CN104342430B - 一种负载离子液体中空液芯微囊化细胞及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种负载离子液体中空液芯微囊化细胞及其应用，该微囊化细胞是通过以下步骤制备获得的：配制含氯化钙、壳聚糖、BMIm]PF₆的混合溶液；将混合溶液与Penicillium purpurogenum Li‑3菌悬液混合，获得混悬液；将混悬液逐滴滴入海藻酸钠溶液中，即得。本发明在微囊化细胞制备过程中添加[BMIm]PF₆，[BMIm]PF₆在微胶囊中以及微胶囊表面形成大量的孔隙，[BMIm]PF₆即聚集这些孔隙、微胶囊表面以及中空液芯内；[BMIm]PF₆的加入不仅使得微胶囊三层结构之间的联系更加紧密，提高了微胶囊的机械强度；而且还提高了微胶囊的传质性能，提高了微囊化细胞的生物催化活性。

Description

一种负载离子液体中空液芯微囊化细胞及其应用

技术领域

本发明属于生物微胶囊固定化细胞技术领域，具体涉及一种负载离子液体中空液芯微囊化细胞及其应用。

背景技术

离子液体(Ionic liquids，ILs)是室温下呈液体的有机熔盐，它由有机阳离子(如烷基咪唑离子、烷基吡啶离子、季胺盐离子等)和不同负离子组成。与传统的水和有机溶剂相比，离子液体具有以下特性：1)基本无蒸汽压，不易燃易爆，有优异的化学和热稳定性；2)对许多有机和无机化合物具有良好溶解性，并且易分离溶解于其中的化合物；3)使酶或微生物全细胞表现出较高的催化活性、操作稳定性和立体选择性。

近年来，陆续出现了一些在绿色、高性能离子液体介质体系中利用全细胞体系进行生物催化反应的研究报道。此前，全细胞催化经常使用有机溶剂和水组成的两相系统作为催化介质，但有机溶剂本身的毒性会对细胞膜造成破坏，影响其催化能力，还造成环境污染，那么采用离子液体来替代有机溶剂则是一种新的尝试。研究表明，以离子液体作为催化介质，不仅有利于维持细胞的完整性、改善细胞膜的通透性，并且能够提高其催化能力以及化学键的选择性。

文献(李扬，曹红*，李春，郑兰，张馨.不同阴离子组成的离子液体对产紫青霉生长、代谢及催化特性的影响[J].高等学校化学学报,2014,35(5):1057-1062.DOI:10.7503/cjcu20130859)以甘草酸(Glycyrrhizin,GL)生物转化为更高效、更安全的单葡萄糖醛酸基甘草次酸(Glycyrrhetinic acid monoglucuronide,GAMG)为目的，分别在几种含不同离子液体的介质中初步进行了Penicillium purpurogenum Li-3全细胞生物转化GL生成GAMG的研究。结果表明，在1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIM]PF₆)/缓冲液两相体系中，GAMG的产率比在纯缓冲液中高出了2倍多。由此可以看出，选择适当的离子液体作为催化介质可以提高Penicillium purpurogenum Li-3菌株全细胞催化效率。

然而，离子液体作为生物催化介质价格昂贵、使用量大以及回收困难而导致使用成本高的问题一直成为其应用于生物催化领域亟待解决的难题。

此外，为了增加底物的转化量、提高微生物全细胞催化的稳定性和重复利用率，以及增强细胞对逆境的耐受性，文献(Hong Cao,Hai Ye,Chun Li,Lan-Lan Zheng,Yang Li,Qiao-Feng Ouyang.Effect of microencapsulated cell preparation technology andconditions on Penicillium purpurogenum Li-3strain cells usable performance[J].Process Biochemistry,2014,49:791–796.)选用无毒且生物相容性较好的海藻酸钠和壳聚糖作为制备微胶囊的材料：先利用离子移变作用，制得载细胞海藻酸钙微球；再利用聚电解质络合反应，用壳聚糖溶液在制得的载细胞海藻酸钙凝胶微球(囊芯)的表面覆一层半透囊膜，即制得海藻酸钠-壳聚糖微胶囊固定化Penicillium purpurogenum Li-3细胞(以下简称微囊化细胞)。实验结果显示，该微囊化细胞重复使用12次后，细胞活性回收率仍能达到55.3％，细胞破损率仅为7.1％。这一尝试为将细胞固定化技术应用于生物转化GL定向合成GAMG提供了依据。

在上述前期工作的基础上，若能将离子液体应用到细胞固定化技术中，不仅能进一步促进细胞的催化活性，还能大大减少了离子液体的使用量，并且利于离子液体的循环利用，对于离子液体使用成本高、使用量大和难于回收利用的问题便迎刃而解。但关于负载离子液体微囊化细胞制备及其在生物催化领域的应用至今未见报道。

发明内容

本发明提供了一种负载离子液体中空液芯微囊化细胞，该微囊化细胞中负载有离子液体，从而大大提升了微囊化细胞的催化活性。

一种负载离子液体中空液芯微囊化细胞，是通过以下步骤制备获得的：

(1)配制含氯化钙、壳聚糖、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的混合溶液；

(2)将该混合溶液与Penicillium purpurogenum Li-3菌悬液混合，获得混悬液；

(3)将所述混悬液逐滴滴入海藻酸钠溶液中，即得所述负载离子液体中空液芯微囊化细胞。

通过本发明的制备方法能够制备出具有三层结构(从内至外依次为：海藻酸钙凝聚层、壳聚糖/海藻酸钠络合层和壳聚糖沉积层)且内部为液态的中空球状微胶囊，菌体细胞则被包埋在中空液芯中。未加入[BMIM]PF₆时，这三层结构之间的作用并不是很强，但当[BMIM]PF₆加入后，[BMIM]PF₆能与壳聚糖分子链上的活泼基团-NH₂和-OH发生反应，能与海藻酸钙、海藻酸钠分子链上的活泼基团-COOH和-OH发生反应，从而使囊膜的三层结构联系更为紧密，同时这种相互作用也限制了高分子链的链段运动，使得高分子链的刚性增强，且高分子链排列更加紧密，提高了囊膜的机械强度。

并且，未添加[BMIm]PF₆制成的微囊化细胞虽然也是多孔结构，但囊膜结构较为致密，传质性能稍差；添加[BMIm]PF₆后，[BMIm]PF₆改变了囊膜的致密性，使囊膜的孔隙量增多；从而本发明的微囊化细胞中，[BMIm]PF₆通过与壳聚糖和海藻酸钠的相互作用被固载在囊膜的孔隙或表面，中空液芯中也存在有部分[BMIm]PF₆。

增加的孔隙不仅为处于中空液芯的菌体细胞提高了更多的生长空间，也更加有利于底物与产物的交换，提高了囊膜的传质性能；并且，[BMIm]PF₆也被固定在中空液芯、以及囊膜的孔隙或表面，由于能与Penicillium purpurogenum Li-3充分接触，少量的[BMIm]PF₆也能充分促进细胞的生物催化性能，大大降低了[BMIm]PF₆等离子液体在生物催化体系中的使用成本，解决了现有技术中离子液体使用量大、难以回收利用等问题。

具体地，所述负载离子液体中空液芯微囊化细胞(以下简称微囊化细胞)是通过以下步骤制备获得的：

(1)配制含氯化钙、壳聚糖、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的混合溶液；

先配制含氯化钙、壳聚糖的醋酸溶液，然后在醋酸溶液中加入1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIm]PF₆)，混合均匀，获得混合溶液。

所述混合溶液中，氯化钙、壳聚糖、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的重量比优选为1：1～2：2～14，更优选为1:2:6；在该重量比下，微囊化细胞的机械强度和催化活性表现为最佳。

作为优选，醋酸溶液中醋酸的浓度为0.17-0.18mol/L，氯化钙的浓度为10～20g/L，壳聚糖的浓度为20～40g/L；作为进一步优选，醋酸溶液中醋酸的浓度为0.175mol/L，氯化钙的浓度为15g/L，壳聚糖的浓度为30g/L。

作为优选，所述混合溶液中，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的浓度为45～135g/L。与未添加[BMIm]PF₆制成的微囊化细胞相比，采用45～135g/L的[BMIm]PF₆制成的微囊化细胞具有更好的球形度，机械强度更高，生物催化能力大大提高。[BMIm]PF₆浓度高于该范围时，微囊化细胞的机械强度和生物催化能力均有所下降。

作为进一步优选，所述混合溶液中，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的浓度为45～105g/L；更优选为45～90g/L；最优选为90g/L。此时微囊化细胞的机械强度和生物催化能力均达到最佳。

本发明中，如未作特殊说明，所述[BMIm]PF₆的纯度均大于99％。以免引入杂质，影响微胶囊的组成和结构，甚至影响微囊化细胞的催化活性。

(2)将该混合溶液与Penicillium purpurogenum Li-3菌悬液混合，获得混悬液；

所述Penicillium purpurogenum Li-3的保藏号为CGMCC No.446。

作为优选，所述Penicillium purpurogenum Li-3菌悬液的浓度为4～6g/L；并以2.5～3.5mL菌悬液/100mL混悬液的比例，将菌悬液与混合溶液混合。优选地，采用对数生长期的Penicillium purpurogenum Li-3制备菌悬液，以保证细胞的活力。

限定菌悬液与混合溶液的混合比例有利于限制混合溶液中钙离子、[BMIm]PF₆、菌体浓度。其中，若钙离子浓度过高，海藻酸钙凝聚层较厚、致密性较高，影响传质；若钙离子浓度过低，微胶囊的囊膜结构较为疏松，微胶囊机械强度降低，易于破碎。而若菌体浓度太低，则微囊化细胞活性低，催化效率低；若菌体浓度太高，位于微囊化细胞液芯内的菌种生存空间受限，营养物质的传质和底物及产物的传质都会受到影响，不利于催化。

(3)将所述混悬液逐滴滴入海藻酸钠溶液中，即得所述负载离子液体中空液芯微囊化细胞。

步骤(3)中，混悬液液滴的体积为45～50μL/滴。若混悬液液滴过大，则液芯负荷过重，并且使得微胶囊体积过大，在振摇状态下培养时会受到较大的剪切力，导致其机械强度降低；若混悬液液滴过小，则液芯中菌体含量过少，降低催化效率。

本发明还提供了所述负载离子液体中空液芯微囊化细胞在生产单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)中的应用。

所述应用包括：将所述负载离子液体中空液芯微囊化细胞置于含有甘草酸的基础产酶培养基中培养。

作为优选，所述负载离子液体中空液芯微囊化细胞的添加量为4～12g/100mL基础产酶培养基。适宜的添加量不仅可以促进反应进行，同时还可有效地缩短催化反应周期，更有利于酶的表达。低于该添加量范围，则GAMG的产率太低；高于该范围，则GAMG的产率开始下降。

作为进一步优选，所述负载离子液体中空液芯微囊化细胞的添加量为6～10g/100mL基础产酶培养基。最优选地，微囊化细胞的添加量为8g/100mL基础产酶培养基。在添加量为6～10g/100mL基础产酶培养基时，GAMG产率的增长量已不明显，在添加量为8g时GAMG产率达到最大。

作为优选，所述培养为：在32℃、150r/min下培养48～192h；更优选为在32℃、150r/min下培养120～192h。在该培养条件下，GAMG产率度过对数增长期，进入稳定期，并在培养192h时达到最大。

本发明的负载离子液体中空液芯微囊化细胞在有效回收并重复利用9次后，GAMG产率还可达到65.03％，同时其球形度仍保持良好，仍可继续使用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明在微囊化细胞制备过程中添加离子液体[BMIm]PF₆，[BMIm]PF₆在微胶囊中以及微胶囊表面形成大量的孔隙，[BMIm]PF₆即聚集这些孔隙、微胶囊表面以及中空液芯内；[BMIm]PF₆的加入不仅使得微胶囊三层结构之间的联系更加紧密，提高了微胶囊的机械强度；而且还提高了微胶囊的传质性能，提高了微囊化细胞的生物催化活性；解决离子液体在生物催化中使用成本高、使用量大和难于回收利用的问题，为离子液体在全细胞和生物酶催化领域的应用提供了新的方法与思路。

附图说明

图1为本发明负载离子液体中空液芯微囊化Penicillium purpurogenum Li-3细胞的外观图；

图2为负载不同浓度[BMIm]PF₆的微囊化细胞的机械强度；

图3a为未负载[BMIm]PF₆的微囊化细胞的SEM观察图；

图3b为负载45.0g/L[BMIm]PF₆的微囊化细胞的SEM观察图；

图3c为负载90.0g/L[BMIm]PF₆的微囊化细胞的SEM观察图；

图3d为负载135.0g/L[BMIm]PF₆的微囊化细胞的SEM观察图；

图3e为负载180.0g/L[BMIm]PF₆的微囊化细胞的SEM观察图；

图4为催化振摇条件下微囊化细胞负载[BMIM]PF₆的损失情况；

图5为负载不同浓度[BMIM]PF₆微囊化细胞的GAMG产率；

图6为未负载离子液体与负载90.0g/L[BMIm]PF₆的微囊化细胞生物催化的时间动力学考察；

图7为负载90.0g/L[BMIm]PF₆的微囊化细胞的加入量对GAMG产率的影响；

图8为甘草酸在未负载[BMIm]PF₆微囊化细胞中的传质曲线；

图9为甘草酸在负载[BMIm]PF₆微囊化细胞中的传质曲线；

图10为负载[BMIm]PF₆微囊化细胞的重复利用次数与GAMG产率的关系图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

实施例1

一种负载离子液体中空液芯微囊化细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)配制含15g·L^-1氯化钙、30g·L^-1壳聚糖的醋酸溶液，其中，氯化钙的浓度为15g·L^-1，壳聚糖的浓度为30g·L^-1，醋酸的浓度为0.175mol·L^-1。

(2)步骤(1)制得的醋酸溶液中加入纯度大于99％的[BMIm]PF₆至其浓度为90.0g·L^-1，并将其磁力搅拌2h，混合均匀，获得混合溶液。

(3)移取100mL基础产酶培养基加入锥形瓶中，灭菌，接种Penicilliumpurpurogenum Li-3，于30℃、170r/min下培养96h后，离心(20℃，8000r/min，10min)，弃上清；取菌体，用0.9％生理盐水洗涤、离心，称菌体湿重，用0.9％生理盐水重悬，制成5g·L-1Penicillium purpurogenum Li-3菌悬液，4℃保存，备用。

(4)取3mL步骤(3)配制的Penicillium purpurogenum Li-3菌悬液，在磁力搅拌下加入步骤(2)配制的含90.0g·L-1[BMIM]PF₆的灭菌混合溶液至100mL，充分混匀，获得混悬液。

(5)配制10g·L^-1海藻酸钠溶液，灭菌，待用。

(6)将步骤(4)搅拌好的混悬液经蠕动泵(蠕动泵所用硅胶管内径为0.8mm，滴速为125rpm(即蠕动泵电机转速)。)逐滴滴入10g·L^-1的海藻酸钠溶液中，即得负载离子液体中空液芯微囊化Penicillium purpurogenum Li-3细胞(以下简称微囊化细胞)，取出微囊化细胞，用无菌生理盐水冲洗3次，然后置于生理盐水中4℃保存。

上述步骤中所用试剂均为分析纯试剂，实验用水为二次蒸馏水；步骤(3)中所用基础产酶培养基的配方为：甘草酸2.8g、NaNO₃3.0g、K₂HPO₄0.8g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、KCl 0.5g、FeSO₄0.01g，1000mL蒸馏水，灭菌。

如图1可见，负载90.0g·L^-1[BMIM]PF₆的微囊化细胞是颜色微白的半透明球体，且具有更好的球形度，通过肉眼可以明显的观察到其在水中时的囊膜与囊芯结构。

实施例2

分别将10g负载不同浓度[BMIM]PF₆的微囊化细胞放入内盛100mL生理盐水的锥形瓶中，将锥形瓶置于32℃、150r/min摇床上振摇，间隔不同时间取样、计录完整微胶囊的个数，计算微胶囊的破损率。然后，将完整微胶囊继续投入生理盐水中检测，考察负载不同浓度[BMIM]PF₆的微囊化细胞的机械强度(图2)。

从图2可以看出，随着振摇时间的增加，微胶囊的破损率会不断增大，即机械强度减小。当振摇168h后，没有负载[BMIM]PF₆的微胶囊的破损率最大。

这是由于该微胶囊的囊膜是由海藻酸钙凝聚层、壳聚糖/海藻酸钠聚电解质层和壳聚糖沉积层这三层结构构成的，在加入[BMIM]PF₆前，这三层结构之间的作用并不是很强，但当[BMIM]PF₆加入后，[BMIM]PF₆能与壳聚糖分子链上的活泼基团-NH₂和-OH发生反应，能与海藻酸钙、海藻酸钠分子链上的活泼基团-COOH和-OH发生反应，从而使囊膜的三层结构联系更为紧密，同时这种相互作用也限制了高分子链的链段运动，使得高分子链的钢性增强，且高分子链排列得更加紧密，提高了囊膜的机械强度。

由图2可见，当[BMIM]PF₆浓度增加至90.0g·L^-1时，囊膜的破损率最小，这是由于[BMIM]PF₆的加入量越大，[BMIM]PF₆与壳聚糖和海藻酸钙之间的作用就越强，则囊膜的机械强度就越大，不仅保证了材料结构的稳定性，还可以减小微胶囊在催化培养振摇过程中的破损率。当[BMIM]PF₆浓度继续增加时，囊膜的破损率逐渐增大，这是由于[BMIM]PF₆浓度增加后，与海藻酸钠、壳聚糖之间作用的机会就越多，而阻碍海藻酸钠与CaCl₂、壳聚糖和海藻酸钠之间相互作用的力就越大，则微胶囊的三层结构就越难形成；另外，[BMIM]PF₆浓度越大，会导致溶液的粘度也越大，使得壳聚糖分子链缠结在一起而不能充分打开，阻碍了海藻酸钠与壳聚糖之间的作用，因此囊膜的机械强度就会减小。

综上所述，本申请选择[BMIM]PF₆最适浓度为90.0g·L^-1，以保证微囊化细胞最佳的机械强度。

实施例3

将负载不同浓度[BMIm]PF₆的微囊化细胞置于65℃真空干燥箱内抽真空干燥24h后，进行扫描电镜分析，对负载不同浓度[BMIM]PF₆的微囊化细胞的微观形貌进行表征，分析结果见图3a、3b、3c、3d、3e。

由图3a可见，未负载[BMIm]PF₆的微囊化细胞，其表面基本是很光滑，只存在很少的皱褶，这说明此微囊化细胞的囊膜中各组分间具有很好的相容性。

由图3b([BMIm]PF₆浓度为45.0g·L^-1)和图3c([BMIm]PF₆浓度为90.0g·L^-1)可见，负载[BMIm]PF₆的微囊化细胞，囊膜上产生了较多的孔隙，且其表面基本较光滑，当[BMIm]PF₆的加入量为90.0g·L^-1时，微囊化细胞表面的孔隙最多。

这是因为，未添加[BMIm]PF₆制成的微囊化细胞虽然也是多孔结构，但囊膜结构较为致密，传质性能稍差；添加[BMIm]PF₆后，[BMIm]PF₆改变了囊膜的致密性，使囊膜的孔隙量增多，如此不仅为处于中空液芯的菌体细胞提高了更多的生长空间，增多的空隙也更加有利于底物与产物的交换，提高了囊膜的传质性能。

由图3d([BMIm]PF₆浓度为135.0g·L^-1)和图3c([BMIm]PF₆浓度为180.0g·L^-1)可见，随着[BMIm]PF₆加入量逐渐增多，囊膜上的孔隙越来越少，且其表面也越来越粗糙，当[BMIm]PF₆的加入量为180.0g·L^-1时，微胶囊的囊膜上只存在很少的孔隙，且其表面的皱褶较多。

这是因为，随着[BMIm]PF₆的加入量增大，未参加作用的多余[BMIm]PF₆就会堆积在微胶囊的表面，从而使得微胶囊表面的孔隙被堵塞，并产生一定的粗糙及皱褶现象。

实施例4

分别取8g负载[BMIM]PF₆浓度为45.0g·L^-1、90.0g·L^-1、135.0g·L^-1、180.0g·L^-1的微囊化细胞，置于装有100mL纯化水的锥形瓶中，于32℃、150r/min的恒温摇床振摇，每隔24h取出2mL振摇液，将其与甲醇1:1混合摇匀，采用紫外分光光度计法测定振摇液中[BMIM]PF₆的浓度，计算[BMIM]PF₆的损失率，考察催化振摇条件下[BMIm]PF₆的损失情况(图4)。

由图4可见，在相同的振摇时间下，微囊化细胞中负载[BMIM]PF₆浓度越高，[BMIM]PF₆的损失率也越大。其中，当微囊化细胞中负载[BMIM]PF₆浓度分别为45.0g·L^-1、90.0g·L^-1时，随着振摇时间的延长，[BMIM]PF₆的损失率增大的趋势均很小；当微囊化细胞中负载[BMIM]PF₆浓度分别为135.0g·g·L^-1时，随着振摇时间的延长，[BMIM]PF₆的损失率增大的趋势开始逐渐明显；当[BMIM]PF6浓度为180.0g·L^-1时，[BMIM]PF₆的损失率增大的趋势最大。

这是因为，正如实施例3所述，[BMIM]PF₆不仅负载在中空液芯和多孔结构囊膜的孔隙内，而且还能通过与壳聚糖与海藻酸钠的相互作用而负载在微胶囊上。然而[BMIM]PF₆浓度越大，囊膜上的孔隙、可与[BMIM]PF₆作用的结合位点就相对越少，未参加作用的多余的[BMIM]PF₆堆积在微胶囊表面，这部分堆积的[BMIM]PF₆与微胶囊的相互作用力很弱，因此随着振摇时间的增加，[BMIM]PF₆的流失量越多。

实施例5

无菌条件下，分别将负载不同浓度[BMIM]PF₆的微囊化细胞置于装有基础产酶培养基的锥形瓶中，于32℃、150r/min的恒温摇床振摇，每隔一定时间取样1mL，采用高效液相色谱法检测，考察负载不同浓度[BMIM]PF₆的微囊化细胞生物催化的能力(图5)。

从图5可以看出，随着微囊化细胞负载[BMIM]PF₆浓度的增加，GAMG的产率不断的增加，当[BMIM]PF₆的浓度为90.0g·L^-1时，GAMG的产率最大；当[BMIM]PF₆的浓度大于90.0g·L^-1时，GAMG的产率则呈下降趋势。

这是因为，首先，[BMIM]PF₆本身对酶的柔性构象状态产生一定影响，使酶与GL上的糖苷键较易于形成酶底物中间络合物，从而利于GAMG形成；其次，正如实施例3所述，随[BMIM]PF₆浓度的增加，囊膜的孔隙增多，而较多的孔隙利于底物与产物的进入与传出，同时也利于细胞的生长，从而增加了GAMG的产率。而当[BMIM]PF₆浓度过大时，多余的[BMIM]PF₆会堵塞囊膜的的孔隙，同时液芯的粘度也会增大，导致底物和产物及营养物质的传质受到严重阻碍，最终影响细胞的生长与生物催化反应的进行。

综上所述，本发明微囊化细胞中负载[BMIM]PF₆的较适浓度为45～105g·L^-1，最佳浓度为90g·L^-1。

实施例6

无菌条件下，分别取8g没有负载离子液体的液芯微囊化细胞、负载90.0g·L^-1[BMIm]PF₆的微囊化细胞置于100mL基础产酶培养基中，于32℃、150rpm的恒温摇床中进行催化反应，每隔一定时间取样，采用高效液相色谱法检测，考察两种液芯微囊化细胞催化GL生成GAMG的时间动力学(图6)。

从图6可以看出，两种微囊化细胞生物催化的时间动力学均呈现“S”型规律，即GAMG的产率都是先逐渐增加，当达到一定时间后GAMG的产率趋于稳定。原因是随着GAMG的不断生成，产物抑制作用逐渐增强。此外，通过比较不难看出，在反应初期二者都有一段延滞期，这是由于底物及其它营养物质须要经囊膜传递后才能进入微囊化细胞的液芯内，而且细胞在微囊环境中也需要一定的时间来调整自身的生理状态，并重新合成必需的酶类、辅酶或某些中间代谢产物来适应新的环境。相比较而言，负载[BMIm]PF₆的微囊化细胞的延滞期较短，说明负载[BMIm]PF₆的微胶囊载体更利于菌体的生长和催化。反应24h后，负载[BMIm]PF₆的微囊化细胞体系中GAMG的产率明显高于未负载离子液体的微囊化细胞体系，当反应进行192h时，与没有负载离子液体的微囊化细胞体系相比，负载[BMIm]PF₆微囊化细胞的体系中GAMG的产率增加了16.8％。

实施例7

分别称取2g、4g、6g、8g、10g、12g的微囊化细胞([BMIM]PF₆负载浓度为90g·L^-1)，加入盛有100mL基础产酶培养基的锥形瓶中，再置于32℃、150r/min的恒温摇床中，培养78h后取样，采用高效液相色谱法检测，考察微囊化细胞的加入量对GAMG产率的影响(图7)。

从图7可以看出，随着微囊化细胞的加入量增加，GAMG的产率越来越大，这是由于微囊化细胞加入量越多，则Penicillium purpurogenum Li-3表达酶的绝对总量就越多，生物催化效率就越高，GAMG的产率也就越高。当微囊化细胞加入量为8g时，GAMG的产率达到最大；而当微囊化细胞的加入量继续增加后，GAMG的产率则减小。这是因为，若微囊化细胞的加入量过多，则溶氧及养分利用就越差，而且菌体所产生的代谢物也越多，进而导致微囊内的菌体越易衰亡，因此减少了酶的表达。由此，适宜的微囊化细胞量不仅可以促进反应进行，同时还可有效地缩短催化反应周期，更有利于酶的表达。本发明中，每100mL基础产酶培养基中微囊化细胞的最适加入量为8g。

实施例8

分别制取不含菌体的无负载[BMIM]PF₆的液芯微胶囊和负载[BMIM]PF₆的液芯微胶囊，然后进行GL的传质实验，绘制传质曲线图(图8、图9)，并计算传质系数k(表1)，考察负载离子液体液芯微胶囊对GL的传质性能。

由图8、图9可知，传质实验初期，两种微胶囊体系中GL浓度均下降得很快，这是由于最初时微胶囊内外的GL浓度相差很大，则其对应的传质推动力也很大，因而GL的传质速率很快；随着时间的推移，微胶囊内GL含量不断增加，则微胶囊内外GL的浓度差逐渐变小，其对应的传质推动力也会越来越小，使GL扩散速率也随之下降，直至微胶囊内外的GL浓度达到平衡，传质也就达到了平衡。

并且，对图8和图9进行比较，在相同时间下，负载[BMIM]PF₆的液芯微胶囊外的GL浓度比无负载[BMIM]PF₆的液芯微胶囊要低，表明负载[BMIM]PF₆的液芯微胶囊的传质速率更快。

表1底物GL在微胶囊中的扩散系数

由表1可见，GL在负载离子液体液芯微胶囊内的传质要明显优于无负载离子液体液芯微胶囊，这与负载ILs的微胶囊囊膜上孔隙增多有关，与图8、图9的结果相一致，也对实施例6的结果进行了验证。

实施例9

有效回收并反复利用本发明的微囊化细胞是降低成本的关键。称取负载90.0g/L[BMIM]PF₆的微囊化细胞8g，置于盛有100mL基础产酶培养基的锥形瓶中，于32℃、150r/min的恒温摇床中，进行重复批次的催化反应，每次催化反应160h；每批次催化结束前后采用高效液相色谱法取样检测反应液中GAMG浓度，计算GAMG的产率。对负载离子液体微囊化Penicillium purpurogenum Li-3细胞的重复利用性进行考察(图10)。

由图10可知，随着微囊化细胞重复利用次数的增加，GAMG的产率会逐渐降低，但其降低的幅度并不太大，这是因为菌体细胞被固定在微胶囊中，微胶囊对菌体细胞具有保护作用，当把初次培养至稳定后期的微囊化细胞转接入新鲜的培养基后，微胶囊内的Penicillium purpurogenum Li-3细胞会再次生长与产酶，进而产生代谢产物，同时前期的实验表明离子液体[BMIM]PF₆对Penicillium purpurogenum Li-3细胞的生长也具有较明显的促进作用。微囊化细胞经过连续使用9次后，GAMG的产率还可达到65.03％，同时发现其球形度也仍保持良好，仍可继续使用。重复使用时，从原培养液中取出微囊化细胞即可，不必单独分离菌体或[BMIM]PF₆，便于对菌体细胞、[BMIM]PF₆的收集和再利用。由此体现了该负载离子液体中空液芯微胶囊在固定化微生物培养方面具有很大的发展潜力。

Claims (1)

1.一种负载离子液体中空液芯微囊化细胞在生产单葡萄糖醛酸基甘草次酸中的应用，其特征在于，

所述负载离子液体中空液芯微囊化细胞，是通过以下步骤制备获得的：

(1)配制含氯化钙、壳聚糖、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的混合溶液；

(2)将该混合溶液与Penicillium purpurogenum Li-3菌悬液混合，获得混悬液；

(3)将所述混悬液逐滴滴入海藻酸钠溶液中，即得所述负载离子液体中空液芯微囊化细胞；

所述混合溶液中，氯化钙、壳聚糖、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的重量比为1：1～2：2～14；

所述混合溶液中，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的浓度为45～105g/L；

所述Penicillium purpurogenum Li-3菌悬液的浓度为4～6g/L；并以2.5～3.5mL菌悬液/100mL混悬液的比例，将菌悬液与混合溶液混合；

步骤(3)中，混悬液液滴的体积为45-50μL/滴；

所述应用为：将所述负载离子液体中空液芯微囊化细胞置于含有甘草酸的基础产酶培养基中培养；

所述负载离子液体中空液芯微囊化细胞的添加量为6～10g/100mL基础产酶培养基；

所述培养的条件为：在32℃、150r/min下培养48～192h。