DE4316882A1 - Ein Koffein-demethylase-Gen enthaltende DNA-Fragment und mikrobielles Verfahren zur Herstellung von 3-Methyl-7-alkylxanthin - Google Patents

Ein Koffein-demethylase-Gen enthaltende DNA-Fragment und mikrobielles Verfahren zur Herstellung von 3-Methyl-7-alkylxanthin

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Description

Die Erfindung betrifft ein DNA-Fragment mit einem Gehalt an einem Koffein-demethylase-Gen, das durch einen Mikroorganismus, der zur Gattung Pseudomonas gehört und zur Metabolisierung von Koffein geeignet ist, gebildet worden ist. Ferner betrifft die Erfindung einen neuen Stamm der Gattung Pseudomonas, der durch Transformation mit einer rekombinanten DNA mit einem Gehalt an diesem DNA-Fragment erhalten worden ist. Schließlich betrifft die Erfindung ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von 3-Methyl-7- alkylxanthin.
3-Methyl-7-alkylxanthine sind wichtige Zwischenprodukte für Arzneimittel. Beispielsweise stellen 3,7-Dimethylxanthin (Theobromin) ein wichtiges Zwischenprodukt für 1-(5- Oxohexyl)-3,7-dimethylxanthin (Pentoxifyllin) und 3-Methyl-7- propylxanthin ein wichtiges Zwischenprodukt für 1-(5- Oxohexyl)-3-methyl-7-propylxanthin (Propentophyllin) dar.
3,7-Dimethylxanthin wird herkömmlicherweise durch Extraktion aus Kakaobohnen oder durch Synthese aus 3-Methylharnstoff hergestellt.
Propentophyllin, das einen wertvollen Arzneistoff zur Behandlung von zerebrovaskulären Störungen darstellt, wird im allgemeinen durch Einführung einer 5-Oxohexylgruppe in 3-Methyl-7-propylxanthin hergestellt, wie in JP-B-52-33120 beschrieben wird. Das Ausgangsmaterial 3-Methyl-7- propylxanthin kann nach verschiedenen chemischen Verfahren synthetisiert werden. Ein typisches Beispiel ist ein Verfahren, das die Behandlung von 1,3-Dimethyl-7-propylxanthin mit Alkali unter Bildung von 4-Methylamino-5- methylcarbamoyl-1-propylimidazol umfaßt, das dann mit Harnstoff unter Bildung von N-Methyl-N-(5-methylcarbamoyl-1- propylimidazol-4-yl)-harnstoff umgesetzt wird, wonach sich die Cyclisierung gemäß JP-A-1-180883 anschließt. Jedoch treten bei diesen bekannten chemischen Herstellungsverfahren zahlreiche Schwierigkeiten bei der großtechnischen Produktion auf, unter anderem deswegen, weil sie sehr komplizierte Stufen beinhalten. Daher besteht ein Bedarf zur Entwicklung eines einfacheren Verfahrens zur Synthese von 3-Methyl-7- propylxanthin.
Ferner wurden mikrobielle Techniken zur Synthese von 3,7-Dimethylxanthin untersucht. Beispielsweise wurde die Umwandlung von 1,3,7-Trimethylxanthin (Koffein) in 3,7-Dimethylxanthin unter Verwendung eines Mikroorganismus, der zur Assimilation von Koffein befähigt ist, oder eines Mutantenstammes davon in Hoope-Seyler′s Z. Physiol. Chem., Bd. 358 (1977), S. 807, JP-B-4-12117 und EP-A-05 09 834 vorgeschlagen.
Jedoch ist keine mikrobielle Synthese eines von 3,7- Dimethylxanthin abweichenden 3-Methyl-7-alkylxanthins bekannt. Ferner erweisen sich die bekannten mikrobiellen Verfahren zur Synthese von 3,7-Dimethylxanthin im Hinblick auf den Wirkungsgrad der Umwandlung und ähnliche Faktoren für eine großtechnische Durchführung noch als unzureichend.
Im Hinblick auf die vorstehend geschilderten Umstände wurde erfindungsgemäß mit Nachdruck nach einem Mikroorganismus gesucht, der zur positionsspezifischen Demethylierung eines 1,3-Dimethyl-7-alkylxanthins befähigt ist. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß ein früher von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung aus natürlichen Quellen isolierter Stamm der Gattung Pseudomonas, der zur Assimilation von Koffein befähigt ist, bei Züchtung in einem Nährmedium mit einem Gehalt an 1,3-Dimethyl-7-alkylxanthin in der Kultur ein entsprechendes 3-Methyl-7-alkylxanthin bildet.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung konnten bereits früher einen Mutantenstamm, der in wesentlichem Umfang Koffein metabolisiert durch Mutation eines aus dem Erdboden isolierten, Koffein assimilierenden Mikroorganismus auffinden. Ferner erhielten sie einen doppelt mutierten Stamm daraus, indem sie den Mikroorganismus einer weiteren Mutation unterzogen, so daß ihm die Fähigkeit zur Demethylierung von Theobromin zu 7-Methylxanthin fehlte (vgl. EP-A-05 09 834).
Die Erfinder stellten ferner fest, daß der vorerwähnte, doppelt mutierte Stamm im Vergleich zum aus der Natur isolierten Ausgangsstamm in stärkerem Umfang dazu befähigt ist, ein 3-Methyl-7-alkylxanthin aus dem entsprechenden 1,3- Dimethyl-7-alkylxanthin zu bilden.
Würde man über die Möglichkeit verfügen, die Reaktion in der ersten Stufe des Koffein-Stoffwechsels durch den vorstehend beschriebenen Mikroorganismus mit höherem Wirkungsgrad durchzuführen, könnte die Möglichkeit zur Erzeugung eines 3-Methyl-7-alkylxanthins aus dem entsprechenden 1,3-Dimethyl-7- alkylxanthin noch weiter verstärkt werden. Im Hinblick auf diese Erwartung wurden erfindungsgemäß weitere Untersuchungen mit dem Ziel durchgeführt, die Aktivität von Koffein­ demethylase, die als Katalysator der Umsetzung gilt, zu verstärken. Aufgrund dieser Bemühungen gelang es, das Gen von Koffein-demethylase, von dem man bisher keine proteologischen Kenntnisse hatte, zu klonieren.
Die Erfindung betrifft somit folgende Gegenstände:
  • 1) Ein isoliertes und gereinigtes DNA-Fragment mit einem Gehalt an einem Koffein-demethylase-Gen, das von einem Bakterium der Gattung Pseudomonas abgeleitet ist;
  • 2) ein DNA-Fragment nach 1), das durch die in Fig. 1 gezeigte Restriktions-endonucleasen-Spaltungskarte charakterisiert ist;
  • 3) ein DNA-Fragment nach 2), in dem die Basensequenz zwischen der AccI-Stelle und der NdeI-Stelle, die das Koffein-demethylase-Gen enthält, durch die Sequenz Nr. 1 wiedergegeben ist;
  • 4) ein isoliertes und gereinigtes DNA-Fragment mit einer Basensequenz, die für die Aminosäuresequenz von Sequenz Nr. 2 codiert;
  • 5) eine rekombinante DNA, in dessen Vektor das DNA- Fragment nach 1) oder 4) integriert ist;
  • 6) ein neuer bakterieller Stamm der Gattung Pseudomonas, der einen Wirt umfaßt, der mit der rekombinanten DNA gemäß 5) transformiert ist;
  • 7) ein neuer bakterieller Stamm der Gattung Pseudomonas gemäß 6), wobei es sich beim Wirt um Pseudomonas putida handelt; und
  • 8) ein neuer bakterieller Stamm der Gattung Pseudomonas nach 7), wobei es sich beim Wirt um Pseudomonas putida IF-3-9C-21 handelt.
Erfindungsgemäß wird auch ein Verfahren zur Herstellung von 3-Methyl-7-alkylxanthin bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus, der mit rekombinanter DNA mit einem Gehalt an einem Koffein­ demethylase-Gen transformiert worden ist, in einem Nährmedium mit einem Gehalt an 1,3-Dimethyl-7-alkylxanthin unter Bildung des entsprechenden 3-Methyl-7-alkylxanthins in der Kultur züchtet und das gebildete 3-Methyl-7-alkylxanthin aus der Kultur gewinnt.
Erfindungsgemäß wird ferner ein Verfahren zur Herstellung von 3-Methyl-7-propylxanthin bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismenstamm der Gattung Pseudomonas, der zur Umwandlung von 1,3-Dimethyl-7- propylxanthin zu 3-Methyl-7-propylxanthin in der Lage ist, oder eine davon abgeleitete Mutante in einem Nährmedium mit einem Gehalt an 1,3-Dimethyl-7-propylxanthin unter Bildung von 3-Methyl-7-methylxanthin in der Kultur züchtet und das gebildete 3-Methyl-7-propylxanthin aus der Kultur gewinnt.
Fig. 1 ist eine Restriktions-endonucleasen-Spaltungskarte eines DNA-Fragments mit einem Gehalt an einem Koffein­ demethylase-Gen.
Fig. 2 ist ein Graph, der den Züchtungsfortschritt in einem kleinen Züchtungsgefäß zeigt. In der Figur bedeuten leere Kreise die Bildung von Theobromin durch Pseudomonas putida IF-3-9C-21/pCA32A; leere Dreiecke die Bildung von Theobromin durch Pseudomonas putida IF-3-9C-21; schwarz ausgefüllte Kreise die Bildung von 3-Methyl-7-propylxanthin durch Pseudomonas putida IF-3-9C-21/pCA32A; und schwarz ausgefüllte Dreiecke die Bildung von 3-Methyl-7-propylxanthin durch Pseudomonas putida IF-3-9C-21.
Zu den Mikroorganismen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, gehören solche, die dazu befähigt sind, ein 1,3- Dimethyl-7-alkylxanthin der allgemeinen Formel (I)
in der R einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest bedeutet, in 3-Methyl-7-alkylxanthin der allgemeinen Formel (II):
in der R die vorstehend definierte Bedeutung hat, umzuwandeln.
Erfindungsgemäß bedeutet R in den vorstehenden Formeln (I) und (II) vorzugsweise eine C1-C4-Alkylgruppe.
Zu den vorerwähnten Mikroorganismen gehören Bakterien der Gattung Pseudomonas und davon abgeleitete Mutanten. Spezielle Beispiele sind Pseudomonas putida IF-3 (hinterlegt als FERM BP-3824 gemäß dem Budapester Vertrag), isoliert aus Erdboden und beschrieben in EP-A-0 509 834, sowie Pseudomonas sp. 188-1 (hinterlegt als FERM P-7073, FERM BP-4282 gemäß dem Budapester Vertrag), beschrieben in JP-B-4-12117, sowie Mutanten dieser Stämme.
Gemäß den Untersuchungen der Erfinder der vorliegenden Anmeldung wurde Pseudomonas sp. 188-1 (hinterlegt als FERM P-7073, FERM BP-4282 gemäß dem Budapester Vertrag) als Pseudomonas cepacia identifiziert, wie nachstehend erläutert wird. Pseudomonas sp. 188-1 (hinterlegt als FERM P-7073, FERM BP-4282 gemäß dem Budapester Vertrag) wird nachstehend als Pseudomonas cepacia FERM BP-4282 bezeichnet.
Eine Mutation zur Gewinnung von Mutantenstämmen dieser Stämme kann nach bekannten Verfahren durchgeführt werden, beispielsweise durch chemische Behandlung mit N-Methyl-N′- nitro-N-nitrosoguanidin (nachstehend als NTG abgekürzt) als Mutagen. Ferner können auch 2-Aminopurin, 5-Bromuracil, Ethylmethansulfonat, Dimethylsulfat, Acriflavin, Acridin­ orange, Hydrazin, 4-Nitrochinolin-N-oxid, Manganchlorid und dgl. als Mutagene verwendet werden. Eine Mutation kann auch durch physikalische Mittel unter Einsatz von UV-Strahlen, radioaktiven Strahlen, Röntgenstrahlen, γ-Strahlen und dgl. herbeigeführt werden (vgl. The Molecular Basis of Mutation, John W. Drake (1970), Holden-Day, Inc. und General Genetics (2. Aufl.), W. H. FREEMAN and COMPANY).
Die Mutantenstämme lassen sich nach bekannten Verfahren isolieren, beispielsweise durch ein direktes Verfahren, bei dem ein Mikroorganismus, der der Mutationsbehandlung unterzogen worden ist, gezüchtet wird und die einzelnen Kolonien auf das Auftreten einer Mutation untersucht werden; durch ein Replikaverfahren als Modifikation des vorstehenden Verfahrens; durch ein Kondensationsverfahren unter Verwendung von Antibiotika, wie Penicillin; und durch eine entsprechende Kombination dieser Verfahren.
Erfindungsgemäß wurden die nachstehenden experimentellen Verfahrensschritte bei der Auswahl von Stämmen, die zur Umwandlung von 1,3-Dimethyl-7-alkylxanthin in ein 3-Methyl-7- alkylxanthin befähigt sind, durchgeführt. Etwa 100 koffeinresistente Stämme, die zum Wachstum auf einem Agar- Medium mit einem Gehalt an 1,0% Bacto-Pepton, 0,5% Bacto- Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid und 2,0% Koffein befähigt waren, wurden aus Erdboden isoliert und jeweils auf ein Agar- Medium (pH-Wert 7,0) mit einem Gehalt an 0,3% Koffein, 0,3% Ammoniumsulfat, 0,5% sekundärem Kaliumphosphat, 0,1% Natriumchlorid und 0,2% Magnesiumsulfat überimpft und 3 Tage bei 30°C gezüchtet. Die Stämme mit gutem Wachstum wurden ausgewählt.
Die bakteriologischen Eigenschaften von Pseudomonas putida IF-3 und Pseudomonas cepacia FERM BP-4282 sind nachstehend angegeben. Diese bakteriologischen Eigenschaften wurden gemäß Manual of the Indentification of Medical Bacteria (MIMB), Identification of Microorganisms, herausgegeben von Society of Hygienic Technology, Japan, und gemäß Classification and Identification of Microorganisms, Bd. 11, herausgegeben von Academic Society Press Center, Japan, untersucht.
Pseudomonas putida IF-3 a) Morphologische Eigenschaften
 1) Gram-Färbung: negativ
 2) Form und Größe der Zellen: Stäbchen von etwa 0,8×2-3 µm
 3) Vorliegen von Beweglichkeit: positiv
 4) Flagellum: <1
 5) Bildung von Sporen: negativ
b) Physiologische Eigenschaften
 1) O-F-Test (Hugh-Leifson-Verfahren): aerobe Säurebildung
 2) Hämolyse: positiv
 3) Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob
 4) Säurebildung aus Zuckern:
D-Glucose
+
D-Xylose +
Mannit -
Lactose -
Saccharose -
D-Maltose -
D-Fructose -
L-Arabinose +
Raffinose -
Inulin -
Salicin -
Sepharose -
D-Sorbit -
D-Galactose +
Glycerin -
 5) Katalase-Test: positiv
 6) Oxidase-Test: positiv
 7) Wachstum auf MacConkey's-Medium: positiv
 8) Wachstum auf SS-Agar-Medium: positiv
 9) Hydrolyse von DBH: negativ
10) Anreicherung von PHB: negativ
11) Verwertung von Citronensäure: positiv
12) Zersetzung von Harnstoff: negativ
13) Nitratreduktion: positiv
14) Denitrifikationsreaktion: negativ
15) Wärmebeständigkeit (60°C × 30 min): nicht beständig
16) Wachstumstemperatur: Wachstum bei 5°C, Wachstum bei 25°C, Wachstum bei 37°C, kein Wachstum bei 42°C
17) Hydrolyse von Gelatine: negativ
18) Lackmusmilch-Reaktion: positiv
19) Hydrolyse von Stärke: negativ
20) Hydrolyse von Casein: negativ
21) Lectinase-Reaktion: negativ
22) Decarboxylierung von Lysin: negativ
23) Arginin-dihydrolase: positiv
24) Decarboxylierung von Ornithin: negativ
25) Hydrolyse von Esculin: negativ
26) NaCl-Beständigkeit: beständig gegen 0% NaCl, beständig gegen 4% NaCl, nicht beständig gegen 6% NaCl, nicht beständig gegen 7% NaCl
27) Acylamidase: negativ
28) Oxidation von Gluconsäure: negativ
29) Anwesenheit von DNAase: negativ
30) Pigmentbildung: in King A-Medium: negativ, in King B-Medium: positiv
31) Hydrolyse von TW-80: negativ
32) Wachstum in NAC-Medium: positiv
33) Hydrolyse von Agar: negativ
34) Lävan-Bildung aus Saccharose: negativ
35) Desaminierung von Phenylalanin: negativ
36) Wachstum in Methylenblau-Milch: Abnahme in Methylenblau: positiv, Koagulation von Methylenblau: negativ, Peptonisierung: negativ
37) Säure aus TSI: negativ/negativ
38) Schwefelwasserstoff-Bildung in TSI-Medium: negativ
39) Hydrolyse von Natriumhippurat: positiv
40) MR-Test: negativ
41) VP-Test: negativ
Eine Unterscheidung des Stammes wurde aufgrund der vorstehenden bakteriologischen Eigenschaften gemäß Guide to Presumptive Identification und Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology durchgeführt. Aufgrund der Ergebnisse in bezug auf Anzahl der Flagellen, Wachstum bei 42°C, Hydrolyse von Gelatine und TW-80, Säurebildung aus Trehalose und Mannit und dgl. wurde der Stamm der Spezies Pseudomonas putida zugeordnet und als Pseudomonas putida IF-3 bezeichnet. Der Stamm wurde beim National Institute of Bioscience and Human­ technology, Agency of Industrial Science & Technology, MITI, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-Shi, Ibaraki-ken 305, Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-3824 gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt.
Pseudomonas cepacia BP-4282 a) Morphologische Eigenschaften
 1) Gram-Färbung: negativ
 2) Form und Größe der Zellen: Stäbchen von etwa 0,7-0,8×1,0-1,3 µm
 3) Vorliegen von Beweglichkeit: positiv
 4) Flagellum: <1
 5) Bildung von Sporen: negativ
b) Physiologische Eigenschaften
 1) O-F-Test (Hugh-Leifson-Verfahren): aerobe Säurebildung
 2) Verhalten gegenüber Sauerstoff: streng aerob
 3) Säurebildung aus Zuckern:
L-Arabinose
+
D-Xylose +
D-Glucose +
D-Mannose +
D-Fructose +
D-Galactose +
Maltose +
Saccharose +
Lactose +
Trehalose +
D-Sorbit +
D-Mannit +
Glycerin +
Inosit -
 4) Katalase-Test: schwach positiv
 5) Oxidase-Test: positiv
 6) Verwertung von Citronensäure (sowohl in Koser's Medium als auch in Christensen's Medium): positiv
 7) Nitratreduktion: positiv
 8) Wärmebeständigkeit (60°C×30 min): nicht beständig
 9) Wachstumstemperatur: Wachstum bei 9 bis 41°C
10) Hydrolyse von Gelatine: negativ
11) Lackmusmilch-Reaktion: negativ
12) Hydrolyse von Stärke: negativ
13) Decarboxylierung von Lysin: positiv
14) Arginin-dihydrolase: negativ
15) Decarboxylierung von Ornithin: negativ
16) Acylamidase: positiv
17) Oxidation von Gluconsäure: positiv
18) Pigmentbildung: in King A-Medium: negativ, in King B-Medium: negativ
19) MR-Test: negativ
20) VP-Test: negativ
Eine Unterscheidung des Stammes wurde aufgrund der vorstehenden bakteriologischen Eigenschaften gemäß Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology vorgenommen. Aus den Ergebnissen in bezug auf negative Gram-Färbung, Stäbchenform, Beweglichkeit mit polaren Flagellen, aerobe Beschaffenheit, positiven Oxidase-Test und Säurebildung aus Glucose wurde der Stamm in die Gattung Pseudomonas eingeordnet. Der Stamm erhielt ursprünglich die Bezeichnung Pseudomonas sp. 188-1 und wurde beim National Institute of Bioscience and Human­ technology, Agency of Industrial Science & Technology, MITI, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan unter der Hinterlegungs-Nummer FERM P-7073 (FERM BP-4282 nach dem Budapester Vertrag) hinterlegt.
Aufgrund einer anschließenden Untersuchung wurde der Stamm der Spezies Pseudomonas cepacia zugeordnet, und zwar aufgrund seiner negativen Ornithin-decarboxylase-Aktivität, positiven Lysin-decarboxylase-Aktivität, positiven Gluconsäure-oxidase- Aktivität, positiven Acylamidase-Aktivität, negativen Arginin-dihydrolase-Aktivität und seines Wachstums bei 41°C.
Ferner wurde erfindungsgemäß aus dem Ausgangsstamm P. putida IF-3 die Mutante Pseudomonas putida IF-3-9C-21 gewonnen. Der Stamm IF-3-9C-21 ist in wesentlichem Umfang zur Umwandlung von Koffein in Theobromin befähigt, jedoch unfähig zur Umwandlung von Theobromin zu 7-Methylxanthin. Der Stamm wurde beim National Institute of Bioscience and Human-technology, Agency of Industrial Science & Technology, MITI, 1-3, Higashi 12-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP 3825 gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt.
Man nimmt an, daß der Koffein-Stoffwechsel durch Bakterien der Gattung Pseudomonas folgendermaßen abläuft (vgl. Hoope- Seyler′s Z. Physiol. Chem., Bd. 358 (1997), S. 807-817):
Es wird angenommen, daß in den Stufen 1, 2 und 3 Enzyme spezifisch die Methylgruppen in der 1-, 3- bzw. 7-Stellung freisetzen. Jedoch gibt es keine Erkenntnisse über die proteologischen Eigenschaften dieser Enzyme, z. B. in bezug auf Molekulargewicht, isoelektrischen Punkt, Aminosäuresequenz, Aminosäurezusammensetzung und dgl. Ihr Vorhandensein wurde bisher proteologisch nicht bestätigt.
Um die Aktivität von Koffein-demethylase in den vorerwähnten Mikroorganismen zu verstärken, wurde erfindungsgemäß erfolgreich der Versuch unternommen, das Gen von Koffein­ demethylase zu klonieren.
Das DNA-Fragment, die rekombinante DNA und transformierte Mikroorganismen lassen sich erfindungsgemäß durch folgende grundlegenden Stufen erhalten:
  • 1) Präparation eines Wirts zum Klonieren des Koffein­ demethylase-Gens. Pseudomonas putida IF-3-9C das zur Metabolisierung von Koffein befähigt ist, wird einer Mutationsbehandlung unterzogen. Ein Stamm, der zur Assimilation von Theobromin befähigt ist, jedoch Koffein nicht assimilieren kann, wird isoliert (Pseudomonas putida IF-3-19).
  • 2) Die gesamte DNA wird aus Pseudomonas putida IF-3 (hinterlegt als FERM BP-3824 gemäß dem Budapester Vertrag) extrahiert und partiell mit geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten (z. B. HindIII).
  • 3) Die in 2) erhaltenen DNA-Fragmente werden in pNI20C an der HindIII-Erkennungsposition inseriert und verknüpft, um eine rekombinante DNA zu erzielen.
  • 4) Der gemäß 1) erhaltene Stamm Pseudomonas putida IF-3- 19 wird unter Verwendung der in 3) erhaltenen rekombinanten DNA unter Bildung eines Transformantenstammes mit wiederhergestellter Koffein- Assimilationsfähigkeit transformiert.
  • 5) Die rekombinante DNA wird subkloniert. Die Basensequenz des DNA-Fragments wird bestimmt, um den codierenden Bereich von Koffein-demethylase zu identifizieren.
  • 6) Ein DNA-Fragment von geeigneter Größe, das den gesamten codierenden Bereich von Koffein-demethylase enthält (ein Fragment, von dem man annimmt, daß es den Promotor, Terminator und dergl. des Gens enthält) wird in einen Vektor (pNI107: ein Vektor, der für seine Fähigkeit zur Transformation eines Bakteriums der Gattung Pseudomonas bekannt ist) integriert, wodurch man eine rekombinante DNA erhält.
  • 7) Pseudomonas putida IF-3-9C-21 (hinterlegt als FERM BP- 3825 gemäß dem Budapester Vertrag) wird unter Verwendung der in 6) erhaltenen rekombinanten DNA transformiert.
  • 8) Die Fähigkeit der in 7) erhaltenen Transformanten zur Umwandlung eines 1,3-Dimethyl-7-alkylxanthins in 3-Methyl-7-alkylxanthin wird bestätigt.
Das vorstehend beschriebene rekombinante DNA-Experiment kann leicht nach in der Gentechnik üblichen Verfahrensweisen durchgeführt werden, beispielsweise gemäß den in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) beschriebenen Verfahren. Sämtliche in diesem Experiment verwendeten Enzyme und Reagenzien sind im Handel erhältlich. Sofern die für das spezielle Produkt angegebenen Bedingungen eingehalten werden, läßt sich, sofern nichts anderes angegeben ist, das beabsichtigte Ziel mit vollem Erfolg erreichen.
Beispielsweise umfaßt die in 2) verwendete DNA-Quelle Pseudomonas putida IF-3 (hinterlegt als FERM BP-3824 gemäß dem Budapester Vertrag) und Pseudomonas flavida IF-4 (hinterlegt als FERM P-10865, FERM BP-4281 gemäß dem Budapester Vertrag).
Die bakteriologischen Eigenschaften von Pseudomonas flavida sind nachstehend angegeben. Diese bakteriologischen Eigenschaften wurden gemäß Manual of the Indentification of Medical Bacteria (MIMB), Identification of Microorganisms, herausgegeben von Society of Hygienic Technology, Japan, und Classification and Identification of Microorganisms, Bd. II, herausgegeben von Academic Society Press Center, Japan, untersucht.
Pseudomonas flavida IF-4 a) Morphologische Eigenschaften
 1) Gram-Färbung: negativ
 2) Form und Größe der Zellen: kurze Stäbchen von etwa 0,7-1,1×1,1-2,5 µm
 3) Vorliegen von Beweglichkeit: positiv
 4) Flagellum: <1
 5) Bildung von Sporen: negativ
b) Physiologische Eigenschaften
 1) O-F-Test (Hugh-Leifson-Verfahren): aerobe Säurebildung
 2) Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob
 3) Säurebildung aus Zuckern:
D-Glucose
+
D-Xylose +
Mannit -
Lactose -
Saccharose -
Maltose -
Salicin -
D-Fructose +
 4) Katalase-Test: positiv
 5) Cytochrom-oxidase-Test: negativ
 6) Wachstum auf MacConey's-Medium: positiv
 7) Wachstum auf SS-Agar-Medium: positiv
 8) Verwertung von Citronensäure: positiv
 9) Zersetzung von Harnstoff: negativ
10) Nitratreduktion: negativ
11) Denitrifikationsreaktion: negativ
12) Wachstumstemperatur: Wachstum bei 5°C, kein Wachstum bei 41°C
13) Hydrolyse von Gelatine: positiv
14) Lackmusmilch-Reaktion: alkalisch
15) Hydrolyse von Stärke: negativ
16) Hydrolyse von Casein: negativ
17) Lectinase-Reaktion: negativ
18) Decarboxylierung von Lysin: negativ
19) Arginin-dihydrolase: positiv
20) Decarboxylierung von Ornithin: negativ
21) Hydrolyse von Esculin: negativ
22) NaCl-Beständigkeit: beständig gegen 6% NaCl
23) Acylamidase: negativ
24) Oxidation von Gluconsäure: positiv
25) Vorliegen von DNAase: negativ
26) Pigmentbildung: in Trypto Soya-Agar-Medium: positiv, in King B-Medium: positiv
27) Hydrolyse von TW-80: negativ
28) Wachstum in NAC-Medium: positiv
29) Hydrolyse von Agar: negativ
30) Lävan-Bildung aus Saccharose: negativ
31) Desaminierung von Phenylalanin: negativ
32) Säure aus TSI: negativ/negativ
33) MR-Test: negativ
34) VP-Test: negativ
Eine Typenbestimmung des Stammes wurde auf der Basis der vorstehenden bakteriologischen Eigenschaften gemäß Guide to Presumptive Identification und Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology durchgeführt. Aus dieser Analyse ergibt sich, daß der Stamm zur Gattung Pseudomonas gehört. Bei der Spezies-Bestimmung konnte der Stamm jedoch keiner herkömmlichen bekannten Spezies zugeordnet werden, da sich in den üblichen Handbüchern keine Beschreibung eines derartigen Stammes findet und da er die neuen Plasmide pNI10 und pNI20 aufweist. Der Stamm wurde aufgrund seines Glanzes und der gelben Farbe als Pseudomonas flavida IF-4 bezeichnet. Der Stamm wurde beim National Institute of Bioscience and Human­ technology, Agency of Industrial Science & Technology, MITI, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM P-10865 (FERM BP-4281 gemäß dem Budapester Vertrag) hinterlegt.
Eine Extraktion der gesamten DNA aus dem Bakterium kann beispielsweise gemäß dem Saito-Verfahren durchgeführt werden (vgl. Biochem. Biophys. Acta., Bd. 72 (1963), S. 619-629).
Eine DNA-Sequenzbestimmung in 5) kann beispielsweise gemäß dem herkömmlichen Didesoxy-Verfahren durchgeführt werden (vgl. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 73, (1977), S. 463).
Vektoren, die zur Transformation von Pseudomonas putida in 3) und 6) verwendet werden können, umfassen die Plasmide pNI107 und pNI20C (vgl. JP-A-3-67590, JP-A-3-67591 und Journal of Biochemistry, Bd. 110 (1991), S. 614-621).
Eine Transformation von Pseudomonas putida in 7) kann beispielsweise gemäß dem Verfahren von Bagdasarian et al., durchgeführt werden (vgl. Gene, Bd. 16, (1981), S. 237).
Von Pseudomonas putida abweichende Mikroorganismen können ebenfalls als Wirt unter Verwendung eines geeigneten Vektors eingesetzt werden. Beispielsweise werden vorzugsweise andere Pseudomonas-Spezies gemäß der Beschreibung in J. Biochem., Bd. 110 (1991), S. 614-621 verwendet.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von 3-Methyl-7-alkylxanthin werden vorzugsweise die vorerwähnten Mikroorganismen und Transformanten verwendet. Insbesondere werden Mutanten von Pseudomonas putida IF-3 und ganz besonders Pseudomonas putida IF-3-9C-21 und Transformanten davon bevorzugt.
Beliebige Nährmedien können zur Züchtung des Stammes verwendet werden, sofern der Mikroorganismus darin wächst. Beim Medium kann es sich entweder um ein natürliches Medium oder ein synthetisches Medium handeln, das routinemäßige Bestandteile, wie Kohlenstoffquellen neben 1,3-Dimethyl-7- alkylxanthin, Stickstoffquellen, anorganischen Salzen und gegebenenfalls anderen Nährstoffen und Hilfsbestandteilen (z. B. pH-Regulatoren, Emulgiermittel, Antischaummittel und dergl.) enthält. Zu von 1,3-Dimethyl-7-alkylxanthin abweichenden geeigneten Kohlenstoffquellen gehören Zucker, wie Glucose, Xylose und Arabinose; Zuckeralkohole, wie Glycerin und Sorbit; und organische Säuren, wie Citronensäure und Fumarsäure. Zu geeigneten Stickstoffquellen gehören anorganische Stickstoffquellen, wie Ammoniumsalze und Nitrate; und organische Stickstoffquellen, wie Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trypton und Kultivator. Zu geeigneten anorganischen Salzen gehören Kaliumphosphat, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Natriumphosphat und Eisen(II)-sulfat.
Die Konzentration von 1,3-Dimethyl-7-alkylxanthin im Medium unterliegt keinen speziellen Beschränkungen und kann unter Berücksichtigung der gewünschten Ausbeute an 3-Methyl-7- alkylxanthin und der Kulturbedingungen sowie unter Berücksichtigung wirtschaftlicher Erwägungen festgelegt werden. Die Konzentration liegt üblicherweise im Bereich von 0,1 bis 10%, vorzugsweise von 0,5 bis 5,0%. Die Züchtung wird bei einer Temperatur von 10 bis 40°C und einem pH-Wert von etwa 4,5 bis 9,0 durchgeführt. Vorzugsweise beträgt der Temperaturbereich 20 bis 30°C bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5, wobei die Züchtungszeit vorzugsweise 5 bis 72 Stunden beträgt. Durch kontinuierliches Einspeisen des Mediums mit einem Gehalt an Kohlenstoffquellen, wie Glucose und Xylose, und Stickstoffquellen, wie Fleischextrakt, Hefeextrakt und Natriumglutamat, und unter Steuerung der Konzentration des 1,3-Dimethyl-7-alkylxanthins im Medium kann die Umwandlungsreaktion von 1,3-Dimethyl-7-alkylxanthin zum entsprechenden 3-Methyl-7-alkylxanthin kontinuierlich durchgeführt werden ("feed batch"-Züchtung). Das 1,3- Dimethyl-7-alkylxanthin kann entweder als Feststoff oder als wäßrige Lösung zugegeben werden.
Gegebenenfalls kann ein Reaktionsbeschleuniger, der die Anreicherung von 3-Methyl-7-alkylxanthin in der Kultur beschleunigt, zugesetzt werden. Geeignete Beispiele für derartige Reaktionsbeschleuniger sind Monomethylxanthin, Metallionen (z. B. Nickel- oder Zinkionen), Koffein und Theobromin, wobei die Art des Beschleunigers in Abhängigkeit von dem in der Kultur vorliegenden Stamm variiert.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das Produkt direkt aus der Kultur selbst, wie es durch die vorerwähnte Züchtung erhalten worden ist, und aus Kulturprodukten, wie mikrobiellen Zellen, Kulturfiltrat, aufgebrochenen Zellen, lyophylisierten Zellen, durch Extraktion mit einem Lösungsmittel, wie Ethylalkohol, Toluol oder Ethylether, hergestellte Zellextrakte und immobilisierte Zellen, gewonnen werden.
Das 1,3-Dimethyl-7-alkylxanthin wird in das entsprechende 3- Methyl-7-alkylxanthin übergeführt, wenn man es in einem wäßrigen Medium mit der Kultur oder dem Kulturprodukt in Kontakt bringt. Das 1,3-Dimethyl-7-alkylxanthin kann in suspendiertem Zustand im Reaktionssystem vorliegen, d. h. in einer Konzentration, die dessen Löslichkeit übersteigt. Der Kontakt von 1,3-Dimethyl-7-alkylxanthin mit der Kultur oder dem Kulturprodukt kann in einem absatzweisen System oder in einem kontinuierlichen System unter Verwendung einer Säule vorgenommen werden.
Das Gemisch aus der Kultur oder dem Kulturprodukt und dem 1,3-Dimethyl-7-alkylxanthin wird unter Belüftung unter den vorstehend erwähnten Bedingungen 5 bis 80 Stunden gerührt, um die Umwandlungsreaktion unter aeroben Bedingungen fortzusetzen. Das gebildete 3-Methyl-7-alkylxanthin kann aus dem Reaktionsgemisch auf übliche Weise gewonnen werden. Dazu wird das Reaktionsgemisch, gegebenenfalls nach zentrifugaler Abtrennung, mit Alkali behandelt. Etwaige Verunreinigungen werden mit einem organischen Lösungsmittel entfernt. Daran schließt sich eine Einstellung des pH-Werts zur Bildung von 3-Methyl-7-alkylxanthin als Niederschlag an.
Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert, die jedoch in keiner Weise den Schutzumfang der Erfindung beschränken sollen.
Bezugsbeispiel 1 Herstellung von 1,3-Dimethyl-7-propylxanthin
600 g Theophyllin (Produkt der Fa. Katayama Kagaku Kogyo K.K.) wurden in 180 ml einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt an 263,4 g Kaliumhydroxid gelöst. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Man erhielt ein Kaliumsalz von Theophyllin. Das erhaltene Salz wurde in 3600 ml Dimethylformamid suspendiert. 436,5 ml Propylbromid wurden zugegeben, wonach 8 Stunden unter Rühren auf 90°C erwärmt wurde. Das Dimethylformamid wurde durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde mit 1800 ml Dichlormethan versetzt. Das Gemisch wurde dreimal mit 300 ml-Portionen 1 n wäßriger Kaliumhydroxidlösung und sodann einmal mit 300 ml Wasser gewaschen und anschließend über 54 g wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Trocknungsmittel wurde durch Filtration entfernt. Die Mutterlauge wurde unter vermindertem Druck und sodann unter Vakuum (85°C, 5 Stunden) getrocknet. Man erhielt 657 g (Ausbeute: 88,8%) 1,3-Dimethyl-7-propylxanthin.
Bezugsbeispiel 2 Herstellung von Pseudomonas putida IF-3-9C-21
Pseudomonas putida IF-3 (FERM BP-3824) wurde in einem TY-Medium (Produkt der Fa. Difco Co. mit einem Gehalt an 1,0% Bacto-Trypton und 0,5% Bacto-Hefeextrakt) bis zum Erreichen der logarithmischen Wachstumsphase gezüchtet. Die mikrobiellen Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen, gewaschen und in 5 ml 50millimolarem Tris-Maleat-Puffer (pH-Wert 6,0) suspendiert.
NTG wurde zu der Zellsuspension in einer Konzentration von 100 µg/ml gegeben. Man ließ die Suspension 30 Minuten bei 30°C stehen. Nach der NTG-Behandlung wurden die Zellen zweimal mit einer 0,9%igen wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen, in einem TY-Medium suspendiert und anschließend über Nacht bei 30°C einer Schüttelkultur unterworfen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen, zweimal mit 0,9% wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen und einer weiteren Züchtung in 5 ml Koffein-Minimalmedium (0,3% Ammoniumsulfat, 0,5% sekundäres Kaliumphosphat, 0,1% Natriumchlorid, 0,2% Magnesiumsulfat-heptahydrat und 0,1% Koffein; pH-Wert = 7,0) 7 Stunden bei 30°C unterworfen. Die erhaltene Kultur wurde verdünnt und auf ein Koffein-Minimal-Agar-Medium (0,3% Ammoniumsulfat, 0,5% sekundäres Kaliumphosphat, 0,1% Natriumchlorid, 0,2% Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,1% Koffein und 1,5% Agar; pH-Wert = 7,0) ausgestrichen. Nach 2 tägiger Züchtung bei 30°C wurden die Kolonien einem Screening auf Stämme mit ausgezeichnetem Wachstum unterworfen.
Die auf diese Weise erhaltenen einzelnen Mutantenstämme wurden auf ein LKC-Medium (1,0% Bacto-Trypton, 0,5% Bacto- Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid, 0,5% sekundäres Kaliumphosphat und 0,1% Koffein; pH-Wert = 7,0) ausgestrichen. Nach 8stündiger Züchtung bei 30°C wurde die Koffeinkonzentration im Medium gemessen. Ein Stamm, der im Vergleich zum Ausgangsstamm eine höheren Koffeinverbrauch zeigte, wurde als für den Koffein-Stoffwechsel wichtiger Mutantenstamm isoliert. Der Stamm erhielt die Bezeichnung 9C.
Der Stamm 9C wurde auf die vorstehend beschriebene Weise mit NTG behandelt. Die gewonnenen und gewaschenen mikrobiellen Zellen wurden über Nacht bei 30°C einer Schüttelkultur in einem Theobromin-Minimalmedium mit einem Gehalt an 0,3% Theobromin, den gleichen anorganischen Salzen wie beim Koffein-Minimalmedium und 300 µg/ml Carbenicillin unterworfen. Die Zellen wurden zweimal mit 0,9%iger wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen und verdünnt. Sodann wurden sie auf ein LT-Agarmedium (1,0% Bacto-Trypton, 0,5% Bacto-Hefeextrakt, 0,3% Theobromin und 1,5% Agar; pH-Wert = 6,8) ausgestrichen. Anschließend erfolgte eine 2tägige Züchtung bei 30°C zur Bildung von Kolonien. 25 Kolonien, die das Theobromin um die Kolonien nicht zersetzten, wurden erhalten.
Die Assimilationseigenschaften für Koffein, Theobromin und 7-Methylxanthin der isolierten Stämme wurden untersucht. Ein Stamm, der nur 7-Methylxanthin assimilierte, wurde isoliert. Er erhielt die Bezeichnung Pseudomonas putida IF-3-9C-21 (hinterlegt als FERM BP-3825 gemäß dem Budapester Vertrag). Beim Stamm Pseudomonas putida IF-3-9C-21 handelt es sich um eine doppelte Mutante, die in wesentlichem Umfang Koffein assimiliert, aber nicht Theobromin in 7-Methylxanthin umwandelt.
Beispiel 1
Pseudomonas putida IF-3-9C-21 (hinterlegt als FERM BP-3825 gemäß dem Budapester Vertrag) wurde auf 75 ml eines Mediums mit einem Gehalt an 1,0% 1,3-Dimethyl-7-propylxanthin (hergestellt gemäß Bezugsbeispiel 1), 1,0% Bacto-Trypton, 0,5% Bacto-Hefeextrakt und 1,0% sekundärem Kaliumphosphat (pH-Wert 6,7) in einem 500 ml Sakaguchi-Kolben überimpft. Nach Anzüchten über Nacht bei 30°C wurden jeweils 1% Aliquot-Anteile der Kulturbrühe auf 75 ml des vorstehend beschriebenen Mediums in einem Sakaguchi-Kolben überimpft. Die Züchtung wurde 18 Stunden bei 30°C unter Rühren mit 120 U/min durchgeführt.
Die vereinigten Kulturen, die ein Volumen von 1700 ml aufwiesen, wurden 15 Minuten bei 10 000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde mit Salzsäure auf den pH-Wert 6,0 eingestellt, unter vermindertem Druck eingeengt und über Nacht bei 5°C stehengelassen. Die ausgefallenen Kristalle wurden in 450 ml gereinigtem Wasser suspendiert. 25,2 g Kaliumhydroxid und sodann etwa 600 ml Dichlormethan wurden zugesetzt. Eine wäßrige Phase von etwa 400 ml wurde abgetrennt. Die wäßrige Phase wurde zur Ausfällung von Kristallen mit Salzsäure versetzt. Anschließend wurde zur Gewinnung des Feststoffs zentrifugiert (12 000 U/min × 15 min). Der Feststoff wurde in etwa 100 ml Wasser suspendiert und erneut zentrifugiert. Sodann wurde der gewonnene Feststoff mit etwa 80 ml Ethylalkohol vermischt und anschließend unter vermindertem Druck bei 50°C getrocknet. Man erhielt 1,18 g eines Präparats.
Eine Aliquotmenge dieses Präparats wurde auf die nachstehend angegebene Weise zur Strukturermittlung analysiert.
a) Ethylierung des Präparats:
Eine 0,2 g Aliquotmenge des Präparats wurde in 1,7 ml 1 n wäßriger Kaliumhydroxidlösung gelöst. Sodann wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in 1,5 ml Dimethylformamid suspendiert und unter Rühren mit 0,22 ml Ethylbromid versetzt. Das Gemisch wurde 5 Stunden unter Rühren auf 90°C erwärmt.
Das Dimethylformamid wurde durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 30 ml Dichlormethan gelöst, zweimal mit jeweils 20 ml 1 n wäßriger Kaliumhydroxidlösung und einmal mit 20 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, unter vermindertem Druck zur Entfernung von Dichlormethan getrocknet und schließlich unter Vakuum getrocknet. Man erhielt 0,2 g (Ausbeute: 88,1%) eines ethylierten Präparats.
b) Herstellung von 1-Ethyl-3,7-dimethylxanthin:
0,9 g Theobromin (Produkt der Fa. Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) wurden in 7,5 ml wäßriger 1 n Kaliumhydroxidlösung gelöst, anschließend wurde unter vermindertem Druck getrocknet. Der Rückstand wurde in 6 ml Dimethylformamid suspendiert und unter Rühren mit 0,6 ml Ethylbromid versetzt. Sodann wurde 8 Stunden unter Rühren auf 90°C erwärmt.
Das Dimethylformamid wurde durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 50 ml Dichlormethan gelöst, zweimal mit jeweils 30 ml einer 1 n wäßrigen Kaliumhydroxidlösung und einmal mit 30 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, unter vermindertem Druck zur Entfernung von Dichlormethan getrocknet und schließlich unter Vakuum getrocknet. Man erhielt 0,86 g (Ausbeute: 83%) 1-Ethyl-3,7-dimethylxanthin.
Das 13C-NMR-Spektrum der N-Substituenten des in a) erhaltenen ethylierten Präparats (nachstehend als (4) bezeichnet), wurde mit den Spektren von Koffein (1,3,7- Trimethylxanthin) (nachstehend als (1) bezeichnet), des in b) erhaltenen 1-Ethyl-3,7-dimethylxanthins (nachstehend als (2) bezeichnet) und des im Bezugsbeispiel 1 erhaltenen 1,3- Dimethyl-7-propylxanthins (nachstehend als (3) bezeichnet) verglichen. Bei einem Vergleich der 13C-NMR-Spektren der N- Methylgruppen von (1), (2) und (3) ergaben sich folgende chemische Verschiebungen (ppm) der N-Methylgruppen in den 1-, 3- und 7-Positionen (nachstehend als N1-Methyl, N3-Methyl und N7-Methyl bezeichnet:
N1-Methyl: 27,72 ppm
N3-Methyl: 29,37-29,54 ppm
N7-Methyl: 33,35-33,40 ppm.
Sodann wurde durch Vergleich der chemischen Verschiebungen von N1-Methyl und N3-Methyl von (3) (27,72 ppm bzw. 29,48 ppm) mit der chemischen Verschiebung der N-Methylgruppe von (4) (29,43 ppm) bestätigt, daß es sich bei der Verbindung des Präparats um 3-Methyl-7-propylxanthin handelte, d. h. um ein Produkt, das aus (3) durch Freisetzung der N1-Methylgruppe aufgrund einer mikrobiellen Umwandlung abgeleitet worden war. Die chemischen Verschiebungen sind in nachstehender Tabelle I zusammengestellt.
Tabelle I
Die Messungen für das 13C-NMR-Spektrum wurden unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Probenlösung: 70 mg von (1) oder 100 mg von (2), (3) oder (4) in 0,5 ml CDCl3
Vorrichtung: JNM-FX60Q der Fa. Japan Electron Optics Lab. Co., Ltd.
Standard: Chemische Verschiebung von CDCl3, 77,1 ppm.
Beispiel 2
Pseudomonas cepacia FERM BP-4282 wurde auf ein Medium der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1, das zusätzlich 0,01% 7-Methylxanthin oder 0,1% Theobromin enthielt, überimpft. Nach Anzüchten über Nacht bei 30°C wurden 1% Aliquotmengen der Kulturbrühe jeweils auf 75 ml des vorstehend beschriebenen Mediums in einem Sakaguchi-Kolben überimpft. Die Züchtung wurde 18 Stunden bei 30°C unter Rühren mit 120 U/min durchgeführt.
Die vereinigte Kultur wurde durch Hochleistungs-Flüssig- Chromatographie (HPLC) unter Verwendung eines Chromatographen der Fa. Toso Co., Ltd. durchgeführt. Es ergab sich, daß ein Peak mit der gleichen Retentionszeit wie beim in Beispiel 1 erhaltenen 3-Methyl-7-propylxanthin (Präparat) auftrat, was die Anreicherung von 3-Methyl-7-propylxanthin in der Kultur bestätigte. Die HPLC-Analyse wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Säule: ODS-80TM (Produkt der Fa. Toso Co., Ltd.)
Mobile Phase: wäßrige Lösung mit einem Gehalt an 17% Acetonitril und 0,1% Trifluoressigsäure
Strömungsgeschwindigkeit: 1 ml/min.
Beispiel 3
Gemäß Beispiel 2 wurde Pseudomonas putida IF-3 (hinterlegt als FERM BP-3824 gemäß dem Budapester Vertrag) über Nacht bei 30°C angezüchtet. 1% Aliquotmengen der Kulturbrühe wurden jeweils auf 75 ml des gleichen Mediums in einem Sakaguchi- Kolben überimpft. Die Züchtung wurde 18 Stunden bei 30°C unter Rühren mit 120 U/min durchgeführt.
Die HPLC-Analyse der vereinigten Kultur gemäß den Bedingungen von Beispiel 2 ergab die Bildung von 3-Methyl-7-propylxanthin.
Beispiel 4
Pseudomonas putida IF-3-9C-21 (hinterlegt als FERM BP-3825 gemäß dem Budapester Vertrag) wurde gemäß Beispiel 1 gezüchtet, mit der Ausnahme, daß das 1,3-Dimethyl-7- propylxanthin aus der Zusammensetzung des Kulturmediums weggelassen wurde. Die erhaltene Kulturbrühe wurde mit 1,3- Dimethyl-7-propylxanthin vermischt. Das Gemisch wurde durch HPLC-Analyse unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 2 untersucht. Als Ergebnis wurde die Bildung von 3-Methyl-7- propylxanthin bestätigt.
Beispiel 5 Isolierung des Koffein-demethylase-Gens aus einem Koffein metabolisierenden Bacterium 1) Herstellung einer Koffein-demethylase-Mangelmutante
Pseudomonas putida IF-3-9C, ein Mutantenstamm mit der Fähigkeit, Koffein in wesentlichem Umfang zu assimilieren, der aus dem Ausgangsstamm IF-3 (hinterlegt als FERM BP-3824 gemäß dem Budapester Vertrag) erhalten worden war, wurde in einem TY-Medium (1,0% Bacto-Trypton und 0,5% Bacto- Hefeextrakt) bis zur logarithmischen Wachstumsphase gezüchtet. Die mikrobiellen Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen, gewaschen und in 5 ml 50 millimolarem Tris-Maleat-Puffer (pH-Wert = 6,0) suspendiert.
NTG wurde zu der Zellsuspension bis zu einer Endkonzentration von 100 µg/ml gegeben. Die Suspension wurde 30 Minuten bei 30°C stehengelassen. Nach der NTG-Behandlung wurden die Zellen zweimal mit 0,9% wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen und anschließend über Nacht bei 30°C einer Schüttelkultur in einem Koffein-Minimalmedium (0,3% Koffein, 0,3% Ammoniumsulfat, 0,5% sekundäres Kaliumphosphat, 0,1% Natriumchlorid und 0,2% Magnesiumsulfat-heptahydrat; pH-Wert = 7,0), das mit Carbenicillin in einer Endkonzentration von 500 µg/ml versetzt worden war, unterworfen. Die gewonnenen Zellen wurden zweimal mit 0,9%iger wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen.
Sodann wurden die gewaschenen Zellen in 1 ml 0,9%iger wäßriger Natriumchloridlösung suspendiert. In geeignet er Weise verdünnt und auf ein LT-Agar-Medium (1% Bacto-Trypton und 0,5% Bacto-Hefeextrakt) ausgestrichen. Nach 1tägiger Züchtung bei 30°C auf dem LT-Agar-medium wurden die Kolonien auf einem Koffein-Minimalmedium repliziert. Nach 2tägiger Züchtung bei 30°C wurden die Assimilationseigenschaften für Koffein, Theobromin und 7-Methylxanthin der Stämme, die ein schlechtes Wachstum im Koffein-Minimalmedium zeigten, untersucht. Ein Mutantenstam IF-3-19, der Theobromin und 7-Methylxanthin, jedoch nicht Koffein assimilierte, wurde erhalten.
Pseudomonas putida IF-3-19 ist ein Mutantenstamm, der Koffein nicht in Theobromin überführt, d. h. es handelt sich um eine Koffein-demethylase-Mangelmutante.
2) Klonieren des Koffein-demethylase-Gens
Die gesamte DNA von Pseudomonas putida IF-3 (hinterlegt als FERM BP-3824 gemäß dem Budapester Vertrag) oder Pseudomonas flavida IF-4 (hinterlegt als FERM P-10865, FERM BP-4281 gemäß dem Budapester Vertrag) wurde gemäß dem Verfahren von Saito und Miura (vgl. Biochem. Biophys. Acta, Bd. 72 (1963), S. 619-629) gewonnen. Die erhaltene gesamte DNA wurde zur Bildung von Fragmenten (1 µg) mit HindIII geschnitten. Unter Verwendung von T4-DNA-Ligase wurde das geschnittene Fragment mit dem Klonierungsvektor pNI20C (etwa 2 µg) verknüpft, wonach sich eine Verdauung mit HindIII und eine Dephosphorylierung anschloß.
Pseudomonas putida IF-3-19, eine Koffein-demethylase- Mangelmutante wurde einer Transformation unter Verwendung der erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA unterworfen und auf Koffein-Minimal-Agarmedium mit einem Gehalt an 25 µg/ml Kanamycin ausgestrichen.
Nach 2tägiger Züchtung bei 30°C wurden vier Transformantenstämme mit einem Gehalt an den Genen aus Pseudomonas putida IF-3 und drei Transformantenstämme mit einem Gehalt an den Genen aus Pseudomonas flavida IF-4 erhalten.
Ein Plasmid wurde aus den einzelnen Transformantenstämmen hergestellt und mit HindIII verdaut. Das Spaltungsmuster wurde durch Agarosegel-Elektrophorese bestätigt. Es wurde festgestellt, daß sämtliche Stämme gemeinsame DNA-Fragmente von 2,4 kb und 4,3 kb aufwiesen, d. h. die in Fig. 1 gezeigten DNA-Fragmente, die durch HindIII geschnitten worden waren.
3) Subklonierung von Koffein-demethylase und Positionsbestimmung davon
Eines der vorstehend in (2) erhaltenen Plasmide erhielt die Bezeichnung pTF1. pTF1 wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten und durch Agarosegel- Elektrophorese analysiert. Man erhielt eine Restriktions­ endonuclease-Spaltungskarte des inserierten 6,7 kb-DNA- Fragments, wie in Fig. 1 gezeigt. Anschließend wurden zur Spezifizierung der in diesem Fragment vorhandenen, für Koffein-demethylase codierenden Region die verschiedenen, mit Restriktionsenzymen verdauten DNA-Fragmente jeweils in pNI107 inseriert und verknüpft, um eine rekombinante DNA herzustellen. Pseudomonas putida IF-3-19 wurde mit dieser rekombinanten DNA transformiert. Als Ergebnis wurde ein DNA- Fragment von etwa 1,7 kb, das durch AccI und NdeI ausgeschnitten wurde und die Koffein- Assimilationseigenschaften von IF-3-19 wieder herstellte, erhalten. Das Plasmid mit diesem DNA-Fragment erhielt die Bezeichnung pCA32A.
4) Bestätigung der Existenz des Koffein-demethylase-Gens in pCA32A
Um zu bestätigen, daß das DNA-Fragment, das in das in der vorstehenden Stufe 3) erhaltene pCA32A inseriert worden war, für Koffein-demethylase codiert, wurde pCA32A in Pseudomonas putida ATCC 8209, das Koffein nicht assimiliert, eingeführt. Es wurde geprüft, ob die erhaltene Transformante zur Umwandlung von Koffein in Theobromin befähigt war. Dieses Verfahren läuft im einzelnen folgendermaßen ab.
Das in der vorstehenden Stufe 3) erhaltene pCA32A wurde ein Pseudomonas putida ATCC 8209, das Koffein nicht assimiliert, d. h. nicht zur Assimilation von einem der Produkte Koffein, Theobromin und 7-Methylxanthin befähigt ist, eingeführt, wodurch man die Transformante 8209/pCA32A erhielt. Zu Vergleichszwecken wurde der Plasmidvektor pNI107 in P. putida ATCC 8209 eingeführt, um die Transformante 8209/pNI107 zu erhalten.
Die einzelnen erhaltenen Transformantenstämme wurden auf 5 ml eines TYKG-Mediums (1,5% Bacto-Trypton, 0,75% Bacto- Hefeextrakt, 0,5% sekundäres Kaliumphosphat, 0,2% Glucose und 0,25 µg/ml Kanamycin; pH-Wert = 6,7) überimpft und 8 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur unterworfen. 0,5 ml- Anteile der Kulturbrühe wurden auf jeweils 50 ml TYKG-Medium in 10 500 ml-Sakaguchi-Kolben überimpft, wonach 16 Stunden eine Schüttelkultur bei 30°C durchgeführt wurde.
Die erhaltenen Kulturen wurden vereinigt (500 ml) und 10 Minuten bei 7000 U/min zentrifugiert. Die auf diese Weise gewonnenen mikrobiellen Zellen wurden mit einem 20 millimolaren Natriumphosphatpuffer (pH-Wert = 6,0) gewaschen und in 30 ml dieses Puffers suspendiert.
Die Zellsuspension (0,5 ml) wurde mit 105 µl 100 millimolarer wäßriger Koffeinlösung, 210 µl einer 50millimolaren wäßrigen NADH-Lösung, 50 µl eines 0,8 m Natriumphosphatpuffers und 1135 ml Wasser versetzt. Das System wurde 16 Stunden bei 25°C zur Umsetzung gebracht. Ein 475 µl-Aliquot-Anteil des Reaktionsgemisches wurde zu 25 µl einer 50%igen wäßrigen Trichloressigsäurelösung gegeben, um die Umsetzung zu stoppen. Das Gemisch wurde zentrifugiert. Der Anteil an Koffein und Theobromin in der überstehenden Flüssigkeit wurde durch HPLC unter den folgenden Bedingungen bestimmt, um die Aktivität an Koffein-demethylase zu ermitteln. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.
Säule = ODS-80T, Produkt der Fa. Toso Co., Ltd.
Mobile Phase = wäßrige Lösung mit einem Gehalt an 17% Acetonitril und 0,1% Trifluoressigsäure
Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min
Nachweis = 272 nm
Tabelle II
Wie aus Tabelle II hervorgeht, bildete der mit dem Plasmidvektor pNI107 transformierte Stamm kein Theobromin, während der mit pCA32A transformierte Stamm ATCC 8209 18,6% des Koffeinsubstrats unter Bildung von 0,16 g/Liter Theobromin umsetzte. Diese Ergebnisse belegen, daß das inserierte DNA-Fragment von pCA32A ein Koffein-demethylase- Gen enthält.
5) Sequenzermittlung des Koffein-demethylase-Gens
Die Basensequenz des AccI-NdeI-DNA-Fragments von etwa 1,7 kb, die in pCA32A inseriert worden war, wurde gemäß dem Sanger- Verfahren bestimmt. Insbesondere wurde das mit AccI und NdeI ausgeschnittene DNA-Fragment mit Klenow-Fragment stumpfendig gemacht und an der SmaI-Erkennungsstelle in pUC118 inseriert, wodurch man die Plasmide 118A und 118B mit unterschiedlicher Insertionsrichtung erhielt.
Aus dem erhaltenen Plasmid wurden Plasmide hergestellt, in denen das inserierte DNA-Fragment stufenweise mittels eines Deletionskits der Fa. Takara Shuzo Co., Ltd. deletiert worden war. Komplementäre DNA wurde unter Verwendung der einzelnen Deletionsplasmide als Matrize mittels eines Sequenzkits der Fa. Applied Biosystems Co. synthetisiert. Die Basensequenz wurde sodann mittels einer DNA-Sequenziervorrichtung gelesen.
Es wurde festgestellt, daß es im vorstehenden DNA-Fragment nur einen einzigen offenen Leseraster gibt.
In der Sequenz Nr. 1 ist die DNA-Basensequenz zwischen AccI und NdeI (1686 bp) mit einem Gehalt an der das Koffein- demethylase-Gen enthaltenden DNA gezeigt. Die angenommene Aminosäuresequenz von Koffein-demethylase ist ebenfalls unter den jeweiligen Basentripletts angegeben.
Beispiel 6 Herstellung von 3-Methyl-7-alkylxanthin aus 1,3-Dimethyl-7- alkylxanthin durch eine pCA32A-Transformante
Pseudomonas putida IF-3-9C-21 (hinterlegt als FERM BP-3825 gemäß dem Budapester Vertrag) wurde mit pCA32A unter Bildung von P. putida IF-3-9C-21/pCA32A transformiert.
P. putida IF-3-9C-21/pCA32A wurde auf 75 ml eines Mediums (pH-Wert = 6,7) mit einem Gehalt an 0,5% Fleischextrakt (Produkt der Fa. Kyokuto Seiyaku Kogyo Co., Ltd.), 0,3% Meast P1G (Produkt der Fa. Asahi Breweries, Ltd.) und 0,3% sekundärem Kaliumphosphat in einem 500 ml Sakaguchi-Kolben überimpft und 16 Stunden bei 30°C angezüchtet. In ein 5 Liter fassendes Gefäß wurden 2 Liter des vorstehenden Mediums gegeben. 0,5% 1, 3-Dimethyl-7-ethylxanthin, 1,3-Dimethyl-7- propylxanthin oder 1,3-Dimethyl-7-butylxanthin wurden zugesetzt. 1% der Anzüchtbrühe wurden auf das bereitgestellte Medium überimpft und 24 bis 48 Stunden gezüchtet, wobei die Temperatur während der ersten 7 Stunden auf 30°C und anschließend auf 25°C unter Belüftung mit 1 v.v.m. und Rühren mit 600 U/min mittels eines Turbomischers flacher Bauart mit sechs Rührblättern eingestellt wurde. 4 Stunden nach Züchtungsbeginn wurde der pH-Wert der Kultur auf 6,6 bis 6,8 eingestellt und mit der Zugabe eines Mediums der folgenden Zusammensetzung begonnen.
Zusammensetzung des eingesetzten Mediums
Glucose|17%
Natriumglutamat 2%
Fleischextrakt 4%
Meast P1G 4%
Tabelle III
Beispiel 7 Umwandlung von Koffein in Theobromin und Umwandlung von 1,3- Dimethyl-7-propylxanthin in 3-Methyl-7-propylxanthin durch P. putida ZF-3-9C-21/pCA32A
Pseudomonas putida IF-3-9C-21 und P. putida IF-3-9C- 21/pCA32A wurden über Nacht bei 30°C in 75 ml eines Mediums mit einem Gehalt an 0,5% Fleischextrakt, 0,3% Meast P1G und 0,3% sekundärem Kaliumphosphat (pH-Wert = 6,7) in einem 500 ml Sakaguchi-Kolben einer Schüttelkultur unterworfen. Das für den Transformantenstamm verwendete Medium enthielt ferner 25 µg/ml Kanamycin.
1% der erhaltenen Anzuchtkultur wurden auf 3 Liter eines Mediums mit einem Gehalt an 0,5% Fleischextrakt, 0,1% Glucose und 0,3% Meast P1G, das ferner 0,5% Koffein oder 1,3-Dimethyl-7-propylxanthin enthielt, überimpft und 50 Stunden gezüchtet, wobei während der ersten 7 Stunden die Temperatur auf 30°C und sodann auf 25°C unter Belüftung mit 1 v.v.m. und Rühren mit 600 U/min mittels eines Turbomischers von flacher Bauart mit 6 Rührblättern eingestellt wurde. 4 Stunden nach Züchtungsbeginn wurde der pH-Wert der Kultur auf 6,6 bis 6,8 eingestellt. Vom gleichen Zeitpunkt an wurde mit der Zugabe eines Mediums mit einem Gehalt an 25% Glucose, 6% Fleischextrakt, 6% Meast P1G, 3% Natriumglutamat und 1,0% Koffein oder 1,3-Dimethyl-7-propylxanthin mit einer Geschwindigkeit von 12 ml/Std. begonnen.
Die Konzentration an Koffein oder 1,3-Dimethyl-7- propylxanthin in der Kultur wurde in Abhängigkeit von der Zeit gemessen. Die Substrate wurden in geeigneter Weise zugegeben, um ihre jeweilige Konzentration auf 0,5 bis 2,5 ml/ml einzustellen.
Auf diese Weise wurde das 1,3-Dimethyl-7-alkylxanthin in das entsprechende 3-Methyl-7-alkylxanthin übergeführt. Die Ergebnisse der Umwandlungsreaktion sind in Fig. 2 gezeigt. Es ist ersichtlich, daß bei Verwendung beider Substrate (Koffein oder 1,3-Dimethyl-7-propylxanthin) der Transformantenstamm mit einem Gehalt an pCA32A, d. h. P. putida IF-3-9C-21/pCA32A, das entsprechende Umwandlungsprodukt (Theobromin bzw. 3- Methyl-7-propylxanthin) in einer Menge bildet, die etwa dem 2- bis 4fachen der von P. putida IF-3-9C-21 gebildeten Menge entspricht.
Die Mengen des Substrats und des Produkts am Ende der Züchtung wurden gemessen. Es ergibt sich, daß im System unter Verwendung von P. putida IF-3-9C-21/pCA32A und Koffein als Substrat die kumulativ innerhalb von 50 Stunden zugesetzte Koffeinmenge 535 g betrug, während die Menge des restlichen Koffeins 80 g und die Menge des gebildeten Theobromins 414 g betrugen, was eine Umwandlung von Koffein zu Theobromin von 98,9% ergibt. In dem System, in dem der gleiche Stamm und 1,3-Dimethyl-7-propylxanthin als Substrat verwendet wurden, betrug die im Verlauf von 50 Stunden zugesetzte kumulative Substratmenge 350 g, während die Menge des restlichen Substrats 63 g und die Menge des gebildeten 3-Methyl-7- propylxanthins 262 g betrugen, was zeigt, daß der Umwandlungsgrad von 1,3-Dimethyl-7-propylxanthin zu 3-Methyl- 7-propylxanthin 97% betrug.
Erfindungsgemäß läßt sich ein 3-Methyl-7-alkylxanthin, das ein wertvolles Zwischenprodukt zur Herstellung von Arzneistoffen darstellt, in wirksamer Weise und unter geringem Kostenaufwand herstellen, indem man einen Mikroorganismus, der zur Bildung von 3-Methyl-7-alkylxanthin befähigt ist, oder eine Mutante davon in einem Nährmedium mit einem Gehalt an 1,3-Dimethyl-7-alkylxanthin unter Bildung und Anreicherung von 3-Methyl-7-alkylxanthin in der Kultur züchtet und das Produkt aus der Kultur gewinnt.
Ferner wird erfindungsgemäß ein DNA-Fragment mit einem Gehalt an einem Koffein-demethylase-Gen bereitgestellt, das es möglich macht, einen neuartigen Stamm von Pseudomonas putida bereitzustellen, der eine verstärkte Koffein-demethylase- Aktivität bei der katalytischen Demethylierung von Koffein in der 1-Stellung aufweist. Durch die Verwendung des neuartigen P. putida-Stammes wird es möglich, ein 3-Methyl-7- alkylxanthin aus dem entsprechenden 1,3-Dimethyl-7- alkylxanthin mit weiter verbessertem Wirkungsgrad herzustellen.
Sequenzlisten (1) Allgemeine Information
  • (i) Anmelder: Yoshinao, Koide, Seÿi, Nakane, Yutaka, Imai
  • (ii) Titel der Erfindung:
    Ein Koffein-demethylase-Gen enthaltendes DNA-Fragment und mikrobielles Verfahren zur Herstellung von 3-Methyl-7-alkylxanthin
  • (iii) Anzahl der Sequenzen: 2
  • (iv) Korrespondenzanschrift:
    (A) Adressat: SUGHRUE, MION, ZINN, MACPEAK & SEAS
    (B) Straße: 2100 Pennsylvania Avenue
    (C) Stadt: N.W.
    (D) Staat: Washington, D.C.
    (E) Land: V.St.A.
    (F) Postleitzahl: 20037-3202
  • (v) Computerlesbare Form:
    (A) Medium: Diskette
    (B) Computer: IBM PC, kompatibel
    (C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
    (D) Software: PatentIn Release 1.0, Version 1.25
  • (vi) Derzeitige Anmeldungsdaten:
    (A) Anmelde-Nr.:
    (B) Anmeldetag:
    (C) Klassifikation:
  • (vii) Daten der Voranmeldung:
    (A) Anmelde-Nr.: JP 4-154380
    (B) Anmeldedatum: 20.5.1992
  • (viii) Daten der Voranmeldung:
    (A) Anmelde-Nr.: JP-4-312954
    (B) Anmeldedatum: 27.10.1992
  • (ix) Telekommunikationsdaten:
    (A) Telefon: 202-293-7060
    (B) Telefax: 202-293-7860
    (C) Telex: 6491103

Claims (15)

1. Isoliertes und gereinigtes DNA-Fragment mit einem Gehalt an einem Koffein-demethylase-Gen, das aus einem Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas stammt.
2. DNA-Fragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Fragment durch die in Fig. 1 gezeigte Restriktionsendonucleasen-Spaltungskarte charakterisiert ist.
3. DNA-Fragment nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Basensequenz zwischen der AccI-Stelle und der NdeI- Stelle in der Restriktionsendonucleasen-Spaltungskarte von Fig. 1, die das Koffein-demethylase-Gen enthält, durch die Sequenz Nr. 1 wiedergegeben wird.
4. Isoliertes und gereinigtes DNA-Fragment mit einem Gehalt an einer Basensequenz, die für die durch die Sequenz Nr. 2 wiedergegebene Aminosäuresequenz codiert.
5. Rekombinante DNA, in deren Vektor ein DNA-Fragment mit einem Gehalt an einem Koffein-demethylase-Gen aus einem Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas integriert ist.
6. Transformante der Gattung Pseudomonas, umfassend einen Wirt, der mit einer rekombinanten DNA transformiert ist, in deren Vektor ein DNA-Fragment mit einem Gehalt an einem Koffein-demethylase-Gen aus einem Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas integriert ist.
7. Transformante der Gattung Pseudomonas nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich beim Wirt um Pseudomonas putida handelt.
8. Transformante der Gattung Pseudomonas nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich beim Wirt um Pseudomonas putida IF-3-9C-21 (FERM BP-3825) handelt.
9. Verfahren zur Herstellung von 3-Methyl-7-alkylxanthin der allgemeinen Formel (II): in der R einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man die Transformante nach Anspruch 6 in einem Nährmedium mit einem Gehalt an 1,3-Dimethyl-7-alkylxanthin der allgemeinen Formel (I) züchtet: in der R die vorstehende Bedeutung hat, um 3-Methyl-7- alkylxanthin in der Kultur zu bilden, und das gebildete 3-Methyl-7-alkylxanthin aus der Kultur gewinnt.
10. Verfahren zur Herstellung von 3-Methyl-7-alkylxanthin der allgemeinen Formel (II) in der R einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man 1,3-Dimethyl-7- alkylxanthin der allgemeinen Formel (I) in der R die vorstehende Bedeutung hat, mit einer Kultur einer Transformante nach Anspruch 6, mit mikrobiellen Zellen oder einem Behandlungsprodukt davon in Kontakt bringt, um 3-Methyl-7-alkylxanthin zu bilden, und das gebildete 3-Methyl-7-alkylxanthin aus dem Reaktionsgemisch gewinnt.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß R einen C1-C4-Alkylrest bedeutet.
12. Verfahren zur Bildung von 3-Methyl-7-propylxanthin der Formel (II) dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas oder eine Mutante davon, die zur Umwandlung von 1,3-Dimethyl-7-propylxanthin in 3-Methyl- 7-propylxanthin in einem Nährmedium mit einem Gehalt an 1,3-Dimethyl-7-propylxanthin der Formel (I) in der Lage ist um 3-Methyl-7-propylxanthin der Formel (II) in der Kultur zu bilden, und das gebildete 3-Methyl-7-propylxanthin der Formel (II) aus der Kultur gewinnt.
13. Verfahren zur Herstellung von 3-Methyl-7-propylxanthin der Formel (II) dadurch gekennzeichnet, daß man 1,3-Dimethyl-7- propylxanthin der Formel (I) mit einer Kultur eines Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas oder einer Mutante davon, die zur Umwandlung von 1,3-Dimethyl-7-propylxanthin in 3-Methyl-7-propylxanthin befähigt ist, mit mikrobiellen Zellen oder einem Behandlungsprodukt davon in Kontakt bringt, um 3- Methyl-7-propylxanthin der Formel (II) zu bilden, und das gebildete 3-Methyl-7-propylxanthin der Formel (II) aus dem Reaktionsgemisch gewinnt.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich beim Mikroorganismus um Pseudomonas putida handelt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich beim Mikroorganismus um Pseudomonas putida IF-3- 9C-21 (FERM BP-3825) handelt.
DE4316882A 1992-05-20 1993-05-19 Ein Koffein-demethylase-Gen enthaltende DNA-Fragment und mikrobielles Verfahren zur Herstellung von 3-Methyl-7-alkylxanthin Withdrawn DE4316882A1 (de)

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