CN100536916C - 人溶菌酶在制备治疗眼病的药物中的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人溶菌酶的新用途,尤其是人溶菌酶在制药领域中的应用。人溶菌酶在制备治疗各种眼病的药物中的应用。人溶菌酶在制备治疗由细菌、衣原体、病毒和耐药菌导致的各种红眼病、眼炎、角膜炎、角膜溃疡疾病的药中的应用。本发明基因重组人溶菌酶来源丰富,制备工艺简单,安全无毒副作用,有很好的药用前景,做成滴眼液,使用方便。发掘了新的医疗用途,开拓了一个新的应用领域。
Description
技术领域:
本发明涉及人溶菌酶的新用途,特别是在制药领域中的新用途。
背景技术:
目前由细菌、病毒、导致的各种红眼病、眼炎、角膜炎、角膜溃疡等疾病很常见,疗法一般是采用抗菌素滴眼液,但是21世纪的今天,耐药菌的发展令人触目惊心,从细菌的耐药发展史可以看出,在某种新的抗生素出现以后,就有一批耐药菌株出现。开发一种新的抗生素一般需要10年左右的时间,而一代耐药菌的产生只要2年的时间,抗生素的研制速度远远赶不上耐药菌的发展速度。使用抗菌素越多,造成细菌为躲避抗菌素而变异的方式越多。由于抗生素的滥用,相当多的耐药性细菌出现。几十年来,人类发明了大量的抗菌药物,目前应用于临床的已不下200种之多,而且仍以平均每年10种以上新的抗菌药物问世的速度在增长。虽然不断有新的抗生素研制和投入使用,但在很短的时间内,就有新的耐药性菌株产生。面对“适者生存,不断进化”的细菌,抗生素似乎已经无计可施。
发明内容:
本发明的目的是提供一种人溶菌酶在制备治疗眼疾的药物中的应用。有效针对由细菌、病毒、导致的各种红眼病、眼炎、角膜炎、角膜溃疡等疾病,剂型合理,使用方便。
实际上本发明涉及人溶菌酶在制备治疗各种眼病的药物中的应用。
涉及人溶菌酶在制备治疗由细菌、衣原体、病毒和耐药菌导致的各种红眼病、眼炎、角膜炎、角膜溃疡疾病的药中的应用。
涉及人溶菌酶在制备治疗由沙门氏菌和衣原体引起的各种红眼病、眼炎、角膜炎、角膜溃疡疾病的药物中的应用。
涉及人溶菌酶在制备治疗由I型疱疹病毒引起的疱疹病导致的各种红眼病、眼炎、角膜炎、角膜溃疡疾病的药物中的应用。
涉及人溶菌酶在制备治疗由柯萨奇病毒引起的导致各种红眼病、眼炎、角膜炎、角膜溃疡疾病的药物中的应用。
涉及人溶菌酶在制备治疗由线病毒引起的导致各种红眼病、眼炎、角膜炎、角膜溃疡疾病的药物中的应用。
涉及人溶菌酶在制备治疗由病原性念球菌引起的导致各种红眼病、眼炎、角膜炎、角膜溃疡疾病的药物中的应用。
所述药物为滴眼液,含有活性300U~300万U/mL人溶菌酶。
所述人溶菌酶包括基因工程表达的重组人溶菌酶、基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸—丙氨酸)2或(谷氨酸—丙氨酸)3修饰的人溶菌酶、基因工程表达或化学合成突变体重组人溶菌酶。
重组人溶菌酶基因来源人的外周血。再通过DNA重组技术,将基因克隆于pUC19质粒载体中,克隆株通过核苷酸DNA序列分析,证实为重组人溶菌酶基因。它是一种有效的抗菌剂,全称为:1,4-β-N-溶菌酶或者称:粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶。它能切断细菌细胞壁的肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4糖苷键的联结,破坏肽聚糖支架,细菌在内部渗透压的作用下细胞胀裂开,引起细菌裂解。人和动物细胞无细胞壁结构亦无肽聚糖,故溶菌酶对人体细胞无毒性作用。重组人溶菌酶除可以直接裂解细菌外,还有抗病毒、抗肿瘤、抗炎和免疫调节作用。
本发明基因重组人溶菌酶来源丰富,制备工艺简单,安全无毒副作用,有很好的药用前景,做成滴眼液,使用方便。发掘了新的医疗用途,开拓了一个新的应用领域。
为了更好的理解本发明的实质,下面将用基因重组人溶菌酶的药理试验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
基因重组人溶菌酶以配制200毫升培养基为准,用磷酸6毫升、硫酸镁3克,硫酸钾4克,氢氧化钾1克,硫酸钙1.5克,加蒸馏水至200毫升,高压灭菌后接种甘油管种子,摇床转数为每分钟250转,培养温度为20—35℃,在恒温床上培养36—48小时。进行种子罐培养,最后进行生产罐培养。将发酵表达完成的培养液进行提取纯化,对提取纯化的蛋白浓缩液进行冻干,测蛋白测活性保存。在符合GMP要求的制药工厂,按制药规程,将纯度95%的基因重组人溶菌酶制得300U~300万U/mL,磷酸盐缓冲液10~20mM(pH6.5~7.5)80%、5~25%丙二醇、万分之五吐温80,在常温下混合均质,制成滴眼液。
一、对动物的模型试验:
A、基因重组人溶菌酶(HLZ)体内外抗菌作用评价
(1)体外抗菌作用:
受试药品及试剂:
1、人溶菌酶(Human Lysozyme HLZ):活性单位:30000单位/mL,由大连奇龙生物技术研究所提供。
2、对照溶菌酶(contral Lysozyme,CLZ):白色粉未,活性单位:50000单位/mg,美国SIGMA公司产品,批号:L6876。
3、克拉霉素:效价948μ/mg,中国药品生物制品检定所标准品,批号:
4、罗红霉素:效价878μ/mg,中国药品生物制品检定所标准品,批号:
5、注射用阿莫西林:哈尔滨制药厂产品,批号:010504。
6、琼脂糖(B10WEST AGAROSE):
7、三羟甲基氨基甲烷(Tris):成都化学试验厂,批号010211试验菌株:
所用菌株均为2001.4~2002.4月于四川、北京地区收集的临床分离致病菌。经本室用API方法重新鉴定后用于试验。
质控菌株:金黄色葡萄球菌ATCC25923
大肠埃希菌ATCC25922
铜绿假单孢菌ATCC27853
培养基:
4、Tris-HCl缓冲液:0.1M Tris 100ml,0.1M HCl 70ml,
High Water 800ml,测PH值,用HCl溶液调至PH7.2,
加High Water至1000ml。
2、Tris-HCl琼脂培养基:在Tris-Cl缓冲液中加入琼脂糖116℃无菌后使用。
3、M-H培养基:中国药品生物制品检定所产品,M-H肉汤培养基:称取25g加1000ml蒸馏水,加热溶解,分装,高压灭菌,116℃20分钟。M-H固体培养基:称取36g,加1000ml蒸馏水,高压灭菌,116℃20分钟,用于革兰阳性、阴性需氧菌的药敏试验。
4、血培养基,即在M-H培养基中加5-10%脱纤维兔血配制而成,用于肠球菌、链球菌的药敏试验。
试验方法:
体外抗菌活性(MIC)测定:采用琼脂二倍稀释法测定受试药物对试验菌株的最低抑菌浓度(MIC)。将受试药物用灭菌蒸馏水溶解,适当稀释。分别取1ml药液加9ml融化的Tris-HCl琼脂糖固体培养基混匀,以二倍稀释,制备系列含药平皿。每皿所含药物终浓度分别为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03……0.001mg/ml;用多点接种仪(Denley A400,England)将稀释至105FU/ml的试验菌液接种于各含药平皿表面,置于37℃培养8-10小时,取出分别吸取6ml融化的M-H培养基(50℃)覆盖上述系列平皿表面,再置于37℃培养10小时取出,观察结果,以无细菌生长平皿内所含最低药物浓度为该菌的最低抑菌浓度(MIC)。
(2)体内抗菌作用评价:
药品:人溶菌酶来源同前。
克拉霉素来源同前。
罗红霉素来源同前。
阿莫西林来源同前。
细菌:金黄色葡球菌01193,金黄色葡球菌MRSA021923均为临床分离致病菌。
动物:昆明种小鼠,体重18-22克,由本所动物室提供。
试验方法:
体内保护试验:挑取一定量的菌苔接种于2mlM-H液体培养基中,37℃培养6小时后,取出用灭菌干酵母液进行适当稀释(10-1,10-2,10-3,10-4),再取昆明种小鼠,随机分组,每组5只鼠,分别腹腔感染不同菌量的受试菌液,测定引起小鼠100%死亡的最小致死菌量(MLD)。再按1:0.5剂间距设置5个剂量组,每组10只鼠,每只小鼠腹腔感染1MLD菌量的菌液0.5ml,感染后即刻静脉注射受试药0.5ml,设感染对照组(不给药),观察1周,记录小鼠死亡数。按Bliss法计算半数有效剂量ED50及95%可信限。
小鼠皮肤烧伤感染模型的疗效评价:昆明种小鼠26-30g,随机分组,每组5只鼠,分别皮肤烧伤感染模型喷涂金黄色葡萄球菌液100ml,菌量为108CFU/ml,连续喷5次(间隔10分钟喷一次),末次喷菌后6小时,分别用无菌棉签挑取皮肤烧伤感染模型涂于无药琼脂平板表面,37℃培养18小时,皮肤烧伤感染模型感染细菌数在>103CFU/ml,且经革兰氏染色、光镜检测为金黄色葡萄球菌的小鼠为感染模型成功。
选取皮肤烧伤感染模型感染成功小鼠随机分组,每组10只鼠,分别用喷雾器喷涂受试药物100μl/次,4次/日,连续5日,每日采用咽试子涂片法,于琼脂平板表面进行活菌计数,作统计学处理,与感染对照组和克拉霉素组、罗红霉素给药组作比较。
试验结果:
人溶菌酶对临床分离菌株的体外抗菌活性见表1、续表2以及续表3。
根据以上试验结果表明:人溶菌酶体外具有一定抗菌作用,体内对伤口感染溃烂的疗效较确切。对多数菌株的抗菌活性比不上克拉霉素、罗红霉素和阿莫西林。人溶菌酶与克拉霉素、罗红霉素联用(1:1),可使克拉霉素、罗红霉素对其耐药菌株的抗菌活性增效2-16倍以上,个别菌株增效倍数在1000倍。溶菌酶是一种小分子蛋白质,存在于机体的泪液、唾液、白细胞和血清中,对多种革兰氏阳性菌和少数革兰氏阴性菌有杀菌作用,由大连奇龙生物技术研究所研制的基因重组人溶菌酶(Human Lysozyme)也具有溶菌酶相同作用机制,主要切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1、4糖苷键之间的联结,破坏肽聚糖支架,引起细菌裂解。
表1 人溶菌酶、鸡溶菌酶、克拉霉素和罗红霉素体内外抗菌活性
续表2
续表3
注:HLZ指人溶菌酶,CLZ指对照溶菌酶(鸡溶菌酶),CLA指克拉霉素,ROX指罗红素B、人溶菌酶对大鼠的镇痛作用(大鼠甩尾法)
120-150克SD健康大鼠,雌雄各半,动物自由饮水。试验室温度控制在22-28℃左右,动物喂饲大鼠标准饲料。选用在TF—光热测痛仪(光源为12V,50W)热照射下10秒钟内反应的大鼠50只,随机分为5组,每组10只,雌雄各半。设空白对照组、人溶菌酶三个剂量组(120、60、30IU/只)、鸡溶菌酶(阳性对照)30IU/,均尾部涂药。涂药前和涂药后0.5—4小时测每只大鼠的疼痛反应(甩尾)时间,若痛阈升高到照射30秒钟不甩尾时即中断照射,以免损伤皮肤与起泡,并以30秒计算。试验重复一次。
试验结果见表17-21,结果表明,涂抹人溶菌酶30、60、120IU/只三小时内,其痛阈明显升高,具有镇痛作用。
表17-21(A)人溶菌酶外涂对大鼠的镇痛作用(甩尾法)
(第一次试验结果)
注:经统计学处理,与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
表17-21(B)人溶菌酶外涂对大鼠的镇痛作用(甩尾法)
(第二次试验结果)
注:经统计学处理,与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。C、人溶菌酶对巴豆油诱发小鼠耳廓肿胀的影响
选用体重27-30克的健康雄性昆明小鼠50只,动物自由饮水。试验室温度控制在22-28℃左右,动物喂饲大鼠标准饲料。随机分成5组,每组10只。第一组为空白对照组;第二、三、四组为人溶菌酶,剂量分别为120、60、30IU/只;第五组为鸡溶菌酶(阳性对照),30IU/只。首先,各组小鼠全部右耳内侧涂1%巴豆油(巴豆油浅棕色油状液体,药用级,批号000309,由江西吉水县华宝天然药用厂生产。临用前用乙醇:水:乙醚25:5:70混合溶媒配制成1%浓度。)30μL致炎,半小时后分别用双蒸水20μl、人溶菌酶(6000IU/ML)20μl、人溶菌酶(3000IU/ML)20μl、人溶菌酶(1500IU/ML)20μl、鸡溶菌酶(1500IU/ML)20μl涂抹各组小鼠右耳内侧。致炎后4小时将小鼠脱颈椎致死,沿耳廓基线剪下左右两耳片,用8mm打孔器冲下两耳片,精确称重,左右耳片重量之差为肿胀度。经T检验,比较药物组与空白对照组的差异,并求出抑制率。试验重复一次。
试验结果见表17-22。小鼠经外涂人溶菌酶120、60、30IU/只,使小鼠由巴豆油诱发耳廓肿胀度明显减轻,经T检验,药物组与空白对照组比较,有显著性差异(P<0.05)。说明人溶菌酶具有抗炎作用。
表17-22人溶菌酶对巴豆油诱发小鼠耳廓肿胀的影响
注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
D、重组人溶菌酶滴眼液抗病毒抑制豚鼠角膜炎试验模型
选体重250克左右的健康豚鼠20只,雄性随机均分四组,每组5只,进行滴眼液造模。首先用细针在豚鼠的眼角膜上轻微划出三道痕迹,然后用I型疱疹病毒100~1000TCID50感染豚鼠的眼角膜,每天三次。第三天豚鼠眼角膜出现轻微角膜炎,第四天豚鼠眼角膜出现红肿,角膜炎加重。将造模后的20只豚鼠重新合并后再随机分成四组,分别设立三个给药组和一模型组。重组人溶菌酶滴眼液以15000u/ml(每滴1500U)为低剂量浓度基础上再配制30000u/ml(每滴3000U)、60000u/ml(每滴6000U)二浓度作为中、高剂量组治疗时的药液浓度。在第五天开始给豚鼠眼角膜用重组人溶菌酶滴眼液,每天三次,每次每只眼一滴,肉眼观察豚鼠形态变化情况及时间。
实验结果给药重组人溶菌酶滴眼液第二天,给药重组人溶菌酶滴眼液中、高剂量组治疗效果凸现,豚鼠角膜红肿减轻。给药重组人溶菌酶滴眼液第三天,给药重组人溶菌酶滴眼液低剂量组也出现好转治疗效果。给药重组人溶菌酶滴眼液第六天,给药模型低、中、高组豚鼠角膜炎和红肿全部消退好转。模型对照组豚鼠角膜红肿,角膜炎症加重并出现溃疡。给药重组人溶菌酶组和一模型组有明显区别。见表4、见表5。
表4
表5
综合以上实验结果分析,试验重组人溶菌酶滴眼液对抗I型疱疹病毒100~1000TCID50感染豚鼠的眼角膜炎,有很好的治疗效果。其治疗效果与使用剂量有明显量效关系。
二、用法及用量:
每次每只眼滴一滴,每天3~6次。
具体实施方式:
实施例1
基因重组人溶菌酶以配制200毫升培养基为准,用磷酸6毫升、硫酸镁3克,硫酸钾4克,氢氧化钾1克,硫酸钙1.5克,加蒸馏水至200毫升,高压灭菌后接种甘油管种子,摇床转数为每分钟250转,培养温度为20—35℃,在恒温床上培养36—48小时。进行种子罐培养,最后进行生产罐培养。将发酵表达完成的培养液进行提取纯化,对提取纯化的蛋白浓缩液进行冻干,测蛋白测活性保存。在符合GMP要求的制药工厂,按制药规程,将纯度95%的基因重组人溶菌酶制得30000U/mL,磷酸盐缓冲液10~20mM(pH6.5~7.5)80%、5~25%丙二醇、万分之五吐温80,在常温下混合均质,制成滴眼液。
实施例2
根据实施例1所述制备方法,在符合GMP要求的制药工厂,按制药规程将纯度95%的基因重组人溶菌酶制得100万U/mL,磷酸盐缓冲液10~20mM(pH6.5~7.5)80%、5~25%丙二醇、万分之五吐温80,在常温下混合均质,制成滴眼液。
实施例3
根据实施例1所述制备方法,在符合GMP要求的制药工厂,按制药规程将纯度95%的基因重组人溶菌酶制得200万U/mL,磷酸盐缓冲液10~20mM(pH6.5~7.5)80%、5~25%丙二醇、万分之五吐温80,在常温下混合均质,制成滴眼液。
Claims (1)
1、人溶菌酶在制备治疗由I型疱疹病毒引起的疱疹病导致的角膜炎疾病的药物中的应用。
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溶菌酶的研究进展. 中国生化药物杂志,第20卷第6期. 1999 |
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重组人溶菌酶研究进展. 中国生物工程杂志,第23卷第9期. 2003 |
重组人溶菌酶研究进展. 中国生物工程杂志,第23卷第9期. 2003 * |
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