WO2000009659A1 - Verfahren zur herstellung von indanderivaten - Google Patents

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WO2000009659A1
WO2000009659A1 PCT/EP1999/005948 EP9905948W WO0009659A1 WO 2000009659 A1 WO2000009659 A1 WO 2000009659A1 EP 9905948 W EP9905948 W EP 9905948W WO 0009659 A1 WO0009659 A1 WO 0009659A1
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microorganisms
indene
indanediol
rhodococcus
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PCT/EP1999/005948
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Marion Plata
Martin Sauter
Andreas Tinschert
Veronica Venetz
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Lonza Ag
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones

Definitions

  • the invention relates to new microorganisms which are capable of indden of the formula
  • indanediols such as, for example, cis- (IS, 2R) -indanediol, which is an important intermediate for the preparation of, for example, cis (IS, 2R) -l-aminoindan-2-ol, which in turn is an important intermediate for the preparation of the HIV Protease inhibitor is Crixivan (WO 93/09096)
  • indane derivatives such as, for example, for the production of cis (IS, 2R) indanediol
  • WO 96/1 1282 describes a process for the production of cis (IS, 2R) indanediol starting from Racemic dihydroxydihydroindene using dehydrogenase-containing microorganisms of the species Pseudomonas putida.
  • a disadvantage of this process is that a cosubstrate, such as, for example, an ⁇ -keto acid, is added to regenerate the cofactor NADH (nicotinamide adenine dinuclotide), which is necessary for the dehydrogenase reaction - must be carried out and that the desired product is obtained in low yield
  • a cosubstrate such as, for example, an ⁇ -keto acid
  • Zhang J et al (J Ferm Bioeng 80, 1 95, 244-246) describe a process for the preparation of cis- (1 S, 2R) -indanediol starting from indene, in which initially racemic indene oxide is formed, which is then hydrolyzed enantioselectively with an epoxy hydrolase to the desired optically active indanediol.
  • WO 98/06865 also encompasses a process for the preparation of cis- (lS, 2R) -indanediol starting from indene via indene oxide by means of microorganisms which form a Epoxy hydrolase contain disadvantages of these two processes are that the desired product is obtained in low yield
  • WO 96/37628 encompasses a process for the preparation of cis- (1 S, 2R) -indanediol starting from 2-acetoxyindane by means of microorganisms which contain dioxygenases. This process also has the disadvantage that the desired product is obtained in low yield WO 97/00966 a process for the preparation of cis- (1 S, 2R) -indandiol starting from indene using microorganisms containing, for example, toluene dioxygenase, in which the desired product is obtained in low yield
  • WO 98/06866 describes a process for the preparation of cis (IS, 2R) indanediol starting from indene using the toluene dioxygenase-containing microorganism species Rhodococcus B264-1.
  • a disadvantage of all of these processes is that the microorganisms used are not suitable for a commercially interesting process
  • microorganisms according to the invention can be isolated from coal, coal dust, soil samples from coal heaps, soil samples from oil-contaminated soil, humus or from clear sludge with the aid of conventional microbiological techniques
  • microorganisms according to the invention can be obtained by enrichment or selection in a nutrient medium which, in addition to nitrogen sources which are customary in the art, have the indens of the formula
  • Indening is advantageously fed to the nutrient medium indirectly, ie via the gas phase
  • the selection can be carried out under aerobic or anaerobic conditions
  • the invention also relates to the enzyme extracts of these microorganisms, which, as is known in the art, can be obtained by disrupting the cells, for example using the French press or lysozyme method
  • microorganisms according to the invention can also grow with commercially available carbon sources such as with sugars, sugar alcohols or dicarboxylic acids
  • the microorganisms can use ammonium sulfate, ammonium halides such as ammonium chloride or ammonium bromide, ⁇ -amino acids, urea, nitrates, peptone and yeast extract as nitrogen sources
  • the selection and growth medium which can be used are those customary in the art, for example low-molar phosphate buffer or mineral salt medium, such as, for example, the mineral salt medium described in Table 1.
  • the medium described in Table 1 is preferably used.
  • the low-molar phosphate buffer can be 10 mM-100 mM potassium or Sodium phosphate buffer can be used
  • the effective enzymes of the microorganisms involved in the formation of the indane derivatives II from indene are appropriately induced.
  • Cyclic hydrocarbons are advantageously used as enzyme inducers.
  • Indene, naphthalene or toluene are suitable as cyclic hydrocarbons, for example
  • Cultivation and selection are usually carried out at a temperature of 10 to 70 ° C., preferably 25 to 35 ° C., and at a pH of 2 to 12, preferably 5 to 9
  • microorganisms according to the invention are able to indene in at least one of the indane derivatives of the general formula
  • indanediols for example cis-indanediols and trans-indanediols, 1-keto-2-hydroxyindanes and / or the indona one 1-indanone and 2-indanone
  • the microorganisms of the invention are capable of forming, are the optically active compounds cis- (lS, 2R) -indanediol, cis- (lR, 2S) -indanediol, trans- (lR, 2R) indanediol, 1-keto- (2S) -hydroxyindane, 1-keto- (2R) -hydroxyindane and trans- (1S, 2S) -indanediol
  • indane derivatives of the general formula II are the optically active indanediols of the formula
  • Preferred microorganisms are microorganisms of the genera Cellulomonas, Rhodococcus, Paenibacillus, Gordona, Arthrobacter, Fusarium or Pseudomonas
  • microorganisms are microorganisms of the species Cellulomonas cellulans Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus ruber, Paenibacillus validus, Gordona rubropertincta, Pseudomonas stutzeri, Arthrobacter nicotianae and Fusarium solani
  • microorganisms of the species Cellulomonas cellulans (Tin 2-1-1), Rhodococcus erythropolis (Tin 4-2-16), Rhodococcus rhodochrous (Tin 4-D-3-71), Rhodococcus ruber (Tin 5-4 -120), Paenibacillus sp (Tin 7-2-20), Paenibacillus validus (Tin 3-1-38), Gordona rubropertincta (Tin 21-4-35), Pseudomonas stutzeri (Tin 12-4-50), Arthrobacter nicotianae (Tin 22-3 -132) Gordona sp (Tin 21-4-35), Tin 10-4-44, Tin 13-4-53, Tin 13-4-54, Tin 2-1-2, Tin 19-4-31, Tin 12-4-120, Rhodococcus aiber (Tin 3-4-61), Rhodococcus ruber (Tin 22-3-1 16), Tin 22-3-133, Tin 6-
  • microorganisms Cellulomonas cellulans (Tin 2-1-1, DSM 12224), Paenibacillus validus (Tin 3-1-38, DSM 12225) and Rhodococcus ruber Tin 3-4-61 (DSM 12226) were released on 8 June 1998 in the German Collection of microorganisms and cell cultures GmbH (DSMZ), Mascheroderweg lb, D-38124 Braunschweig, deposited according to the Budapest contract
  • “Functionally equivalent variants and mutants” are understood to mean microorganisms which have essentially the same properties and functions as the original microorganisms. Such variants and mutants can be formed accidentally, for example by UV radiation
  • Nitrate reduction (NO-, to NO 2 ) - denitrification (N0 3 to N 2 ) + Substrate recycling _
  • the profile of the cellular fatty acids is typical for the RNA group I of the Pseudomonas P stutzeri is assigned a high value
  • the partial sequencing of the 16S rDNA showed the highest similarity of 99.3% to different strains of genome group 3 within the species Pseudomonas stutzeri (eg DSM 50227). There is less agreement on the type strain of the species. This species is currently genetically very different heterogeneous and requires a new description
  • microorganisms which are capable of utilizing indene as the sole source of carbon and energy are suitable.
  • Preferred microorganisms are those of the genus Cellulomonas, Rhodococcus, Paenibacillus, Gordona, Arthrobacter, Fusarium or Pseudomonas
  • Particularly preferred microorganisms are microorganisms of the species Cellulomonas cellulans, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus ruber, Paenibacillus validus, Gordona rubropertincta, Pseudomonas stutzeri, Arthrobacter nicotianae and Fusarium solani
  • microorganisms examples include the microorganism species Cellulomonas cellulans (Tin 2-1-1, DSM 12224), Rhodococcus erythropolis (Tin 4-2-16), Rhodococcus rhodochrous (Tin 4-D-3-71), Rhodococcus ruber (Tin 5 -4-120), Paenibacillus (Tin 7-2-20), Paenibacillus validus (Tin 3-1-38, DSM 12225), Gordona rubropertincta (Tin 21- 4-35), Pseudomonas stutzeri (Tin 12-4-50 ), Arthrobacter nicotianae (Tin 22-3-132), Tin 10-4- 44, Tin 13-4-53, Tin 13-4-54, Tin 2-1-2, Fusarium solani (Tin 19-4-31 ), Rhodococcus ruber (Tin 3-4-61), Rhodococcus ruber (Tin 22-3-1 16), Tin 22-3-133, Tin 6-D-3-134, Tin 7-2-145
  • the biotransformation can be carried out in media customary in the art, for example in low-molar phosphate buffer, citrate buffer, full media, HEPES buffer, or in the medium according to Table 1.
  • the biotransformation is preferably carried out in a medium according to Table 1
  • the biotransformation is expediently carried out with a single or continuous addition of indene such that the concentration does not exceed 5% by weight, preferably 2% by weight
  • the pH can be in a range from 2 to 12, preferably from 5 to 9.
  • the biotransformation is expediently carried out at a temperature of 10 to 100 ° C., preferably at a temperature of 20 to 50 ° C.
  • the indane derivatives of the general formula II can then be isolated in a known manner
  • Indane derivatives of the formula II which can be prepared by means of the microorganisms according to the invention are indanediols such as cis-indanediols and trans-indanediols, 1-keto-2-hydroxyindanes and / or the indanones 1-indanone and 2-indanone
  • Particularly preferred compounds of the formula II which can be prepared with the aid of the microorganisms according to the invention are the optically active compounds cis- (lS, 2R) -indanediol, cis- (lR, 2S) -indanediol, trans- (lR, 2R ) -Indanediol, l-keto- (2S) -hydroxyindane, l -keto- (2R) -hydroxyindane and trans- (lS, 2S) -indanediol
  • cis (1 S, 2R) indanediol is conveniently carried out using the microorganisms Cellulomonas cellulans (Tin 2- 1 -1, DSM 12224) or Rhodococcus ruber (Tin 3-4-61, DSM 12226), the formation of cis - (lR, 2S) -indanediol with the microorganisms Arthrobacter nicotianae (Tin 22-3-132) or Paenibacillus validus (Tin 3- 1 -38, DSM 12225) and the formation of cis- (l R, 2S) and trans- (IS, 2S) indanediol with the microorganisms Rhodococcus ruber (Tin 9-4-158) or Rhodococcus ruber (Tin 22-3-1 16)
  • microorganisms which are suitable for producing a specific compound of the formula II or III can be found in a simple manner among the indene-degrading microorganisms according to the invention by simple analysis of the transformation products of the microorganisms by means of HPLC, for example chiral HPLC
  • the indane derivatives of the formulas II or III are preferably prepared with resting (non-growing) cells
  • the effective enzymes of the microorganisms involved in the formation of the indane derivatives of the formula II or III are expediently induced for the process by adding suitable inductors.
  • Cyclic hydrocarbons are expediently used as the enzyme inductors.
  • Preferred cyclic hydrocarbons are, for example, indene, naphthalene or toluene Microorganisms with the inductor as the only source of carbon and energy, especially if cells are used for the process itself at rest.
  • the choice of the inductor can also influence the product spectrum of the microorganisms
  • a total of 37 enrichments in A + N medium (Table 1) in 300 ml or 500 ml Erlenmeyer flasks with three baffles were used to enrich inden-degrading microorganisms.
  • a + N medium 50 ml
  • the substrate Inden slowly evaporated into the airspace and from there dissolved in the medium.
  • Sterile control flasks without the addition of inoculum were among the above conditions described after 2-3 days indene concentrations of 200 - 400 ⁇ M measured in A + N medium
  • Example 1 The experimental setup essentially corresponded to that of Example 1 1.
  • 50 ⁇ l of indene were additionally pipetted directly into the A + N medium (50 ml) in each Erlenmeyer flask, so that theoretically one Substrate concentration of 8 mM could be reached.
  • Inden rings were actually measured in these concentrations up to 6.3 mM.
  • the cultures were passaged after a further 7 days. Every 4-7 days, 50 ⁇ l of indene were pipetted into the medium again. All flasks during the subsequent passages (a total of 3 passages consecutively) contained indene directly in the medium
  • Vitamin solution 1 ml Milli-QH 2 0 873 ml
  • a + N stock solution, solution B, SL4 and Milli-QH 2 O were prepared separately and each was autoclaved at 121 ° C for 30 minutes.
  • the vitamin solution was sterile filtered
  • Dilutions in 0.9% NaCl were made from the enrichments of all pass levels and these were plated onto agar-solidified A + N medium.
  • the processing was carried out under an inert atmosphere in a desiccator at 30 ° C. for 7-14 days
  • Inden atmosphere A 50 ml beaker containing 4 ml of indene was placed in the desiccator. In addition, 50 ⁇ l of indene were pipetted directly into the lid of each petri dish and the same amount of indene was pipetted every 3-4 days to ensure a high indene concentration. To isolate pure cultures Individual colonies picked on plates of the same type and also incubated under the conditions described above. This was repeated in succession until pure cultures were obtained. The purity of the cultures was checked by streaking on nutrient agar plates (complete medium)
  • Tin 9-4-158 Rhodococcus ruber 3.2 Identification of isolates Tin 3-4-61, Tin 22-3-116 and Tin 9-4-158
  • Fatty acids 1-5%, (+), 5-15%, +; 15-30%, ++; > 30%, +++; br, branched fatty acids ie iso-hexadecanoic acid; 16: 0, hexadecenoic acid; 10-Me-18, tuberculostearic acid.
  • Example 2 The experimental set-up was identical to Example 1. Inoculation was carried out with cells from colonies of the respective strain resuspended in 0.9% NaCl from the A rN agar plates described above. The incubation was carried out at 30 ° C. and 120 rpm. The growth (OD 6 j () nm ) and the formation of indene degradation products in the test flask was followed for 10 days. 67 of the 160 strains grew with indene as the only source of carbon and energy in the liquid A + N medium (cf. FIG. 1) in HPLC analyzes of the culture supernatants of these grown Cultures were found after centrifugation of the cells. Inden degradation products. Growth with indene, which was supplied via the gas phase, was linear. FIG. 1 shows the growth of bacterial strains enriched with indene, with indene as the only carbon and energy source
  • naphthalene was added as follows. 0.1 g of naphthalene in 2 ml of water was autoclave. After autoclaving, this became 100 ml of sterile A + N medium placed in a 500 ml Erlenmeyer flask, so that approx. 0.1% solid naphthalene resulted in the Erlenmeyer flask.
  • Naphthalene-containing agar plates were prepared analogously by stirring the autoclaved naphthalene solution to 100 ml of sterile, 83 ° C. hot A + N / l , 9% agar medium was added, and agar plates were poured from it. On cooling, the naphthalene precipitated out as a homogeneously distributed solid substance in agar. During the growth of bacteria with naphthalene in liquid medium, the naphthalene solid dissolved substance gradually
  • the Tin 3-4 strains -61, Tin 4-D-3-71 and Tin 5-4-120 grew with both indene and toluene and the strain Tin 2-1-1, Tin 7-2-20 and Tin 9-4-158 both with indene, toluene and with naphthalene as the only source of carbon and energy
  • the strains Tin 2-1-2, Tin 10-4-44, Tin 12-4-120, Tin 7- 1 - 149, Tin 3-1-38, Tin 22-3-1 16, Tin 22-3-132, Tin 22-3-133 and Tin 7-2-145 grew with indene and with naphthalene
  • FIG. 4 shows the biotransformation of indene using Arthrobacter nicotianae (Tin 22-3-132), which was grown with naphthalene as the only source of carbon and energy.
  • FIG. 5A shows the biotransformation of indene using Rhodococcus ruber (tin 22-3-1 16), which was grown with indene as the only source of carbon and energy, and Fig. 5B when grown with naphthalene
  • FIG. 6A shows the biotransformation of indene using Rhodococcus ruber (Tin 3-4-61), which was grown with glucose as the sole carbon and energy source, and FIG. 6B if this was grown with indene as the only carbon and energy source, and FIG 6C, when grown with toluene as the sole source of carbon and energy.
  • FIGS. 7A, B and C show the biotransformations of indene using Rhodococcus ruber (Tin 9-4-158), which is combined with glucose (FIG. 7A) and with toluene (FIG. 7B ) and with Inden (Fig. 7C) as the only source of carbon and energy
  • Figure 8 shows the biotransformation of indene using the Tin 2-1-2 strain grown with naphthalene as the only source of carbon and energy
  • the Tin 2-1 -1 strain formed cis-indanediol, l-keto-2-hyd ⁇ oxyindan and 1-indanone when grown with toluene as the sole source of carbon and energy (Fig. 2). It preferably formed the cis- (lS, 2R) -Indanediol (Table 3), trans-indandiol was not formed.
  • the Tin 3-1-38 strain formed l-keto-2-hydroxyindane, cis-indanediol and 1-Indanone (Fig. 3)
  • the preferred cis-indanediol enantiomer was cis- (IR, 2S) -indanediol (Table 3); this strain did not form trans-indanediol
  • the Tin 22-3-132 strain when grown with naphthalene, set indene to cis (IR, 2S) indandiol with high ee (Fig. 4, Table 3) and 1-keto-2-hydroxyindane and 1 -Indanon um He did not form trans-indandiol
  • the Tin 22-2-1 16 strain when grown with indene as the sole source of carbon and energy, converted indene to ice and trans-indanediol (Fig.

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Abstract

Beschrieben werden neue Mikroorganismen, die befähigt sind, Inden der Formel (I) als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle zu verwerten sowie ein Verfahren zur Herstellung von Indanderivaten der allgemeinen Formel (II) unter Verwendung dieser Mikroorganismen.

Description

Verfahren zur Herstellung von Indanderivaten
Beschreibung
Die Erfindung betrifft neue Mikroorganismen, die befähigt sind, Inden der Formel
Figure imgf000003_0001
als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle zu verwerten, sowie deren Verwendung für ein neues Verfahren zur Herstellung von Indanderivaten der allgemeinen Formel
Figure imgf000003_0002
worin R und R gleich oder verschieden sind und eine Hydroxylgruppe, ein Wasserstoffatom oder = O bedeuten
Interessante Indanderivate sind Indandiole wie beispielsweise cis-(lS,2R)-Indandiol, das ein wichtiges Zwischenprodukt zur Herstellung von beispielsweise cis-(lS,2R)-l-Aminoindan-2-ol ist, welches wiederum ein wichtiges Zwischenprodukt zur Herstellung des HlV-Protease- Hemmstoffes Crixivan ist (WO 93/09096)
Zur Herstellung von Indanderivaten, wie z B zur Herstellung von cis-(l S,2R)-Indandiol, sind mehrere Verfahren bekannt Beispielsweise beschreibt die WO 96/1 1282 ein Verfahren zur Herstellung von cis-(lS,2R)- Indandiol ausgehend von racemischem Dihydroxydihydroinden mittels Dehydrogenase-ent- haltenden Mikroorganismen der Spezies Pseudomonas putida Nachteilig bei diesem Verfahren ist, dass zur Regenerierung des Cofaktors NADH (Nikotinamidadenindinuklotid), das für die Dehydrogenase-Reaktion notwendig ist, ein Cosubstrat, wie z B eine α-Ketosaure, hinzu- gefuhrt werden muss und dass das gewünschte Produkt in geringer Ausbeute erhalten wird
Zhang J et al (J Ferm Bioeng 80, 1 95, 244-246) beschreiben ein Verfahren zur Herstellung von cis-(l S,2R)-Indandiol ausgehend von Inden, bei dem zun chst racemisches Indenoxid gebildet wird, welches dann mit einer Epoxid-Hydrolase enantioselektiv zum gewünschten optisch aktiven Indandiol hydrolysiert wird Auch die WO 98/06865 umfasst ein Verfahren zur Herstellung von cis-(l S,2R)-Indandiol ausgehend von Inden über Indenoxid mittels Mikroorganismen, die eine Epoxid-Hydrolase enthalten Nachteile dieser beiden Verfahren sind, dass das gewünschte Produkt in geringer Ausbeute erhalten wird
Die WO 96/37628 umfasst ein Verfahren zur Herstellung von cis-(l S,2R)-Indandiol ausgehend von 2-Acetoxyindan mittels Mikroorganismen, welche Dioxygenasen enthalten Auch dieses Verfahren hat den Nachteil, dass das gewünschte Produkt in geringer Ausbeute erhalten wird Desweiteren beschreibt die WO 97/00966 ein Verfahren zur Herstellung von cis-(l S,2R)-In- dandiol ausgehend von Inden mittels z B Toluol-Dioxygenase-enthaltenden Mikroorganismen, bei dem das gewünschte Produkt in geringer Ausbeute erhalten wird
Die WO 98/06866 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von cis-(lS,2R)-Indandiol ausgehend von Inden mittels der Toluol-Dioxygenase-enthaltenden Mikroorganismen-Spezies Rhodococcus B264-1 Nachteilig bei allen diesen Verfahren ist, dass die eingesetzten Mikro- Organismen für einen kommerziell interessanten Prozess nicht geeignet sind
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war, diese Nachteile zu beseitigen und ein wirtschaftlicheres Verfahren zur Herstellung von Indanderivaten der allgemeinen Formel II zur Verfügung zu stellen
Diese Aufgabe wird mit den Mikroorganismen gemass Anspruch 1 und dem Verfahren gemass Anspruch 3 gelost
Die erfindungsgemassen Mikroorganismen können aus Kohle, Kohlestaub, Bodenproben von Kohlehalden, Bodenproben olverschmutzter Boden, Humus oder aus Klarschlamm unter Zuhilfenahme üblicher mikrobiologischer Techniken isoliert werden
Die erfindungsgemassen Mikroorganismen sind durch Anreicherung oder Selektion in einem Nahrmedium erhaltlich, das neben fachmannisch üblichen Stickstoffquellen Inden der Formel
Figure imgf000004_0001
als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle enthalt, wobei die Mikroorganismen in üblicher Weise gezüchtet werden Vorteilhaft wird das Inden dem Nahrmedium indirekt, d h über die Gasphase zugeführt Die Selektion kann unter aeroben oder anaeroben Bedingungen durchgeführt werden
Gegenstand der Erfindung sind auch die Enzymextrakte dieser Mikroorganismen, die, wie fachmannisch bekannt, durch Aufschliessen der Zellen, beispielsweise mit der French-Press- oder Lysozym-Methode, erhalten werden können
Die erfindungsgemaßen Mikroorganismen können auch mit handelsüblichen Kohlenstoffquellen wie mit Zuckern, Zuckeralkoholen oder Dicarbonsauren wachsen
Als Stickstoffquellen können die Mikroorganismen Ammoniumsulfat, Ammoniumhalogenide wie Ammoniumchlorid oder Ammoniumbromid, α-Aminosauren, Harnstoff, Nitrate, Pepton und Hefeextrakt nutzen
Als Selektions- und Anzuchtmedium können die in der Fachwelt üblichen Verwendung finden, beispielsweise niedermolare Phosphatpuffer oder Mineralsalzmedium, wie z B das in Tabelle 1 beschriebene Mineralsalzmedium Vorzugsweise wird das in Tabelle 1 beschriebene Medium verwendet Als niedermolare Phosphatpuffer können 10 mM - 100 mM Kalium- oder Natriumphosphatpuffer eingesetzt werden
Wahrend der Anzucht und Selektion werden zweckmassig die wirksamen, an der Bildung der Indanderivate II aus Inden beteiligten Enzyme der Mikroorganismen induziert Als Enzyminduktoren werden zweckmäßig cyclische Kohlenwasserstoffe eingesetzt Als cyclische Kohlenwasserstoffe sind beispielsweise Inden, Naphthalin oder Toluol geeignet
Üblicherweise erfolgt die Anzucht und Selektion bei einer Temperatur von 10 bis 70°C, vorzugsweise von 25 bis 35°C, und bei einem pH-Wert von 2 bis 12, vorzugsweise von 5 bis 9
Die erfindungsgemaßen Mikroorganismen sind in der Lage, Inden in wenigstens eines der Indanderivate der allgemeinen Formel
Figure imgf000005_0001
zu überfuhren Bevorzugte Verbindungen der Formel II sind Indandiole, beispielsweise cis-Indandiole und trans-Indandiole, l-Keto-2-hydroxyindane und/oder die Inda one 1-Indanon und 2-Indanon
Die Bildungsraten für die Produkte trans-lndandiol, cis-Indandiol, l-Keto-2-hydroxyindan, 1- Indanon und 2-Indanon aus Inden liegen im Bereich von 0, 1 - 1000 mg/1 h OD6s()lιm = 10, zweckmassig im Bereich von 1 - 200 mg/1 h ODf)50ιmι = 10, insbesondere im Bereich von 1 - 65 mg/1 h OD65o„,n = 10
Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel II, zu deren Bildung die erfindungsgemaßen Mikroorganismen in der Lage sind, sind die optisch aktiven Verbindungen cis-( l S,2R)- Indandiol, cis-(l R,2S)-Indandiol, trans-(lR,2R)-Indandiol , l -Keto-(2S)-hydroxyindan, 1- Keto-(2R)-hydroxyindan und trans-( l S,2S)-Indandiol
Besonders bevorzugte Indanderivate der allgemeinen Formel II sind die optisch aktiven Indandiole der Formel
OH
OH
III
insbesondere cis-( 1 S,2R)-Indandiol, cis-( 1 R,2S)-Indandiol, trans-( 1 R,2R)-Indandiol, und trans-(lS,2S)-Indandiol Ganz besonders bevorzugt sind cis-( l S,2R)-lndandiol und trans- (lR,2R)-Indandiol
Bevorzugte Mikroorganismen sind Mikroorgaismen der Gattungen Cellulomonas, Rhodococcus, Paenibacillus, Gordona, Arthrobacter, Fusarium oder Pseudomonas
Besonders bevorzugte Mikroorganismen sind Mikroorganismen der Spezien Cellulomonas cellulans Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus ruber, Paenibacillus validus, Gordona rubropertincta, Pseudomonas stutzeri , Arthrobacter nicotianae und Fusarium solani
Beispiele bevorzugter erfindungsgemaßer Mikroorganismen sind Mikroorganismen der Spezien Cellulomonas cellulans (Tin 2-1-1 ), Rhodococcus erythropolis (Tin 4-2-16), Rhodococcus rhodochrous (Tin 4-D-3-71 ), Rhodococcus ruber (Tin 5-4-120), Paenibacillus sp (Tin 7-2-20), Paenibacillus validus (Tin 3-1-38), Gordona rubropertincta (Tin 21-4-35), Pseudomonas stutzeri (Tin 12-4-50), Arthrobacter nicotianae (Tin 22-3-132) Gordona sp (Tin 21-4-35), Tin 10-4-44, Tin 13-4-53, Tin 13-4-54, Tin 2-1-2, Tin 19-4-31, Tin 12-4-120, Rhodococcus aiber (Tin 3-4-61 ), Rhodococcus ruber (Tin 22-3-1 16), Tin 22-3-133, Tin 6-D- 3-134, Tin 7-2-145, Tin 7-1-149, Tin 10-4-150, Tin 14-4-152, Tin 22-3-154, Tin 14-D-3-156, Rhodococcus ruber (Tin 9-4-158) Rhodococcus ruber (Tin 5-4-120), Fusarium solani (Tin 19- 4-31), sowie deren fünktionell aequivalente Varianten und Mutanten
Die Mikroorganismen Cellulomonas cellulans (Tin 2-1-1, DSM 12224), Paenibacillus validus (Tin 3-1-38, DSM 12225) und Rhodococcus ruber Tin 3-4-61 (DSM 12226) wurden am 8 6 1998 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroderweg lb, D-38124 Braunschweig, gemass Budapester Vertrag hinterlegt
Unter "fünktionell aequivalente Varianten und Mutanten" werden Mikroorganismen verstan- den, die im wesentlichen dieselben Eigenschaften und Funktionen wie die Ursprungsmikroorganismen besitzen Derartige Varianten und Mutanten können zufällig, z B durch UV-Bestrahlung, gebildet werden
Eigenschaften der Mikroorganismen Rhodococcus ruber Tin 3-4-61 (DSM 12226), Tin 22-3-116 und Tin 9-4-158.
1 Morphologie und Farbe der Kolonien Kurze verzweigte Hyphen, die im Alter in Stabchen und Kokken zerfallen, Kolonien matt, beige-rot bis lachsrot RAL 3012-2022
2 Mycolsauren Rhodococcus-Mycolsauren Die Bestimmung der Mycolsaure- Kettenlange (C_4-C50) und der Vergleich der Daten mit den Eintragen in die Mycolsauredatenbank ergab eine sehr hohe Ähnlichkeit zu den Mustern der
Rhodococcus ruber Stamme
3 Fettsauremuster Unverzweigte, ges ttigte und ungesättigte Fettsauren plus Tuberculostearinsaure Dieses Fettsauremuster ist diagnostisch für alle Vertreter der Gattung Rhodococcus und ihre nahen Verwandten wie Mycobacterium, Tsukamurella, Skermania, Nocardia und Gordona Eine weitere Differenzierung zur Spezies Ebene erfolgte durch den Vergleich der qualitativen und quantitativen Unterschiede der Fettsauremuster mit Hilfe numerischer Methoden mit den Fettsaure- Datenbankeintragen Auch mit dieser Methode wurden die Stamme Rhodococcus ruber zugeordnet 4 Bei der Partial-Sequenzierung der 16S rRNA der Isolate wurde eine sehr hohe
Übereinstimmung ( 100%) mit den Sequenzen der spezifischen Regionen von Rhodococcus ruber gefunden Das Identifizieamgsergebnis ist eindeutig, da drei voneinander unabhängige Merkmale (Mycolsauren, Fettsauren, 16S rDNA) Tin 3-4-61 , Tin 22-3-1 16, Tin 9-4-158 der Spezies
Rhodococcus ruber zugeordnet haben
Eigenschaften des Stammes Cellulomonas cellulans Tin 2-1-1 (DSM 12224)
Charakterisierung Gram-positive, coryneforme Stabchen, fakultativ anaerob, schwache Saurebildung aus Glucose unter anaeroben Bedingungen
Beweglichkeit
Sporen
Katalase + meso-Diaminopimelinsaure in der Zellwand nein
Peptidoglycan-Typ A4α, L-Lys-D-Ser-D-Asp
16S rDNA Sequenz- Ähnlichkeit Sequenzierung des Bereichs mit der grossten Variabilität ergab 99,8% mit Cellulomonas cellulans
Eigenschaften des Stammes Arthrobacter nicotianae, Tin 22-3-132 Charakterisierung Gram-positive, corynefomre Stachen, in alteren Kulturen kokkoid, jrtrikt aerob, keine Saurebildung aus Glucose
Beweglichkeit Sporen Katalase + meso-Diaminopimelinsaure in der Zellwand nein Peptidoglycan-Typ A4α, L-Lys-L-Ala-L-Glu
16S rDNA Sequenz- Ähnlichkeit Sequenzierung des Bereich mit der grossten Variabilität ergab 100,0% mit Arthrobacter nicotianae Eigenschaften des Stammes Paenibacillus sp. Tin 7-2-20
Zellform Stäbchen
Breite μm 0,8-1,2
Länge μm 2,5-5,0
Sporenbildung + eliposoide Sporen + runde Sporen -
Anaerobes Wachstum
Voges-Proskauer Test pH in VP
Säurebildung aus
D-Glukose +
L — Arabinose -
D-Xylose +
D-Mannit +
D-Fruktose +
Gasbildung aus Glukose -
Hydrolyse von Casein -
Gelatine -
Stärke +w
Tween 80 (w)
Esculin -
Verwertung von Citrat
Propionat
Tyrosin
Phenylalanindesaminase
Lecithinase
Nitratreduktion +
Indol Wachstum bei pH 5,7
Wachstum bei 2% NaCl -
5% NaCl -
7% NaCl -
10% NaCl -
Wachstum bei 40°C +
45°C +
50°C +
55°C +
Wachstum bei 0,0001%
Lysozym
Arginindihydrolase
Die Analyse der zellularen Fettsauren und der physiologischen Eigenschaften ergaben eine Zuordnung zur
Gattung Paenibacillus
Die Analyse der partiellen 16S rDNA Sequenz zeigte eine Ähnlichkeit des unbekannten Stammes zu
Paenibacillus validus von 93,6%
Eigenschaften des Stammes Paenibacillus validus Tin 3-1-38 (DSM 12225)
Zellform Stabchen
Breite μm 0,8-1,2
Lange μm 2,5-5,0
Sporenbildung +
eliposoide Sporen + runde Sporen
Anaerobes Wachstum
Voges-Proskauer Test pH in VP 6,0 Saurebildung aus
D-Glukose +
L-Arabinose
D-Xylose +
D-Mannit +
D-Fruktose +
Gasbildung aus Glukose
Hydrolyse von Casein Gelatine Starke + Tween 80 Esculin
Verwertung von Citrat
Propionat +
Tyrosin
Phenylalanindesaminase
Lecithinase
Nitratreduktion +
Indol
Wachstum bei pH 5,7
bei 2% NaCl -
5% NaCl -
7% NaCl -
10% NaCl - bei 40°C +
45°C +
50°C -
55°C - Wachstum bei 0,0001% Lysozym Arginindihydrolase
Die Analyse der zellularen Fettsauren ergab eine hohe Zuordnung zur Gattung Paenibacillus Die Analyse der partiellen 16S rDNA Sequenz zeigte eine Ähnlichkeit des unbekannten Stammes zu Paenibacillus validus von annhaernd 100% Auch die physiologischen Eigenschaften deuten auf Paenibacillus validus, mit Ausnahme der Tests "anaerobes Wachstum" und "Wachstum bei pH
5,7"
Eigenschaften des Stammes Pseudomonas stutzeri, Tin 12-4-50
Zellform Stabchen
Breite μm 0,7-0,8
Lange μm 1,5-3,0
Beweglichkeit +
Geissein monopolar,
>1
Gram-Reaktion -
Lyse durch 3% KOH +
Aminopeptidase (Cerny) +
Sporen -
Oxidase +
Katalase +
Fluoreszens -
Pycoyanin -
ADH (Alkoholdehydrogenase) -
Urease -
Hydrolyse von Gelatine -
Esculin -
Nitratreduktion (NO-, zu NO2) - Denitrifikation (N03 zu N2) + Substratverwertung _
Adipat +
Citrat +
Malat -
Phenylacetat +
D-Glucose +
Maltose +
Mannitol +
L-Valin -
Arabinose -
Mannose +
Geraniol +
L-Arginin +
L-Histidin +
Sebacinat +
Azelat +
ERGEBNIS:
Stamm Tin 12-4-50
= Pseudomonas stutzeri (RNA-Gruppe I)
Das Profil der zellularen Fettsauren ist typisch für die RNA-Gruppe I der Pseudomonaden P stutzeri wird mit einem hohen Wert zugeordnet
Die partielle Sequenzierung der 16S rDNA ergab die höchste Ähnlichkeit von 99,3% zu verschiedenen Stammen der Genomgruppe 3 innerhalb der Spezies Pseudomonas stutzeri (z B DSM 50227) Zu dem Typstamm der Art wird eine geringere Übereinstimmung gefunden Diese Spezies stellt sich zur Zeit genetisch sehr heterogen dar und bedarf der Neubeschreibung
Für die eigentliche Biotransformation, die Umsetzung von Inden der Formel I zu den Indanderivaten der allgemeinen Formel II, sind im Prinzip alle Mikroorganismen geeignet, die befähigt sind, Inden als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle zu verwerten Bevorzugte Mikroorganismen sind die der Gattung Cellulomonas, Rhodococcus, Paenibacillus, Gordona, Arthrobacter, Fusarium oder Pseudomonas Besonders bevorzugte Mikroorganismen sind Mikroorganismen der Spezien Cellulomonas cellulans, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus ruber, Paenibacillus validus, Gordona rubropertincta, Pseudomonas stutzeri , Arthrobacter nicotianae und Fusarium solani
Beispiele besonders bevorzugter Mikroorganismen sind die Mikroorganismenspezien Cellulomonas cellulans (Tin 2-1 - 1 , DSM 12224), Rhodococcus erythropolis (Tin 4-2-16), Rhodococcus rhodochrous (Tin 4-D-3-71), Rhodococcus ruber (Tin 5-4-120), Paenibacillus (Tin 7-2-20), Paenibacillus validus (Tin 3-1-38, DSM 12225), Gordona rubropertincta (Tin 21- 4-35), Pseudomonas stutzeri (Tin 12-4-50), Arthrobacter nicotianae (Tin 22-3-132), Tin 10-4- 44, Tin 13-4-53, Tin 13-4-54, Tin 2-1-2, Fusarium solani (Tin 19-4-31), Rhodococcus ruber (Tin 3-4-61), Rhodococcus ruber (Tin 22-3-1 16), Tin 22-3-133, Tin 6-D-3-134, Tin 7-2-145, Tin 7- 1-149, Tin 10-4-150, Tin 14-4-152, Tin 22-3-154, Tin 14-D-3-156 Rhodococcus ruber (Tin 9-4-158), sowie deren fünktionell aequivalente Varianten und Mutanten
Für das Verfahren besonders geeignet sind Cellulomonas cellulans (Tin 2-1-1, DSM 12224), Paenibacillus validus (Tin 3-1-38, DSM 12225), Rhodococcus ruber (Tin 5-4-120), Rhodococcus ruber (Tin 3-4-61, DSM 12226) Rhodococcus ruber (Tin 22-3-116), Rhododcoccus ruber (Tin 9-4-158) und Arthrobacter nicotianae (Tin 22-3-132)
Die Biotransformation kann in fachmannisch üblichen Medien durchgeführt werden, beispielsweise in niedermolarem Phosphatpuffer, Citrat-Puffer, Vollmedien, HEPES-Puffer, oder in dem Medium gemass Tabelle 1 Vorzugsweise wird die Biotransformation in einem Medium gemass Tabelle 1 durchgeführt
Zweckmassig wird die Biotransformation unter einmaliger oder kontinuierlicher Indenzugabe so durchgeführt, dass die Konzentration 5 Gew %, vorzugsweise 2 Gew %, nicht übersteigt
Der pH-Wert kann wahrend der Biotransformation in einem Bereich von 2 bis 12, vorzugs- weise von 5 bis 9 liegen Zweckmassig wird die Biotransformation bei einer Temperatur von 10 bis 100 °C, vorzugsweise bei einer Temperatur von 20 bis 50 °C, durchgeführt
Nach einer üblichen Umsetzungszeit von einigen Stunden bis zu mehreren Tagen können dann die Indanderivate der all 'ag^emeinen Formel II auf bekannte Art und Weise isoliert werden
Indanderivate der Formel II, die mittel der erfindungsgemassen Mikroorganismen hergestellt werden können, sind Indandiole wie cis-Indandiole und trans-Indandiole, l-Keto-2- hydroxyindane und/oder die Indanone 1-Indanon und 2-Indanon Die Bildungsraten für die Produkte trans-lndandiol, cis-Indandiol, l -Keto-2-hydroxyindan, 1- Indanon und 2-Indanon aus Inden liegen im Bereich von 0, 1 - 1000 mg/1 h OD65Unπι = 10, zweckmassig im Bereich von 1 - 200 mg/1 h ODf) )nm = 10, insbesondere im Bereich von 1- 65 mg/l h OD6S0lllll = 10
Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel II, die mit Hilfe der erfindungsgemaßen Mikroorganismen hergestellt werden können, sind die optisch aktiven Verbindungen cis-(l S,2R)-Indandiol, cis-( lR,2S)-Indandiol, trans-(l R,2R)-Indandiol , l -Keto-(2S)- hydroxyindan, l -Keto-(2R)-hydroxyindan und trans-(l S,2S)-Indandiol
Ganz besonders bevorzugte Indanderivate der allgemeinen Formel II sind die optisch aktiven Indandiole der Formel
OH
OH
III
insbesondere cis-(l S,2R)-Indandiol, cis-(lR,2S)-Indandiol, trans-(l R,2R)-Indandiol und trans-( 1 S,2S)-Indandiol Am meisten bevorzugt sind cis-( 1 S,2R)-Indandiol und trans-( 1 R,2R)- Indandiol
Die Herstellung von cis-( 1 S,2R)-Indandiol erfolgt zweckmassig mit den Mikroorganismen Cellulomonas cellulans (Tin 2- 1 -1 , DSM 12224) oder Rhodococcus ruber (Tin 3-4-61 , DSM 12226), die Bildung von cis-(lR,2S)-Indandiol mit den Mikroorganismen Arthrobacter nicotianae (Tin 22-3-132) oder Paenibacillus validus (Tin 3- 1 -38, DSM 12225) und die Bildung von cis-( l R,2S) und trans-(lS,2S)-Indandiol mit den Mikroorganismen Rhodococcus ruber (Tin 9-4-158) oder Rhodococcus ruber (Tin 22-3-1 16)
Weitere Mikroorganismen, die zur Herstellung einer bestimmten Verbindung der Formel II oder III geeignet sind, lassen sich unter den Inden-abbauenden erfindungsgemaßen Mikroorganismen durch einfache Analyse der Transformatuionsprodukte der Mikroorganismen mittels HPLC, beispielsweise chiraler HPLC, in einfacher Weise auffinden
Bevorzugt erfolgt die Herstellung der Indanderivate der Formeln II oder III mit ruhenden (nicht wachsenden) Zellen Zweckmäßig werden die wirksamen, an der Bildung der Indanderivate derFormel II oder III beteiligten Enzyme der Mikroorganismen für das Verfahren durch Zugabe geeigneter Induktoren induziert Als Enzyminduktoren werden zweckmäßig cyclische Kohlenwasserstoffe eingesetzt Bevorzugte cyclische Kohlenwasserstoffe sind beispielsweise Inden, Naphthalin oder Toluol Vorteilhaft erfolgt die Enzyminduktion durch Anzucht der Mikroorganismen mit dem Induktor als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle, insbesondere wenn für das Verfahren selbst ruhend Zellen eingesetzt werden Durch die Wahl des Induktors laßt sich auch das Produktspektrum der Mikroorganismen beeinflussen
Beispiele:
Beispiel 1 Anreicherung von Inden abbauenden Mikroorganismen
Zur Anreicheaing Inden-abbauender Mikroorganismen wurden insgesamt 37 Anreicherungen im A+N Medium (Tabelle 1) in 300 ml oder 500 ml Erlenmeyerkolben mit drei Schikanen angesetzt Als Inokulum wurde jeweils 2,5 g einer Erd - oder Kompostprobe oder 2,5 ml Klar- schlämm aus dem Belebtschlammbecken der ersten Klarstufe der Klaranlage der Lonza AG in Visp, Schweiz, hinzugefugt Aufgrund der naturlich Inden- Vorkommensquellen wurden unter anderem Erdproben verschiedener olverseuchter Boden sowie Erde und Kohle von der Kohlehalde der LONZA AG in Visp, Schweiz, als Inokulum eingesetzt (siehe Tabelle 2) Die Inkubation aller Anreicherungen erfolgte bei 30°C
Gemass Tabelle 2 unterschieden sich die Anreicherungen hinsichtlich folgender Parameter
Inokulumherkunft
Sauerstof bedingungen (mit 120 rpm geschüttelt oder nicht geschüttelt) pH (pH 7,2 oder pH um 6) - Inden über die Gasphase zugeführt oder direkt dem Medium beigefügt
1.1 Anreicherung Inden abbauender Mikroorganismen mit indirekter Indenzugabe
Jeder Erlenmeyerkolben wurde mit einem Reagenzglas (15-20 ml) , enthaltend 1 ml Inden, versehen (insgesamt 18 Ansätze)
Das A+N Medium (50 ml) mit dem Inokulum befand sich ausserhalb des Reagenzglases im Erlenmeyerkolben Das Substrat Inden verdampfte langsam in den Luftraum und loste sich von dort im Medium In sterilen Kontrollkolben ohne Inokulumzugabe wurden unter den oben beschriebenen Bedingungen nach 2-3 Tagen Indenkonzentrationen von 200 - 400 μM im A+N Medium gemessen
Da Inden im Reagenzglas mit der Zeit sehr viskos wurde und dann nur noch wenig fluchtig ist, wurde, um sicherzustellen, dass keine Indenlimitation im Medium auftrat, alle 3-4 Tage zusätzlich 500 μl Inden nachgefüllt Mit allen Kolben (auch wahrend der verschiedenen Passagen) wurde so verfahren
Passagieren/Uberimpfen
Die Passagen zur Anreicheαmg der wachsenden Mikroorganismen, die Indenzugabe und die Inkubation erfolgte auf die gleiche Art und Weise wie oben beschrieben Bei jeder Passage wurde jeweils 1 ml aus der jeweiligen Kultur zum Animpfen von 50 ml sterilem A+N-Medium in einem neuen Erlenmeyerkolben verwendet Die Kulturen wurden ca alle 8 Tage 4x hintereinander passagiert
1.2 Anreicherung Inden abbauender Mikroorganismen mit indirekter plus direkter Indenzugabe
Die Versuchsanordnung entsprach im wesentlichen der von Beispiel 1 1 Im Unterschied zu Beispiel 1 1 wurde nach den ersten 7 Tagen der Bebrutung zusatzlich in jeden Erlenmeyer- kolben 50 μl Inden direkt in das A+N Medium (50 ml) pipettiert, so dass theoretisch eine Substratkonzentration von 8 mM erreicht werden konnte Tatsachlich gemessen wurden in diesen AnreicheRingen Indenkonzentrationen bis 6,3 mM Die Kulturen wurden nach weiteren 7 Tagen passagiert Alle 4-7 Tage wurden erneut 50 μl Inden ins Medium pipettiert Alle Kolben wahrend der anschliessenden Passagen (insgesamt 3 Passagen hintereinander) enthiel- ten Inden direkt im Medium
Das Passagieren/Uberimpfen erfolgte wie in Beispiel 1 1 beschrieben
Tabelle 1 A+N Medium (1 Liter)
A+N Stammlosung 100 ml
Losung B 25 ml
SL4 1 ml
Vitamin-Losung 1 ml Milli-Q-H20 873 ml
A+N Stammlosung, Losung B, SL4 und Milli-Q-H2O wurden getrennt hergestellt und jeweils bei 121°C 30 Minuten autoklaviert Die Vitamin-Losung wurde sterilfiltriert A+N Stainmlosung (1 Liter)
KH2PO4 10 g
(NH4)2S04 20 g Na2HPO 20 g
NaCl 30 g
Losung B (1 Liter)
FeCl3 • 6H20 0,032 g CaCl2»2H2O 0,580 g
MgCl2»6H2O 16,0 g
SL4(1 Liter)
CuCl2 • 2H2O 0,01 g NiCl2»6H2O 0,02 g
Na2MoO4 • 2H20 0,03 g
MnCl2 • 4H2O 0,09 g
ZnSO4-7H2O 0,10 g
CoCl2 • 6H2O 0,20 g H3BO3 0,30 g
EDTANa2»2H2O 5,0 g
FeS04 • 4H20 2,0 g
Vitamin-Lsg (1 Liter) Biotin 2 mg
Folsaure 2 mg
D-Calcium-Panthothenat 5 mg
4-Aminobenzoesaure 5 mg
Vitamin B 12 5 mg Riboflavin 5 mg
Nicotinsaureamid 5 mg
Thiaminhydrochlorid 5 mg
Pyridoxalhydrochlorid 0 mg Beispiel 2
Isolation von Reinkulturen
Aus den Anreicherungen aller Passagestufen wurden Verdünnungen in 0,9 % NaCl hergestellt und diese auf Agar verfestigtes A+N Medium ausplattiert Die Bebaitung erfolgte unter Indenatmosphare im Exsikkator bei 30°C 7-14 Tage lang
Indenatmosphare Ein 4 ml Inden enthaltendes 50 ml Becherglas wurde in den Exsikkator gestellt Zusatzlich wurden jeweils 50 μl Inden direkt in den Deckel jeder Petrischale pipettiert und die gleiche Menge Inden alle 3-4 Tage nachpipettiert, um eine hohe Indenkonzentration zu gewahrleisten Zur Isolierung von Reinkulturen wurden Einzelkolonien gepickt auf Platten gleicher Art und ebenfalls unter den zuvor beschriebenen Bedingungen inkubiert Dies wurde nacheinander so oft wiederholt, bis Reinkulturen vorlagen Die Reinheit der Kulturen wurden durch Ausstriche auf Nutrient-Agarplatten (Vollmedium) kontrolliert
Beispiel 3
3.1 Screening der Reinkulturen nach Inden umsetzenden Stämmen
Insgesamt wurden 160 verschiedene Stamme isoliert und diese wurden dem Screening unter- worfen
Folgende Stamme, welche mit Inden wachsen, wurden bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig) identifiziert
Tin 2-1-1 Cellulomonas cellulans
Tin 4-2-16 Rhodococcus erythropolis
Tin 7-2-20 Paenibacillus sp
Tin 19-4-31 Fusarium solani Tin 21-4-35 Gordona aibropertincta
Tin 3-1-38 Paenibacillus validus
Tin 12-4-50 Pseudomonas stutzeri
Tin 4-D-3-71 Rhodococcus rhodochrous
Tin 5-4-120 Rhodococcus ruber
Tin 22-3-132 Arthrobacter nicotianae
Tin 3-4-61 Rhodococcus ruber
Tin 22-3-1 16 Rhodococcus ruber
Tin 9-4-158 Rhodococcus ruber 3.2 Identifizierung der Isolate Tin 3-4-61, Tin 22-3-116 und Tin 9-4-158
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Figure imgf000020_0002
3J rπ Ω m RAL Deutsches Institut für Gütesicherung und Kennzeichnung e.V. ro cπ Übersichtskarte RAL-F2: RAL 3012 = Beige-rot; RAL 3022 = Lachsrot
Morphologie EB-R-C elementare Verzweigung-Stäbchen-Coccus Wachstum Cyclus
Fettsäuren: 1-5%, (+), 5-15%, +; 15-30%, ++; >30%, +++; br, verzweigte Fettsäuren i.e. Iso-Hexadecansäure; 16:0, Hexadecensäure; 10-Me-18, Tuberculostearinsäure.
Figure imgf000020_0001
3.3 Wachstu stest der Stämme in flüssigem A+N-Medium unter Indenatmosph re.
Die Versuchsanordnung war identisch zu Beispiel 1 1 Angeimpft wurde mit in 0,9 % NaCl resuspendierten Zellen von Kolonien des jeweiligen Stammes von den oben beschriebenen A r-N-Agarplatten Die Inkubation erfolgte bei 30°C und 120 rpm Das Wachstum (OD6j()nm) und die Bildung von Inden- Abbauprodukten im Testkolben wurde 10 Tage lang verfolgt 67 der 160 Stamme wuchsen mit Inden als einziger Kohlenstoff -und Energiequelle in dem flussigen A+N-Medium (vgl Fig 1) In HPLC-Analysen der Kulturuberstande dieser gewachsenen Kulturen fanden sich nach Abzentrifugation der Zellen Indenabbauprodukte Das Wachstum mit Inden, das über die Gasphase zugeführt wurde, war linear Fig 1 zeigt das Wachstum von mit Inden angereicherten Bakterienstammen, mit Inden als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle
3.4 Induktionsbedingungen und Inden-Biotransformation mit ruhenden Zellen
Die Stamme wurden auch hinsichtlich Wachstum mit Glucose (1%), Glycerin (1 %), Succinat (1 %), Inden, Toluol und Naphthalin (0,1 %) als einziger Kohlenstoffquelle auf A+N-Agar- platten und in flussigem A+N Medium untersucht Toluol und Inden wurden über die Gasphase zugegeben nach der Methode von Beispiel 1 1 Naphthalin wurde folgendermassen zugefügt 0, 1 g Naphthalin in 2 ml Wasser wurden auto- klaviert Nach dem Autoklavieren wurde dies zu 100 ml sterilem A+N Medium in einem 500 ml Erlenmeyerkolben gegeben, so dass ca 0, 1% Naphthalin-Festsubstanz in dem Erlenmeyerkolben resultierte Analog wurden Naphthalin enthaltende Agarplatten hergestellt, indem die autoklavierte Naphthalin-Losung unter Ruhren zu 100 ml sterilem, 83 °C heissem A+N/l, 9 % Agar-Medium gegeben wurde, und hiervon Agarplatten gegossen wurden Beim Erkalten fiel das Naphthalin als homogen verteilte Festsubstanz in Agar aus Wahrend des Wachstum von Bakterien mit Naphthalin in Flussigmedium loste sich die Naphthalin-Festsubstanz nach und nach auf
Die Ergebnisse der Wachstumstests sind in Tabelle 2 zusammengefasst 6 Stamme wuchsen mit Toluol, 13 Stamme wuchsen mit Naphthalin - jeweils als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle (Flussigkultur) Von diesen Stammen wuchsen nur drei sowohl mit Toluol, als auch mit Naphthalin, die restlichen Stamme wuchsen jeweils nur mit einer der beiden Kohlenstoff-Quellen (vgl Tabelle 2) Auch Stamme, die mit Inden wachsen, mit Naphthalin oder Toluol aber nicht wachsen, wurden gefunden (z B Tin 21-4-35) Die Stamme Tin 21-4-35, Tin 4-2-16 und Tin 14-D-3-156 wuchsen mit Inden, jedoch nicht mit Toluol und nicht mit Naphthalin als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle in Flussigmedium Die Stamme Tin 3-4-61, Tin 4-D-3-71 und Tin 5-4-120 wuchsen sowohl mit Inden als auch mit Toluol und der Stamm Tin 2-1-1 , Tin 7-2-20 und Tin 9-4-158 sowohl mit Inden, Toluol und mit Naphthalin als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle Die Stamme Tin 2-1-2, Tin 10-4-44, Tin 12-4-120, Tin 7- 1 - 149, Tin 3-1-38, Tin 22-3-1 16, Tin 22-3-132, Tin 22-3-133 und Tin 7-2-145 wuchsen mit Inden und mit Naphthalin
Biotransformation: Die Zellmasse der gewachsenen Kulturen wurde durch Zentrifügation gewonnen, 1 x in 50 mM Phosphatpuffer pH 7,0 gewaschen, und anschliessend in 50 mM Phosphatpuffer so resuspendiert, dass eine ODfi_sonm = 18 - 120 resultierte
Biotransformations-Test (Gesamtvolumen 6 ml, OD650nm = 1,8 - 12)
600 μl Zellsuspension
120 μl einer 100 mM Inden-Losung (in Ethanol)
5380 μl 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0 in einem verschlossenen Reagenzglas (15 ml)
Die Inkubation erfolgte unter Ruhren bei 30°C
Nach bestimmten Zeitintervallen wurden Proben genommen, die Zellen durch Zentrifügation abgetrennt und die Menge der verschiedenen Transformationsprodukte mit einer quantitativen HPLC-Analysemethode bestimmt Mit einer chiralen HPLC-Analysemethode wurden die cis- Indandiol-Enantiomere und die trans-Indandiol-Enantiomere bestimmt
Nach Anzucht mit Glucose, Glycerin oder Succinat setzte nur der Stamm Tin 9-4-158 im Biotransformationstest Inden in nennenswerter Menge nach einer lag-Phase von ca 2 - 4 Stunden um (vgl Fig 7) Die anderen Stamme setzten Inden nicht um, wenn sie mit Glucose angezuchtet worden waren (Fig 6) Mit Inden, Toluol oder Naphthalin gewachsene Zellen der verschiedenen Stamme dagegen setzten Inden um (vgl Fig 2 - 7) Dieses Ergebnis zeigt, dass die Inden-umsetzenden Enzyme in diesen Stammen induzierbar sind und dass sie durch Inden, Toluol oder Naphthalin induziert werden können Fig 2 zeigt die Biotransformation von Inden mittels Cellulomonas cellulans (Tin 2-1-1), welcher mit Toluol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle angezuchtet wurde Fig 3 zeigt die Biotransformation von Inden mittels Paenibacillus validus (Tin 3-1-38), welcher mit Naphthalin als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle angezuchtet wurde 2 !
Fig 4 zeigt die Biotransformation von Inden mittels Arthrobacter nicotianae (Tin 22-3-132), welcher mit Naphthalin als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle angezuchtet wurde Fig 5A zeigt die Biotransfoimation von Inden mittels Rhodococcus ruber (Tin 22-3-1 16), welcher mit Inden als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle angezuchtet wurde und Fig 5B, wenn dieser mit Naphtalin angezuchtet wurde
Fig 6A zeigt die Biotransformation von Inden mittels Rhodococcus ruber (Tin 3-4-61), welcher mit Glucose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle angezuchtet wurde, und Fig 6B, wenn dieser mit Inden als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle angezuchtet wurde, und Fig 6C, wenn dieser mit Toluol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle angezuchtet wurde Fig 7A, B und C zeigen die Biotransformationen von Inden mittels Rhodococcus ruber (Tin 9- 4-158), welcher mit Glucose (Fig 7A) und mit Toluol (Fig 7B) und mit Inden (Fig 7C) als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle angezuchtet wurde
Fig 8 zeigt die Biotransformation von Inden mittels dem Stamm Tin 2-1-2, welcher mit Naphtalin als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle angezuchtet wurde
Die Biotransformationsergebnisse mit Inden können wie folgt zusammengefasst werden
Der Stamm Tin 2-1 -1 bildete cis-Indandiol, l-Keto-2-hydιoxyindan und 1-Indanon, wenn er mit Toluol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle angezuchtet wurde (Fig 2) Er bildete bevorzugt das cis-(lS,2R)-Indandiol (Tabelle 3), trans-lndandiol wurde nicht gebildet Der Stamm Tin 3-1-38 bildete, wenn er mit Naphthalin als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle angezuchtet wurde, l-Keto-2-hydroxyindan, cis-Indandiol und 1-Indanon (Fig 3) Das bevorzugt gebildete cis-Indandiol Enantiomer war cis-(lR,2S)-Indandiol (Tabelle 3), trans- lndandiol bildete dieser Stamm nicht
Der Stamm Tin 22-3-132 setzte, wenn er mit Naphthalin angezuchtet wurde, Inden zu cis- (lR,2S)-Indandiol mit hohem ee-Wert (Fig 4, Tabelle 3) sowie l-Keto-2-hydroxyindan und 1-Indanon um Er bildete kein trans-lndandiol Der Stamm Tin 22-2- 1 16 setzte, wenn er mit Inden als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle angezuchtet wurde, Inden zu eis- und trans- Indandiol um (Fig 5A), wobei hauptsachlich das trans-(lS,2S)-Indendiol und das cis-(lR,2S)- Indandiol gebildet wurden (Tabelle 3) l-Keto-2-hydroxyindan, 1 -Indanon und 2-Indanon bildete dieser Stamm nach Anzucht mit Inden nicht Nach Anzucht mit Naphtalin bildete der Stamm Tin 22-3-1 16 cis-Indandiol, l-Keto-2-hydroxyindan und 1-Indanon (Fig 5B) Stamm Tin 3-4-61 setzte Inden nicht um, wenn er mit Glucose als Kohlenstoff- und Energie- quelle angezuchtet wurde (Fig 6A), er bildete jedoch cis-Indandiol als einziges Produkt, wenn er mit Inden oder Toluol angezuchtet wurde (Fig 6B und C) In beiden Fallen wurde das cis- ( lS,2R)-Indandiol mit hohem ee-Wert gebildet (Tabelle 3) Trans-lndandiol, l-Keto-2- hydroxyindan und 1-Indanon wurden nicht gebildet Tin 9-4-158 bildete bei Anzucht mit Glucose oder Toluol sowohl trans-lndandiol als auch cis- Indandiol (Fig 7A und B), wobei hauptsachlich das cis-(lR,2S)-Indandiol und das trans- (lS,2S)-Indandiol gebildet wurden (Tabelle 3) l-Keto-2-hydroxyindan ,1 -Indanon und 2- Indanon wurden in den Biotransformationen mit Zellmasse des Stammes aus Glucose- oder Toluol- Anzucht nicht gebildet Nach Anzucht mit Inden bildete der Stamm Tin 9-4-158 trans- lndandiol, cis-Indandiol und zusatzlich 2-Indanon (Fig 7C) Der Stamm Tin 2-1-2 bildete nach Anzucht mit Naphtalin cis-Indandiol, l-Keto-2- hydroxyindan, 1 -Indanon und 2-Indanon Trans-lndandiol bildete dieser Stamm nicht (Fig 8)
Tabelle 2 Indandiol-Stämme: Wachstum mit Inden, Toluol und Naphthalin
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Tabelle 3 ee-Werte
- , fraπs-lπdaπdiol nicht vorhanden
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Λktenzeicnen des Anmelders Internationale». Λ :eπze:ι oder Anwalts T 07854 PCT/EP Q Q / n R 3
ANGABEN ZU EINEM HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS (Regel 13h,s P(m
A. Dfe nachstehenden Angaben betrerfen den Mikroorganismus, der in der Beschreibung genannt ist auf Seite 5 Zeile 9 - 1 2"
B. KENNZEICHNUNG DER HINTERLEGUNG Weitere Hinterlegungen sind auf einem zusatzlichen Blatt gekennzeichnet
Name der Hinterlegungsstelle
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)
Anschrift der Hinterlegungsstelle (einschließlich Postleitzahl und Land)
Mascheroderweg lb 38124 Braunschweig Deutschland
Datum der Hinterlegung Eiπgangsnummer
08 . 06 . 1998 ( 08 . Juni 1998 ) DSM 1 2224
C. WEITERE ANGABEN (falls nicht zutreffend, bitte frei lassen) Die Angaben werden auf einem ι — j gesonderten Blatt fortgesetzt I — I
Der in Regel 28 EPU vorgesehene Zugang zu dem hinterlegten biologischen Material soll bis zu dem Tag, an dem der Hinweis auf die Erteilung des europäischen Patents bekannt gemacht wird oder an dem die Patentanmeldung zurückgewiesen oder zurückgenommen wird oder al$ zurückgenommen gilt, nur durch Herausgabe einer Probe an einen Sachverständigen hergestellt werden (Regel 28(4) EPÜ) .
BESTIMMUNGSSTAATEN, FÜR DIE ANGABEN GEMACHT WERDEN
(falls die Angaben nicht für alle Besnmmungsstaaien gelten)
EP
E. NACHREICHUNG VON ANGABEN (falls nicht zutreffend, bitte frei lassen)
Die nachstehenden Angaben werden spater beim Internationalen Büro eingereicht (bitte Art der Angaben nennen. z. B. "Eingangsnummer der Hinterlegung")
— — Nur zur Verwendung im Internationalen Büro —
0 Dieses Blatt ist eingegangen mit der internationalen [ I Dieses Blatt ist beim Internationalen Büro eingegangen Anmeldung
1 3 AUG 1999
Bevollmächtigter Bediensteter Bevollmacntiiter Bediensteter
E. Speiser Q A teπzeicnen des Aπmei-i rs oder Anwalts T 0755 "m J / 0 5 9 -. 8
ANGA BEN ZU EINEM HINTERLEGTEN MI KROORGANISMUS (Regel l B'-' PCn
Die nachstenenden Angaben betreffen den Mikroorganismus, der in der Bescnreibung genannt ist auf Seite ς . Zeile 9 - 1 2 .
B. KENNZEICHNUNG DER HINTERLEGUNG Weitere Hinterlegungen sind auf einem zusätzlichen Blatt gekennzeichnet
Name der Hinterlegungsstelle
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)
Anschrift der Hinterlegungsstelle (einschließlich Postleitzahl und Land)
Mascheroderweg lb 38124 Braunschweig Deutschland
Datum der Hinterlegung Eingangsnummer
08 . 06 . 1998 ( 08 . Juni 1998 ) DSM 1 222 5
C. WEITERE A GABEN (falls nicht zutreffend, bitte frei lassen) Die Angaben werden auf einem 1 — | gesonderten Blatt fortgesetzt I — I
Der in Regel 28 EPU vorgesehene Zugang zu dem hinterlegten biologischen Material soll bis zu dem Tag, an dem der Hinweis auf die Erteilung des europäischen Patents bekannt gemacht wird oder an dem die Patentanmeldung zurückgewiesen oder zurückgenommen wird oder als| zurückgenommen gilt, nur durch Herausgabe einer Probe an einen Sachvers ändigen hergestellt werden (Regel 28(4) EPÜ) .
D. BESTIMMUNGSSTAATEN, FÜR DIE ANGABEN GEMACHT WERDEN
(falls die Angaben nicht für alle Bestimmungsstaaten gelten)
EP
E. NACHREICHUNG VON ANGABEN (falls nicht zutreffend, bitte frei lassen)
Die nachstehenden Angaben werden spater beim Internationalen Büro eingereicht (bitte Art der Angaben nennen. z. B. "Eingangsnummer der Hinterlegung")
— — Nur zur Verwendung im Internationalen Büro
| | Dieses Blatt ist beim Internationalen Büro eingegangen
Bevollm.ii.ntu_.er Bediensteter
Figure imgf000030_0001
'. stenzeicheπ des Anmelders Internationales Aktenzi oder Anwalts Lθ 7 8 5 PCT/EP 9 9 / 0 5 9 4 8
ANGABEN ZU EINEM HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS (Regel ! 3h's PCT)
Die nachstehender Angaben betreffen den Mikroorganismus, der in der Beschreibung genannt ist auf Seite 5 Zeile 9 -12
B. KENNZEICHNUNG DER HINTERLEGUNG Weitere Hinterlegungen sind auf einem pr-p-j zusatzlichen Blatt aekeππzeicnnet !-__-_
Name der Hinterlegungsstelle
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)
Anschπft der Hinterlegungsstelle (einschließlich Postleitzahl und Land)
Mascheroderweg lb 38124 Braunschweig Deutschland
Datum der Hinterlegung Emgangsnummer
08 .06 . 1998 ( 08 . Juni 1998 ) DSM 12226
C. WEITERE ANGABEN (falls nicht zutreffend, bitte frei lassen) Die Angaben werden auf einem gesonderten Blatt fortgesetzt D
Der m Regel 28 EPU vorgesehene Zugang zu dem hinterlegten biologischen Material soll bis zu dem Tag, an dem der Hinweis auf die Erteilung des europäischen Patents bekannt gemacht wird oder an dem die Patentanmeldung zurückgewiesen oder zurückgenommen wird oder al$ zurückgenommen gilt, nur durch Herausgabe einer Probe an einen Sachverständigen hergestellt werden (Regel 28(4) EPÜ) .
BESTIMMUNGSSTAATEN, FÜR DIE ANGABEN GEMACHT WERDEN
(falls die Angaben nicht für alle Bestimmungsstaaten gelten)
EP
E. NACHREICHUNG VON ANGABEN (falls nicht zutreffend, bitte frei lassen)
Die nachstehenden Angaben werden spater beim Internationalen Büro eingereicht (bitte Art der Angaben nennen. z. B. "Eingangsnummer der Hinterlegung")
Nur zur Verwendung im Anmeldeamt — — Nur zur Verwendung im Internationalen Büro — —
S Dieses Blatt ist eingegangen mit der internationalen | | Dieses Blatt ist beim Internationalen Büro eingegangen Anmeldung
1 3 AUG 1999
Bevollmächtigter Bediensteter Bevollmächtigter Bediensteter
E. Speiser E>

Claims

Patentansprüche
Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass sie befähigt sind, Inden der Formel
Figure imgf000032_0001
als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle zu verwerten, sowie Enzymeextrakte daraus
Mikroorganismen nach Anspruch 1, ausgewählt aus Mikroorganismen der Gattungen Cellulomonas, Rhodococcus, Paenibacillus, Gordona, Arthrobacter, Pseudomonas oder Fusarium.
Verfahren zur Herstellung von Indanderivaten der allgemeinen Formel
Figure imgf000032_0002
worin R1 und R2 gleich oder verschieden sind und eine Hydroxylgruppe, Wasserstoff oder =O bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass man Inden der Formel
Figure imgf000032_0003
mittels eines Mikroorganismus nach Anspruch 1 oder 2 oder eines Enzymextraktes daraus in das Endprodukt der allgemeinen Formel II überfuhrt.
Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Indandiolen der Formel
OH
Figure imgf000032_0004
dadurch gekennzeichnet, dass man Inden der Formel
Figure imgf000033_0001
mittels eines Mikroorganismus nach Anspruch 1 oder 2 oder eines Enzymextraktes daraus, in das Endprodukt der allgemeinen Formel III überfuhrt
Verfahren nach Anspaich 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Biotransformation eingesetzten Mikroorganismen aus den Gattungen Cellulomonas, Rhodococcus, Paenibacillus, Gordona, Arthrobacter, Fusarium und/oder Pseudomonas ausgewählt sind
Verfahren nach Anspaich 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Biotransformation eingesetzten Mikroorganismen aus den Spezies Cellulomonas cellulans (Tin 2-1-1 , DSM 12224), Rhodococcus ruber (Tin 3-4-61, DSM 12226), Paenibacillus validus (Tin 3-1-38, DSM 12225) oder deren funktioneil aequivalenten Varianten und Mutanten ausgewählt sind
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6 , dadurch gekennzeichnet, dass die
Biotransformation bei einer Temperatur von 10 bis 100°C und bei einem pH-Wert von 2 bis 12 durchgeführt wird
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