CN100519737C - 赤红球菌zjb-064及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了从土壤中筛选到的微生物新菌株赤红球菌ZJB-064(Rhodococcus ruber ZJB-064)，及其在制备对羟基苯乙酰胺中的应用。所述赤红球菌ZJB-064保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No：M 206040，保藏日期2006年4月14日。本发明筛选得到的菌株赤红球菌ZJB-064(Rhodococcus ruber ZJB-064)可用于生物法合成对羟基苯乙酰胺。对羟基苯乙酰胺的产率达可到98%以上，具有产率高，环境友好，过程绿色等优点。

Description

赤红球菌ZJB-064及其应用

(一)技术领域

本发明涉及从土壤中筛选到的微生物新菌株赤红球菌ZJB-064(Rhodococcus ruber ZJB-064)，及其在制备对羟基苯乙酰胺中的应用。

(二)背景技术

1990年，丹麦的Novo Industri A/S报道了能水合非环式、环式和杂环腈以及能水合含酸性或碱性基团腈的水合酶。其中该酶能转化的底物包括对羟基苯乙腈，同时证明苯环上对位吸电子基团取代能促进酶的水合作用，相反吸电子基团取代会抑制酶的水合作用。但目前国内外并没有直接报道以对羟基苯乙腈为底物，用微生物法合成对羟基苯乙酰胺。

对羟基苯乙腈，英文名为p-hydroxylacetonitrile，简称PHN，分子式为C₈H₇NO，重要的基团有：一个乙氰基(-CH₂CN)，一个羟基(-OH)。黄色晶体熔点67～71℃，沸点756mmHg下为330℃，有刺激性及毒性。

对羟基苯乙酰胺，英文名为p-hydroxyphenylacetaminde，简称PHAD，分子式为C₈H₉NO₂，重要的基团有：一个乙酰胺基(-CH₂CONH₂)，一个羟基(-OH)。通常是白色或黄色针状结晶，熔点为151～153℃。

对羟基苯乙酰胺为合成阿替洛尔(Atenolol)的重要中间体。阿替洛尔又叫氨酰心胺，是一种新的β₁-肾上腺素能受体阻滞剂，对心脏的β₁受体有选择的阻滞作用。ASIST研究比较了β₁受体阻滞剂阿替洛尔对缺血性心脏病人的长期预后影响，与安慰剂比较阿替洛尔可明显降低死亡、心肌梗死、心脏病发作次数及入院率，突然减少β₁受体阻滞剂用量使病人病情恶化。

临床研究结果表明：β₁受体阻滞剂阿替洛尔能有效预防心脏X综合征患者的心绞痛症状，优于硝酸酯、二氢吡啶类。对一组应用β受体阻滞剂治疗心肌梗死的荟萃分析显示，于心肌梗死后3～4天加用β受体阻滞剂，无内在拟交感活性的β受体阻滞剂可使心肌梗死的死亡率降低30％，优于有内在拟交感活性的β受体阻滞剂，预防作用源于对β受体阻滞剂。通常，冠心病或心肌梗死后发生的心力衰竭病人仍有心肌缺血存在，60％以上的心力衰竭由心肌缺血引起，β受体阻滞剂治疗也同样有效。

45年前β受体阻滞剂用于临床，至今重要性有增无减，并且获得了令人振奋的证据。β受体阻滞剂治疗心绞痛，通过降低心肌耗氧量、控制心肌缺血而预防冠心病发作、改善预后。阿替洛尔已成为临床最受重视的β₁受体阻滞剂，是专科医院治疗心血管疾病的常用药物。因此，对羟基苯酰胺作为合成阿替洛尔的重要中间体同时也具有很好的市场应用前景，目前国内外主要采用化学法合成对羟基苯乙酰胺，化学法合成通常存在周期长，处理步骤繁复，原材料消耗大，污染严重等问题。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供利用水合作用将对羟基苯乙腈转化为对羟基苯乙酰胺的赤红球菌属新菌株及其在制备对羟基苯乙酰胺中的应用。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

赤红球菌ZJB-064(Rhodococcus ruber ZJB-064)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No：M206040，保藏日期2006年4月14日，提议的分类命名为赤红球菌ZJB-064。

所述赤红球菌ZJB-064由以下途径筛选得到：

富集培养基及培养条件：葡萄糖10g/L，K₂HPO₄ 0.8g/L，KH₂PO₄3.3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，NaCl 1g/L，FeSO₄·7H₂O 10mg/L，CaCl₂15mg/L，对羟基苯乙腈1g/L，pH7.0～7.2。1.0×10⁵Pa灭菌20min。培养条件：28℃，摇床转速150r/min，每批土样通过三次富集，每次富集时间3～4d。

菌种初筛：将各地采集的土样各称取1g分别均匀分散与10mL蒸馏水中。然后取以上土样的悬浊液3mL加入到30mL灭好菌的富集培养基中，放于摇床中培养。经过3次富集的土样进行稀释，并将梯度为10^-8、10^-9、10^-10涂布于分离平板，放于28℃培养箱培养3d，然后挑取生长形态不同的菌株于斜面中培养进行编号，作为复筛的对象。

菌种复筛：将初筛菌种接种于液体发酵培养基中，摇床振荡培养2d后，加入0.3g/L的对羟基苯乙腈做为诱导剂，诱导培养48h。诱导培养后的菌种通过离心，再用生理盐水洗涤2次，得到菌体在pH7.0的磷酸盐缓冲液中转化，底物浓度为1g/L，转化液通过液相检测，能水合对羟基苯乙腈为对羟基酰胺的菌株为目的菌株。

用于筛选微生物的土样来自各种可分离到微生物的样品，如果园、农田、污水处理站等。

所述的赤红球菌ZJB-064细胞形态为圆形、红色、表面有花纹，芽孢中生，革兰氏染色阳性，所述的赤红球菌ZJB-064生化实验过氧化氢酶阴性，兼好氧，氧化镁试验阴性，淀粉水解阴性，V.P.试验阴性，M.R.试验阴性，酪素水解阳性，硝酸盐还原阳性，脲酶试验阴性。以上为对赤红球菌ZJB-064的细胞形态与生理生化特征的部分描述，详细描述见表1：

表1：赤红球菌ZJB-064菌株生理生化特征的科学描述

 

细胞形态	圆形，红色，表面有花纹
		革兰氏染色	+
孢子	芽孢中生
		氧化镁试验	-
过氧化氢酶	-
		淀粉水解	-
M.R试验	-

 

V.P试验	-
		苯丙氨酸脱氧酶	-
柠檬酸盐油脂水解	++
		三糖铁发酵	乳糖
产H<sub>2</sub>S	+
		产气产气	+
ONPG	-
		反硝化作用	-
耐盐性试验  2％5％7％9％	++---
		吲哚试验	玫瑰红
明胶液化	+
		丙二酸盐试验	-
糖分解	+
		需氧性	兼好氧
L-酪氨酸水解	+
		酪素水解	+
硝酸盐还原	+
		氨酸脱羧酶L-精氨酸L-赖氨酸L-鸟氨酸	+--
产H<sub>2</sub>S试验	+
		卵磷脂酶	-
脲酶试验	-
		石蕊牛奶试验	胨化
生长pH 5.78.1	++
		生长温度40℃45℃	+-

注：表中+表示阳性，-表示阴性，++表示非常明显。

以提取到的细胞总DNA为模板，利用引物p16S-8：5′-aga gttt gat cctggc tca g-3′和p16S-1541：5′-aag gag gtg atc cag ccg ca-3′扩增菌株的16SrDNA基因，将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，经PCR扩增成功获得了一长约为1.5kb的片段，经测序确认该片段实际长度为1463bp，其序列如下：

TGGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCTCGGGATGCATGTTCCGGGGTGGAAAGGTTTTCCGGTGCAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTACCGACGAAGCGCAAGTGACGGTAGGTACAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTCTGTGAAAACCCGCAGCTCAACTGCGGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGTTTCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATACACCGGACCGCCCCAGAGATGGGGTTTCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGGACTCGCAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTCGTGGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAA。

将该序列(已提交GenBank，GenBank登记号为No.DQ468352)与GenBank中相关数据进行相似性分析发现，与赤红球菌的同源性最高(homology，100％/1463 bps，based on 16S rDNA)。同已知的细菌16SrDNA序列进行比对，利用Phylips(version 3.572)软件构建进化树(如图1)，确定菌株ZJB-064的进化地位，生理生化鉴定结合分子鉴定，可确认该菌株为赤红球菌，拟命名为Rhodococcus ruber ZJB-064。

对羟基苯乙腈(简称PHN)通过水合作用生成对羟基苯乙酰胺(简称PHAD)的反应式如下：

所述的赤红球菌ZJB-064通过水合作用转化对羟基苯乙腈制备对羟基苯乙酰胺。所述的应用是将赤红球菌ZJB-064菌种接种到适用于赤红球菌的产酶培养基中进行培养，然后离心或过滤，得到菌体，将菌体细胞或处理过的菌体细胞添加到对羟基苯乙腈溶液中进行水合反应，最后对转化液进行分离，即得所述的对羟基苯乙酰胺。所述处理过的菌体细胞是指经处理后得到的粗酶、固定化细胞、固定化酶。

用于本发明赤红球菌ZJB-064菌种的产酶培养基含有可以被所述菌株利用营养物质，培养基中合理配入上述微生物能利用的碳源、氮源、无机盐等。可作为碳源的有：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、糊精、淀粉、甘油、甘露醇、山梨醇、油脂类(豆油、猪油等)；可作为氮源的有：肉汁、酵母膏、干酵母、大豆粉、玉米浆、蛋白胨、尿素、氨盐(硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、醋酸胺等)，肽类(二肽、三肽等)；无机盐类有：Na、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、Co、Ni等金属盐类和磷酸盐、醋酸盐等有机酸盐类；另可加有：氨基酸类(如谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸等)、微生素(V_B1、V_B2、V_B12、V_C、V_E、烟酸等)、核酸类(如嘌呤、嘧啶及其衍生物等)。用无机酸或有机酸、碱类调节培养基的pH值。

本发明所用产酶培养基组成为：葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，尿素7.5g/L，谷氨酸钠0.75g/L，K₂HPO₄0.5g/L，KH₂PO₄0.5g/L，Mg₂SO₄0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 10mg/L，CoCl₂ 10mg/L，pH7.0～7.2，余量为去离子水；培养条件为：pH6～8、温度20～35℃下培养1～3天。优选在pH6.5～7.5、温度28～32℃条件下培养2天。

酶活力单位：在一定条件下，1min转化底物得到1μmol对羟基苯乙酰胺所需的酶量为1个酶活力单位U，单位为μmol/min。

所述水合反应的反应条件为：反应温度5～50℃，反应pH5～10，反应2～4小时。优选反应条件：温度45℃，pH6.0～7.0下反应2小时。将细胞或固定化处理过的细胞(粗酶、固定化细胞、固定化酶等)悬浮在水、或缓冲液、也可以是生理盐水中，然后加入底物对羟基苯乙腈。加入底物对羟基苯乙腈的方式有多种，可以一次性加入，也可以逐渐地，以可控制的方式连续加入腈化合物，底物浓度最大达到20g/L。

本发明中作为生物催化剂的微生物细胞或处理过的细胞(粗酶、固定化细胞、固定化酶等)可以重复利用。

所述转化液分离方法为：将转化液离心或过滤除去菌体细胞，上清夜或滤液置于4℃冰箱中结晶得到所述对羟基苯乙酰胺的晶体。

如果适当地控制反应和产物分离条件，对羟基苯乙酰胺的产率达到98％以上，产品纯度达到99％以上。

优选的，所述对羟基苯乙酰胺制备方法如下：

(1)产酶培养：葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，尿素7.5g/L，谷氨酸钠0.75g/L，K₂HPO₄0.5g/L，KH₂PO₄0.5g/L，Mg₂SO₄0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 10mg/L，CoCl₂ 10mg/L，pH7.0～7.2，余量为去离子水，灭菌，接种赤红球菌ZJB-064菌种；培养条件为：pH6.5～7.5、温度28～32℃下培养2天，培养液离心收集菌体，用pH7.0，0.1mol/L的磷酸钠缓冲液洗涤两次后，离心收集菌体，冷藏备用；

(2)水合反应：将步骤(1)所得菌体与底物对羟基苯乙腈均匀分散于pH7.0、0.1mol/L的磷酸钠缓冲液中，配成含湿菌体0.01g/mL、含底物10g/L的反应液，45℃水浴、pH6.0～7.0下反应2小时；

(3)产物分离：将转化液过滤除去菌体细胞，滤液置于4℃冰箱中结晶得到所述对羟基苯乙酰胺的晶体。

本发明中的检测分析方法：

(1)薄层层析(TLC)

转化液通过离心，用毛细管点样于硅胶板，在乙醇:水＝95:5(v/v)的展开剂中展开后，放入到典缸中显色。对羟基苯乙腈R_f＝0.854对羟基苯乙酰胺R_f＝0.813。

(2)高效液相色谱(HPLC)检测

转化液通过离心、过滤后用HPLC检测。流动相为(v/v)甲醇:水:TNF:乙酸＝35:65:1:1，流速为1mL/min，检测波长为274nm，进样量为20μl。

本发明的有益效果主要体现在：通过筛选得到一株新的菌种用于生物法合成对羟基苯乙酰胺，具有转化率高，环境友好，过程绿色等优点。该菌种可以将高毒性的腈类化合物水解成危害较小的酰胺类物质，生物法是迄今处理工业废水中高毒性腈化合物最经济、最有效的一种方法，所以本发明在环境治理上也具有重要的现实意义。

(四)说明书附图

图1为赤红球菌ZJB-064与相关菌株的进化树。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

产酶培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，尿素7.5g/L，谷氨酸钠0.75g/L，K₂HPO₄0.5g/L，KH₂PO₄0.5g/L，Mg₂SO₄0.5g/L，FeSO₄·7H₂O10mg/L，CoCl₂ 10mg/L，余量为去离子水，pH7.0～7.2。121℃灭菌20min，接种赤红球菌ZJB-064菌种，在pH6.5～7.5、温度28～32℃条件下培养2天。

将培养液离心(12000rpm)，收集菌体，用pH7.0，0.1mol/L的磷酸钠缓冲液洗涤两次后，离心收集赤红球菌ZJB-064菌体，冷冻保藏以备用。

将冷冻保藏于冰箱中的菌体均匀分散于pH7.0，0.1mol/L的磷酸钠缓冲液中，配置成含湿菌体浓度约为0.05、0.1、0.15、0.2g/mL的菌悬液。

在4个磨口三角瓶中，分别加入18mL含底物浓度为2.222g/L的磷酸钠缓冲液(pH7.0，0.1mol/L)，每个三角瓶中分别加入以上菌悬液2mL，测定对应转化液OD为2.042、4.084、6.126、8.168(稀释到OD线性范围测定)，底物浓度为2g/L，转化液分别编号为1，2，3，4。在30℃的水浴摇床中转化，转速为150rpm。转化30、60min各取样1mL，然后立即离心、过滤、HPLC检测。

转化液中湿菌体终浓度为0.005g/mL(OD＝2.042)时其比活力最高，比活力随菌体量的增加反而降低。而转化液中产物达到相同的收率所需的时间随转化液中菌体量的增加而减少，实验通过综合考察转化液中赤红球菌ZJB-064静息细胞的酶活力、比活力，选择转化液中湿菌体终浓度为0.01g/mL(OD＝4.084)。

实施例2：

制备赤红球菌ZJB-064菌体与实施例1同。

用HAc-NaAc缓冲液配成pH分别为3.6，4.0，4.4，4.8，5.2，5.6的溶液，用NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液配成pH分别为6.2，6.6，7.0，7.4，7.8的溶液，用Gly-NaOH配成pH为8.6，9.0，9.4，9.8，10.4，10.6的溶液，三种缓冲液的浓度均为0.1mol/L。同时配制含湿菌体浓度约为0.1g/mL的菌悬液。

转化液中分别加入各种pH值的缓冲液10mL，再加入8mL含底物浓度为12.5g/L的腈水溶液，然后再加入2mL菌体悬液，使转化液的底物终浓度为5g/L，测定转化液OD值为4.186。由于转化液中的缓冲液被稀释，pH值发生改变，用pH计测定重新确定转化液的pH值。转化液放于30℃水浴中转化，转速为150rpm，转化60min取样、离心、过滤，HPLC检测。

转化液初始pH在接近6.0～7.0的范围内其酶活力最高，在pH值低于4.5的范围内其活性基本接近于0。同时不同的缓冲液体系对赤红球菌ZJB-064静息细胞酶活力的影响也较大，在HAc-NaAc缓冲液体系中，其酶活力较低，在NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液中其活力急剧上升。因此选择NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液作为转化液体系，最佳pH值为6.0～7.0。

实施例3：

制备赤红球菌ZJB-064菌体与实施例1同。

用磷酸缓冲液(pH7.0，0.1mol/L)配制含PHN为5.555、11.111和22.222g/L的腈缓冲溶液，同时配置含菌体量为0.1g/mL的菌悬液。在50mL磨口三角瓶中分别加入18mL以上配置好的腈缓冲溶液，再用移液枪在每个三角瓶中同时加入2mL菌悬液，使转化液中底物终浓度分别为5g/L、10g/L和20g/L，湿菌体终浓度为0.01g/mL，不同底物浓度的转化液各做两个平行。然后放入30℃的水浴摇床中转化，摇床转速为150rpm，每间隔20min取样1mL，立即离心、过滤，用HPLC跟踪转化情况。

底物浓度为5g/L和10g/L时，分别转化60和75min，底物完全转化，生成PHAD。而底物浓度为20g/L时，赤红球菌ZJB-064静息细胞的活性基本都被抑制，转化24h仍只有少量PHAD生成。底物浓度为10g/L生成的PHAD的收率约为95％。

实施例4：

制备菌体与实施例1同。

将PHN直接溶于磷酸缓冲液中(pH7.0，0.1mol/L)，配置成终浓度分别为6g/L，7g/L，8g/L，9g/L，10g/L，12g/L，14g/L，16g/L，20g/L的腈溶液。转化时各加0.2g湿菌体均匀悬浮于20mL以上各种浓度的腈溶液中，在水浴摇床中转化，t＝30℃，r＝150rpm。转化100min取样、离心、过滤，HPLC检测。

底物终浓度在低于10g/L时其酶活力随底物浓度的增加而增加，在底物终浓度为10g/L时其对应的酶活力最高，随着底物浓度继续增加，酶活力下降较快，在底物终浓度为20g/L时，酶活力降为最高酶活力的1/13，说明底物高于10g/L对赤红球菌ZJB-064静息细胞酶活力抑制比较明显。低浓度下的底物抑制视为反竞争性抑制，求出K_m＝0.29mol/L和V_max＝183.824μmol/min/g。

实施例5：

制备菌体与实施例1同。

用磷酸缓冲液(pH7.0，0.1mol/L)配制含PHAD为10g/L的腈缓冲溶液，然后用该腈缓冲溶液配制分别含PHAD终浓度为5g/L、10g/L、12g/L、15g/L、17g/L、20g/L的混合溶液。取以上各种含PHAD不同终浓度的混合溶液20mL放于50mL磨口三角瓶中，然后每瓶加入0.2g湿菌体并均匀分散，再放入30℃水浴中转化，转速为150rpm，间隔1h取样、离心、过滤，HPLC检测。

产物对赤红球菌ZJB-064静息细胞的酶活力没有很明显的影响。转化液中初始PHAD浓度为5g/L和20g/L时的酶活力分别为10.5121和8.1291U。

实施例6：

制备菌体与实施例1同。

量取30mL磷酸缓冲液(pH7.0，0.01mol/L)于50mL三角瓶中，同时三角瓶中加入一定量的玻璃珠。称取冷冻保藏的湿菌体3g，加入到以上三角瓶中摇晃，使菌体均匀分散，菌悬液浓度为0.1g/mL。

取两个50mL磨口三角瓶，分别加入9mL含底物为11.111g/L的腈缓冲液，在测定温度下保温10min，使缓冲液温度与水浴达到平衡，然后加入1mL菌悬液，使转化液的底物终浓度为10g/L。测定的不同温度分别为15、30、35、45、55、65、75℃，在相同的温度下分别做两个平行，水浴转速为150rpm，转化1h取样、离心、过滤，用HPLC检测。

温度对ZJB-064静息细胞活性的影响呈钟罩形变化。在45℃附近赤红球菌ZJB-064静息细胞的活性达到高峰，酶活力为12.192U。温度低于45℃，此静息细胞的活性随温度的升高而增加，当温度高于45℃时，此静息细胞的活性急速下降，在温度为65℃时，基本失去酶活。

实施例7：

制备菌体与实施例1同。

准备两个50mL的三角瓶，分别量取20mL磷酸缓冲液(pH7.0，0.01mol/L)于两个三角瓶中，同时加入一定量的玻璃珠。分别称取冷冻保藏的菌体2g，加入到以上三角瓶中摇晃，使菌体均匀分散。

将菌悬液放置到温度分别为50、55℃的水浴中，菌悬液与水浴温度达到平衡后开始计时，每间隔10min各取出保温中菌悬液2mL。同时准备4个50mL磨口三角瓶，分别加入9mL含底物为11.111g/L的腈缓冲液，并加入取出的保温一定时间的菌悬液1mL，使转化液的底物终浓度为10g/L，每个温度各个保温时间做两个平行，然后放于30℃水浴中转化，转速为150rpm，转化1h取样、离心、过滤，用HPLC检测。

赤红球菌ZJB-064静息细胞的活性随着保温时间的延长其活性降低，50℃时其活性降低相对比较平缓，在55℃的条件下其活性随着保温时间的延长急剧下降，保温时间为100min中时，其酶活力将为原来的1/7。

序列表.ST25

SEQUENCE LISTING

<110>浙江工业大学

<120>赤红球菌ZJB-064及其应用

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1463

<212>DNA

<213>Rhodococcus ruber

<400>1

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>2

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>3

Claims (7)

1.赤红球菌ZJB-064(Rhodococcus ruber ZJB-064)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No：M206040，保藏日期2006年4月14日。

2.如权利要求1所述的赤红球菌ZJB-064在制备对羟基苯乙酰胺中的应用。

3.如权利要求2所述的赤红球菌ZJB-064在制备对羟基苯乙酰胺中的应用，其特征在于：所述的应用是将赤红球菌ZJB-064菌种接种到适用于赤红球菌的产酶培养基中进行培养，然后对培养液进行离心或过滤，得到菌体，将菌体细胞添加到对羟基苯乙腈溶液中进行水合反应，最后对转化液进行分离，即得所述的对羟基苯乙酰胺。

4.如权利要求3所述的赤红球菌ZJB-064在制备对羟基苯乙酰胺中的应用，其特征在于所述产酶培养基组成为：葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，尿素7.5g/L，谷氨酸钠0.75g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，Mg₂SO₄ 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 10mg/L，CoCl₂ 10mg/L，pH7.0～7.2，余量为去离子水；培养条件为：pH6～8、温度20～35℃下培养1～3天。

5.如权利要求3所述的赤红球菌ZJB-064在制备对羟基苯乙酰胺中的应用，其特征在于所述水合反应的反应条件为：反应温度5～50℃，反应pH5～10，反应2～4小时。

6.如权利要求3所述的赤红球菌ZJB-064在制备对羟基苯乙酰胺中的应用，其特征在于所述转化液分离方法为：将转化液离心或过滤除去菌体细胞，然后置于4℃冰箱中结晶得到所述对羟基苯乙酰胺的晶体。

7.如权利要求3所述的赤红球菌ZJB-064在制备对羟基苯乙酰胺中的应用，其特征在于所述应用如下：

(1)产酶培养：葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，尿素7.5g/L，谷氨酸钠0.75g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，Mg₂SO₄ 0.5g/L，FeSO₄·7H2O 10mg/L，CoCl₂ 10mg/L，pH7.0～7.2，余量为去离子水，灭菌，接种赤红球菌ZJB-064菌种；培养条件为：pH6.5～7.5、温度28～32℃下培养2天，培养液离心收集菌体，用pH7.0，0.1mol/L的磷酸钠缓冲液洗涤两次后，离心收集菌体，冷藏备用；

(2)水合反应：将步骤(1)所得菌体与底物对羟基苯乙腈均匀分散于pH7.0、0.1mol/L的磷酸钠缓冲液中，配成含湿菌体0.01g/mL、含底物10g/L的反应液，45℃水浴、pH6.0～7.0下反应2小时；

(3)产物分离：将转化液过滤除去菌体细胞，滤液置于4℃冰箱中结晶得到所述对羟基苯乙酰胺的晶体。

Images