CN102337319A

CN102337319A - 酶法转化甘草酸生成甘草次酸的方法

Info

Publication number: CN102337319A
Application number: CN2011103366887A
Authority: CN
Inventors: 宋新波; 黄鸿志; 马百平; 余河水; 张洁; 李薇
Original assignee: TIANJIN ZHONGYI PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: TIANJIN ZHONGYI PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2011-10-31
Filing date: 2011-10-31
Publication date: 2012-02-01

Abstract

本发明涉及一种酶法生物转化甘草酸生成甘草次酸的方法。采用微生物产生的甘草酸水解酶，对甘草酸进行水解，生成甘草次酸。本发明有益效果：转化率高，适合甘草次酸是生产制备。

Description

酶法转化甘草酸生成甘草次酸的方法

发明领域

本发明涉及一种转化甘草酸生成甘草次酸的生物方法，即用微生物产生的酶进行生物转化。

背景技术

甘草酸（Glycyrrhizic acid，GL）是甘草中的主要活性物质^[1]。甘草酸具有一定的药理活性，如具有肝脏保护^[2]，抗病毒^[3]和抗癌^[4]的作用。甘草酸在食品上也有着广泛的用途。甘草酸具有较高的甜味，它的甜味是蔗糖的170-200倍，而且它有特殊的风味。因此，它在食品行业中被用作为甜味剂、增香剂。例如，我国国标2760-86规定允许甘草酸作为罐头、调味品、糖果、饼干、蜜饯等的甜味剂，用量根据正常生产需要而定^[5, 6]。在日本，甘草酸也被用于食品中作为甜味剂和增香剂^[7]。

另一方面，甘草酸也被作为前体化合物，用于其它化合物的合成。例如，甘草酸去掉两个葡萄糖醛酸基，生成甘草次酸（Glycyrrhetinic acid，GA）^[8-10]。甘草次酸没有甜味，但是其药理活性比甘草酸强，具有很强的肝保护作用，抗病毒活性及抗肿瘤活性^[8]。目前，利用甘草酸生成甘草次酸主要有两种方法，即化学方法和生物转化方法。化学方法通过酸、碱作用，水解去掉甘草酸的糖基，从而生成甘草次酸^[11]。但是，由于这种方法要用到大量的酸、碱试剂，对环境污染较为严重。而且强酸、强碱对甘草酸结构也会产生一定的破坏作用，从而导致甘草次酸的最终得率下降。例如，在申请专利201010192841.9中^[11]，应用化学方法制备甘草次酸的得率是60％～90％。因此，人们开始尝试用生物转化方法生产甘草次酸。但是，就目前有关报道，用微生物转化甘草酸生成甘草次酸的效率还是比较低。一方面，是因为这些微生物分泌的能够转化甘草酸生成甘草次酸的酶量比较少，另一方面，是因为这些酶的活力比较低。导致了转化甘草酸的效率比较低，至今未见生物转化方法产业化应用。因此，寻找能够高效水解甘草酸的微生物就至关重要。

发明内容

本发明目的是利用生物技术，提供一种酶法转化甘草酸生成甘草次酸的方法，其转化率高，适合甘草次酸是生产制备。

我们研究发现一些真菌可以将甘草酸水解生产甘草次酸。利用马铃薯琼脂等斜面培养基进行真菌培养；再将真菌接种到YPG等液体培养基中发酵产生酶；将酶液加入到甘草酸溶液中，进行转化；将转化生产的甘草次酸进行适当分离纯化，即可得到甘草次酸。

具体地，本发明涉及一种酶法生物转化甘草酸生成甘草次酸的方法，其特征是：采用微生物产生的甘草酸水解酶，对甘草酸进行水解，生成甘草次酸。

优选地，在本发明的方法中，甘草酸水解酶通过将真菌接种到YPG液体培养基中发酵产生酶。

优选地，在本发明的方法中，所述的真菌利用马铃薯琼脂斜面培养基进行培养。

优选地，本发明的方法包括下述步骤：

a)利用马铃薯琼脂等斜面培养基进行真菌培养；b)将真菌接种到YPG液体培养基中发酵产生酶；c)将酶液加入到甘草酸溶液中，进行转化；d)任选地，将转化生产的甘草次酸进行适当分离纯化，得到甘草次酸。

优选地，在本发明的上述各方面，所述的甘草酸水解酶由真菌Aspergillus phoenicis产生。

优选地，在本发明的各方法中，利用甘草酸水解酶对甘草酸进行水解的反应中，作为酶作用的底物的甘草酸的纯度是20%-85%，酶水解作用温度是30-60℃，pH范围是2.5-7.0。

实施例

实施例一：

配制马铃薯琼脂斜面培养基。首先制备马铃薯浸汁：将200 g去皮马铃薯切成小块，加适量水煮沸后80℃浸泡1 h，纱布过滤，水加至1000 mL。然后配制马铃薯琼脂斜面培养基：马铃薯汁100 mL、葡萄糖2 g、琼脂2 g。于1.06 kg/cm²压力下121°C湿热灭菌30 min。

配制液体培养基YPG：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，琼脂15 g，加水1升，pH调至6.0。于1.06 kg/cm²压力下121°C湿热灭菌30 min。

将真菌Aspergillus phoenicis接种在马铃薯琼脂斜面培养基上，25^oC培养三天，然后以无菌水洗下孢子，孢子悬浮液按3％（V/V）接种量接种到500 mL三角瓶（装有200 mL液体培养基）中，恒温摇床25±1℃，150 ～180 rmp/min振荡培养5 天。离心分离得到上清液，超滤浓缩10倍，即为粗酶液。

100 mL 3%（w/w）甘草酸（纯度为85%）溶于175 mL水中，加入125 mL0.2M磷酸缓冲液（pH 5.0），再与100 mL粗酶液混合，在50℃下反应24小时。反应结束后，加入等量水饱和正丁醇溶液终止反应并萃取三次，合并正丁醇层，浓缩，冰干，得到转化产物粗品1.3g。HPLC分析表明甘草酸已全部转化为甘草次酸，粗品中甘草次酸的含量为87%。

将甘草次酸粗品用80%乙醇重结晶2次，得到无色结晶，并测试质谱与核磁共振数据。

ESI-TOF-MS (negative) m/z: 469.3322 [M–H]^–(C₃₀H₄₅O₄; 计算值：469.3318)。

¹H-NMR (600 MHz, 吡啶-d5): δ 0.88(3H, s, Me), 1.09 (3H, s, Me), 1.25 (3H, s, Me), 1.36 (3H, s, Me), 1.44 (3H, s, Me), 1.47 (3H, s, Me), 1.61 (3H, s, Me)。¹³C-NMR (150 MHz, 吡啶-d5): δ39.1 (C-1), 27.2 (C-2), 78.9 (C-3), 39.1 (C-4), 54.9 (C-5), 17.5 (C-6), 32.8 (C-7), 43.2 (C-8), 61.8 (C-9), 37.1 (C-10), 200.5 (C-11), 128.5 (C-12), 169.5 (C-13), 45.5 (C-14), 26.4 (C-15), 26.5 (C-16), 31.9 (C-17), 48.2 (C-18), 41.0 (C-19), 43.8 (C-20), 30.9 (C-21), 37.2 (C-22), 28.6 (C-23), 15.6 (C-24), 16.4 (C-25), 18.7 (C-26), 23.4 (C-27), 28.1 (C-28), 28.5 (C-29), 181.8 (C-30).

实施例二：

1000 mL 3%（w/w）甘草酸（纯度为60%）加入500 mL水中，加入500 mL0.25M磷酸缓冲液（pH 4.0）,再与500 mL在实施例一中得到的粗酶液混合，在40°C下反应24小时。反应结束后，加入等量水饱和正丁醇溶液终止反应并萃取三次，合并正丁醇层，浓缩，冰干，得到转化产物粗品9.1g。HPLC分析表明甘草酸已全部转化为甘草次酸，粗品中甘草次酸的含量为85%。

参考文献

[1] Kitagawa I. Licorice root. A natural sweetener and an important ingredient in Chinese medicine. Pure Appl Chem，2002， 74: 1189-1198.

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[3] Pompei R, Flore O, Marccialis MA, Pani A, Loddo B. Glycyrrhizic acid inhibits virus growth and inactivates virus particles. Nature，1979， 281: 689-690.

[4]Okamoto H, Yoshida D, Mizusaki S. Inhibition of 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced ornithine decarboxylase activity in mouse epidermis by sweetening agents and related compounds. Cancer Lett., 1983, 19: 47-53.

[5] 凌关庭主编：《食品添加剂手册》.化学工业出版社. 北京，1997：165-166.

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[11] 中国专利申请201010192841.9甘草次酸的制备方法。

Claims

1.酶法生物转化甘草酸生成甘草次酸的方法，其特征是：采用微生物产生的甘草酸水解酶，对甘草酸进行水解，生成甘草次酸。

2.权利要求1的方法，特征在于甘草酸水解酶通过将真菌接种到YPG液体培养基中发酵产生酶。

3.权利要求1的方法，特征在于所述的真菌利用马铃薯琼脂斜面培养基进行培养。

4.权利要求1的方法，所述的方法包括下述步骤：

a)利用马铃薯琼脂等斜面培养基进行真菌培养；

b)将真菌接种到YPG液体培养基中发酵产生酶；

c)将酶液加入到甘草酸溶液中，进行转化；

d)任选地，将转化生产的甘草次酸进行适当分离纯化，得到甘草次酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的甘草酸水解酶由真菌Aspergillus phoenicis产生。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征是：利用甘草酸水解酶对甘草酸进行水解的反应中，作为酶作用的底物的甘草酸的纯度是20%-85%，酶水解作用温度是30-60℃，pH范围是2.5-7.0。