KR0122509B1 - L-라이신을 생산하는 미생물 - Google Patents

L-라이신을 생산하는 미생물

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Abstract

1. 특허청구의 범위에 기재된 발명이 속하는 기술분야
미생물
2. 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제
L-라이신의 정제수율을 개선하는 생산방법
3. 발명의 해결방법의 요지
L-라이신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC10672를 모균주로 하여 L-아르지닌 유출형(leaky) 특성을 부여한 돌연변이체를 획득하였다.
본 발명의 신규한 균주 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC10821에 의해 L-라이신 발효를 실시한 결과 발효액 중에 L-라이신과 공존하는 L-아르지닌 농도를 현저히 감소시킴으로써 L-라이신의 정제수율을 향상시킨다.
4. 발명의 중요한 용도
의약품, 사료, 식품등

Description

L-라이신을 생산하는 미생물
본 발명은 기존의 L-라이신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) KFCC10672를 인공변이시켜 L-아르지닌 유출(leaky)형질을 가지는 신규한 미생물에 관한 것이다.
L-라이신은 필수아미노산의 일종으로 가축의 사료, 식품첨가제, 의약원료, 영양제등으로 사용되고 있으며 사료첨가용으로 메치오닌 다음으로 수요가 큰 아미노산이다. L-라이신의 공업적 제조방법으로는 주로 직접 발효법이 사용되는데 그 생산균주로는 각종 아미노산 영양요구주(L-루이신, L-메치오닌, L- 스레오닌, L-아이소루이신등), 아미노산유사체, 항생체, 퓨린, 피리미딘 염기 유사체에 대한 내성을 지닌 코리네박테리움 또는 브레비박테리움속등이다.
종래 L-라이신을 제조하는 방법으로는 국내특허공고 79-1782, 81-1746, 85-1231, 91-2850, 92-7402등이 있으며 일본공개특허로는 昭 57-14839, 昭 61-35840, 平 02-234686, 平 04-4887, 平 05-111386등이 있다. 이중 국내특허공고 91-2850은 당사의 L-라이신 생산균주(코리네박테리움 글루타미컴 KFCC10672)특허로서 아르지닌 유사체에 대한 내성을 부여하여 L-아르지닌의 균체외 생산(2g/ℓ 이상)을 가능하게 함으로써 균주의 수율향상을 이룩한 것이다.
그런데 발효액중에 소량이긴 하지만 L-아르지닌이 L-라이신과 공존함으로써 L-라이신 정제수율 및 품질을 다소 저하시키는 원인임을 발견하고 이러한 단점을 극복하고자 L-아르지닌 유출형 L-라이신 생산균주개발을 시도하였다. 본 발명을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 L-아르지닌 유출형 균주는 자외선(U.V) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(이하 NTG라함)을 처리하여 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) KFCC10672(특성 : α-아미노-β-하이드록시발레릭산, S-(β-아미노메틸)-L-시스테인, 메틸라이신, 아르지닌 하이드록사메이트 내성 및 로이신, 호모세린 영양요구성)로부터 얻었다.
자외선변이법은 균주의 세포농도를 107내지 108세포/㎖로 하여 0.1몰의 마그네슘설페이트 용액에 현탁시켜 자외선을 60 내지 80초 조사시켜 처리하는 방법이며 NTG에 의한 변이법의 경우는 0.1몰의 사이트레이트 완충액(pH 5.5)에 107내지 108세포/㎖로 현탁시킨 뒤 NTG의 최종농도가 200 내지 500 ㎍/㎖ 되게 한 뒤 실온 또는 30°C에서 20 내지 30분간 처리하는 방법이다. 상기 방법에 의해 변이처리된 균은 무균생리식염수로 세척한후 Luria Bertani(LB) 액체배지에 접종하여 30 내지 32℃에서 4내지 5시간 활성화시킨 후 세척하여 20% 설탕용액, 0.1M 마그네슘설페이트가 함유된 최소배지에 접종한다. 균을 배양하면서 페니실린 G를 10,000 내지20,000Units/ml 되게 가하여 집적배양(enrichment)하고 무균 생리식염수로 세척 후 L-아르지닌 함유 최소배지에 접종하여 발현시킨다. 발현된 균은 LB플레이트배지에 도말한 후 배양시킨 뒤 최소 플레이트 배치 및 L-아르지닌 함유 최소배지에 tooth picking하여 30 내지 32℃에 1일간 배양시킨후 L-아르지닌 유출형 균주라 판단되는 균주를 2주 선별하였다. 한편 L-라이신 농도는 HPLC(Hight Performance Liquid Chromatography)로 분석, 정량하였고 당분석은 Bertrand법으로 하였으며 본 실험에 사용된 최소배지 및 플라스크 배지성분은 다음과 같다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
[실시예 1]
상기의 방법으로 선별된 L-아르지닌 유출형 균주 및 모균주를 최소 배지에 접종(플라스크)하여 30 내지 32℃에서 18시간 배양 후 성장도를 비교 관찰하여 그 결과를 상대성장도로 나타냈다(표 1). 2균주 모두 L-아르지닌 유출형 균주임을 재차 확인하였으며 각각 코리네박테리움 글루타미컴 CH23, CH24라 명명하였다.
[실시예 2]
코리네박테리움 글루타미컴 CH23, CH24 및 KFCC10672의 L-라이신 생산성을 시험하기 위해 30 내지 32℃에서 220 내지 230rpm의 진탕기로 55 내지 65시간 동안 플라스크발효를 실시하였다. 그 결과 CH24균주는 모균주에 비해 생산성이 오히려 저하되었으며 CH23 균주는 모균주와 거의 대등한 생산성을 나타내었다. 최종 선발된 CH23은 1994년 6월 2일자로 한국종균협회에 기탁하였고(코리네박테리움 글루타미컴 KFCC10821) 다음 표 2에 그 결과를 나타내었다.
[실시예 3]
플라스크에서 최종 선발된 코리네박테리움 글루타미컴 CH23 및 모균주 KFCC10672를 전술한 7L 발효배지를 사용하여 30 내지 32℃, pH 7.0 내지 7.2이고 통기량 1.0vvm의 발효 조건에서 발효중 영양원을 배지에 첨가하는 유가식으로 L-라이신 및 L-아르지닌의 생산 농도를 시험한 결과 CH23의 L-라이신 농도 및 수율은 모균주와 거의 대등하였고 L-아르지닌의 축적 농도는 현저히 감소되었음을 알 수 있었다(표 3).
[실시예 4]
코리네박테리움 글루타미컴 KFCC10672와 CH23(KFCC10821)을 각각 배양하여 얻은 발효액 20L에 황산을 가하여 pH를 조정한 후, NH 으로 재생시킨 강산성 양이온 교환지수 Dulite C-20N가 충진된 수지탑에 상류식으로 흡착시켰다.
흡착이 완료된 수지를 물로 충분히 세척후, 암모니아수를 이용하여 용리하므로서 수지량의 0.6배인 고농도부분의 용리액을 얻고 저농도 부분은 다음탑 요리시 재사용하였다.
그런데 표4에서 볼 수 있듯이 발효액을 수지탑에 흡착하는 과정에서 L-아르지닌의 일부가 수지에 흡착됨으로써 발효액내 L-라이신의 회수율을 떨어뜨리는 요인중 하나임을 알 수 있었다.
따라서 개발균주 CH23은 기존의 L-아르지닌 생산균주인 KFCC10672보다 수지에 대한 흡착률 증가에 따라 회수율이 향상됨을 확인할 수 있었다.
[실시예 5]
얻어진 고농도액을 농축하여 암모니아를 제거하고 염산을 사용하여 pH 5.0으로 조정한 후 활선탄 처리를 거친 뒤 농축, 분리 등을 하여 결정(1차 결정)과 모액 (1차 모액)을 얻은 다음, 1차 모액을 재차 농축하여 결정(2차 결정)과 모액(2차 모액)을 다시 얻고 2차 모액은 발효액 저장탱크에 재순환시키고 2차 결정은 수지탑에서 얻은 고농도의 처리공정에 투입하여 제품화하는데 사용하였다.
L-아르지닌 염산염은 L-라이신 염산염보다 용해도가 높아 라이신 결정과정에서 동시 결정화는 발생하지 않으나 모액을 수지탑내 흡착공정으로 재순환시키는 과정을 반복함에 따라 모액내 농도가 점차 증가됨을 확인하였다.
한편, 모액내 L-아르지닌이 고농도로 농축될 경우 라이신 제품내로 일부가 혼입됨에 따라 최종 제품의 품질에도 영향을 주었다.
상술한 방법에 의해 얻어진 결정을 열풍건조한 결과 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC10672의 최종회수율은 94%이었으나, L-아르지닌 유출형질을 지닌 CH23의 경우 96%로 생산성 및 품질을 향상시킬 수 있었다.

Claims (2)

  1. L-아르지닌 유출형(leaky) 특성을 가지는 L-라이신 생산 코리네박테리움 글루타미컴 CH23(Corynebacterium glutamicum KFCC10821).
  2. 제1항에 따른 미생물에 의해 통상의 발효배지에서 L-라이신을 생산하는 것을 특징으로 하는 L-라이신의 제조방법.
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