JP5019519B2 - ロドコッカス属細菌由来の抗菌活性物質及びそれを用いた微生物防除法 - Google Patents
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Description
(a) Rhodococcus erythropolis JCM6821
(b) Rhodococcus erythropolis JCM6822
(c) Rhodococcus erythropolis JCM6823
(d) Rhodococcus erythropolis JCM6824
(e) Rhodococcus erythropolis JCM6827
(f) Rhodococcus erythropolis DSM11397
(g) Rhodococcus erythropolis DSM44522
(h) Rhodococcus globerulus DSM44519
(i) Rhodococcus erythropolis JCM2895
(j) Rhodococcus erythropolis JCM2893
(k) Rhodococcus erythropolis JCM2894
(l) Rhodococcus erythropolis DSM9675
(m) Rhodococcus erythropolis DSM43200
(n) Rhodococcus erythropolis IAM1400
(o) Rhodococcus erythropolis IAM1503
(p) Rhodococcus ruber DSM43338
(q) Rhodococcus rhodnii DSM43336
(r) Rhodococcus zopfii DSM44189
[2] [1]の(a)から(e)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から精製により得られる抗菌活性物質であって、グラム染色陽性細菌(phylum Actinobacteria、phylum Firmicutes)に対して抗菌作用を持つ抗菌活性物質。
[3] [1]の(a)から(e)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から精製により得られる抗菌活性物質であって、じゃがいもそうか病菌に対し抗菌作用を持つ抗菌活性物質。
[4] [1]の(a)から(e)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から精製により得られる抗菌活性物質であって、スイートピー帯化病菌に対し抗菌作用を持つ抗菌活性物質。
[5] [1]の(f)から(h)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から精製により得られる抗菌活性物質であって、少なくともロドコッカス及びノカルジア(Nocardia)に属する菌並びにファーミキューテス(phylum Firmicutes)に分類される菌に対して抗菌作用を持つ抗菌活性物質。
[6] [1]の(i)から(o)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から精製により得られる抗菌活性物質であって、少なくともロドコッカス・エリスロポリスに対する抗菌作用を持つ抗菌活性物質。
[7] [1]の(p)に示されるロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から精製により得られる抗菌活性物質であって、少なくともシノリゾビウム(Sinorhizobium)及びアルスロバクター(Arthrobacter)に属する菌に対して抗菌作用を持つ抗菌活性物質。
[8] [1]の(q)に示されるロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から精製により得られる抗菌活性物質であって、少なくともアルスロバクター(Arthrobacter)に属する菌に対して抗菌作用を持つ抗菌活性物質。
[9] [1]の(r)に示されるロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から精製により得られる抗菌活性物質であって、少なくとも大腸菌(Escherichia)に属する菌に対して抗菌作用を持つ抗菌活性物質。
[10] ロドコッカス属細菌菌株からの精製が有機溶媒による抽出及び逆相クロマトグラフィー用固定相を用いた固相抽出により行われる[1]〜[9]のいずれかの抗菌活性物質。
[12] [1]〜[11]のいずれかの抗菌活性物質の少なくとも1つを有効成分として含有する抗菌剤。
[13] [1]の(a)から(r)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物からの分離により得られる抗菌活性画分。
[14] [1]の(a)から(e)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物からの分離により得られるじゃがいもそうか病菌に対して抗菌活性を示す抗菌活性画分。
[15] [1]の(a)から(e)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から分離により得られるスイートピー帯化病菌に対して抗菌活性を示す及び抗菌活性画分。
[16] [1]の(f)から(h)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から分離により得られる抗菌活性画分であって、少なくともロドコッカス及びノカルジア(Nocardia)に属する菌並びにファーミキューテス(phylum Firmicutes)に分類される菌に対して抗菌作用を示す抗菌活性画分。
[17] [1]の(i)から(o)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から分離により得られる抗菌活性画分であって、少なくともロドコッカス・エリスロポリスに対する抗菌作用を示す抗菌活性画分。
[18] [1]の(p)に示されるロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から分離により得られる抗菌活性画分であって、少なくともシノリゾビウム(Sinorhizobium)及びアルスロバクター(Arthrobacter)に属する菌に対して抗菌作用を示す抗菌活性画分。
[19] [1]の(q)に示されるロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から分離により得られる抗菌活性画分であって、少なくともアルスロバクター(Arthrobacter)に属する菌に対して抗菌作用を示す抗菌活性画分。
[20] [1]の(r)に示されるロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から分離により得られる抗菌活性画分であって、少なくとも大腸菌(Escherichia)に属する菌に対して抗菌作用を示す抗菌活性画分。
[22] 有機溶媒による抽出が酢酸エチルによる抽出である[21]の抗菌活性画分。
[23] [13]〜[22]のいずれかの抗菌活性画分の少なくとも1つを有効成分として含有する抗菌剤。
[24] [1]の(a)から(r)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株の培養物を有効成分として含有する抗菌剤。
[25] [1]の(a)から(e)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株の培養物を有効成分として含有するじゃがいもそうか病菌に対して抗菌活性を示す抗菌剤。
[26] [1]の(a)から(e)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株の培養物を有効成分として含有するスイートピー帯化病菌に対して抗菌活性を示す抗菌剤。
[27] [1]の(f)から(h)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株の培養物を有効成分として含有する、少なくともロドコッカス及びノカルジア(Nocardia)に属する菌並びにファーミキューテス(phylum Firmicutes)に分類される菌に対して抗菌活性を示す抗菌剤。
[28] [1]の(i)から(o)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株の培養物を有効成分として含有する、少なくともロドコッカス・エリスロポリスに対する抗菌活性を示す抗菌剤。
[29] [1]の(p)に示されるロドコッカス属細菌菌株の培養物を有効成分として含有する、少なくともシノリゾビウム(Sinorhizobium)及びアルスロバクター(Arthrobacter)に属する菌に対して抗菌活性を示す抗菌剤。
[30] [1]の(q)に示されるロドコッカス属細菌菌株の培養物を有効成分として含有する、少なくともアルスロバクター(Arthrobacter)に属する菌に対して抗菌活性を示す抗菌剤。
[32] [1]の(a)から(r)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該菌株の培養物から抗菌活性を有する物質を精製することを特徴とするロドコッカス属細菌菌株由来の抗菌活性物質製造法。
[33] ロドコッカス属細菌菌株からの精製が有機溶媒による抽出及び逆相クロマトグラフィー用固定相を用いた固相抽出により行われる[32]のロドコッカス属細菌菌株由来の抗菌活性物質製造法。
[34] 有機溶媒による抽出が酢酸エチルによる抽出であり、固相抽出の移動相がエタノール又はメタノールである[33]のロドコッカス属細菌菌株由来の抗菌活性物質製造法。
[35] [1]の(a)から(r)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該菌株の培養物から抗菌活性を有する画分を分離することを特徴とするロドコッカス属細菌菌株由来の抗菌活性画分の製造法。
[36] ロドコッカス属細菌菌株からの分離が有機溶媒による抽出により行われる[35]のロドコッカス属細菌菌株由来の抗菌活性画分の製造法。
[37] 有機溶媒による抽出が酢酸エチルによる抽出である[36]のロドコッカス属細菌菌株由来の抗菌活性画分の製造法。
[38] [1]〜[11]のいずれかの抗菌活性物質、[13]〜[22]のいずれかの抗菌活性画分並びに[12]、[23]〜[31]のいずれかの抗菌剤からなる群から選択される抗菌活性物質、抗菌活性画分又は抗菌剤の少なくとも1つを有効成分として用い、抗菌作用を得ることを特徴とする微生物防除の方法。
[39] [38]の微生物防除の方法であって、[1]〜[11]のいずれかの抗菌活性物質、[13]〜[22]のいずれかの抗菌活性画分並びに[12]、[23]〜[31]のいずれかの抗菌剤からなる群から選択される抗菌活性物質、抗菌活性画分又は抗菌剤の複数を組合せて用いることを特徴とする微生物防除の方法。
[40] [3]の抗菌活性物質、[14]の抗菌活性画分及び[1]の(a)から(e)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株の培養物からなる群から選択される抗菌活性物質、抗菌活性画分又は培養物の少なくとも1つを有効成分として用いることを特徴とする、じゃがいもそうか病菌防除の方法。
[41] [3]の抗菌活性物質、[14]の抗菌活性画分及び[1]の(a)から(e)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株の培養物からなる群から選択される抗菌活性物質、抗菌活性画分又は培養物の複数を組合せて用いる及びことを特徴とする、じゃがいもそうか病菌防除の方法。
[42] [4]の抗菌活性物質、[15]の抗菌活性画分及び[1]の(a)から(e)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株の培養物からなる群から選択される抗菌活性物質、抗菌活性画分又は培養物の少なくとも1つを有効成分として用いることを特徴とする、スイートピー帯化病菌防除の方法。
[43] [4]の抗菌活性物質、[15]の抗菌活性画分及び[1]の(a)から(e)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株の培養物からなる群から選択される抗菌活性物質、抗菌活性画分又は培養物の複数を組合せて用いる及びことを特徴とする、スイートピー帯化病菌防除の方法。
1. 抗菌活性を有するロドコッカス属細菌
本発明の抗菌活性を有するロドコッカス属細菌は、国内外の菌株保存機関から数々の菌株を収集し、その性質を調べることにより探索することができる。菌株保存機関としては、例えばIAM(Institute of Applied Microbiology、東京大学)、JCM(Japan Collection of Microorganisms、理化学研究所)、DSM(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)、ATCC(米国)等が挙げられる。また、新たに自然環境よりロドコッカス属細菌を単離し、該単離細菌について性質を調べてもよい。
Escherichia coli IAM1264*
Pseudomonas putida IAM1236
Sinorhizobium meliloti IAM12611
Acinetobacter calcoaceticus IAM12087
(以上グラム染色陰性細菌)
Bacillus subtilis IAM12118
Streptomyces griseus IAM12311
Arthrobacter atrocyaneus IAM12339
Corynebacterium glutamicum IAM12435
Rhodococcus erythropolis IAM12122 (基準菌株)
Rhodococcus rhodocurous JCM3202**
(以上グラム染色陽性細菌)
Saccharomyces cerevisiae IAM14383
(以上真菌)
*IAM = Institute of Applied Microbiology (東京大学)
**JCM = Japan Collection of Microorganisms (理化学研究所)
上記で示されたような抗菌活性を有する細菌の培養物で得られる抗菌効果の他に、実際の使用にはそれらが生産する抗菌活性画分を抽出あるいは分離などによって取得し、液体又は固体の抗菌剤として用いることもできる。
本発明において、「抗菌活性画分」とは培養物から抗菌活性物質を含む画分を分離、抽出した物、部分的に精製した物、純物質に精製した抗菌活性物質のいずれをも意味するものである。すなわち、上記培養物を分離、抽出、精製等の処理により得られた抗菌活性を有する成分を含む物ならば、抗菌活性物質の純度に限定されることなく本発明の「抗菌活性画分」に含まれる。上記の「抗菌活性画分」のうち、純物質に精製した抗菌活性物質は、画分中にほぼ該抗菌活性物質のみが含まれる程度まで精製して得られた単離された抗菌活性物質であり、例えば、電気泳動によりほぼ単一のバンドのみ得られるまで精製したもの、またはクロマトグラフィーに供したときにほぼ単一のピークのみ得られるまでに精製したものをいう。その純度は70%以上、好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上である。本発明のロドコッカス属細菌菌株の培養物から精製により得られる抗菌活性物質は、例えば、有機溶媒を用いて抽出することができる。具体的には、例えば、菌株菌体破砕物又は菌株の培養上清に有機溶媒を添加し、攪拌し、遠心分離により有機溶媒層を回収し、蒸発乾固することにより乾固物として得ることができる。有機溶媒としては、例えば、酢酸エチル等を用いることができるが、有機溶媒は酢酸エチルに限られず、抽出に用いることができるどんな有機溶媒又はそれらの混合物も用いることができる。例えば、クロロホルム:メタノールなどを用いることができる。また培養上清を酸やアルカリに合わせてから有機溶媒抽出する方法も用いることができる。たとえば塩酸でpH2〜pH6、好ましくはpH3〜pH5、例えば、pH3、pH4、pH5などに、あるいは水酸化ナトリウムでpH7〜pH11、好ましくはpH8〜pH10、例えばpH8、pH9、pH10などに合わせてから抽出を行うことができる。
(a) Rhodococcus erythropolis JCM6821
(b) Rhodococcus erythropolis JCM6822
(c) Rhodococcus erythropolis JCM6823
(d) Rhodococcus erythropolis JCM6824
(e) Rhodococcus erythropolis JCM6827
(f) Rhodococcus erythropolis DSM11397***
(g) Rhodococcus erythropolis DSM44522
(h) Rhodococcus globerulus DSM44519
(i) Rhodococcus erythropolis JCM2895
(j) Rhodococcus erythropolis JCM2893
(k) Rhodococcus erythropolis JCM2894
(l) Rhodococcus erythropolis DSM9675
(m) Rhodococcus erythropolis DSM43200
(n) Rhodococcus erythropolis IAM1400
(o) Rhodococcus erythropolis IAM1503
(p) Rhodococcus ruber DSM43338
(q) Rhodococcus rhodnii DSM43336
(r) Rhodococcus zopfii DSM44189
***DSM = Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)
上記(d)株 (= Rhodococcus erythropolis JCM6824)を培養し遠心分離で菌体を沈殿させた後、その上清をメンブランフィルターに通し培養上清として回収する。この培養上清に酢酸エチルを加え良く撹拌した後、遠心分離で酢酸エチル層(上層)と水層(下層)に分離し、酢酸エチル層を回収する。回収した酢酸エチル層に無水硫酸ナトリウムを加え脱水し、減圧乾固を行う。乾燥物をエタノールで溶かし、この溶液を(d)株抽出物とする。本手法は抗菌スペクトルが一致していた(a)から(e)株に同様に用いることができる。
上記の(d)株抽出物の抗菌活性は、この抽出物をしみ込ませた濾紙(ペーパーディスク)を作成し、これをソフトアガー試験に用いることで確認できる。寒天培地に感受性菌を含むソフトアガーを重層した後、あらかじめ準備したペーパーディスクをその上に置き、培養後の阻止円の形成を観察する。
(d)株抽出物のペーパーディスクを用いた抗菌活性の確認は(d)株に対し最も感受性の高いアルスロバクター(Arthrobacter atrocyaneus IAM12339)を用いることが望ましいがその限りではない。
上記(f)株 (= Rhodococcus erythropolis DSM11397)を培養し遠心分離で菌体を沈殿させた後、その上清をメンブランフィルターに通し培養濾液として回収する。この培養濾液に飽和量の塩化ナトリウムと酢酸エチルを加え良く撹拌した後、遠心分離で酢酸エチル層(上層)と水層(下層)に分離し、酢酸エチル層を回収する。回収した酢酸エチル層に無水硫酸ナトリウムを加え脱水し、減圧乾固を行う。乾燥物をエタノールで溶かし、この溶液を(f)株抽出物とする。本手法は抗菌スペクトルが一致していた(f)から(h)株に同様に用いることができる。
上記の(f)株抽出物の抗菌活性は、上記(d)株抽出物の抗菌活性と同様に試験することができる。
新規の抗菌活性ロドコッカスを得るため、ソフトアガー重層法で用いる被験菌は以下に示す11株の微生物を用いた。
被験菌として用いた菌株
Escherichia coli IAM1264*
Pseudomonas putida IAM1236
Sinorhizobium meliloti IAM12611
Acinetobacter calcoaceticus IAM12087
(以上グラム染色陰性細菌)
Bacillus subtilis IAM12118
Streptomyces griseus IAM12311
Arthrobacter atrocyaneus IAM12339
Corynebacterium glutamicum IAM12435
Rhodococcus erythropolis IAM12122 (基準菌株)
Rhodococcus rhodocurous JCM3202**
(以上グラム染色陽性細菌)
Saccharomyces cerevisiae IAM14383
(以上真菌)
*IAM = Institute of Applied Microbiology (東京大学)
**JCM = Japan Collection of Microorganisms (理化学研究所)
(a) Rhodococcus erythropolis JCM6821
(b) Rhodococcus erythropolis JCM6822
(c) Rhodococcus erythropolis JCM6823
(d) Rhodococcus erythropolis JCM6824
(e) Rhodococcus erythropolis JCM6827
(f) Rhodococcus erythropolis DSM11397***
(g) Rhodococcus erythropolis DSM44522
(h) Rhodococcus globerulus DSM44519
(i) Rhodococcus erythropolis JCM2895
(j) Rhodococcus erythropolis JCM2893
(k) Rhodococcus erythropolis JCM2894
(l) Rhodococcus erythropolis DSM9675
(m) Rhodococcus erythropolis DSM43200
(n) Rhodococcus erythropolis IAM1400
(o) Rhodococcus erythropolis IAM1503
(p) Rhodococcus ruber DSM43338
(q) Rhodococcus rhodnii DSM43336
(r) Rhodococcus zopfii DSM44189
***DSM = Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)
ロドコッカス菌体を用いた抗菌活性の取得。菌株リスト1の(d)株(= Rhodococcus erythropolis JCM6824)を用いた実施例を以下に示す。
LB寒天培地にあらかじめ(d)株を植菌し、1〜3日培養してコロニーを形成させておく。感受性菌(例えばArthrobacter atrocyaneus IAM12339)を1×106 〜 1×107 CFU / mlとなるように35℃程度に冷やしたソフトアガーに懸濁し、この5 mlを(d)株が生育したシャーレ(直径9 cm)に重層する。
[01] Acetobacter aceti IAM14349
[02] Sphingomonas paucimobilis IAM12576
[03] Sinorhizobium meliloti IAM12611
[04] Bradyrhizobium japonicum IAM12608
[05] Paracoccus aminovorans IAM14244
(以上phylum Proteobacteria, class Alphaproteobacteria)
[06] Comamonas testosteroni IAM12419
[07] Achromobacter denitrificans IAM12370
[08] Alcaligenes faecalis IAM12586
[09] Ralstonia eutropha IAM12368
[10] Microvirgula aerodenitrificans IAM14991
[11] Thauera linaloolentis IAM15112
(以上phylum Proteobacteria, class Betaproteobacteria)
[12] Pseudomonas putida IAM1236
[13] Escherichia coli IAM1264
[14] Acinetobacter calcoaceticus IAM12087
[15] Alteromonas macleodii IAM12920
[16] Stenotrophomonas maltophilia IAM12423
(以上phylum Proteobacteria, class Gammaproteobacteria)
[17] Sphingobacterium multivorum IAM14316
[18] Flavobacterium saccharophilum IAM14309
(以上phylum Bacteroidetes)
[19] Deinococcus grandis IAM13005
(以上phylum Deinococcus-Thermus)
[20] Bacillus subtilis IAM12118
[21] Paenibacillus polymyxa IAM13419
[22] Planococcus citreus IAM12541
[23] Sporolactobacillus nakayamae subsp. Nakayamae IAM12388
(以上phylum Firmicutes)
[24] Arthrobacter atrocyaneus IAM12339
[25] Corynebacterium glutamicum IAM12435
[26] Janibacter terrae IAM14781
[27] Micrococcus luteus IAM1056
[28] Mycobacterium smegmatis IAM12065
[29] Nocardia pseudosporangifera IAM501
[30] Nocardioides jensenii IAM112581
[31] Streptomyces griseus IAM12311
[32] Streptomyces scabiei JCM7914 (じゃがいもそうか病菌の一種)
[33] Terrabacter tumescens IAM12345
[34] Dietzia psychroalcalophilus IAM14896
[35] Micromonospora chalcea IAM14285
(以上phylum Actinobacteria)
[36] Rhodococcus fascians JCM10002 (スイートピー帯化病菌の一種)
[37] Rhodococcus rhodocurous JCM3202
[38] Rhodococcus opacus DSM44193
[39] Rhodococcus coprophilus DSM43591
[40] Rhodococcus percolatus DSM44240
[41] Rhodococcus pyridinivorans DSM44555
[42] Rhodococcus baikonurensis DSM44587
[43] Rhodococcus aetherivorans DSM44752
[44] Rhodococcus erythroplois JCM3191
[45] Rhodococcus erythroplois IAM12122 T(Type strain = 基準菌株)
[46] Rhodococcus erythroplois IAM1399
[47] Rhodococcus erythroplois JCM6825
[48] Rhodococcus erythroplois IAM1414
[49] Rhodococcus erythroplois JCM3011
[50] Rhodococcus erythroplois DSM7373
[51] Rhodococcus erythroplois DSM20665
(以上phylum Actinobacteria, genus Rhodococcus)
[52] Saccharomyces cerevisiae IAM14383
(以上真菌)
ロドコッカス培養物からの抗菌活性画分の抽出法。菌株リスト1の(d)株(= Rhodococcus erythropolis JCM6824)を用いた実施例を以下に示す。
(少容量のLB培地からの抽出)
(d)株からの抗菌活性抽出物を以下の手順で調製した。
1) 50 mlのLB液体培地に(d)株を植菌し、28℃で48〜72時間振盪培養した。培養中に増殖した菌が分散せずに菌塊を形成し、菌濃度が上がらない場合はガラスビーズ(粒径2〜5 mm)を培養チューブに入れ、菌塊がほぐせるように培養した。
2) 培養後の菌液を遠心分離し(室温、3,000 rpm、10分)、上清を孔経0.2μmのシリンジフィルターに通して菌体を除去し、新しい50 mlチューブに培養上清として回収した。
3) 40 mlの培養上清に10 mlの酢酸エチルを加え、ボルテックスミキサーを用いて5分間激しく撹拌、遠心分離し(室温、3,000 rpm、10分)、酢酸エチル層を新しいチューブに回収した。
4) 回収した酢酸エチルに0.4 gの無水硫酸ナトリウムを加え、ボルテックスミキサーを用いて5分間激しく撹拌して脱水し、抽出酢酸エチルとして回収した。
5) 抽出酢酸エチルをガラスチューブに移し、減圧乾燥機を用いて蒸発乾固し、乾固物を400μlのエタノールに再溶解し、(d)株抽出液(LB)とした。
(d)株からの抗菌活性抽出物を以下の手順で調製した。
1) 炭素源としてコハク酸、シュークロース、カザミノ酸をそれぞれ0.1% (w/v)、またチアミン0.002% (w/v)を加えた1,200 mlのW液体培地に (d)株を植菌し、28℃で72〜96時間振盪培養した。培養は2リットルのバッフル付き三角フラスコ2本に分注して行った。
2) 培養後の菌液を遠心分離し(室温、3,000 rpm、10分)、上清を孔経0.2μmのボトルトップフィルターに通して菌体を除去し、培養上清として回収した。
3) 1,200 mlの培養上清を2 l容のガラス瓶に移し、300 mlの酢酸エチルを加え、スターラーを用いて2時間激しく撹拌後4時間静置し、上層を遠心分離して(室温、3,000 rpm、10分)酢酸エチル層を新しい50 mlチューブに分注回収した。
4) 回収した酢酸エチル50 mlあたりに2 gの無水硫酸ナトリウムを加え、激しく撹拌して脱水し、抽出酢酸エチルとして回収した。
5) 抽出酢酸エチルをガラスチューブに移し、減圧乾燥機を用いて蒸発乾固し、乾固物を計6 ml のエタノールに再溶解し、(d)株抽出液(W)とした。
上記2通りの(d)株からの抽出法は同じ抗菌スペクトルを示したグループ1の(a)から(e)株に、またグループ2の(f)から(h)株全てに用いることができた。
上記2通りの(d)株からの抽出法は、グループ2の(f)から(h)株に用いる場合、培養上清に酢酸エチルを加える前に飽和量の塩化ナトリウムを加えること、また培養上清のpHを8〜10に調節することによって更に効果的に抽出を行うことができた。
抗菌活性画分の使用法。上記(d)株抽出液(LB)、(d)株抽出液(W)、を用いた実施例を以下に示す。
(d)株抽出液(LB)及び(d)株抽出液(W)の抗菌活性の検出は以下の手順で行った。
1) 直径7 mmの濾紙でできたペーパーディスクに5〜20μlの抽出液を染みこませ、十分に乾燥させてエタノールを除去した。
2) 感受性菌(Arthrobacter atrocyaneus IAM12339又はRhodococcus erythropolis IAM12122)を1×106 〜 1×107 CFU / mlとなるように35℃程度に冷やしたソフトアガーに懸濁し、この5 mlを新しいLB寒天培地のシャーレ(直径9 cm)に重層した。
3) ソフトアガーが固まった後、1)で準備したペーパーディスクをその上に置いた。
4) 28℃で1〜2日培養し、ペーパーディスクの周りの阻止円を確認した(図2)。
上記(d)株抽出物の使用は菌株リスト1の(a)から(h)株(グループ1、2)からの全ての抽出物について行うことができた。
エタノールに溶解した(d)株抽出物は4℃の冷蔵庫で少なくとも6ヶ月以上の期間安定に保存することができた。
(d)株抽出物のカラム精製を行った実施例を以下に示す。
上記実施例2で調製した(d)株抽出液(W)のカラム精製を以下の手順で行った。カラムはWaters社のSep-Pakメソッド開発キットKを用いた。
1) 2 mlの100% エタノールをカラムに通し、コンディショニングを行った。
2) 2 mlの20% エタノールをカラムに通し、平衡化を行った。
3) 2 mlの20% エタノールに調製したサンプルをカラムにロードした。
4) 2 mlの20% エタノールをカラムに通し、洗浄した。
5) 0.4 mlの50%又は100%エタノールで溶出し、カラム精製産物とした。
上記のエタノール(EtOH)溶出をメタノール(MeOH)、アセトニトリル(CH3CN)に変更したコンディションも試験した。
カラム精製産物の抗菌活性を上記実施例3のペーパーディスクを用いた方法で測定し、結果を表7に示した。
寒天培地から得られる抗菌活性の検出。菌株リスト1の(i)から(o)株(グループ3)の培養液からは、酢酸エチルによる抽出で抗菌活性を再確認できなかった。このことからこれらの株の生産する抗菌活性物質が酢酸エチルに溶解しない(抽出されない)、あるいは酢酸エチルで変性する性質であることが考えられる。そこで(i)株を用い、LB寒天培地から得られる抗菌活性を確認した。
1) LB寒天培地に11 mm幅になるように縦横格子状に(i)株を植菌し、25℃で48時間培養した。
2) 生育した菌に囲まれた菌の無い部分を7 mm角で切り出し、ゲルチップとした。
3) 感受性菌(Rhodococcus erythropolis IAM12122)を1×106 〜 1×107 CFU / mlとなるように35℃程度に冷やしたソフトアガーに懸濁し、この5 mlを新しいLB寒天培地のシャーレ(直径9 cm)に重層した。
4) ソフトアガーが固まった後、2)で準備したゲルチップをその上に置いた。
5) 25℃で1〜2日培養し、ゲルチップの周りの阻止円を確認した(図3)。
Claims (43)
- 以下の(a)から(r)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から精製により得られる抗菌活性物質。
(a) Rhodococcus erythropolis JCM6821
(b) Rhodococcus erythropolis JCM6822
(c) Rhodococcus erythropolis JCM6823
(d) Rhodococcus erythropolis JCM6824
(e) Rhodococcus erythropolis JCM6827
(f) Rhodococcus erythropolis DSM11397
(g) Rhodococcus erythropolis DSM44522
(h) Rhodococcus globerulus DSM44519
(i) Rhodococcus erythropolis JCM2895
(j) Rhodococcus erythropolis JCM2893
(k) Rhodococcus erythropolis JCM2894
(l) Rhodococcus erythropolis DSM9675
(m) Rhodococcus erythropolis DSM43200
(n) Rhodococcus erythropolis IAM1400
(o) Rhodococcus erythropolis IAM1503
(p) Rhodococcus ruber DSM43338
(q) Rhodococcus rhodnii DSM43336
(r) Rhodococcus zopfii DSM44189 - 請求項1の(a)から(e)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から精製により得られる抗菌活性物質であって、グラム染色陽性細菌(phylum Actinobacteria、phylum Firmicutes)に対して抗菌作用を持つ抗菌活性物質。
- 請求項1の(a)から(e)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から精製により得られる抗菌活性物質であって、じゃがいもそうか病菌に対し抗菌作用を持つ抗菌活性物質。
- 請求項1の(a)から(e)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から精製により得られる抗菌活性物質であって、スイートピー帯化病菌に対し抗菌作用を持つ抗菌活性物質。
- 請求項1の(f)から(h)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から精製により得られる抗菌活性物質であって、少なくともロドコッカス及びノカルジア(Nocardia)に属する菌並びにファーミキューテス(phylum Firmicutes)に分類される菌に対して抗菌作用を持つ抗菌活性物質。
- 請求項1の(i)から(o)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から精製により得られる抗菌活性物質であって、少なくともロドコッカス・エリスロポリスに対する抗菌作用を持つ抗菌活性物質。
- 請求項1の(p)に示されるロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から精製により得られる抗菌活性物質であって、少なくともシノリゾビウム(Sinorhizobium)及びアルスロバクター(Arthrobacter)に属する菌に対して抗菌作用を持つ抗菌活性物質。
- 請求項1の(q)に示されるロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から精製により得られる抗菌活性物質であって、少なくともアルスロバクター(Arthrobacter)に属する菌に対して抗菌作用を持つ抗菌活性物質。
- 請求項1の(r)に示されるロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から精製により得られる抗菌活性物質であって、少なくとも大腸菌(Escherichia)に属する菌に対して抗菌作用を持つ抗菌活性物質。
- ロドコッカス属細菌菌株からの精製が有機溶媒による抽出及び逆相クロマトグラフィー用固定相を用いた固相抽出により行われる請求項1〜9のいずれか1項に記載の抗菌活性物質。
- 有機溶媒による抽出が酢酸エチルによる抽出であり、固相抽出の移動相がエタノール又はメタノールである請求項10記載の抗菌活性物質。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の抗菌活性物質の少なくとも1つを有効成分として含有する抗菌剤。
- 請求項1に記載の(a)から(r)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物からの分離により得られる抗菌活性画分。
- 請求項1に記載の(a)から(e)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物からの分離により得られるじゃがいもそうか病菌に対して抗菌活性を示す抗菌活性画分。
- 請求項1に記載の(a)から(e)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から分離により得られるスイートピー帯化病菌に対して抗菌活性を示す抗菌活性画分。
- 請求項1の(f)から(h)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から分離により得られる抗菌活性画分であって、少なくともロドコッカス及びノカルジア(Nocardia)に属する菌並びにファーミキューテス(phylum Firmicutes)に分類される菌に対して抗菌作用を示す抗菌活性画分。
- 請求項1の(i)から(o)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から分離により得られる抗菌活性画分であって、少なくともロドコッカス・エリスロポリスに対する抗菌作用を示す抗菌活性画分。
- 請求項1の(p)に示されるロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から分離により得られる抗菌活性画分であって、少なくともシノリゾビウム(Sinorhizobium)及びアルスロバクター(Arthrobacter)に属する菌に対して抗菌作用を示す抗菌活性画分。
- 請求項1の(q)に示されるロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から分離により得られる抗菌活性画分であって、少なくともアルスロバクター(Arthrobacter)に属する菌に対して抗菌作用を示す抗菌活性画分。
- 請求項1の(r)に示されるロドコッカス属細菌菌株を培養し、該細菌の培養物から分離により得られる抗菌活性画分であって、少なくとも大腸菌(Escherichia)に属する菌に対して抗菌作用を示す抗菌活性画分。
- ロドコッカス属細菌菌株からの分離が有機溶媒による抽出により行われる請求項13〜20のいずれか1項に記載の抗菌活性画分。
- 有機溶媒による抽出が酢酸エチルによる抽出である請求項21記載の抗菌活性画分。
- 請求項13〜22のいずれか1項に記載の抗菌活性画分の少なくとも1つを有効成分として含有する抗菌剤。
- 請求項1に記載の(a)から(r)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株の培養物を有効成分として含有する抗菌剤。
- 請求項1に記載の(a)から(e)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株の培養物を有効成分として含有するじゃがいもそうか病菌に対して抗菌活性を示す抗菌剤。
- 請求項1に記載の(a)から(e)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株の培養物を有効成分として含有するスイートピー帯化病菌に対して抗菌活性を示す抗菌剤。
- 請求項1の(f)から(h)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株の培養物を有効成分として含有する、少なくともロドコッカス及びノカルジア(Nocardia)に属する菌並びにファーミキューテス(phylum Firmicutes)に分類される菌に対して抗菌活性を示す抗菌剤。
- 請求項1の(i)から(o)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株の培養物を有効成分として含有する、少なくともロドコッカス・エリスロポリスに対する抗菌活性を示す抗菌剤。
- 請求項1の(p)に示されるロドコッカス属細菌菌株の培養物を有効成分として含有する、少なくともシノリゾビウム(Sinorhizobium)及びアルスロバクター(Arthrobacter)に属する菌に対して抗菌活性を示す抗菌剤。
- 請求項1の(q)に示されるロドコッカス属細菌菌株の培養物を有効成分として含有する、少なくともアルスロバクター(Arthrobacter)に属する菌に対して抗菌活性を示す抗菌剤。
- 請求項1の(r)に示されるロドコッカス属細菌菌株の培養物を有効成分として含有する、少なくとも大腸菌(Escherichia)に属する菌に対して抗菌活性を示す抗菌剤。
- 請求項1の(a)から(r)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該菌株の培養物から抗菌活性を有する物質を精製することを特徴とするロドコッカス属細菌菌株由来の抗菌活性物質製造法。
- ロドコッカス属細菌菌株からの精製が有機溶媒による抽出及び逆相クロマトグラフィー用固定相を用いた固相抽出により行われる請求項32に記載のロドコッカス属細菌菌株由来の抗菌活性物質製造法。
- 有機溶媒による抽出が酢酸エチルによる抽出であり、固相抽出の移動相がエタノール又はメタノールである請求項33記載のロドコッカス属細菌菌株由来の抗菌活性物質製造法。
- 請求項1の(a)から(r)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株を培養し、該菌株の培養物から抗菌活性を有する画分を分離することを特徴とするロドコッカス属細菌菌株由来の抗菌活性画分の製造法。
- ロドコッカス属細菌菌株からの分離が有機溶媒による抽出により行われる請求項35に記載のロドコッカス属細菌菌株由来の抗菌活性画分の製造法。
- 有機溶媒による抽出が酢酸エチルによる抽出である請求項36記載のロドコッカス属細菌菌株由来の抗菌活性画分の製造法。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の抗菌活性物質、請求項13〜22のいずれか1項に記載の抗菌活性画分並びに請求項12、23〜31のいずれか1項に記載の抗菌剤からなる群から選択される抗菌活性物質、抗菌活性画分又は抗菌剤の少なくとも1つを有効成分として用い、抗菌作用を得ることを特徴とする微生物防除の方法。
- 請求項38記載の微生物防除の方法であって、請求項1〜11のいずれか1項に記載の抗菌活性物質、請求項13〜22のいずれか1項に記載の抗菌活性画分並びに請求項12、23〜31のいずれか1項に記載の抗菌剤からなる群から選択される抗菌活性物質、抗菌活性画分又は抗菌剤の複数を組合せて用いることを特徴とする微生物防除の方法。
- 請求項3に記載の抗菌活性物質、請求項14に記載の抗菌活性画分及び請求項1に記載の(a)から(e)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株の培養物からなる群から選択される抗菌活性物質、抗菌活性画分又は培養物の少なくとも1つを有効成分として用いることを特徴とする、じゃがいもそうか病菌防除の方法。
- 請求項3に記載の抗菌活性物質、請求項14に記載の抗菌活性画分及び請求項1に記載の(a)から(e)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株の培養物からなる群から選択される抗菌活性物質、抗菌活性画分又は培養物の複数を組合せて用いることを特徴とする、じゃがいもそうか病菌防除の方法。
- 請求項4に記載の抗菌活性物質、請求項15に記載の抗菌活性画分及び請求項1に記載の(a)から(e)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株の培養物からなる群から選択される抗菌活性物質、抗菌活性画分又は培養物の少なくとも1つを有効成分として用いることを特徴とする、スイートピー帯化病菌防除の方法。
- 請求項4に記載の抗菌活性物質、請求項15に記載の抗菌活性画分及び請求項1に記載の(a)から(e)に示されるいずれかのロドコッカス属細菌菌株の培養物からなる群から選択される抗菌活性物質、抗菌活性画分又は培養物の複数を組合せて用いる及びことを特徴とする、スイートピー帯化病菌防除の方法。
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