JPH05317071A - 微生物を用いた３−メチル−７−アルキルキサンチンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】微生物を用いて１，３−ジメチル−７−アルキ
ルキサンチンから３−メチル−７−アルキルキサンチン
を効率的に生産する方法を提供する。 【構成】３−メチル−７−アルキルキサンチンを製造す
る能力を有している微生物又は該微生物を変異した変異
体を１，３−ジメチル−７−アルキルキサンチンを含む
栄養培地で培養して培養物中に３−メチル−７−アルキ
ルキサンチンを生成せしめ、これを採取することにより
医薬品の重要な中間体である３−メチル−７−アルキル
キサンチンを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、３−メチル−７−アル
キルキサンチンの製造法に関する。３−メチル−７−ア
ルキルキサンチンは医薬品の重要な中間体である。例え
ば３−メチル−７−プロピルキサンチンは１−（５−オ
キソヘキシル）−３−メチル−７−プロピルキサンチ
ン、別名プロペントフィリン（Propentofilline）合成
の重要な中間体である。

【０００２】

【従来の技術】プロペントフィリンは、脳血管障害治療
剤として有用な医薬品であり、該医薬品は、通常、３−
メチル−７−プロピルキサンチンに５−オキソヘキシル
基を導入する方法（特公昭52-33120）によって合成され
ている。

【０００３】この原料となる３−メチル−７−プロピル
キサンチンは種々の化学的合成法で合成されている。例
えば１，３−ジメチル−７−プロピルキサンチンをアル
カリ剤で処理し、４−メチルアミノ−５−メチルカルバ
モイル−１−プロピルイミダゾールとし、尿素を反応せ
しめ、Ｎ−メチル−Ｎ−（５−メチルカルバモイル−１
−プロピル−イミダゾール−４−イル）−尿素とし、次
いでこれを閉環して合成する方法（特開平1-180883)が
知られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
化学的合成法では工程が非常に煩雑であり、工業的には
必ずしも適した方法ではない等、多くの問題点があり、
より簡単な合成法の開発が望まれていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な事情に鑑み鋭意研究を重ね、１，３−ジメチル−７−
アルキルキサンチンから位置特異的に脱メチルする能力
を有する微生物を広く自然界に求めた。

【０００６】意外にも先に本発明者らが自然界から分離
したカフェイン資化能を有するシュードモナス属に属す
る菌株を、１，３−ジメチル−７−アルキルキサンチン
を含む栄養培地で培養すると培養物に３−メチル−７−
アルキルキサンチンが生産されることを見いだし、本発
明を完成した。

【０００７】本発明者らは土壌より分離したカフェイン
資化能を有する微生物を変異改良することにより、カフ
ェインを構成的に代謝する変異株を得、さらに変異改良
することにより生成したテオブロミンを７−メチルキサ
ンチンへと脱メチル化する能力を欠失した二重変異株を
得、特許出願（特願平3-112471）をしている。

【０００８】本二重変異株は自然界より分離した親株と
比較すると１，３−ジメチル−７−アルキルキサンチン
から３−メチル−７−アルキルキサンチンを製造する高
い能力を有している。

【０００９】即ち、本発明に従えば、１，３−ジメチル
−７−アルキルキサンチンを３−メチル−７−アルキル
キサンチンに変換せしめる能力を有している微生物又は
該微生物を変異した変異体を１，３−ジメチル−７−ア
ルキルキサンチンを含む栄養培地で培養して培養物中に
３−メチル−７−アルキルキサンチンを生成せしめ、こ
れを採取することからなる３−メチル−７−アルキルキ
サンチンの製造法が提供される。

【００１０】以下、本発明について詳しく説明する。本
発明に用いる微生物は一般式［Ｉ］

【００１１】

【化５】

【００１２】（式中、Ｒはメチル基を除く直鎖状または
分枝状のアルキル基である）で表される１，３−ジメチ
ル−７−アルキルキサンチンを一般式［ＩＩ］

【００１３】

【化６】

【００１４】（式中、Ｒはメチル基を除く直鎖状または
分枝状のアルキル基である）で表される３−メチル−７
−アルキルキサンチンに変換する能力を有する微生物で
あればよく、例えばシュードモナス属に属する微生物及
びこれら親株の変異株が挙げられる。

【００１５】具体例としては、土壌より分離した特願平
3-112471記載のシュードモナス・プチダIF-3（Pseudomo
nas putida IF-3）株、特公平4-12117記載のシュードモ
ナスsp.188-1（FERM P-7073）及びそれらの変異株があ
げられる。尚、特公平4-12117記載のシュードモナス s
p.188-1（FERM P-7073）は、その後の本発明者らがその
種を同定した結果、シュードモナス・セパシアであるこ
とが判明した。

【００１６】即ち、シュードモナス sp.188-1（FERM P-
7073）はオルニチンデカルボキシラーゼが陰性、リジン
デカルボキシラーゼが陽性、グルコン酸酸化酵素が陽
性、アシルアミダーゼが陽性、アルギニンデヒドロラー
ゼが陰性、41℃で生育することより、シュードモナス・
セパシア（Pseudomonas cepacia）と同定された。以
後、本発明においてはシュードモナス sp.188-1（FERM
P-7073）をシュードモナス・セパシアと言う。本発明に
は、好ましくはシュードモナス・プチダIF-3の変異株が
利用される。

【００１７】微生物の変異誘導は既知の方法によって行
うことができる。例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン（以下、「ＮＴＧ」という）を変
異誘起剤として使用する化学的手段によって行うことが
できる。

【００１８】２−アミノプリン、５−ブロムウラシル、
エチルメタンスルホネート、ジメチルサルフェート、ア
クリフラビン、アクリジンオレンジ、ヒドラジン、４−
ニトロキノリン−Ｎ−オキシド、塩化マンガン等も変異
誘起剤として使用できる。さらに紫外線照射、Ｘ線、γ
線等の放射線照射を使用する物理的方法によっても行う
ことができる。

【００１９】変異株の分離方法についても公知の手法が
適用できる。つまり、変異処理した菌株を培養し、形成
されたコロニーについて変異の有無を検討する直接的な
方法、或いはこの方法を改良したレプリカ法、ペニシリ
ン等の抗生物質を使用する濃縮法、特殊な基質を用いる
自殺基質処理法ならびにこれらを適宜に組み合わせた方
法などが適用できる。

【００２０】本発明においては、以下のようにして行っ
た。即ち、バクトトリプトン1.0％、バクトイーストエ
キストラクト0.5％、塩化ナトリウム0.5％、カフェイン
2.0％を含む寒天培地に生育する、カフェイン耐性株約1
00株を土壌より分離し、該菌株をカフェイン0.3％、硫
酸アンモニウム0.3％、リン酸二カリウム0.5％、塩化ナ
トリウム0.1％、硫酸マグネシウム0.2％を含む寒天培地
（pH7.0）に接種し、30℃で３日間培養し、生育の良好
な菌株を得た。

【００２１】本菌株の菌学的性質は次の通りである。（ａ）形態的性質 （１）グラム染色：陰性 （２）細胞の形及び大きさ：約 0.8×２〜３μmの桿菌 （３）運動性の有無：有 （４）鞭毛：＞１ （５）胞子の形成：無

【００２２】（ｂ）生理学的性質 （１）Ｏ−Ｆテスト（Hugh-Leifson法）：好気的に酸を
生成する （２）溶血性：陽性 （３）酸素に対する態度：好気性 （４）糖類から酸の生成の有無： Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−キシロース ＋ マンニトール − 乳糖 − ショ糖 − Ｄ−マルトース − Ｄ−フラクトース − Ｌ−アラビノース ＋ ラフィノース − イヌリン − サルシン − セファロース − Ｄ−ソルビトール − Ｄ−ガラクトース ＋ グリセロール − （５）カタラーゼ試験：陽性 （６）オキシダーゼ試験：陽性 （７）マッコンキー培地での生育：生育する （８）ＳＳ寒天培地での生育：生育する （９）ＤＢＨの加水分解：なし （10）ＰＨＢの蓄積：なし （11）クエン酸の利用：あり （12）尿素の分解：なし （13）硝酸塩の還元：あり （14）硝酸塩のガス生成：なし （15）耐熱性（60℃、30分）：なし （16）生育温度：５℃ 生育する 25℃ 生育する 37℃ 生育する 42℃ 生育しない （17）ゼラチンの分解性：なし （18）リトマスミルクにおける反応：陽性 （19）デンプンの加水分解：なし （20）カゼイン加水分解：なし （21）レクチナーゼ反応：陰性 （22）リジンの脱炭酸反応：陰性 （23）アルギニン・ジヒドロラーゼ：陽性 （24）オルニチンの脱炭酸反応：陰性 （25）エスクリンの加水分解：なし （26）NaCl耐性：０％ 耐性あり ４％ 耐性あり ６％ 耐性なし ７％ 耐性なし （27）アシルアミダーゼ：陰性 （28）グルコン酸の酸化：なし （29）ＤＮＡａｓｅ：陰性 （30）色素の生成：キングＡ培地 なし キングＢ培地 あり （31）ＴＷ−８０の分解性：なし （32）ＮＡＣ培地での生育：陽性 （33）寒天加水分解：なし （34）ショ糖からのレバンの形成：なし （35）フェニールアラニン脱アミノ反応：陰性 （36）メチレンブルーミルクでの生育： メチレンブルーの減少 陽性 メチレンブルーの凝固 陰性 メチレンブルーでのペプトン化 陰性 （37）ＴＳＩから酸：陰性／陰性 （38）ＴＳＩ培地での硫化水素の生成：なし （39）馬尿酸ナトリウムの加水分解：あり （40）ＭＲテスト：陰性 （41）ＶＰテスト：陰性

【００２３】上記の菌学的性質は、Manual of the Iden
tification of Medical Bacteria（ＭＩＭＢ）、微生物
同定法（衛生技術会）及び微生物の分類と同定（下巻）
（学会出版センター）に基づいて検討した。

【００２４】以上の諸菌学的性質からGuide to Presump
tive Identification、Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology の記載に基づいて検討したところ、鞭毛
の本数、42℃での生育、ゼラチン及びＴＷ−８０の分解
性、トレハロース及びマンニットよりの酸の産生などの
結果から本菌株はシュードモナス・プチダと同定し、本
菌株シュードモナス・プチダIF-3と命名した。

【００２５】本菌は工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研条寄第3824号（FERM BP-3824）として寄託されて
いる。

【００２６】更に本発明者らは、シュードモナス・プチ
ダIF-3株を親株として変異処理して、カフェインをテオ
ブロミンに構成的に変換するが、テオブロミンから７−
メチルキサンチンへの変換を行わない性質を有している
変異株シュードモナス・プチダIF-3-9C-21株を構築・分
離した。

【００２７】本菌は工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研条寄第3825号（FERM BP-3825）として寄託されて
いる。

【００２８】本発明に使用する菌株を培養する栄養培地
としては前記微生物が培養により増殖し得るものであれ
ば任意のもので良い。例えば１，３−ジメチル−７−ア
ルキルキサンチンのほかに他の炭素源を加えることがで
き、さらに窒素源、無機塩類および変異株が必要とする
場合には他の栄養物質、補助的成分（pH調製剤、乳化
剤、消泡剤など）等通常の成分を含有した天然培地又は
合成培地のいずれも使用できる。例えば他の炭素源とし
ては、グルコース、キシロース、アラビノースなどの糖
類、グリセロール、ソルビトールなどの糖アルコール、
クエン酸、フマル酸などの有機酸が用いられる。窒素源
としては、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素源、
肉エキス、酵母エキス、トリプトン、カルチベータなど
の有機窒素源が用いられる。また無機塩類としてはリン
酸カリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナ
トリウム、リン酸ナトリウム、硫酸第一鉄などが用いら
れる。

【００２９】培地中の１，３−ジメチル−７−アルキル
キサンチン濃度は特に限定はないが、目的とする３−メ
チル−７−アルキルキサンチンの収量、培養条件及び経
済的視点から判断して規定される。例えば0.1〜10％、
好ましくは0.5〜5.0％である。培養条件としては温度10
〜40℃、pH約4.5〜9.0、より好ましくは温度20〜30℃、
pH6.5〜7.5において培養し、培養開始後５〜72時間培養
するのが望ましい。グルコース、キシロースなどの炭素
源及び肉エキス、酵母エキス、グルタミン酸ナトリウム
などの窒素源を含む培地を連続的に加えていくと同時に
培地中の１，３−ジメチル−７−アルキルキサンチン濃
度をコントロールすることにより１，３−ジメチル−７
−アルキルキサンチンから３−メチル−７−アルキルキ
サンチンへの変換反応を継続させる。添加する１，３−
ジメチル−７−アルキルキサンチンは固体のままでも、
水に溶解して使用してもよい。さらに必要であれば、培
養液中に３−メチル−７−アルキルキサンチンがより蓄
積するような反応促進物質を添加することもできる。反
応促進物質としては用いる菌株によって異なるが、例え
ば、モノメチルキサンチン、金属イオン（例えばニッケ
ルイオン、亜鉛イオン）、カフェイン、テオブロミン等
が挙げられる。

【００３０】本発明法には上記の培養法によって得られ
た培養物そのもの、もしくは菌体又は培養ろ液、菌体の
破砕物、凍結乾燥菌体、菌体のエタノール、トルエン、
エーテルなどの溶剤による処理物、菌体の固定化処理物
のいずれも使用可能である。上記培養物などと１，３−
ジメチル−７−アルキルキサンチンを水性媒体中で接触
作用せしめることにより３−メチル−７−アルキルキサ
ンチンに転換される。

【００３１】１，３−ジメチル−７−アルキルキサンチ
ンは固体のまま添加してもよく、また水に溶解して使用
してもよい。反応液中での１，３−ジメチル−７−アル
キルキサンチンの濃度は、１，３−ジメチル−７−アル
キルキサンチンの溶解度を越えて懸濁状態で存在しても
よい。培養物などと１，３−ジメチル−７−アルキルキ
サンチンの接触は回分方式でもよく、またカラムを使用
した連続方式も可能である。

【００３２】このような培地成分及び１，３−ジメチル
−７−アルキルキサンチンを上記条件下において５〜80
時間通気攪拌を行って、好気的条件下にて変換反応を続
ける。生成した培地中の３−メチル−７−アルキルキサ
ンチンは通常の方法により回収することができる。即
ち、培養液を必要ならば、遠心分離し、アルカリ処理
し、有機溶媒で不純物を除き、ｐＨを調整することによ
り、沈殿として得られる。

【００３３】以下、本発明を参考例、実施例に基づいて
詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものでは
ない。参考例１ １，３−ジメチル−７−プロピルキサンチン
の合成 テオフィリン（片山化学工業製）600ｇを水酸化カリウ
ム水溶液（263.4g→1800ml）に溶解後、減圧乾固して対
応するカリウム塩を調製した。この塩をジメチルホルム
アミド3600mlに懸濁し、臭化プロピル436.5mlを加え、9
0℃にて８時間、加熱攪拌した。ジメチルホルムアミド
を減圧溜去して得られた残渣にジクロロメタン1800mlを
加え、１Ｎの水酸化カリウム水溶液300mlで３回、水300
mlで１回洗浄後、無水硫酸マグネシウム54gで乾燥し
た。乾燥剤を濾去後、母液を減圧乾燥し、更に真空乾燥
（85℃、５時間）に付して１，３−ジメチル−７−プロ
ピルキサンチン657g（収率：88.8%）を得た。

【００３４】参考例２ シュードモナス・プチダIF-3-9
C-21の構築 シュードモナス・プチダIF-3株をＴＹ培地（ディフコ社
製、バクトトリプトン1.0％、バクトイーストエキスト
ラクト0.5％）で対数増殖期まで培養した後、遠心分離
により集菌、洗浄を行った後、５mlの50mMトリス−マレ
イト緩衝液（pH6.0）に懸濁した。

【００３５】この菌体懸濁液にＮＴＧを100μg／mlにな
るように加えた後、30℃で30分間放置した。ＮＴＧ処理
後、0.9％塩化ナトリウムで２回洗浄した後、ＴＹ培地
に懸濁し、30℃で一夜振盪培養を行った。遠心分離によ
り集菌しさらに0.9％塩化ナトリウムにて２回洗浄した
後、５mlのカフェイン最少培地（硫酸アンモニウム0.3
％、リン酸二カリウム0.5％、塩化ナトリウム0.1％、硫
酸マグネシウム・７水塩0.2％、カフェイン0.1％、pH7.
0）にて30℃、６時間培養した後、カフェイン最少寒天
培地（硫酸アンモニウム0.3％、リン酸二カリウム0.5
％、塩化ナトリウム0.1％、硫酸マグネシウム・７水塩
0.2％、カフェイン0.1％、寒天1.5％、pH7.0）に希釈し
てまき、30℃、２日間培養後、生育の良好な菌株を選択
した。

【００３６】得られた変異菌株をＬＫＣ培地（バクトト
リプトン1.0％、バクトイーストエキストラクト0.5％、
塩化ナトリウム0.5％、リン酸二カリウム0.5％、カフェ
イン0.1％、pH7.0）に接種し、30℃、８時間培養した
後、培地中のカフェイン濃度を測定し、親株に比較して
カフェインの減少が多いと認められた株をカフェイン資
化の構成変異株9C株として分離した。

【００３７】さらに、9C株を前記の方法と同様にＮＴＧ
処理を行い、洗浄菌体を得た後、テオブロミン最少培地
（テオブロミン0.3％、無機塩はカフェイン最少培地と
同一）にカルベニシリン（300μg／ml）を加えて30℃で
一夜振盪培養後、0.9％NaClにて２回洗浄した後、ＬＴ
寒天培地（バクトトリプトン1.0％、バクトイーストエ
キストラクト0.5％、テオブロミン0.3％、寒天1.5％、p
H6.8）に希釈してまき、30℃で２日間培養してコロニー
を形成させ、コロニーの周辺のテオブロミンを分解しな
い株を25株得た。

【００３８】得られた菌株のカフェイン、テオブロミ
ン、７−メチルキサンチンの資化能を調べ、７−メチル
キサンチンのみを資化するシュードモナス・プチダIF-3
-9C-21株を分離した。シュードモナス・プチダIF-3-9C-
21株はカフェイン資化に対して構成的であると同時にテ
オブロミンから７−メチルキサンチンへの変換が行われ
ない二重変異体である。

【００３９】

【実施例】

実施例１ 参考例１に示した合成法で得られた１，３−ジメチル−
７−プロピルキサンチン1.0％、バクトトリプトン1.0
％、バクトイーストエキストラクト0.5％、リン酸二カ
リウム1.0％からなる組成の培地（pH6.7）75mlの入った
500ml容の坂口フラスコにシュードモナス・プチダIF-3-
9C-21（FERM BP-3825）を接種し、30℃で前培養を一夜
行った後、坂口フラスコ（75ml／フラスコ）前記培地に
１％接種した。培養条件は下記に示す。 培養温度： 30℃ 攪拌条件： 120 rpm 培養時間： 18時間

【００４０】得られた培養液1700mlを遠心分離（10,000
rpm、15分）し、遠心上澄に塩酸を加えてpH6.0に調製
し、減圧濃縮し５℃で１夜放置した。晶出した結晶を45
0mlの精製水に懸濁し、水酸化カリウム25.2gを添加し、
ジクロロメタン約600mlを加え、水層約400mlを採取し
た。塩酸を加えて結晶を晶出させ、遠心分離（12,000rp
m、15分）して沈殿を得た。沈殿に水約100mlを加えて懸
濁し、更に遠心分離により上澄部を除き、エタノール約
80mlを加えた後、50℃で減圧乾燥し、標品（1.18g）を
得た。

【００４１】得られた標品の一部を用い、以下のように
してその構造を決定した。 (a) 標品のエチル化体の調製 標品0.2gを１Ｎの水酸化カリウム水溶液1.7mlに溶解
後、減圧乾固した。これにジメチルホルムアミド1.5ml
を加え、懸濁攪拌下、臭化エチル0.22mlを加えた後、90
℃にて、５時間加熱攪拌した。

【００４２】ジメチルホルムアミドを減圧下で溜去し、
その残渣をジクロロメタン30mlに溶解し、１Ｎの水酸化
カリウム水溶液20mlにて２回、水20mlにて１回洗浄し、
無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ジクロロメタンを減圧
乾固、真空乾燥して、標品のエチル化体0.2g（収率：8
8.1％）を得た。

【００４３】(b) １−エチル−３，７−ジメチルキサン
チンの調製 テオブロミン（天野製薬製）0.9gを１Ｎの水酸化カリウ
ム水溶液7.5mlに溶解後、減圧乾固した。これにジメチ
ルホルムアミド6mlを加え、懸濁攪拌下、臭化エチル0.6
mlを加えた後、90℃にて、８時間加熱攪拌した。

【００４４】ジメチルホルムアミドを減圧下で溜去し、
その残渣をジクロロメタン50mlに溶解し、１Ｎの水酸化
カリウム水溶液30mlにて２回、水30mlにて１回洗浄し、
無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ジクロロメタンを減圧
乾固、真空乾燥して、１−エチル−３，７−ジメチルキ
サンチン0.86（収率：83％）を得た。

【００４５】(a)で得られた標品のエチル化体（とす
る）のＮの置換基の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルをカフェイ
ン（１，３，７−トリメチルキサンチン）（とす
る）、(b)で得られた１−エチル−３，７−ジメチルキ
サンチン（とする）及び参考例で得られた１，３−ジ
メチル−７−プロピルキサンチン（とする）のＮの置
換基の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルと比較することにより行
った。

【００４６】即ち、のＮ−メチル基の¹³Ｃ−ＮＭ
Ｒスペクトルを比較することにより、それぞれ１，３，
７位のＮ−メチル基（それぞれＮ₁−メチル、Ｎ₃−メチ
ル、Ｎ₇−メチルと略す）の化学シフト（ppm）が決定で
きる。 Ｎ₁−メチル：27.72 ppm Ｎ₃−メチル：29.37-29.54 ppm Ｎ₇−メチル：33.35-33.40 ppm

【００４７】次に、のＮ₁及びＮ₃のメチル基の化学シ
フト（Ｎ₁−メチル基：27.72 ppm、Ｎ₃−メチル基：2
9.48 ppm）とのＮ−メチル基の化学シフト（29.43
ppm）を比較することにより、標品の化合物はから微
生物変換によりＮ₁−メチル基が脱離した３−メチル−
７−プロピルキサンチンであることが判明した。その化
学シフトの測定結果を表１に示す。

【００４８】

【表１】

【００４９】¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルの測定条件は以下
の通りである。各試料（を70mg、〜をそれぞれ10
0mg）をCDCl₃ 0.5mlに溶解し、JNM-FX60Q（日本電子
製）を使用し、CDCl₃の化学シフト77.1ppmを基準に各シ
フトを決定した。

【００５０】実施例２ 実施例１と同様にしてシュードモナス・セパシア（FERM
P-7073）を実施例１記載の培地に0.01％の７−メチル
キサンチン或いは0.1％のテオブロミンを添加した培地
に接種し、30℃で前培養を一夜行った後、坂口フラスコ
（75ml／フラスコ）前記培地に１％接種した。培養条件
は下記に示す。 培養温度： 30℃ 攪拌条件： 300 rpm 培養時間： 7.5時間

【００５１】得られた培養液について高速液体クロマト
グラフィー（東ソー製）で分析した。実施例１で得られ
た３−メチル−７−プロピルキサンチン（標品）と同一
のリテンションタイムを有するピークが確認された。即
ち、培養液中に３−メチル−７−プロピルキサンチンの
生成が確認された。

【００５２】ＨＰＬＣの条件は17％アセトニトリル、0.
1％トリフルオロ酢酸含有水溶液を移動相とし、流速１m
l/分で、カラムはODS-80TM（東ソー製）を用いた。

【００５３】実施例３ 実施例２と同様にしてシュードモナス・プチダIF-3（FE
RM BP-3824）を接種し、30℃で前培養を一夜行った後、
坂口フラスコ（75ml／フラスコ）前記培地に１％接種し
た。培養条件は下記に示す。 培養温度： 30℃ 攪拌条件： 200 rpm 培養時間： 12.5時間

【００５４】得られた培養液を用いて実施例２と同様に
してＨＰＬＣで分析し、３−メチル−７−プロピルキサ
ンチンの生成を確認した。

【００５５】実施例４ 実施例１記載の培地から１，３−ジメチル−７−プロピ
ルキサンチンを除いた培地を用い、シュードモナス・プ
チダIF-3-9C-21（FERM BP-3825）を同様にして培養して
培養液を得た。該培養液に１，３−ジメチル−７−プロ
ピルキサンチンを添加混合し、実施例２と同様にしてＨ
ＰＬＣで分析したところ、３−メチル−７−プロピルキ
サンチンの生成が確認された。

【００５６】

【発明の効果】本発明により、３−メチル−７−アルキ
ルキサンチンを製造する能力を有している微生物又は該
微生物を変異した変異体を１，３−ジメチル−７−アル
キルキサンチンを含む栄養培地で培養して培養物中に３
−メチル−７−アルキルキサンチンを生成せしめ、これ
を採取することにより医薬品の重要な中間体である３−
メチル−７−アルキルキサンチンを効率良く、安易に製
造することができる。

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【手続補正書】

【提出日】平成５年５月１０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１５】具体例としては、土壌より分離した特願平
３−１１２４７１記載のシュードモナス・プチダＩＦ−
３（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＩＦ−
３）株、特公平４−１２１１７記載のシュードモナスｓ
ｐ．１８８−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４２８２）及びそれ
らの変異株があげられる。尚、特公平４−１２１１７記
載のシュードモナスｓｐ．１８８−１（ＦＥＲＭＢＰ−
４２８２）は、その後の本発明者らがその種を同定した
結果、シュードモナス・セパシアであることが判明し
た。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１６】即ち、シュードモナスｓｐ．１８８−１
（ＦＥＲＭ ＢＰ−４２８２）はオルニチンデカルボキ
シラーゼが陰性、リジンデカルボキシラーゼが陽性、グ
ルコン酸酸化酵素が陽性、アシルアミダーゼが陽性、ア
ルギニンデヒドロラーゼが陰性４１℃で生育することよ
り、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ｃｅｐａｃｉａ）と同定された。以後、本発明にお
いてはシュードモナスｓｐ．１８８−１（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４２８２）をシュードモナス・セパシアと言う。本
発明には、好ましくはシュードモナス・プチダＩＦ−３
の変異株が利用される。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１９】変異株の分離方法についても公知の手法が
適用できる。つまり、変異処理した菌株を培養し、形成
されたコロニーについて変異の有無を検討する直接的な
方法、或いはこの方法を改良したレプリカ法、ペニシリ
ン等の抗生物質を使用する濃縮法ならびにこれらを適宜
に組み合わせた方法などが適用できる。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３５】この菌体懸濁液にＮＲＧを１００μｇ／ｍ
ｌになるように加えた後、３０℃で３０分間放置した。
ＮＴＧ処理後、０．９％塩化ナトリウム溶液で２回洗浄
した後、ＴＹ培地に懸濁し、３０℃で一夜振盪培養を行
った。遠心分離により集菌しさらに０．９％塩化ナトリ
ウムにて２回洗浄した後、５ｍｌのカフェイン最少培地
（硫酸アンモニウム０．３％、リン酸二カリウム０．５
％、塩化ナトリウム０．１％、硫酸マグネシウム・７水
塩０．２％、カフェイン０．１％、ｐＨ７．０）にて３
０℃、６時間培養した後、カフェイン最少寒天培地（硫
酸アンモニウム０．３％、リン酸二カリウム０．５％、
塩化ナトリウム０．１％、硫酸マグネシウム・７水塩
０．２％、カフェイン０．１％、寒天１．５％、ｐＨ
７．０）に希釈してまき、３０℃、２日間培養後、生育
の良好な菌株を選択した。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３６】得られた変異菌株をＬＫＣ培地（バクトト
リプトン１．０％、バクトイーストエキストラクト０．
５％、塩化ナトリウム０．５％、リン酸二カリウム０．
５％、カフェイン０．１％、ｐＨ７．０）に接種し、３
０℃、８時間培養した後、培地中のカフェイン濃度を測
定し、親株に比較してカフェインの減少が多いと認めら
れた株をカフェイン資化の構成変異株ＩＦ−３−９Ｃ株
として分離した。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３７】さらに、ＩＦ−３−９Ｃ株を前記の方法と
同様にＮＴＧ処理を行い、洗浄菌体を得た後、テオブロ
ミン最少培地（テオブロミン０．３％、無機塩はカフェ
イン最少培地と同一）にカルベニシリン（３００μｇ／
ｍｌ）を加えて３０℃で一夜振盪培養後、０．９％Ｎａ
Ｃｌ溶液にて２回洗浄した後、ＬＴ寒天培地（バクトト
リプトン１．０％、バクトイーストエキストラクト０．
５％、テオブロミン０．３％、寒天１．５％、ｐＨ６．
８）に希釈してまき、３０℃で２日間培養してコロニー
を形成させ、コロニーの周辺のテオプロミンを分解しな
い株を２５株得た。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５０】実施例２ 実施例１と同様にしてシュードモナス・セパシア（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−４２８２）を実施例１記載の培地に０．０
１％の７−メチルキサンチン或いは０．１％のテオブロ
ミンを添加した培地に接種し、３０℃で前培養を一夜行
った後、坂口フラスコ（７５ｍｌ／フラスコ）前記培地
に１％接種した。培養条件は下記に示す。 培養温度： ３０℃ 攪拌条件： １２０ｒｐｍ 培養時間： １８時間

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５３】実施例３ 実施例２と同様にしてシュードモナス・プチダＩＦ−３
（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８２４）を接種し、３０℃で前培
養を一夜行った後、坂口フラスコ（７５ｍｌ／フラス
コ）前記培地に１％接種した。培養条件は下記に示す。 培養温度： ３０℃ 攪拌条件： １２０ｒｐｍ 培養時間： １８時間

【旧寄託機関の名称】 工業技術院微生物工業技術研究所

【旧寄託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−７０７３

【新寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技術研究所

【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−４２８２

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】微生物を下記一般式［Ｉ］ 【化１】 （式中、Ｒはメチル基を除く直鎖状または分枝状のアル
   キル基である）で表される化合物を含む栄養培地で培養
   して培養物中に下記一般式［ＩＩ］ 【化２】 （式中、Ｒはメチル基を除く直鎖状または分枝状のアル
   キル基である）で表される化合物を生成せしめることを
   特徴とする３−メチル−７−アルキルキサンチンの製造
   法。
2. 【請求項２】微生物の培養物、菌体、若しくはこれらの
   処理物を下記一般式［Ｉ］ 【化３】 （式中、Ｒはメチル基を除く直鎖状または分枝状のアル
   キル基である）で表される化合物に接触作用せしめ、下
   記一般式［ＩＩ］ 【化４】 （式中、Ｒはメチル基を除く直鎖状または分枝状のアル
   キル基である）で表される化合物を生成せしめることを
   特徴とする３−メチル−７−アルキルキサンチンの製造
   法。