromosomal oder extrachromosomal erfolgen. Vorzugsweise
erfolgt die Insertion der Nukleinsäurekonstrukte chromosomal.
Die
Nukleinsäurekonstrukte
werden im folgenden auch als Expressionskasetten bezeichnet.
In
Ausführungsform
d) werden bevorzugt auch erfindungsgemäße Expressionseinheiten mit
veränderter
spezifischer Expressionsaktivität
gemäß Ausführungsform
c) eingesetzt. Diese können
in Ausführungsform d),
wie in Ausführungsform
d) beschrieben im Mikroorganismus vorliegen und hergestellt werden
oder in isolierter Form in den Mikroorganismus eingebracht werden.
Die
Erfindung betrifft ferner in einer bevorzugten Ausführungsform
ein Verfahren zur Erhöhung
oder Verursachung der Expressionsrate eines Gens in Mikroorganismen
im Vergleich zum Wildtyp indem man
- ch) die
spezifische Expressionsaktivität
im Mikroorganismus von erfindungsgemäßen, endogenen Expressionseinheiten,
die die Expression der endogenen Gene regulieren, im Vergleich zum
Wildtyp erhöht
oder
- dh) die Expression von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten
oder durch Expressionseinheiten mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform
c) reguliert, wobei die Gene im Bezug auf die Expressionseinheiten
heterolog sind.
Vorzugsweise
wird die Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus
durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten
oder durch Expressionseinheiten mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform
c) dadurch erreicht, dass man
- dh1) eine oder
mehrere erfindungsgemäße Expressionseinheiten,
gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität,
in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Expression
eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten
Expressionseinheiten, gegebe nenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt
oder
- dh2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt,
so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene
unter der Kontrolle der erfindungsgemäßen, endogenen Expressionseinheiten,
gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität,
erfolgt oder
- dh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine
erfindungsgemäße Expressionseinheit,
gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität,
und funktionell verknüpft
eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus
einbringt.
Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Reduzierung der Expressionsrate
von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp, indem man
- cr) die spezifische Expressionsaktivität im Mikroorganismus
von endogenen, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten,
die die Expression der endogenen Gene regulieren, im Vergleich zum
Wildtyp reduziert oder
- dr) Expressionseinheiten mit reduzierter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform
cr) in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Expression
endogener Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Expressionseinheiten
mit reduzierter Expressionsaktivität erfolgt.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren zur Veränderung
oder Verursachung der Transkriptionsrate und/oder Expressionsrate
von Genen in Mikroorganismen sind die Gene ausgewählt aus
der Gruppe Nukleinsäuren
kodierend ein Protein aus den Biosyntheseweg von Feinchemikalien,
wobei die Gene gegebenenfalls weitere Regulationselemente enthalten
können.
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren zur Veränderung
oder Verursachung der Transkriptionsrate und/oder Expressionsrate
von Genen in Mikroorganismen sind die Gene ausgewählt aus
der Gruppe Nukleinsäuren
kodierend ein Protein aus den Biosyntheseweg von proteinogenen und
nicht-proteinogenen Aminosäuren,
Nukleinsäuren
kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Nukleotiden und
Nukleosiden, Nukleinsäuren
kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von organischen Säuren, Nukleinsäuren kodierend
ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Lipiden und Fettsäuren, Nukleinsäuren kodierend
ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Diolen, Nukleinsäuren kodierend
ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Konhlenhydraten, Nukleinsäuren kodierend
ein Protein aus dem Biosyntheseweg von aromatischen Verbindung,
Nukleinsäuren
kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Vitaminen, Nukleinsäuren kodierend
ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Cofaktoren und Nukleinsäuren kodierend
ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Enzymen, wobei die Gene gegebenenfalls
weitere Regulationselemente enthalten können.
In
einer besondere bevorzugten Ausführungsform
sind die Proteine aus dem Biosyntheseweg von Aminosäuren ausgewählt aus
der Gruppe Aspartatkinase, Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase, Diaminopimelat-Dehydrogenase, Diaminopimelat-Decarboxylase,
Dihydrodipicolinate-Synthetase, Dihydrodipicolinate-Reduktase, Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase,
3-Phosphoglycerat-Kinase,
Pyruvat-Carboxylase, Triosephosphat-Isomerase, Transkriptioneller
Regulator LuxR, Transkriptioneller Regulator LysR1, Transkriptioneller
Regulator LysR2, Malat-Quinon-Oxidoreduktase, Glucose-6-Phosphat-Deydrogenase,
6-Phosphogluconat-Dehydrognease,
Transketolase, Transaldolase, Homoserin-O-Acetyltransferase, Cystahionin-gamma-Synthase,
Cystahionin-beta-Lyase, Serin-Hydroxymethyltransferase,
O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase, Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase, Phosphoserin-Aminotransferase,
Phosphoserin-Phosphatase, Serin-Acetyl-Transferase,
Homoserin-Dehydrogenase, Homoserin-Kinase, Threonin-Synthase, Threonin-Exporter-Carrier,
Threonin-Dehydratase, Pyruvat-Oxidase, Lysin-Exporter, Biotin-Ligase,
Cystein-Synthasel, Cystein-Synthase II, Coenzym B12-abhängige Methionin-Synthase,
Coenzym B12-unabhängige
Methionin-Synthase-Aktivität, Sulfatadenyltransferase
Untereinheit 1 und 2, Phosphoadenosin Phosphosulfat Reduktase, Ferredoxin-sulfit-reductase,
Ferredoxin NADP Reduktase, 3-Phosphoglycerat Dehydrogenase, RXA00655 Regulator,
RXN2910-Regulator, Arginyl-t-RNA-Synthetase, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase,
Threonin Efflux-Protein, Serinhydroxymethyltransferase, Fruktose-1,6-bisphosphatase,
Protein der Sulfat-Reduktion RXA077,
Protein der Sulfat-Reduktion RXA248, Protein der Sulfat-Reduktion RXA247,
Protein OpcA, 1-Phosphofruktokinase und 6-Phosphofruktokinase.
Bevorzugte
Proteine und Nukleinsäuren
kodierend diese Proteine der vorstehend beschriebenen Proteine aus
dem Biosyntheseweg von Aminosäuren
sind Proteinsequenzen bzw. Nukleinsäuresequenzen mikrobiellen Ursprungs,
vorzusgweise aus Bakterien der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium,
bevorzugt aus coryneformen Bakterien, besonders bevorzugt aus Corynebakterium
glutamicum.
Beispiele
für besonders
bevorzugte Proteinsequenzen und die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen
kodierend diese Proteine aus dem Biosyntheseweg von Aminosäuren, deren
Bezugsdokument, sowie deren Bezeichnung im Bezugsdokument sind in
Tabelle 1 aufgelistet: Tabelle
1
Ein
weiteres Beispiel für
eine besonders bevorzugte Proteinsequenz und die entsprechenden
Nukleinsäuresequenz
kodierend dieses Protein aus dem Biosyntheseweg von Aminosäuren, ist
die Sequenz der Fructose-1,6-bisphosphatase 2, oder auch fbr2 genannt,
(SEQ. ID. NO. 8) und die entsprechenden Nukleinsäuresequenz kodierend eine Fructose-1,6-bisphosphatase
2 (SEQ. ID. NO. 7).
Ein
weiteres Beispiel für
eine besonders bevorzugte Proteinsequenz und die entsprechenden
Nukleinsäuresequenz
kodierend dieses Protein aus dem Biosyntheseweg von Aminosäuren, ist
die Sequenz des Proteins in Sulfat-Reduktion, oder auch RXA077 genannt,
(SEQ. ID. NO. 10) und die entsprechenden Nukleinsäuresequenz
kodierend ein Protein in Sulfat-Reduktion (SEQ. ID. NO. 9)
Weitere
besonders bevorzugte Proteinsequenzen aus dem Biosyntheseweg von
Aminosäuren,
weisen jeweils die in Tabelle 1 für dieses Protein angegebene
Aminosäuresequenz
auf, wobei das jeweilige Protein jeweils an mindestens einer der
in Tabelle 2/Spalte2 für
diese Aminosäuresequenz
angegebenen Aminosäurepositionen
eine andere proteinogene Aminosäure
aufweist als die jeweilige in Tabelle2/Spalte3 in der gleichen Zeile
angegebene Aminosäure.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform,
weisen die Proteine an mindestens einer der in Tabelle 2/Spalte
2 für die
Aminosäuresequenz
angegebenenen Aminosäureposition die
in Tabelle2/Spalte4 in der gleichen Zeile angegebene Aminosäure auf.
Es handelt sich bei den in Tabelle 2 angegebenen Proteine um mutierte
Proteine des Biosyntheseweges von Aminosäuren, die besonders vorteilhafte
Eigenschaften aufweisen und sich deshalb insbesondere zur Expression
der entsprechenden Nukleinsäuren
durch den erfinungsgemäßen Promotor
und zur Herstellung von Aminosäuren
eignen. Beispielsweise führt
die Mutation T311I zu einem Ausschalten der feedback-Inhibierung
von ask.
Die
entsprechenden Nukleinsäuren,
die ein vorstehend beschriebenes mutiertes Protein aus Tabelle 2
kodieren, lassen sich durch übliche
verfahren herstellen.
Als
Ausgangspunkt zur Herstellung der Nukleinsäuresequenzen kodierend ein
mutiertes Protein eignet sich beispielsweise das Genom eines Corynebacterium
glutamicum-Stammes,
der von der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung
ATCC 13032 erhältlich
ist oder die in Tabelle 1 in Bezug genommenen Nukleinsäuresequenzen.
Für die
Rückübersetzung
der Aminosäuresequenz
der mutierten Proteine in die Nukleinsäuresequenzen kodierend diese
Proteine ist es vorteilhaft, die codon usage desjenigen Organismus zu
verwenden, in den die Nukleinsäuresequenz
eingebracht werden soll oder in der die Nukleinsäuresequenz vorliegt. Beispielsweise
ist es vorteihaft für
Corynebakterium glutamicum die codon usage von Corynebakterium glutamicum
zu verwenden. Die codon usage des jeweiligen Organismus lässt sich
in an sich bekannter Weise aus Datenbanken oder Patentanmeldungen
ermitteln, die zumindest ein Protein und ein Gen, das dieses Protein
kodiert, aus dem gewünschten
Organismus beschreiben.
Die
Angaben in Tabelle 2 sind folgendermassen zu verstehen:
In
Spalte 1 "Identifikation" wird eine eindeutige
Bezeichnung für
jede Sequenz in Bezug auf Tabelle 1 aufgeführt.
In
Spalte 2 "AS-POS" bezieht sich die
jeweilige Zahl auf die Aminosäureposition
der entsprechenden Polypeptidsequenz aus Tabelle 1. Eine "26" in der Spalte "AS-POS" bedeutet demzufolge
die Aminosäureposition
26 der entsprechend angegebenen Polypeptidsequenz. Die Zählung der
Position beginnt N-Terminal bei +1.
In
Spalte 3 "AS-Wildtyp" bezeichnet der jeweilige
Buchstabe die Aminosäure – dargestellt
im Ein-Buchstaben-Code- an der in Spalte 2 angegebenen Position
beim entsprechenden Wildtyp-Stamm der Sequenz aus Tabelle 1.
In
Spalte 4 "AS-Mutante" bezeichnet der jeweilige
Buchstabe die Aminosäure – dargestellt
im Ein-Buchstaben-Code- an der in Spalte 2 angegebenen Position
beim entsprechenden Mutanten-Stamm.
In
Spalte 5 "Funktion" wird die physiologische
Funktion der entsprechenden Polypeptidsequenz aufgeführt.
Für ein mutiertes
Protein mit einer bestimmten Funktion (Spalte 5) und einer bestimmten
Ausgangsaminosäuresequenz
(Tabelle 1) werden in den Spalten 2,3 und 4 mindestens eine Mutation,
bei einigen Sequenzen auch mehrere Mutationen beschrieben. Diese
mehreren Mutationen beziehen sich immer auf die jeweils obenstehende,
nächstliegendste
Ausgangsaminosäuresequenz
(Tabelle 1). Unter dem Begriff „mindestens eine der Aminsäurepositionen" einer bestimmten
Aminosäuresequenz
wird vorzugsweise mindestens eine der für diese Aminosäuresequenz
in Spalte 2, 3 und 4 beschriebenen Mutationen verstanden.
Ein-Buchstaben-Code
der proteinogenen Aminosäuren:
- A
- Alanin
- C
- Cystein
- D
- Aspartat
- E
- Glutamat
- F
- Phenylalanin
- G
- Glycin
- H
- His
- I
- Isoleucin
- K
- Lysin
- L
- Leucin
- M
- Methionin
- N
- Asparagin
- P
- Prolin
- Q
- Glutamin
- R
- Arginin
- S
- Serin
- T
- Threonin
- V
- Valin
- W
- Tryptophan
- Y
- Tyrosin
In
den vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren zur Veränderung
oder Verursachung der Transkriptionsrate und/oder Expressionsrate
von Genen in Mikroorganismen sowie den nachstehend beschriebenen
Verfahren zur Herstellung von genetisch veränderten Mikroorganismen, den
nachstehend beschriebenen genetisch veränderten Mikroorganoismen und
den nachstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung von biosynthetischen
Produkten erfolgt das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, der erfindungsgemäßen Expressionseinheiten,
der vorstehend beschriebenen Gene und der vorstehend beschriebnen
Nukleinsäurekonstrukte
oder Expressionskasetten in den Mikroorganismus, insbeondere in
corynefome Bakterien, vorzugsweise durch die SacB-Methode.
Die
SacB-Methode ist dem Fachmann bekannt und beispielsweise in Schäfer A, Tauch
A, Jäger
W, Kalinowski J, Thierbach G, Pühler
A.; Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from
the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined
deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum, Gene.
1994 Jul 22;145(1):69-73 und Blomfield IC, Vaughn V, Rest RF, Eisenstein
BI.; Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis
sacB gene and a temperature-sensitive pSC101 replicon; Mol Microbiol.
1991 Jun;5(6):1447-57 beschrieben.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Veränderung
oder Verursachung der Transkriptionsrate und/oder Expressionsrate
von Genen in Mikroorganismen durch Einbringen von erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität
bzw. erfindungsgemäßen Expressionseinheiten
in den Mikroorganismus.
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Veränderung
oder Verursachung der Transkriptionsrate und/oder Expressionsrate
von Genen in Mikroorganismen durch Einbringen der vorstehend beschriebenen
Nukleinsäurekonstrukte
oder Expressionskasetten in den Mikroorganismus.
Die
Erfindung betrifft daher ferner eine Expressionskassette, umfassend
mindestens
eine erfindungsgemäße Expressionseinheit
mindestens
eine weitere, zu exprimierende Nukleinsäuresequenz, also ein zu exprimierendes
Gen und
gegebenenfalls weitere genetische Kontrollelemente,
wie beispielsweise einen Terminator,
wobei mindestens eine
Expressionseinheit und eine weitere, zu exprimierende, Nukleinsäuresequenz
funktionell miteinander verknüpft
sind und die weitere, zu exprimierende, Nukleinsäuresequenz in Bezug auf die
Expressionseinheit heterolog ist.
Vorzugsweise
ist die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz mindestens eine
Nukleinsäuren
kodierend ein Protein aus den Biosyntheseweg von Feinchemikalien.
Besonders
bevorzugt ist die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus
der Gruppe Nukleinsäuren
kodierend ein Protein aus den Biosyntheseweg von proteinogenen und
nicht-proteinogenen Aminosäuren,
Nukleinsäuren
kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Nukleotiden und
Nukleosiden, Nukleinsäuren
kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von organischen Säuren, Nukleinsäuren kodierend
ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Lipiden und Fettsäuren, Nukleinsäuren kodierend
ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Diolen, Nukleinsäuren kodierend
ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Konhlenhydraten, Nukleinsäuren kodierend
ein Protein aus dem Biosyntheseweg von aromatischen Verbindung, Nukleinsäuren kodierend
ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Vitaminen, Nukleinsäuren kodierend
ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Cofaktoren und Nukleinsäuren kodierend
ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Enzymen.
Bevorzugte
Proteine aus dem Biosyntheseweg von Aminosäuren sind vorstehend und deren
Beispiele in Tabelle 1 und 2 beschrieben.
In
den erfindungsgemäßen Expressionskassetten
ist die physikalische Lage der Expressionseinheit relativ zum zu
exprimierenden Gen so gewählt,
daß die
Expressioneinheit die Transkription und vorzugsweise auch die Translation
des zu exprimierenden Gens reguliert und damit die Bildung eines
oder mehrerer Proteine ermöglicht.
Die "Bildung ermöglichen" beinhaltet dabei
die konstitutive Steigerung der Bildung, Abschwächung bzw. Blockierung der
Bildung unter spezifischen Bedingungen und oder die Steigerung der
Bildung unter spezifischen Bedingungen. Die "Bedingungen" umfassen dabei: (1) Zugabe einer Komponente
zum Kulturmedium, (2) Entfernen einer fassen dabei: (1) Zugabe einer
Komponente zum Kulturmedium, (2) Entfernen einer Komponente vom
Kulturmedium, (3) Austausch einer Komponente im Kulturmedium durch
eine zweite Komponente, (4) Erhöhung
der Temperatur des Kulturmediums, (5) Erniedrigung der Temperatur
des Kulturmediums, und (6) Regulierung der atmosphärischen
Bedingungen, wie z.B. die Sauerstoff- oder Stickstoffkonzentration,
in der das Kulturmedium gehalten wird.
Die
Erfindung betrifft ferner einen Expressionsvektor enthaltend eine
vorstehend beschriebene, erfindungsgemäße Expressionskassette.
Vektoren
sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. N. et
al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen
werden. Unter Vektoren sind außer
Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie
beispielsweise Phagen, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare
oder zirkuläre
DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus
repliziert oder chromosomal repliziert werden.
Als
Plasmide eignen sich solche besonders bevorzugt, die in coryneformen
Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren,
wie z. B. pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology
(1989) 64: 549-554), pEKE×1
(Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et
al., Gene 107: 69-74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden
pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren, wie z. B. pCLiK5MCS,
oder solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160) oder pNG2 (Serwold-Davis et
al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)) oder pAG1 (US-A
5,158,891) beruhen, können
in gleicher Weise verwendet werden.
Weiterhin
eignen sich auch solche Plasmidvektoren mit Hilfe derer man das
Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom
anwenden kann, so wie es beispielsweise von Remscheid et al. (Applied
and Environmental Microbiology 60,126-132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation
des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird
das vollständige
Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise
E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen
beispielsweise pSUP301 (Sirnon et al., Bio/ Technology 1,784-791 (1983)), pK18mob
oder pK19mob (Schäfer
et al., Gene 145,69-73 (1994)), Bernard et al., Journal ofMolecular
Biology, 234: 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal
of Bacteriology 173: 4510--4516) oder pBGS8 (Spratt et al.,1986,
Gene 41: 337-342) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende
Gen enthält,
wird anschließend
durch Transformation in den gewünschten
Stamm von C. glutamicum überführt. Methoden
zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Ap plied
Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan
(Biotechnology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological
Letters 123,343-347 (1994)) beschrieben.
Die
Erfindung betrifft ferner einen genetisch verändertern Mikroorganismus, wobei
die genetische Veränderung
zu einer Veränderung
oder Verursachung der Transkriptionsrate von mindestens einem Gen
im Vergleich zum Wildtyp führt
und bedingt ist durch
- a) Veränderung
der spezifischen Promotoraktivität
im Mikroorganismus von mindestens einer endogenen Nukleinsäure mit
Promotoraktivität
gemäß Anspruch
1, die die Transkription mindestens eines endogenen Gens reguliert
oder
- b) Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganismus
durch Nukleinsäuren
mit Promotoraktivität gemäß Anspruch
1 oder durch Nukleinsäuren
mit Promotoraktivität
gemäß Anspruch
1 mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität
gemäß Ausführungsform
a), wobei die Gene in Bezug auf die Nukleinsäuren mit Promotoraktivität heterolog
sind.
Wie
vorstehend bei den Verfahren beschrieben, wird die Regulation der
Transkription von Genen im Mikroorganismus durch Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität
gemäß Anspruch
1 oder durch Nukleinsäuren
mit Promotoraktivität
gemäß Anspruch
1 mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität
gemäß Ausführungsform a)
dadurch erreicht, dass man
b1)
eine oder mehrere Nukleinsäuren
mit Promotoraktivität
gemäß Anspruch
1, gebenenfalls mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität,
in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Transkription
eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten
Nukleinsäure
mit Promotoraktivität
gemäß Anspruch
1, gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität,
erfolgt oder
b2)
ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt,
so dass die Transkription eines oder mehrerer der eingebrachten
Gene unter der Kontrolle der endogenen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch
1, gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität,
erfolgt oder
b3)
ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte,
enthaltend eine Nukleinsäure
mit Promotoraktivität
gemäß Anspruch
1, gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität,
und funktionell verknüpft
eine oder mehrere, zu transkribierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus
einbringt.
Die
Erfindung betrifft ferner eine genetisch verändertern Mikroorganismus mit
erhöhter
oder verursachter Transkriptionsrate von mindestens einem Gen im
Vergleich zum Wildtyp, wobei
- ah) die spezifische
Promotoraktivität
im Mikroorganismus von endogenen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch
1, die die Transkription von endogenen Genen regulieren, im Vergleich
zum Wildtyp erhöht
ist oder
- bh) die Transkription von Genen im Mikroorganismus durch Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität
gemäß Anspruch
1 oder durch Nukleinsäuren
mit erhöhter
spezifischer Promotoraktivität
gemäß Ausführungsform
ah) reguliert wird, wobei die Gene in Bezug auf die Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität
heterolog sind.
Wie
vorstehend bei den Verfahren beschrieben, wird die Regulation der
Transkription von Genen im Mikroorganismus durch Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität
gemäß Anspruch
1 oder durch Nukleinsäuren
mit Promotoraktivität
gemäß Anspruch
1 mit veränderter
spezifischer Promotoraktivität
gemäß Ausführungsform a)
dadurch erreicht, dass man
- bh1) eine oder mehrere
Nukleinsäuren
mit Promotoraktivität
gemäß Anspruch
1, gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Promotoraktivität,
in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Transkription eines
oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten
Nukleinsäure
mit Promotoraktivität,
gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Promotoraktivität,
erfolgt oder
- bh2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt,
so dass die Transkription eines oder mehrerer der eingebrachten
Gene unter der Kontrolle der endogenen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch
1, gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Promotoraktivität,
erfolgt oder
- bh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine
Nukleinsäure
mit Promotoraktivität
gemäß Anspruch
1, gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Promotoraktivität,
und funktionell verknüpft
eine oder mehrere, zu transkribierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus
einbringt.
Die
Erfindung betrifft ferner einen genetisch verändertern Mikroorganismus mit
reduzierter Transkriptionsrate von mindetstens einem Gen im Vergleich
zum Wildtyp, wobei
- ar)die spezifische Promotoraktivität im Mikroorganismus
von mindestens einer endogenen Nukleinsäure mit Promotoraktivität gemäß Anspruch
1, die die Transkription von mindestens einem, endogenen Gen reguliert,
im Vergleich zum Wildtyp reduziert ist oder
- br)eine oder mehrere Nukleinsäuren mit reduzierter Promotoraktivität gemäß Ausführungsform
a) in das Genom des Mikrorganismus eingebracht wurden, so dass die
Transkription mindestens eines endogenen Gens unter der Kontrolle
der eingebrachten Nukleinsäure
mit reduzierter Promotoraktivität
erfolgt.
Die
Erfindung betrifft ferner einen genetisch verändertern Mikroorganismus, wobei
die genetische Veränderung
zu einer Veränderung
oder Verursachung der Expressionsrate mindestens eines Gens im Vergleich zum
Wildtyp führt
und bedingt ist durch
- c) Veränderung
der spezifischen Expressionsaktivität im Mikroorganismus von mindestens
einer endogenen Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, die die
Expression mindestens eines endogenen Gens reguliert, im Vergleich
zum Wildtyp oder
- d) Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus durch
Expressionseinheiten gemäß Anspruch
2 oder 3 oder durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit veränderter
spezifischer Expressionsaktivität
gemäß Ausführungsform
a), wobei die Gene im Bezug auf die Expressionseinheiten heterolog
sind.
Wie
vorstehend bei den Verfahren beschrieben, wird die Regulation der
Expression von Genen im Mikroorganismus durch Expressionseinheiten
gemäß Anspruch
2 oder 3 oder durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit veränderter
spezifischer Expressionsaktivität
gemäß Ausführungsform
a) dadurch erreicht, dass man
- d1) eine oder
mehrere Expressionseinheiten gemäß Anspruch
2 oder 3, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer
Expressionsaktivität,
in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Expression
eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten
Expressionseinheiten gemäß Anspruch
2 oder 3, gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Expressionsaktivität,
erfolgt oder
- d2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt,
so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene
unter der Kontrolle der endogenen Expressionseinheiten gemäß Anspruch
2 oder 3, gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Expressionsaktivität,
erfolgt oder
- d3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine
Expressionseinheit gemäß Anspruch
2 oder 3, gegebenenfalls mit veränderter
spezifischer Expressionsakti vität,
und funktionell verknüpft
eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus
einbringt.
Die
Erfindung betrifft ferner einen genetisch verändertern Mikroorganismus mit
erhöhter
oder verursachter Expressionsrate mindestens eines Gens im Vergleich
zum Wildtyp, wobei man
- ch) die spezifische
Expressionsaktivität
im Mikroorganismus von mindestens einer endogenen Expressionseinheiten
gemäß Anspruch
2 oder 3, die die Expression der endogenen Gene reguliert, im Vergleich zum
Wildtyp erhöht
oder
- dh) die Expression von Genen im Mikroorganismus durch Expressionseinheiten
gemäß Anspruch
2 oder 3 oder durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit erhöhter spezifischer
Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform
a) reguliert, wobei die Gene im Bezug auf die Expressionseinheiten
heterolog sind.
Wie
vorstehend bei den Verfahren beschrieben, wird die Regulation der
Expression von Genen im Mikroorganismus durch Expressionseinheiten
gemäß Anspruch
2 oder 3 oder durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit erhöhter spezifischer
Expressionsaktivität
gemäß Ausführungsform
a) dadurch erreicht, dass man
- dh 1) eine oder
mehrere Expressionseinheiten gemäß Anspruch
2 oder 3, gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität,
in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Expression
eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten
Expressionseinheiten gemäß Anspruch
2 oder 3, gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität,
erfolgt oder
- dh2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt,
so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene
unter der Kontrolle der endogenen Expressionseinheiten gemäß Anspruch
2 oder 3, gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität,
erfolgt oder
- dh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine
Expressionseinheit gemäß Anspruch
2 oder 3, gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität,
und funktionell verknüpft
eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus
einbringt.
Die
Erfidnung betrifft ferner einen genetisch verändertern Mikroorganismus mit
reduzierter Expressionsrate von mindetstens einem Gen im Vergleich
zum Wildtyp, wobei,
- cr)die spezifische Expressionsaktivität im Mikroorganismus
von mindestens einer endogenen Expressionseinheit gemäß Anspruch
2 oder 3, die die Expression von mindestens einem edogenen Gen reguliert,
im Vergleich zum Wildtyp reduziert ist oder
- dr)eine oder mehrere Expressionseinheiten gemäß Anspruch
2 oder 3 mit reduzierter Expressionsaktivität in das Genom des Mikrorganismus
eingebracht wurden, so dass die Expression mindestens eines Gens unter
der Kontrolle der eingebrachten Expressionseinheit gemäß Anspruch
2 oder 3 mit reduzierter Expressionsaktivität erfolgt.
Ferner
betrifft die Erfindung einen genetisch veränderter Mikroorganismus, enthaltend
eine Expressionseinheit gemäß Anspruch
2 oder 3 und funktionell verknüpft
ein zu eprimierendes Gen, wobei das Gen im Bezug auf die Expressionseinheit
heterolog ist.
Besonders
bevorzugt enthält
dieser genetisch veränderte
Mikroorganismus eine erfindungsgemäße Expressionskasette.
Besonders
bevorzugt betrifft die vorliegende Erfindung gentisch veränderte Mikroorgansismen,
insbesondere coryneforme Bakterien, die einen Vektor, insbesondere
Pendelvektor oder Plasmidvektor, der wenigstens ein rekombinantes
Nukleinsäurekonstrukt
erfindungsgemäßer Definition
trägt,
enthalten.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
der genetisch veränderten
Mikroorganismen sind die vorstehend beschriebenen Gene mindestens
eine Nukleinsäuren
kodierend ein Protein aus den Biosyntheseweg von Feinchemikalien.
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der genetisch veränderten
Mikroorganismen sind die vorstehend beschriebenen Gene ausgewählt sind
aus der Gruppe Nukleinsäuren
kodierend ein Protein aus den Biosyntheseweg von proteinogenen und
nicht-proteinogenen Aminosäuren,
Nukleinsäuren
kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Nukleotiden und
Nukleosiden, Nukleinsäuren
kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von organischen Säuren, Nukleinsäuren kodierend
ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Lipiden und Fettsäuren, Nukleinsäuren kodierend
ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Diolen, Nukleinsäuren kodierend
ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Konhlenhydraten, Nukleinsäuren kodierend
ein Protein aus dem Biosyntheseweg von aromatischen Verbindung,
Nukleinsäuren
kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Vitaminen, Nukleinsäuren kodierend
ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Cofaktoren und Nukleinsäuren kodierend
ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Enzymen, wobei die Gene gegebenenfalls
weitere Regulationselemente enthalten können.
Bevorzugte
Proteine aus dem Biosyntheseweg von Aminosäuren sind ausgewählt aus
der Gruppe Aspartatkinase, Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase, Diaminopimelat-Dehydrogenase, Diaminopimelat-Decarboxylase,
Dihydrodipicolinate-Synthetase, Dihydrodipicolinate-Reduktase, Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase,
3-Phosphoglycerat-Kinase,
Pyruvat-Carboxylase, Triosephosphat-Isomerase, Transkriptioneller
Regulator LuxR, Transkriptioneller Regulator LysR1, Transkriptioneller
Regulator LysR2, Malat-Quinon-Oxidoreduktase, Glucose-6-Phosphat-Deydrogenase,
6-Phosphogluconat-Dehydrognease, Transketolase,
Transaldolase, Homoserin-O-Acetyltransferase,
Cystahionin-gamma-Synthase, Cystahionin-beta-Lyase, Serin-Hydroxymethyltransferase,
O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase, Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase, Phosphoserin-Aminotransferase,
Phosphoserin-Phosphatase,
Serin-Acetyl-Transferase, Homoserin-Dehydrogenase, Homoserin-Kinase, Threonin-Synthase,
Threonin-Exporter-Carrier, Threonin-Dehydratase, Pyruvat-Oxidase,
Lysin-Exporter, Biotin-Ligase, Cystein-Synthasel, Cystein-Synthase
II Coenzym B12-abhängige
Methionin-Synthase, Coenzym B12-unabhängige Methionin-Synthase-Aktivität, Sulfatadenyltransferase
Untereinheit 1 und 2, Phosphoadenosin Phosphosulfat Reduktase, Ferredoxin-sulfit-reductase, Ferredoxin
NADP Reduktase, 3-Phosphoglycerat Dehydrogenase, RXA00655 Regulator,
RXN2910-Regulator, Arginyl-t-RNA-Synthetase, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase,
Threonin Efflux-Protein, Serinhydroxymethyltransferase, Fruktose-1,6-bisphosphatase,
Protein der Sulfat-Reduktion
RXA077, Protein der Sulfat-Reduktion RXA248, Protein der Sulfat-Reduktion RXA247,
Protein OpcA, 1-Phosphofruktokinase und 6-Phosphofruktokinase Besonders
bevorzugte Beispiele der Proteine und Gene aus dem Biosyntheseweg
von Aminosäuren
sind vorstehend in Tabelle 1 und Tabelle 2 beschrieben.
Bevorzugte
Mikroorganismen oder genetisch veränderte Mikroorganismen sind
Bakterien, Algen, Pilze oder Hefen.
Besonders
bevorzugte Mikroorgansimen sind insbeondere coryneforme Bakterien.
Bevorzugte
coryneforme Bakterien sind Bakterien der Gattung Corynebacterium,
insbesondere der Arten Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium
acetoglutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium
thermoaminogenes, Corynebacterium melassecola und Corynebacterium
efficiens oder der Gattung Brevibacterium,insbesondere der Arten
Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum und Brevibacterium
divaricatum.
Besonders
bevorzugte Bakterien der Gattungen Corynebacterium und Brevibacterium
sind ausgewählt
aus der Gruppe Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Coryne bacterium
acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC
13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Corynebacterium
melassecola ATCC 17965, Corynebacterium efficiens DSM 44547, Corynebacterium
efficiens DSM 44548. Corynebacterium efficiens DSM 44549, Brevibacterium
flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Brevibacterium
divaricatum ATCC 14020, Corynebacterium glutamicum KFCC10065 und
Corynebacterium glutamicum ATCC21608.
Mit
der Abkürzung
KFCC ist die Korean Federation of Culture Collection gemeint, mit
der Abkürzung ATCC
die American type strain culture collection, mit der Abkürzung DSM
die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen.
Weitere
besonders bevorzugte Bakterien der Gattungen Corynebacterium und
Brevibacterium sind in Tabelle 3 aufgelistet:
Die
Abkürzungen
haben folgende Bedeutung:
- ATCC:
- American Type Culture
Collection, Rockville, MD, USA
- FERM:
- Fermentation Research
Institute, Chiba, Japan
- NRRL:
- ARS Culture Collection,
Northern Regional Research Laboratory, Peoria, IL, USA
- CECT:
- Coleccion Espanola
de Cultivos Tipo, Valencia, Spain
- NCIMB:
- National Collection
of Industrial and Marine Bacteria Ltd., Aberdeen, UK
- CBS:
- Centraalbureau voor
Schimmelcultures, Baarn, NL
- NCTC:
- National Collection
of Type Cultures, London, UK
- DSMZ:
- Deutsche Sammlung
von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Germany
Durch
die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität
und den erfindungsgemäßen Expressionseinheiten
ist es mit Hilfe der vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Verfahren
möglich
in den vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen genetisch veränderten
Mikroorganismen die Stoffwechselwege zu spezifischen biosynthetischen
Produkten zu regulieren.
Dazu
werden beispielsweise Stoffwechselwege die zu einem spezifischen
biosynthetischen Produkt führen
durch Verursachung oder Erhöhung
der Transkriptionrate bzw. Expressionsrate von Genen dieses Biosyntheseweges
verstärkt
in dem die erhöhte
Proteinmenge zu einer erhöhten
Gesamtaktivität
dieser Proteine des gewünschten Biosyntheseweges
und damit zu einem verstärkten
Stoffwechselfluß zu
dem gewünschen biosynthetischen
Produkt führt.
Weiterhin
können
Stoffwechselwege die von einem spezifischen biosynthetischen Produkt
wegführen durch
Reduzierung der Transkriptionrate bzw. Expressionsrate von Genen
dieses wegführenden
Biosyntheseweges abgeschwächt
werden in dem die reduzierte Proteinmenge zu einer reduzierten Gesamtaktivität dieser Proteine
des unerwünschten
Biosyntheseweges und damit zusätzlich
zu einem verstärkten
Stoffwechselfluß zu
dem gewünschen
biosynthetischen Produkt führt.
Die
erfindungsgemäßen genetisch
veränderten
Mikroorganismen sind beispielsweise in der Lage aus Glucose, Saccharose,
Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin
und Ethanol biosynthetische Produkte herzustellen.
Die
Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von biosynthetischen
Produkten durch Kultivierung von erfindungsgemäßen, genetisch veränderten
Mikroorganismen.
Je
nach gewünschtem
biosynthetischen Produkt muss die Transkriptionsrate bzw. Expressionsrate verschiedener
Gene erhöht
bzw. reduziert werden. In der Regel ist es vorteilhaft die Transkrioptionsrate
bzw. Expressionsrate mehrere Gene zu verändern, d.h. die Transkrioptionsrate
bzw. Expressionsrate einer Kombination von Gene zu Erhöhen und/oder
die Transkrioptionsrate bzw. Expressionsrate einer Kombination von Gene
zu reduzieren.
In
den erfindungsgemäßen genetisch
veränderten
Mikroorganismen ist mindestens eine veränderte, dass heißt erhöhte oder
reduzierte Transkriptionsrate bzw. Expressionsrate eines Gens auf
eine erfindungsgemäße Nukleinsäure mit
Promotoraktivität
bzw. erfindungsgemäße Expressionseinheit
zurückzuführen.
Weitere,
zusätzliche
veränderte,
d.h. zusätzlich
erhöhte
oder zusätzlich
reduzierte Transkriptionsraten bzw. Expressionsraten von weiteren
Genen im genetisch veränderten
Mikroorganismus können,
müssen
aber nicht auf die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit
Promotoraktivität
bzw. die erfindungsgemäßen Expressionseinheiten
zurück
gehen.
Die
Erfindung betrifft deshalb weiterhin ein Verfahren zur Herstellung
von biosynthetischen Produkten durch Kultivierung von erfindungsgemäßen, genetisch
veränderten
Mikroorganismen.
Bevorzugte
biosynthetische Produkte sind Feinchemikalien.
Der
Begriff "Feinchemikalie" ist im Fachgebiet
bekannt und beinhaltet Verbidnungen, die von einem Organismus produziert
werden und in verschiedenen Industriezweigen Anwendungen finden,
wie bspw., jedoch nicht beschränkt
auf die pharmazeutische Industrie, die Landwirtschafts-, Kosmetik
, Food und Feed-Industrie. Diese Verbindungen umfassen organische
Säuren,
wie beispielsweise Weinsäure,
Itaconsäure
und Diaminopimelinsäure,
sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Purin-
und Pyrimidinbasen, Nukleoside und Nukleotide (wie bspw. beschrieben
in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, S. 561-612,
in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH: Weinheim und den
darin enthaltenen Zitaten), Lipide, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren (bspw.
Arachidonsäure),
Diole (bspw. Propandiol und Butandiol), Kohlenhydrate (bspw. Hyaluronsäure und
Trehalose), aromatische Verbindungen (bspw. aromatische Amine, Vanillin
und Indigo), Vitamine und Cofaktoren (wie beschrieben in Ullmann's Encyclopedia of
Industrial Chemistry, Bd. A27, "Vitamins", S. 443-613 (1996)
VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten; und Ong, A.S.,
Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition,
Lipids, Health and Disease" Proceedings
of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations
in Malaysia and the Society for Free Radical Research – Asien,
abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malysia, AOCS Press (1995)),
Enzyme und sämtliche
anderen von Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data
Corporation, ISBN: 0818805086 und den darin angegebenen Literaturstellen,
beschriebenen Chemikalien. Der Metabolismus und die Verwendungen
bestimmter Feinchemikalien sind nachstehend weiter erläutert.
1. Aminosäure-Metabolismus
und Verwendungen
Die
Aminosäuren
umfassen die grundlegenden Struktureinheiten sämtlicher Proteine und sind
somit für
die normalen Zellfunktionen essentiell. Der Begriff "Aminosäure" ist im Fachgebiet
bekannt. Die proteinogenen Aminosäuren, von denen es 20 Arten
gibt, dienen als Struktureinheiten für Proteine, in denen sie über Peptidbindungen
miteinander verknüpft
sind, wohingegen die nicht-proteinogenen Aminosäuren (von denen Hunderte bekannt
sind) gewöhnlich
nicht in Proteinen vorkommen (siehe Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry,
Bd. A2, S. 57-97 VCH: Weinheim (1985)). Die Aminosäuren können in
der D- oder L-Konfiguration vorliegen, obwohl L-Aminosäuren gewöhnlich der
einzige Typ sind, den man in natürlich
vorkommenden Proteinen vorfindet. Biosynthese- und Abbauwege von
jeder der 20 proteinogenen Aminosäuren sind sowohl bei prokaryotischen
als auch eukaryotischen Zellen gut charakterisiert (siehe bspw.
Stryer, L. Biochemistry, 3. Auflage, S. 578-590 (1988)). Die "essentiellen" Aminosäuren (Histidin,
Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan
und Valin), so bezeichnet, da sie aufgrund der Komplexität ihrer
Biosynthese mit der Ernährung
aufgenommen werden müssen,
werden durch einfache Biosyntheseswege in die übrigen 11 "nichtessentiellen" Aminosäuren (Alanin, Arginin, Asparagin,
Aspartat, Cystein, Glutamat, Glutamin, Glycin, Prolin, Serin und
Tyrosin) umgewandelt. Höhere
Tiere besitzen die Fähigkeit,
einige dieser Aminosäuren
zu synthetisieren, jedoch müssen
die essentiellen Aminosäuren
mit der Nahrung aufgenommen werden, damit eine normale Proteinsynthese
stattfindet.
Abgesehen
von ihrer Funktion bei der Proteinbiosynthese sind diese Aminosäuren interessante
Chemikalien an sich, und man hat entdeckt, daß viele bei verschiedenen Anwendungen
in der Nahrungsmittel-, Futter-, Chemie-, Kosmetik-, Landwirtschafts-
und pharmazeutischen Industrie zum Einsatz kommen. Lysin ist nicht
nur für
die Ernährung
des Menschen eine wichtige Aminosäure, sondern auch für monogastrische
Tiere, wie Geflügel
und Schweine. Glutamat wird am häufigsten
als Geschmacksadditiv (Mononatriumglutamat, MSG) sowie weithin in
der Nahrungsmittelindustrie verwendet, wie auch Aspartat, Phenylalanin,
Glycin und Cystein. Glycin, L-Methionin und Tryptophan werden sämtlich in
der pharmazeutischen Industrie verwendet. Glutamin, Valin, Leucin,
Isoleucin, Histidin, Arginin, Prolin, Serin und Alanin werden in
der pharmazeutischen Industrie und der Kosmetikindustrie verwendet.
Threonin, Tryptophan und D-/L-Methionin
sind weitverbreitete Futtermittelzusätze (Leuchtenberger, W. (1996)
Amino acids – technical
production and use, S. 466-502 in Rehm et al., (Hrsg.) Biotechnology
Bd. 6, Kapitel 14a, VCH: Weinheim). Man hat entdeckt, daß sich diese
Aminosäuren
außerdem
als Vorstufen für
die Synthese von synthetischen Aminosäuren und Proteinen, wie N-Acetylcystein,
S-Carboxymethyl-L-cystein, (S)-5-Hydroxytryptophan und anderen,
in Ullmann's Encyclopedia
of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97, VCH, Weinheim, 1985 beschriebenen
Substanzen eignen.
Die
Biosynthese dieser natürlichen
Aminosäuren
in Organismen, die sie produzieren können, bspw. Bakterien, ist
gut charakterisiert worden (für
einen Überblick
der bakteriellen Aminosäure-Biosynthese
und ihrer Regulation, s. Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem.
47: 533 – 606).
Glutamat wird durch reduktive Aminierung von α-Ketoglutarat, einem Zwischenprodukt
im Citronensäure-Zyklus,
synthetisiert. Glutamin, Prolin und Arginin werden jeweils nacheinander
aus Glutamat erzeugt. Die Biosynthese von Serin erfolgt in einem Dreischritt-Verfahren
und beginnt mit 3-Phosphoglycerat (einem Zwischenprodukt bei der
Glykolyse), und ergibt nach Oxidations-, Transaminierungs- und Hydrolyseschritten
diese Aminosäure.
Cystein und Glycin werden jeweils aus Serin produziert, und zwar
die erstere durch Kondensation von Homocystein mit Serin, und die letztere
durch Übertragung
des Seitenketten-β-Kohlenstoffatoms
auf Tetrahydrofolat, in einer durch Serintranshydroxymethylase katalysierten
Reaktion. Phenylalanin und Tyrosin werden aus den Vorstufen des
Glycolyse- und Pento sephosphatweges, Erythrose-4-Phosphat und Phosphoenolpyruvat
in einem 9-Schritt-Biosyntheseweg
synthetisiert, der sich nur in den letzten beiden Schritten nach
der Synthese von Prephenat unterscheidet. Tryptophan wird ebenfalls
aus diesen beiden Ausgangsmolekülen
produziert, jedoch erfolgt dessen Synthese in einem 11-Schritt-Weg. Tyrosin läßt sich
in einer durch Phenylalaninhydroxylase katalysierten Reaktion auch aus
Phenylalanin herstellen. Alanin, Valin und Leucin sind jeweils Biosyntheseprodukte
aus Pyruvat, dem Endprodukt der Glykolyse. Aspartat wird aus Oxalacetat,
einem Zwischenprodukt des Citratzyklus, gebildet. Asparagin, Methionin,
Threonin und Lysin werden jeweils durch Umwandlung von Aspartat
produziert. Isoleucin wird aus Threonin gebildet. In einem komplexen
9-Schritt-Weg erfolgt die Bildung von Histidin aus 5-Phosphoribosyl-1-pyrophosphat,
einem aktivierten Zucker.
Aminosäuren, deren
Menge den Proteinbiosynthesebedarf der Zelle übersteigt, können nicht
gespeichert werden, und werden stattdessen abgebaut, so daß Zwischenprodukte
für die
Haupt-Stoffwechselwege der Zelle bereitgestellt werden (für einen Überblick
siehe Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl. Kap. 21 "Amino Acid Degradation
and the Urea Cycle";
S 495-516 (1988)). Die Zelle ist zwar in der Lage, ungewünschte Aminosäuren in
nützliche
Stoffwechsel-Zwischenprodukte umzuwandeln, jedoch ist die Aminosäureproduktion
hinsichtlich der Energie, der Vorstufenmoleküle und der für ihre Synthese
nötigen
Enzyme aufwendig. Es überrascht daher
nicht, daß die
Aminosäure-Biosynthese durch
Feedback-Hemmung reguliert wird, wobei das Vorliegen einer bestimmten
Aminosäure
ihre eigene Produktion verlangsamt oder ganz beendet (für einen Überblick über den
Rückkopplungs-Mechanismus
bei Aminosäure-Biosynthesewegen,
siehe Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl., Kap. 24, "Biosynthesis of Amino
Acids and Heme",
S. 575-600 (1988)). Der Ausstoß einer
bestimmten Aminosäure
wird daher durch die Menge dieser Aminosäure in der Zelle eingeschränkt.
II. Vitamine, Cofaktoren
und Nutrazeutika-Metabolismus sowie Verwendungen
Vitamine,
Cofaktoren und Nutrazeutika umfassen eine weitere Gruppe von Molekülen. Höhere Tiere haben
die Fähigkeit
verloren, diese zu synthetisieren und müssen sie somit aufnehmen, obwohl
sie leicht durch andere Organismen, wie Bakterien, synthetisiert
werden. Diese Moleküle
sind entweder biologisch aktive Moleküle an sich oder Vorstufen von
biologisch aktiven Substanzen, die als Elektronenträger oder
Zwischenprodukte bei einer Reihe von Stoffwechselwegen dienen. Diese
Verbindungen haben neben ihrem Nährwert
auch einen signifikanten industriellen Wert als Farbstoffe, Antioxidantien
und Katalysatoren oder andere Verarbeitungs-Hilfsstoffe. (Für einen Überblick über die
Struktur, Aktivität
und die industriellen Anwendungen dieser Verbindungen siehe bspw.
Ullmann's Encyclopedia
of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH:
Weinheim, 1996). Der Begriff "Vitamin" ist im Fachgebiet
bekannt und umfaßt
Nährstoffe,
die von einem Organismus für
eine normale Funktion benötigt
werden, jedoch nicht von diesem Organismus selbst synthetisiert
werden können.
Die Gruppe der Vitamine kann Cofaktoren und nutrazeutische Verbindungen
umfassen. Der Begriff "Cofaktor" umfaßt nicht-proteinartige
Verbindungen, die für
das Auftreten einer normalen Enzymaktivität nötig sind. Diese Verbindungen
können
organisch oder anorganisch sein; die erfindungsgemäßen Cofaktor-Moleküle sind
vorzugsweise organisch. Der Begriff "Nutrazeutikum" umfaßt Nahrungsmittelzusätze, die bei
Pflanzen und Tieren, insbesondere dem Menschen, gesundheitsfördernd sind.
Beispiele solcher Moleküle sind
Vitamine, Antioxidantien und ebenfalls bestimmte Lipide (z.B. mehrfach
ungesättigte
Fettsäuren).
Die
Biosynthese dieser Moleküle
in Organismen, die zu ihrer Produktion befähigt sind, wie Bakterien, ist
umfassend charakterisiert worden (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613,
VCH: Weinheim, 1996, Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An
Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A.S.,
Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition,
Lipids, Health and Disease" Proceedings
of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations
in Malaysia and the Society for free Radical Research – Asien,
abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press,
Champaign, IL X, 374 S).
Thiamin
(Vitamin B,) wird durch chemisches Kuppeln von Pyrimidin und Thiazol-Einheiten gebildet.
Riboflavin (Vitamin B2) wird aus Guanosin-5'-triphosphat (GTP)
und Ribose-5'-phosphat
synthetisiert. Riboflavin wiederum wird zur Synthese von Flavinmononukleotid
(FMN) und Flavinadeniridinukleotid (FAD) eingesetzt. Die Familie
von Verbindungen, die gemeinsam als "Vitamin B6" bezeichnet werden (bspw. Pyridoxin,
Pyridoxamin, Pyridoxal-5'-phosphat
und das kommerziell verwendete Pyridoxinhydrochlorid), sind alte
Derivate der gemeinsamen Struktureinheit 5-Hydroxy-6-methylpyridin. Panthothenat
(Pantothensäure,
R-(+)-N-(2,4-Dihydroxy-3,3-dimethyl-1-oxobutyl)-β-alanin) kann entweder durch
chemische Synthese oder durch Fermentation hergestellt werden. Die
letzten Schritte bei der Pantothenat-Biosynthese bestehen aus der
ATP-getriebenen Kondensation von β-Alanin
und Pantoinsäure.
Die für
die Biosyntheseschritte für
die Umwandlung in Pantoinsäure,
in β-Alanin
und zur Kondensation in Pantothensäure verantwortlichen Enzyme
sind bekannt. Die metabolisch aktive Form von Pantothenat ist Coenzym
A, dessen Biosynthese über
5 enzymatische Schritte verläuft.
Pantothenat, Pyridoxal-5'-phosphat,
Cystein und ATP sind die Vorstufen von Coenzym A. Diese Enzyme katalysieren
nicht nur die Bildung von Pantothenat, sondern auch die Produktion
von (R)-Pantoinsäure, (R)-Pantolacton,
(R)-Panthenol (Provitamin B5), Pantethein
(und seinen Derivaten) und Coenzym A.
Die
Biosynthese von Biotin aus dem Vorstufenmolekül Pimeloyl-CoA in Mikroorganismen
ist ausführlich
untersucht worden, und man hat mehrere der beteiligten Gene identifiziert.
Es hat sich herausgestellt, daß viele
der entsprechenden Proteine an der Fe-Cluster-Synthese beteiligt
sind und zu der Klasse der nifS-Proteine gehören. Die Liponsäure wird
von der Octanonsäure
abgeleitet und dient als Coenzym beim Energie-Metabolismus, wo sie
Bestandteil des Pyruvatdehydrogenasekomplexes und des α-Ketoglutaratdehydrogenasekomplexes
wird. Die Folate sind eine Gruppe von Substanzen, die alle von der
Folsäure
abgeleitet werden, die wiederum von L-Glutaminsäure, p-Aminobenzoesäure und
6-Methylpterin hergeleitet ist. Die Biosynthese der Folsäure und
ihrer Derivate, ausgehend von den metabolischen Stoffwechselzwischenprodukten
Guanosin-5'-triphosphat
(GTP), L-Glutaminsäure
und p-Aminobenzoesäure ist
in bestimmten Mikroorganismen eingehend untersucht worden.
Corrinoide
(wie die Cobalamine und insbesondere Vitamin B12)
und die Porphyrine gehören
zu einer Gruppe von Chemikalien, die sich durch ein Tetrapyrrol-Ringsystem
auszeichnen. Die Biosynthese von Vitamin B12 ist
hinreichend komplex, daß sie
noch nicht vollständig
charakterisiert worden ist, jedoch ist inzwischen ein Großteil der
beteiligten Enzyme und Substrate bekannt. Nikotinsäure (Nikotinat)
und Nikotinamid sind Pyridin-Derivate, die auch als "Niacin" bezeichnet werden.
Niacin ist die Vorstufe der wichtigen Coenzyme NAD (Nikotinamidadenindinukleotid)
und NADP (Nikotinamidadenindinukleotidphosphat) und ihrer reduzierten
Formen.
Die
Produktion dieser Verbindungen im Großmaßstab beruht größtenteils
auf zellfreien chemischen Synthesen, obwohl einige dieser Chemikalien
ebenfalls durch großangelegte
Anzucht von Mikroorganismen produziert worden sind, wie Riboflavin,
Vitamin B6, Pantothenat und Biotin. Nur
Vitamin B12 wird aufgrund der Komplexität seiner
Synthese lediglich durch Fermentation produziert. In-vitro-Verfahren
erfordern einen erheblichen Aufwand an Materialien und Zeit und
häufig
an hohen Kosten.
III.
Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid- und Nukleotid-Metabolismus und Verwendungen
Gene
für den
Purin- und Pyrimidin-Stoffwechsel und ihre entsprechenden Proteine
sind wichtige Ziele für
die Therapie von Tumorerkrankungen und Virusinfektionen. Der Begriff "Purin" oder "Pyrimidin" umfaßt stickstoffhaltige
Basen, die Bestandteil der Nukleinsäuren, Coenzyme und Nukleotide
sind. Der Begriff "Nukleotid" beinhaltet die grundlegenden
Struktureinheiten der Nukleinsäuremoleküle, die
eine stickstoffhaltige Base, einen Pentose-Zucker (bei RNA ist der
Zucker Ribose, bei DNA ist der Zucker D-Desoxyribose) und Phosphorsäure umfassen.
Der Begriff "Nukleosid" umfaßt Moleküle, die
als Vorstufen von Nukleotiden dienen, die aber im Gegensatz zu den
Nukleotiden keine Phosphorsäureeinheit
aufweisen. Durch Hemmen der Biosynthese dieser Mole küle oder
ihrer Mobilisation zur Bildung von Nukleinsäuremolekülen ist es möglich, die
RNA- und DNA-Synthese zu hemmen; wird diese Aktivität zielgerichtet
bei kanzerogenen Zellen gehemmt, läßt sich die Teilungs- und Replikations-Fähigkeit
von Tumorzellen hemmen.
Es
gibt zudem Nukleotide, die keine Nukleinsäuremoleküle bilden, jedoch als Energiespeicher
(d.h. AMP) oder als Coenzyme (d.h. FAD und NAD) dienen.
Mehrere
Veröffentlichungen
haben die Verwendung dieser Chemikalien für diese medizinischen Indikationen
beschrieben, wobei der Purin- und/oder Pyrimidin-Metabolismus beeinflußt wird
(bspw. Christopherson, R.I. und Lyons, S.D. (1990) "Potent inhibitors
of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic
agents", Med. Res.
Reviews 10: 505-548). Untersuchungen an Enzymen, die am Purin- und Pyrimidin-Metabolismus
beteiligt sind, haben sich auf die Entwicklung neuer Medikamente
konzentriert, die bspw. als Immunsuppressionsmittel oder Antiproliferantien
verwendet werden können
(Smith, J.L. "Enzymes
in Nucleotide Synthesis" Curr.
Opin. Struct. Biol. 5 (1995) 752-757; Biochem. Soc. Transact. 23
(1995) 877-902). Die Purin- und
Pyrimidinbasen, Nukleoside und Nukleotide haben jedoch auch andere
Einsatzmöglichkeiten: als
Zwischenprodukte bei der Biosysnthese verschiedener Feinchemikalien
(z.B. Thiamin, S-Adenosyl-methionin, Folate oder Riboflavin), als
Energieträger
für die
Zelle (bspw. ATP oder GTP) und für
Chemikalien selbst, werden gewöhnlich
als Geschmacksverstärker
verwendet (bspw. IMP oder GMP) oder für viele medizinische Anwendungen
(siehe bspw. Kuninaka, A., (1996) "Nucleotides and Related Compounds in
Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH: Weinheim, S. 561-612).
Enzyme, die am Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid- oder Nukleotid-Metabolismus
beteiligt sind, dienen auch immer stärker als Ziele, gegen die Chemikalien
für den
Pflanzenschutz, einschließlich
Fungiziden, Herbiziden und Insektiziden entwickelt werden.
Der
Metabolismus dieser Verbindungen in Bakterien ist charakterisiert
worden (für Übersichten
siehe bspw. Zalkin, H. und Dixon, J.E. (1992) "De novo purin nucleotide biosynthesis" in Progress in Nucleic
Acids Research and Molecular biology, Bd. 42, Academic Press, S.
259-287; und Michal, G. (1999) "Nucleotides
and Nucleosides";
Kap. 8 in : Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular
Biology, Wiley, New York). Der Purin-Metabolismus, das Objekt intesiver
Forschung, ist für
das normale Funktionieren der Zelle essentiell. Ein gestörter Purin-Metabolismus
in höheren
Tieren kann schwere Erkrankungen verursachen, bspw. Gicht. Die Purinnukleotide
werden über
eine Reihe von Schritten über
die Zwischenverbindung Inosin-5'-phosphat
(IMP) aus Ribose-5-phosphat synthetisiert, was zur Produktion von
Guanosin-5'-monophosphat (GMP) oder
Adenosin-5'-monophosphat
(AMP) führt,
aus denen sich die als Nukleotide verwendeten Triphosphatformen
leicht herstellen lassen. Diese Ver bindungen werden auch als Energiespeicher
verwendet, so daß ihr
Abbau Energie für
viele verschiedene biochemische Prozesse in der Zelle liefert. Die
Pyrimidinbiosynthese erfolgt über
die Bildung von Uridin-5'-monophosphat
(UMP) aus Ribose-5-phosphat. UMP wiederum wird in Cytidin-5'-triphosphat (CTP)
umgewandelt. Die Desoxyformen sämtlicher
Nukleotide werden in einer Einschritt-Reduktionsreaktion aus der
Diphosphat-Riboseform des Nukleotides zur Diphosphat-Desoxyriboseform
des Nukleotides hergestellt. Nach der Phosphorylierung können diese
Moleküle
an der DNA-Synthese teilnehmen.
IV. Trehalose-Metabolismus
und Verwendungen
Trehalose
besteht aus zwei Glucosemolekülen,
die über α,α-1,1-Bindung
miteinander verknüpft
sind. Sie wird gewöhnlich
in der Nahrungsmittelindustrie als Süßstoff, als Additiv für getrocknete
oder gefrorene Nahrungsmittel sowie in Getränken verwendet. Sie wird jedoch
auch in der pharmazeutischen Industrie, der Kosmetik- und Biotechnologie-Industrie
angewendet (s. bspw. Nishimoto et al., (1998) US-Patent Nr. 5 759 610;
Singer, M.A. und Lindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467;
Paiva, C.L.A. und Panek, A.D. Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314;
und Shiosaka, M. J. Japan 172 (1997) 97-102). Trehalose wird durch
Enzyme von vielen Mikroorganismen produziert und auf natürliche Weise
in das umgebende Medium abgegeben, aus dem sie durch im Fachgebiet
bekannte Verfahren gewonnen werden kann.
Besonders
bevorzugte biosynthetische Produkte sind ausgewählt aus der Gruppe organische
Säuren, Proteine,
Nukleotide und Nukleoside, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene
Aminosäuren,
Lipide und Fettsäuren,
Diole, Kohlehydrate, aromatische Verbindungen, Vitamine und Cofaktoren,
Enzyme und Proteine.
Bevorzugte
organische Säuren
sind Weinsäure,
Itaconsäure
und Diaminopimelinsäure
Bevorzugte Nukleoside und Nukleotide sind beispielsweise beschrieben
in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, S. 561-612,
in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH: Weinheim und den
darin enthaltenen Zitaten.
Bevorzugte
biosynthetische Produkte sind weiterhin Lipide, gesättigte und
ungesättigte
Fettsäuren, wie
beispielsweise Arachidonsäure,
Diole wie beispielsweise Propandiol und Butandiol, Kohlenhydrate,
wie beispielsweise Hyaluronsäure
und Trehalose, aromatische Verbindungen, wie beispielsweise aromatische Amine,
Vanillin und Indigo, Vitamine und Cofaktoren, wie beispielsweise
beschrieben in Ullmann's
Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A27, "Vitamins", S. 443-613 (1996) VCH: Weinheim und
den darin enthaltenen Zitaten; und Ong, A.S., Niki, E. und Packer,
L. (1995) "Nutrition,
Lip ids, Health and Disease" Proceedings
of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations
in Malaysia and the Society for Free Radical Research – Asien,
abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malysia, AOCS Press (1995)),
Enzyme Polyketide (Cane et al. (1998) Science 282: 63-68), und sämtliche
anderen von Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data
Corporation, ISBN: 0818805086 und den darin angegebenen Literaturstellen, beschriebenen
Chemikalien.
Besonders
bevorzugte biosynthetische Produkte sind Aminosäuren, besonders bevorzugt essentielle Aminosäuren, insbeondere
L-Glycin, L-Alanin, L-leucin, L-Methionin, L-Phenylalanin, L-Tryptophan, L-Lysin, L-Glutamin,
L-Glutaminsäure,
L-Serin, L-Prolin, L-Valin,
L-Isoleucin, L-Cystein, L-Tyrosin, L-Histidin, L-Arginin, L-Asparagin,
L-Asparaginsäure und
L-Threonin, L-Homoserin, insbesondere L-Lysin, L-Methionin und L-Threonin.
Im folgenden wird unter unter einer Aminosäure, wie beispielsweise Lysin,
Methionin und Threonin, sowohl jeweils die L- und die D-Form der
Aminosäure,
vorzugsweise die L-Form, also beispielsweise L-Lysin, L-Methionin
und L-Threonin verstanden.
Die
Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von
Lysin durch Kultivierung von genetisch veränderten Mikroorganismen mit
erhöhter
oder verursachter Expressionsrate mindestens eines Gens im Vergleich
zum Wildtyp, wobei man
- ch) die spezifische
Expressionsaktivität
im Mikroorganismus von mindestens einer endogenen, erfindungsgemäßen Expressionseinheit,
die die Expression der endogenen Gene reguliert, im Vergleich zum
Wildtyp erhöht
oder
- dh) die Expression von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten
oder durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten
mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität
gemäß Ausführungsform
ch) reguliert, wobei die Gene im Bezug auf die Expressionseinheiten
heterolog sind,
und wobei die Gene ausgewählt sind
aus der Gruppe Nukleinsäuren
kodierend eine Aspartatkinase, Nukleinsäuren kodierend eine Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase,
Nukleinsäuren
kodierend eine Diaminopimelat- Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend
eine Diaminopimelat- Decarboxylase, Nukleinsäuren kodierend eine Dihydrodipicolinate-Synthetase,
Nukleinsäuren
kodierend eine Dihydridipicolinate-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend
eine Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend
eine 3-Phosphoglycerat-Kinase, Nukleinsäuren kodierend eine Pyruvat
Carboxylase, Nukleinsäuren
kodierend eine Triosephosphat-Isomerase, Nukleinsäuren kodierend
einen Transkriptionellen Regulator LuxR, Nukleinsäuren kodierend
einen Transkriptionellen Regulator LysR1, Nukleinsäuren kodierend
einen Transkripti onellen Regulator LysR2, Nukleinsäuren kodierend
eine Malat-Quinon-Oxodoreduktase,
Nukleinsäuren
kodierend eine Glucose-6-Phosphat-Deydrognease, Nukleinsäuren kodierend
eine 6-Phosphogluconat-Dehydrognease, Nukleinsäuren kodierend eine Transketolase,
Nukleinsäuren
kodierend eine Transaldolase, Nukleinsäuren kodierend einen Lysin
Exporter, Nukleinsäuren
kodierend eine Biotin-Ligase, Nukleinsäuren kodierend eine Arginyl-t-RNA-Synthetase,
Nukleinsäuren
kodierend eine Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, Nukleinsäuren kodierend
eine Fruktose-1,6-bisphosphatase,
Nukleinsäuren
kodierend ein Protein OPCA, Nukleinsäuren kodierend eine 1-Phosphofructokinase
und Nukleinsäuren
kodierend eine 6-Phosphofructokinase.
Wie
vorstehend bei den Verfahren beschrieben, wird die Regulation der
Expression dieser Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten
oder durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten
mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität
gemäß Ausführungsform
ch) dadurch erreicht, dass man
- dh1) eine oder
mehrere erfindungsgemäße Expressionseinheiten,
gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität,
in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Expression
eines oder mehrerer dieser endogenen Gene unter der Kontrolle der
eingebrachten, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten,
gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität,
erfolgt oder
- dh2) ein oder mehrere dieser Gene in das Genom des Mikrorganismus
einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten
Gene unter der Kontrolle der endogenen, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten,
gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität,
erfolgt oder
- dh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine
erfindungsgemäße Expressionseinheit,
gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität,
und funktionell verknüpft
eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus
einbringt.
Eine
weiter bevorzugte Ausführungsform
des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Lysin
ist dadurch gekennzeichnet, dass die genetisch veränderten
Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine erhöhte Aktivität, mindestens
einer der Aktivitäten,
ausgewählt
aus der Gruppe Aspartatkinase-Aktivität, Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase-Aktivität, Diaminopimelat-
Dehydrogenase-Aktivität,
Diaminopimelat-Decarboxylase-Aktivität, Dihydrodipicolinate-Synthetase-Aktivität, Dihydridipicolinate-Reduktase-Aktivität, Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase-Aktivität, 3-Phosphoglycerat-Kinase-Aktivität, Pyruvat
Carboxylase-Aktivität,
Triosephosphat-Isomerase-Aktivität,
Aktivität
des Transkriptio nellen Regulators LuxR, Aktivität des Transkriptionellen Regulators
LysR1, Aktivität
des Transkriptionellen Regulators LysR2, Malat-Quinon-Oxodoreduktase-Aktivität, Glucose-6-Phosphat-Deydrognease-Aktivität, 6-Phosphogluconat-Dehydrognease-Aktivität, Transketolase-Aktivität, Transaldolase-Aktivität, Lysin-Exporter-Aktivität, Arginyl-t-RNA-Synthetase-Aktivität, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Aktivität, Fruktose-1,6-bisphosphatase-Aktivität, Protein
OpcA-Aktivität,
1-Phosphofructokinase-Aktivität,
6-Phosphofructokinase-Aktivität
und Biotip-Ligase-Aktivität
aufweisen.
Eine
weiter besonders bevorzugte Ausführungsform
des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Lysin
ist dadurch gekennzeichnet, dass die genetisch veränderten
Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine reduzierte Aktivität, mindestens
einer der Aktivitäten,
ausgewählt
aus der Gruppe Threonin Dehydratase-Aktivität, Homoserin O-Acetyltransferase-Aktivität, O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase-Aktivität, Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität, Pyruvat-Oxidase-Aktivität, Homoserine-Kinase-Aktivität, Homoserin-Dehydrogenase-Aktivität, Threonin-Exporter-Aktivität, Threonin-Efflux-Protein-Aktivität, Asparaginase-Aktivität, Aspartat-Decarboxylase-Aktivität und Threonin-Synthase-Aktivität aufweisen.
Diese
zusätzlichen,
erhöhten
oder reduzierten Aktivitäten
mindestens einer der vorstehend beschriebenen Aktivitäten können, müssen aber
nicht durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäure mit
Promotoraktivität
und/oder eine erfindungsgemäße Expressionseinheit
verursacht sein.
Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Methionin
durch Kultivierung von genetisch veränderten Mikroorganismen mit
erhöhter
oder verursachter Expressionsrate mindestens eines Gens im Vergleich
zum Wildtyp, wobei man
- ch) die spezifische
Expressionsaktivität
im Mikroorganismus von mindestens einer endogenen, erfindungsgemäßen Expressionseinheit,
die die Expression der endogenen Gene reguliert, im Vergleich zum
Wildtyp erhöht
oder
- dh) die Expression von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten
oder durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten
mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität
gemäß Ausführungsform
ch) reguliert, wobei die Gene im Bezug auf die Expressionseinheiten
heterolog sind,
und wobei die Gene ausgewählt sind
aus der Gruppe Nukleinsäuren
kodierend eine Aspartatkinase, Nukleinsäuren kodierend eine Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase,
Nukleinsäuren
kodierend eine Homoserin Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend eine Glycerinaldehyd-3-Phosphat
Dehydrogenase, Nukleinsäuren
kodierend eine 3- Phosphoglycerat
Kinase, Nukleinsäuren
kodierend eine Pyruvat Carboxylase, Nukleinsäuren kodierend eine Triosephosphat
Isomerase, Nukleinsäuren
kodierend eine Homoserin O-Acetyltransferase, Nukleinsäuren kodierend
eine Cystahionin-gamma-Synthase,
Nukleinsäuren
kodierend eine Cystahionin-beta-Lyase, Nukleinsäuren kodierend eine Serin-Hydroxymethyltransferase,
Nukleinsäuren
kodierend eine O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase,
Nukleinsäuren
kodierend eine Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase,
Nukleinsäuren
kodierend eine Phosphoserin-Aminotransferase,
Nukleinsäuren
kodierend eine Phosphoserin-Phosphatase, Nukleinsäuren kodierend
eine Serine Acetyl-TransferaseNukleinsäuren kodierend eine Cystein-Synthase
Aktivität
I, Nukleinsäuren
kodierend eine Cystein-Synthase Aktivität II , Nukleinsäuren kodierend
eine Coenzym B12-abhängige
Methionin-Synthase-Aktivität, Nukleinsäuren kodierend
eine Coenzym B12-unabhängige
Methionin-Synthase-Aktivität, Nukleinsäuren kodierend
eine Sulfat-Adenylyltransferase-Aktivität, Nukleinsäuren kodierend eine Phosphoadenosin-Phosphosulfat-Reductase-Aktivität, Nukleinsäuren kodierend eine
Ferredoxin-Sulfit-Reduktase-Aktivität, Nukleinsäuren kodierend eine Ferredoxin
NADPH-Reduktase Aktivität,
Nukleinsäuren
kodierend eine Ferredoxin-Aktivität, Nukleinsäuren kodierend ein Protein
der Sulfat-Reduktion RXA077, Nukleinsäuren kodierend ein Protein
der Sulfat-Reduktion RXA248, Nukleinsäuren kodierend ein Protein
der Sulfat-Reduktion RXA247, Nukleinsäuren kodierend eine, RXA0655
Regulator und Nukleinsäuren
kodierend einen RXN2910 Regulator.
Wie
vorstehend bei den Verfahren beschrieben, wird die Regulation der
Expression dieser Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten
oder durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten
mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität
gemäß Ausführungsform
ch) dadurch erreicht, dass man
- dh1) eine oder
mehrere erfindungsgemäße Expressionseinheiten,
gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität,
in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Expression
eines oder mehrerer dieser endogenen Gene unter der Kontrolle der
eingebrachten, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten,
gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität,
erfolgt oder
- dh2) ein oder mehrere dieser Gene in das Genom des Mikrorganismus
einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten
Gene unter der Kontrolle der endogenen, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten,
gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität,
erfolgt oder
- dh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine
erfindungsgemäße Expressionseinheit,
gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität,
und
funktionell verknüpft
eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus
einbringt.
Eine
weiter bevorzugte Ausführungsform
des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Methionin
ist dadurch gekennzeichnet, dass die genetisch veränderten
Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine erhöhte Aktivität, mindestens
einer der Aktivitäten,
ausgewählt
aus der Gruppe Aspartatkinase-Aktivität, Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase-Aktivität, Homoserin
Dehydrogenase-Aktivität,
Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase-Aktivität, 3-Phosphoglycerat Kinase-Aktivität, Pyruvat
Carboxylase-Aktivität,
Triosephosphat Isomerase-Aktivität,
Homoserin O-Acetyltransferase-Aktivität, Cystahionin-gamma-Synthase-Aktivität, Cystahioninbeta-Lyase-Aktivität Serin-Hydroxymethyltransferase-Aktivität, O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase-Aktivität, Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase-Aktivität, Phosphoserin-Aminotransferase-Aktivität, Phosphoserin-Phosphatase-Aktivität, Serine
Acetyl-Transferase-Aktivität, Cystein-Synthase-Aktivität, Cystein-Synthase
II -Aktivität,
Coenzym B12-abhängige
Methionin-Synthase-Aktivität,
Coenzym B12-unabhängige
Methionin-Synthase-Aktivität,
Sulfat-Adenylyltransferase-Aktivität, Phosphoadenosin-Phosphosulfat-Reductase-Aktivität, Ferredoxin-Sulfit-Reduktase-Aktivität, Ferredoxin
NADPH-Reduktase Aktivität, Ferredoxin-Aktivität Aktivität Proteins
der Sulfat-Reduktion
RXA077, Aktivität
eines Proteins der Sulfat-Reduktion RXA248, Aktivität eines
Proteins der Sulfat-Reduktion RXA247, Aktivität eines RXA655-Regulators und Aktivität eines
RXN2910-Regulators aufweisen
Eine
weiter besonders bevorzugte Ausführungsform
des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Methionin
ist dadurch gekennzeichnet, dass die genetisch veränderten
Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine reduzierte Aktivität, mindestens
einer der Aktivitäten,
ausgewählt
aus der Homoserine-Kinase-Aktivität, Threonin-Dehydratase-Aktivität, Threonin
Synthase-Aktivität,
Meso-Diaminopimelat
D-Dehydrogenase-Aktivität,
Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität, Pyruvat-Oxidase-Aktivität, Dihydrodipicolinat
Synthase-Aktivität,
Dihydrodipicolinat Reduktase-Aktivität, und Diaminopicolinat Decarboxylase-Aktivität aufweisen.
Diese
zusätzlichen,
erhöhten
oder reduzierten Aktivitäten
mindestens einer der vorstehend beschriebenen Aktivitäten können, müssen aber
nicht durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäure mit
Promotoraktivität
und/oder eine erfindungsgemäße Expressionseinheit
verursacht sein.
Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Threonin
durch Kultivierung von genetisch veränderten Mikroorganismen mit
erhöhter
oder verursachter Expressionsrate mindestens eines Gens im Vergleich
zum Wildtyp, wobei man
- ch) die spezifische
Expressionsaktivität
im Mikroorganismus von mindestens einer endogenen, erfindungsgemäßen Expressionseinheit,
die die Expression der endogenen Gene reguliert, im Vergleich zum
Wildtyp erhöht
oder
- dh) die Expression von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten
oder durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten
mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität
gemäß Ausführungsform
ch) reguliert, wobei die Gene im Bezug auf die Expressionseinheiten
heterolog sind,
und wobei die Gene ausgewählt sind
aus der Gruppe Nukleinsäuren
kodierend eine Aspartatkinase, Nukleinsäuren kodierend eine Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase,
Nukleinsäuren
kodierend eine Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend
eine 3-Phosphoglycerat Kinase, Nukleinsäuren kodierend eine Pyruvat
Carboxylase, Nukleinsäuren
kodierend eine Triosephosphat Isomerase, Nukleinsäuren kodierend
eine Homoserin-Kinase, Nukleinsäuren
kodierend eine Threonin Synthase, Nukleinsäuren kodierend einen Threonin
Exporter Carrier, Nukleinsäuren
kodierend eine Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend
eine Transaldolase, Nukleinsäuren
kodierend eine Transketolase, Nukleinsäuren kodierend einer Malat-Quinon-Oxidoreductase,
Nukleinsäuren
kodierend eine 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase,
Nukleinsäuren
kodierend einen Lysin-Exporter, Nukleinsäuren kodierend eine Biotin-Ligase,
Nukleinsäuren
kodierend eine Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, Nukleinsäuren kodierend
ein Threonin Efflux-Protein, Nukleinsäuren kodierend eine Fruktose-1,6-bisphosphatase,
Nukleinsäuren
kodierend ein OpcA Protein, Nukleinsäuren kodierend eine 1-Phosphofructokinase,
Nukleinsäuren
kodierend eine 6-Phosphofructokinase, und Nukleinsäuren kodierend
eine Homoserin-Dehydrogenase
Wie
vorstehend bei den Verfahren beschrieben, wird die Regulation der
Expression dieser Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten
oder durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten
mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität
gemäß Ausführungsform
ch) dadurch erreicht, dass man
- dh1) eine oder
mehrere erfindungsgemäße Expressionseinheiten,
gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität,
in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Expression
eines oder mehrerer dieser endogenen Gene unter der Kontrolle der
eingebrachten, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten,
gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität,
erfolgt oder
- dh2) ein oder mehrere dieser Gene in das Genom des Mikrorganismus
einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten
Gene unter der Kontrolle der endogenen, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten,
gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität,
erfolgt oder
- dh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine
erfindungsgemäße Expressionseinheit,
gegebenenfalls mit erhöhter
spezifischer Expressionsaktivität,
und funktionell verknüpft
eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus
einbringt.
Eine
weiter bevorzugte Ausführungsform
des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Threonin
ist dadurch gekennzeichnet, dass die genetisch veränderten
Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine erhöhte Aktivität, mindestens
einer der Aktivitäten,
ausgewählt
aus der Gruppe Aspartatkinase-Aktivität, Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase-Aktivität, Glycerinaldehyd-3-Phosphat
Dehydrogenase-Aktivität,
3-Phosphoglycerat Kinase-Aktivität,
Pyruvat Carboxylase-Aktivität,
Triosephosphat Isomerase-Aktivität,
Threonin Synthase-Aktivität, Aktivität eines
Threonin Export-Carriers, Transaldolase-Aktivität, Transketolase-Aktivität, Glucose-6-Phosphat-dehydrogenase-Aktivität, Malat-Qinon-Oxidoreductase-Aktivität, Homoserin-Kinase-Aktivität, Biotin-Ligase-Aktivität, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Aktivität, Threonin-Efflux-Protein-Aktivität, Protein
OpcA-Aktivität,
1-Phosphofructokinase-Aktivität,
6-Phosphofructokinase-Aktivität,
Fruktose 1,6 bisphosphatase-Aktivität, 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase
und Homoserin-Dehydrogenase-Aktivität aufweisen.
Eine
weiter besonders bevorzugte Ausführungsform
des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Threonin
ist dadurch gekennzeichnet, dass die genetisch veränderen Mikroorganismen
im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich
eine reduzierte Aktivität,
mindestens einer der Aktivitäten,
ausgewählt
aus der Gruppe Threonin Dehydratase-Aktivität, Homoserin O-Acetyltransferase-Aktivität, Serin-Hydroxymethyltransferase-Aktivität, O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase-Aktivität, Meso-Diaminopimelat D-Dehydrogenase-Aktivität, Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität, Pyruvat-Oxidase-Aktivität, Dihydrodipicolinat
Synthetase-Aktivität,
Dihydrodipicolinat Reduktase-Aktivität, Asparaginase-Aktivität, Aspartat-Decarboxylase-Aktivität, Lysin-Exporter-Aktivität, Acetolactat-Synthase-Aktivität, Ketol-Aid-Reductoisomerase-Aktivität, Branched
chain aminotransferase- Aktivität
, Coenzym B12-abhängige
Methionin Synthase- Aktivität
, Coenzym B12-unabhängige
Methion Synthase- Aktivität,
Dihydroxy-acid Dehydratase- Aktivität und Diaminopicolinat Decarboxylase-Aktivität aufweisen.
Diese
zusätzlichen,
erhöhten
oder reduzierten Aktivitäten
mindestens einer der vorstehend beschriebenen Aktivitäten können, müssen aber
nicht durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäure mit
Promotoraktivität
und/oder eine erfindungsgemäße Expressionseinheit
verursacht sein.
Unter
dem Begriff der „Aktivität" eines Proteins wird
bei Enzymen die Enzymaktivität
des entsprechenden Proteins, bei anderen Proteinen, beispielsweise
Struktur oder Transport-Proteinen die physiologische Aktivität der Proteine
verstanden.
Die
Enzyme sind in der Regel in der Lage ein Substrat in ein Produkt
umzuwandeln bzw. diesen Umwandlunsgschritt zu katalysieren.
Dementsprechend
wird unter der „Aktivität" eines Enzyms die
in einer bestimmten Zeit durch das Enzym umgesetzte Menge Substrat
bzw. gebildete Menge Produkt verstanden.
Bei
einer erhöhten
Aktivität
im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in
einer bestimmten Zeit durch das Enzym die umgesetzte Menge Substrat
bzw. die gebildete Menge Produkt erhöht.
Vorzugsweise
beträgt
diese Erhöhung
der „Aktivität" bei allen vorstehend
und nachstehend beschriebenen Aktivitäten mindestens 5 %, weiter
bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter
bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter
mindestens 500 %, insbesondere mindestens 600 % der „Aktivität des Wildtyps".
Bei
einer reduzierten Aktivität
im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in
einer bestimmten Zeit durch das Enzym die umgesetzte Menge Substrat
bzw. die gebildete Menge Produkt reduziert.
Unter
einer reduzierten Aktivität
wird vorzugsweise die teilweise oder im wesentlichen vollständige, auf unterschiedliche
zellbiologische Mechanismen beruhende Unterbindung oder Blockierung
der Funktionalität diese
Enzyms in einem Mikroorganismus verstanden.
Eine
Reduzierung der Aktivität
umfasst eine mengenmäßige Verringerung
eines Enzyms bis hin zu einem im wesentlichen vollständigen Fehlen
des Enzyms (d.h. fehlende Nachweisbarkeit der entsprechenden Aktivität oder fehlende
immunologische Nachweisbarkeit des Enzyms). Vorzugsweise wird die
Aktivität
im Mikroorganismus im Vergleich zum Wildtyp um mindestens 5 %, weiter
bevorzugt um mindestens 20 %, weiter bevorzugt um mindestens 50
%, weiter bevorzugt um 100 % reduziert. Insbe sondere meint "Reduzierung" auch das vollständigen Fehlen
der entsprechenden Aktivität.
Die
Aktivität
bestimmter Enzyme in genetisch veränderten Mikroorganismen sowie
im Wildtyp und damit die Erhöhung
oder Reduzierung der Enzymaktivität lassen sich nach bekannten
Verfahren, wie beispielsweise Enzymassays ermitteln.
Beispielsweise
wird unter eine Pyruvatcarboxylase ein Protein verstanden, das die
enzymatische Aktivität
aufweist, Pyruvat in Oxaloacetat umzuwandeln.
Dementsprechend
wird unter einer Pyruvatcarboxylase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit
durch das Protein Pyruvatcarboxylase umgesetzte Menge Pyruvat bzw.
gebildete Menge Oxaloacetat verstanden.
Bei
einer erhöhten
Pyruvatcarboxylase-Aktivität
gegenüber
dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten
Zeit durch das Protein Pyruvatcarboxylase die umgesetzte Menge Pyruvat
bzw. die gebildete Menge Oxaloacetat erhöht.
Vorzugsweise
beträgt
diese Erhöhung
der Pyruvatcarboxylase-Aktivität
mindestens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt
mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens
300 %, noch bevorzugter mindestens 500 %, insbesondere mindestens
600 % der Pyruvatcarboxylase -Aktivität des Wildtyps.
Weiterhin
wir beispielsweise unter eine Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität die Enzymaktivität einer
Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-verstanden.
Unter
einer Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase wird ein Protein verstanden,
das die enzymatische Aktivität
aufweist, Oxaloacetat in Phosphoenolpyruvat umzuwandeln.
Dementsprechend
wird unter Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität die in
einer bestimmten Zeit durch das Protein Phosphoenolpyruvat umgesetzte
Menge Oxaloacetat bzw. gebildete Menge Phosphoenolpyruvat verstanden.
Bei
einer reduzierten Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität gegenüber dem
Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten
Zeit durch das Protein Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase die umgesetzte
Menge Oxaloacetat bzw. die gebildete Menge Phosphoenolpyruvat reduziert.
Eine
Reduzierung der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität umfasst
eine mengenmäßige Verringerung
einer Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase bis hin zu einem im wesentlichen
vollständigen
Fehlen der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (d.h. fehlende Nachweisbarkeit
von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität oder fehlende immunologische
Nachweisbarkeit der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase). Vorzugsweise
wird die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität im Vergleich
zum Wildtyp um mindestens 5 %, weiter bevorzugt um mindestens 20
%, weiter bevorzugt um mindestens 50 %, weiter bevorzugt um 100
% reduziert. Insbesondere meint "Reduzierung" auch das vollständigen Fehlen
der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase – Aktivität.
Die
zusätzliche
Erhöhung
von Aktivitäten
kann durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch Ausschalten
von hemmenden Regulationsmechanismen auf Expressions- und Proteinebene
oder durch Erhöhung
der Genexpression von Nukleinsäuren
kodierend die vorstehend beschriebenen Proteine gegenüber dem
Wildtyp.
Die
Erhöhung
der Genexpression der Nukleinsäuren
kodierend die vorstehend beschriebenen Proteine gegenüber dem
Wildtyp kann ebenfalls durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise
durch Induzierung des Gens durch Aktivatoren oder wie vorstehend
beschrieben durch Erhöhung
der Promotoraktivität
oder Erhöhung
der Expressionsaktivität
oder durch Einbringen von einer oder mehrerer Genkopien in den Mikroorganismus.
Unter
Erhöhung
der Genexpression einer Nukleinsäure
codierend ein Protein wird erfindungsgemäß auch die Manipulation der
Expression der Mikroorganismus eigenen, endogenen Proteine verstanden.
Dies
kann beispielsweise, wie vorstehend beschrieben durch Veränderung
der Promotor- und/oder Expressionseinheits-Sequenzen der Gene erreicht
werden. Eine solche Veränderung,
die eine erhöhte
Expressionsrate des Gens zur Folge hat, kann beispielsweise durch
Deletion oder Insertion von DNA Sequenzen erfolgen.
Es
ist, wie vorstehend beschrieben, möglich, die Expression der endogenen
Proteine durch die Applikation exogener Stimuli zu verändern. Dies
kann durch besondere physiologische Bedingungen, also durch die
Applikation von Fremdsubstanzen erfolgen.
Zur
Erzielung einer Erhöhung
der Genexpression kann der Fachmann weitere unterschiedliche Maßnahmen
einzeln oder in Kombination ergreifen. So kann beispielsweise die
Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die
Promotor- und Regulationsregion
oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens
befindet, mutiert werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die
Expression im Verlaufe der fermentativen Produktion zu steigern.
Durch Maßnahmen
zur Verlängerung
der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert.
Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls
die Enzymaktivität
verstärkt.
Die Gene oder Genkonstrukte können
entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen
oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann
weiterhin eine Überexpression
der betreffenden Gene durch Veränderung der
Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
Anleitungen
hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Biontechnology
5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)),
Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns
et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift 0472869,
im US Patent 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler (Biotechnology 9, 84-87
(1991), bei Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology
60,126-132 (1994), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175,
1001-1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Malumbres
et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift
JP-A-10-229891,
bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58,. 191-195
(1998)), bei Makrides (Microbiological Reviews 60 : 512-538 (1996)
und in bekannten Lehrbüchern der
Genetik und Molekularbiologie.
Weiterhin
kann es für
die Produktion von biosynthetischen Produkten, insbesondere L-Lysin, L-Methionin
und L-Threonin, vorteilhaft sein, neben der Expression bzw. Verstärkung eines
Gens unerwünschte
Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction
of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic
Press, London, UK, 1982).
In
einer bevorzugten Ausführungsform
erfolgt die Erhöhung
der Genexpression einer Nukleinsäure
kodierend eines der vorstehend beschriebenen Proteine durch Einbringen
von mindestens einer Nukleinsäure kodierend
ein entsprechendes Protein in den Mikroorganismus. Das Einbringen
der Nukleinsäure
kann chromsomal oder extrachromosomal erfolgen, also durch Erhöhung der
Kopienzahl auf dem Chromosom und oder eine Kopie des Gens auf einem
sich replizierenden Plasmid in dem Wirtsmikroorganismus.
Vorzugsweise
erfolgt das Einbringen der Nukleinsäure, beispielsweise in Form
einer Expressionskassete, enthaltend die Nukleinsäure, chromosomal,
insbesondere durch die vorstehend beschriebene SacB-Methode.
Dazu
kann prinzipiell jedes Gen, das eines der vorstehend beschriebenen
Proteine kodiert verwendet werden.
Bei
genomischen Nukleinsäure-Sequenzen
aus eukaryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall
das der Wirtsmikroorganismus nicht in der Lage ist oder nicht in
die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden Proteine zu exprimieren,
bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden
cDNAs zu verwenden.
Beispiele
für die
entsprechenden Gene sind in Tabelle 1 und 2 aufgelistet.
Vorzugsweise
erfolgt die Reduzierung der vorstehend beschriebenen Aktivitäten in Mikroorganismen durch
mindestens eines der nachfolgenden Verfahren:
- • Einbringen
mindestens einer sense-Ribonukleinsäuresequenz zur Induktion einer
Kosuppression oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette
- • Einbringen
mindestens eines DNA- oder Protein-bindenden Faktors gegen das entsprechede
-Gen, -RNA oder -Protein oder einer dessen Expression gewährleistenden
Expressionskassette
- • Einbringen
mindestens einer den RNA-Abbau bewirkenden viralen Nukleinsäuresequenz
oder einer deren Expression gewährleistenden
Expressionskassette
- • Einbringen
mindestens eines Konstruktes zur Erzeugung eines Funktionsverlustes,
wie beispielsweise die Generierung von Stopp-Kodons oder eine Verschiebungen
im Leseraster, an einem Gen beispielsweise durch Erzeugung einer
Insertion, Deletion, Inversion oder Mutation in einem Gen. Bevorzugt
können
Knockout-Mutanten mittels gezielter Insertion in das gewünschte Zielgen
durch homologe Rekombination oder Einbringen von sequenzspezifischen
Nukleasen gegen das Zielgen generiert werden.
- • Einbringen
eines Promotors mit reduzierter Promotoraktivität oder einer Expressionseinheit
mit reduzierter Expressionsaktivität.
Dem
Fachmann ist bekannt, dass auch weitere Verfahren im Rahmen der
vorliegenden Erfindung zur Reduzierung seiner Aktivität oder Funktion
eingesetzt werden können.
Beispielsweise kann auch das Einbringen einer dominant-negativen
Variante eines Proteins oder einer deren Expression gewährleistenden
Expressionskassette vorteilhaft sein.
Dabei
kann jedes einzelne dieser Verfahren eine Verminderung der Proteinmenge,
mRNA-Menge und/oder Aktivität
eines Proteins bewirken. Auch eine kombinierte Anwendung ist denkbar.
Weitere Methoden sind dem Fachmann bekannt und können die Behinderung oder Unterbindung
der Prozessierung des Proteins, des Transports des Proteins oder
dessen mRNA, Hemmung der Ribosomenanlagerung, Hemmung des RNA-Spleißens, Induktion
eines RNA abbauenden Enzyms und/oder Hemmung der Translationselongation oder
-termination umfassen.
Im
erfindungsgemäßen Verfahren
zur Herstellung von biosynthetischen Produkten wird vorzugsweise dem
Kultivierungsschritt der genetisch veränderten Mikroorganismen ein
Isolieren von biosynthetischen Produkten aus den Mikroorganismen
oder/oder aus der Fermentationsbrühe angeschlossen. Diese Schritte
können
gleichzeitig und/oder vorzugsweisie nach dem Kultivierungsschritt
stattfinden.
Die
erfindungsgemäßen genetisch
veränderten
Mikroorganismen können
kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch- Verfahren (Satzkultivierung)
oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren
(repetitives Zulaufverfahren) zur Produktion von biosynthetischen
Produkten, insbesondere L-Lysin, L-Methionin und L-Threonin, kultiviert
werden. Eine Zusammenfassung über
bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik
1. Einführung
in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))
oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) zu finden.
Das
zu verwendende Kulturmedium hat in geeigneter Weise den Ansprüchen der
jeweiligen Stämme zu
genügen.
Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind
im Handbuch "Manual of
Methods für
General Bacteriology" der
American Society für
Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
Diese
erfindungsgemäß einsetzbaren
Medien umfassen gewöhnlich
eine oder mehrere Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische
Salze, Vitamine und/oder Spurenelemente.
Bevorzugte
Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide.
Sehr gute Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Fructose,
Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose,
Saccharose, Raffinose, Stärke
oder Cellulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie
Melassen, oder an dere Nebenprodukte der Zucker-Raffinierung zu den
Medien geben. Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener
Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Öle und Fette
wie z. B. Sojaöl.
Sonnenblumenöl.
Erdnußöl und Kokosfett,
Fettsäuren
wie z. B. Palmitinsäure,
Stearinsäure
oder Linolsäure,
Alkohole wie z. B. Glycerin, Methanol oder Ethanol und organische
Säuren
wie z. B. Essigsäure
oder Milchsäure.
Stickstoffquellen
sind gewöhnlich
organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien,
die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen
umfassen Ammoniak-Gas oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid,
Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumnitrat, Nitrate,
Harnstoff, Aminosäuren
oder komplexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein,
Hefeextrakt, Fleischextrakt und andere. Die Stickstoffquellen können einzeln
oder als Mischung verwendet werden.
Anorganische
Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen
die Chlorid-, Phosphor- oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium,
Natrium, Kobalt, Molybdän,
Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen Als Schwefelquelle für die Herstellung
von Feinchemikalien, insbesondere von Methionin, können anorganische
Verbindungen wie beispielsweise Sulfate, Sulfite, Dithionite, Tetrathionate,
Thiosulfate, Sulfide aber auch organische Schwefelverbindungen,
wie Mercaptane und Thiole, verwendet werden.
Als
Phosphorquelle können
Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die
entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden.
Chelatbildner
können
zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu
halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole,
wie Catechol oder Protocatechuat, oder organische Säuren, wie
Citronensäure.
Die
erfindungsgemäß eingesetzten
Fermentationsmedien enthalten üblicherweise
auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer,
zu denen beispielsweise Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat
und Pyridoxin gehören.
Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Medienkomponenten,
wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Dem
Kulturmedium können überdies
geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genaue Zusammensetzung der
Medienverbindungen hängt
stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden spezifischen Fall individuell
entschieden. Information über
die Me dienoptimierung ist erhältlich
aus dem Lehrbuch "Applied
Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury,
IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien
lassen sich auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Standard
1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und dergleichen.
Sämtliche
Medienkomponenten werden, entweder durch Hitze (20 min bei 1,5 bar
und 121°C)
oder durch Sterilfiltration, sterilisiert. Die Komponenten können entweder
zusammen oder nötigenfalls
getrennt sterilisiert werden. Sämtliche
Medienkomponenten können
zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich
oder chargenweise hinzugegeben werden.
Die
Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 15°C und 45°C, vorzugsweise
bei 25°C
bis 40°C
und kann während
des Experimentes konstant gehalten oder verändert werden. Der pH-Wert des
Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen.
Der pH-Wert für
die Anzucht läßt sich
während
der Anzucht durch Zugabe von basische Verbindungen wie Natriumhydroxid,
Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen
wie Phosphorsäure
oder Schwefelsäure
kontrollieren. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel,
wie z. B. Fettsäurepolyglykolester,
eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden
können
dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie z. B. Antibiotika,
hinzugefügt
werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff
oder Sauerstoff haltige Gasmischungen, wie z. B. Umgebungsluft,
in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise
bei 20°C
bis 45°C.
Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten
Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb
von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die
so erhaltenen Fermentationsbrühen
haben üblicherweise
eine Trockenmasse von 7,5 bis 25 Gew.-%.
Vorteilhaft
ist außerdem
auch, wenn die Fermentation zumindest am Ende, insbesondere jedoch über mindestens
30% der Fermentationsdauer zuckerlimitiert gefahren wird. Das heißt, dass
während
dieser Zeit die Konzentration an verwertbarem Zucker im Fermentationsmedium
auf 0 bis 3 g/l gehalten, beziehungsweise abgesenkt wird.
Die
Isolierung von biosynthetischen Produkten aus der Fermentationsbrühe und/oder
den Mikroorganismen erfolgt in an sich bekannter Weise entsprechend
den physikalisch-chemischen Eigenschaften des biosynthetischen Wertprodukts
und den biosynthetischen Nebenprodukten.
Die
Fermentationsbrühe
kann anschließend
beispielsweise weiterverarbeitet werden. Je nach Anforderung kann
die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden, wie
z. B. Zentrifugation, Filtration, Dekantieren oder einer Kombination
dieser Methoden aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr
belassen werden.
Anschließend kann
die Fermentationsbrühe
mit bekannten Methoden, wie z. B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers,
Dünnschichtverdampfers,
Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose, oder durch Nanofiltration,
eingedickt beziehungsweise aufkonzentriert werden. Diese aufkonzentrierte
Fermentationsbrühe
kann anschließend
durch Gefriertrocknung, Sprühtrocknung,
Sprühgranulation
oder durch anderweitige Verfahren aufgearbeitet werden.
Es
ist aber auch möglich
die biosynthetischen Produkte, insbesonder L-Lysin, L-Methionin und L-Threonin,
weiter aufzureinigen. Hierzu wird die produkthaltige Brühe nach
dem Abtrennen der Biomasse einer Chromatographie mit einem geeigneten
Harz unterworfen, wobei das gewünschte
Produkt oder die Verunreinigungen ganz oder teilweise auf dem Chromatographieharz
zurückgehalten
werden. Diese Chromatographieschritte können nötigenfalls wiederholt werden,
wobei die gleichen oder andere Chromatographieharze verwendet werden.
Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographieharze
und ihrer wirksamsten Anwendung bewandert. Das gereinigte Produkt
kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei
einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der die Stabilität des Produktes
maximal ist.
Die
biosynthetischen Produkte können
in unterschiedlichen Formen anfallen, beispielsweise in Form ihrer
Salze oder Ester.
Die
Identität
und Reinheit der isolierten Verbindung(en) kann durch Techniken
des Standes der Technik bestimmt werden. Diese umfassen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
(HPLC), spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie,
NIRS, Enzymtest oder mikrobiologische Tests. Diese Analyseverfahren
sind zusammengefaßt
in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova
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(1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547,
S. 559-566, 575-581
und S. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas
of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon,
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Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17.