ES2280325T3 - Conjunto de genes del citocromo p-450 de rhodococcus ruber y uso del mismo en la escision de combustible de tipo eter. - Google Patents
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Abstract
Un ácido nucleico aislado que hibrida específicamente en condiciones restrictivas con la ID SEC Nº 2.
Description
Conjunto de genes de citocromo
P-450 de Rhodococcus ruber y uso del mismo en
la escisión de combustible de tipo éter.
La presente invención se dirige a un conjunto de
genes del citocromo P450 implicados en la escisión de aditivos del
combustible de tipo éter. Más en especial, la presente invención se
refiere a la secuencia de ácido nucleico de los genes responsables
de la biodegradación del etil-terc-butil-éter (ETBE) en
Rhodococcus ruber, y a varias aplicaciones que resultan del
conocimiento de esta secuencia, tales como sondas y biosensores
para detectar la contaminación por un combustible de tipo éter, y
para evaluar el potencial de un suelo o efluente contaminado para
escindir dicho combustible de tipo éter. La invención también se
refiere a procedimientos para que una célula sea capaz de escindir
aditivos de combustibles de tipo éter, y a bacterias útiles para la
descontaminación del combustible de tipo éter de un suelo o efluente
contaminado.
El metil-terc-butil-éter (MTBE) y el
etil-terc-butil-éter (ETBE) se usan como aditivos en la
gasolina sin plomo. Estos éteres inicialmente se usaron para
potenciar el número de octanos de la gasolina. El número de octanos,
también llamado grado antidetonante, mide la capacidad de un
combustible para resistir la detonación cuando se prende en una
mezcla con aire en el cilindro de un motor de combustión interna.
El número de octanos se determina comparando, en condiciones
normales, la intensidad de la detonación del combustible con la de
mezclas de dos combustibles de referencia: el isooctano, que
resiste la detonación, y el heptano que detona fácilmente. El
número de octanos es el porcentaje en volumen de isooctano en la
mezcla de isooctano/heptano que se corresponde con el combustible
ensayado en un motor de ensayo convencional.
Ahora, el MTBE y ETBE también se usan como
oxigenadores, para aumentar el contenido de oxígeno de la gasolina,
con el fin de mejorar la eficacia de la combustión, reduciendo así
las emisiones de hidrocarburos no quemados a la atmósfera.
Típicamente, se pueden usar concentraciones de
hasta 15% (v/v) de MTBE en la gasolina oxigenada, haciendo que el
MTBE sea uno de los productos químicos orgánicos principales
producido en Estados Unidos. El ETBE se usa en algunos países
europeos y su interés radica en su potencial para aumentar el
mercado del etanol, puesto que el ETBE se fabrica a partir de
etanol e isobuteno. El ETBE también tiene una superioridad técnica
comparado con el MTBE, en términos de menos presión de vapor y mayor
número de octanos.
El amplio uso de éteres en la gasolina ha dado
como resultado su introducción en el agua subterránea por los
depósitos con fugas y los vertidos, exponiendo a la gente a bajos
niveles de éteres en el agua para beber. Comparado con otros
compuestos de la gasolina, los éteres son relativamente no tóxicos.
Sin embargo, la carcinogenicidad de estos compuestos todavía es
incierta. Además, su sabor y olor desagradables en concentraciones
muy bajas hace que el agua no sea adecuada para beber, convirtiendo
a estos compuestos xenobióticos en contaminantes importantes.
Para desarrollar biorremediaciones para estos
compuestos, se han llevado a cabo estudios de biodegradabilidad del
MTBE y ETBE. Se han aislado bacterias capaces de usar el MTBE como
única fuente de carbono y energía (16, 27). Hasta ahora no se ha
elucidado el mecanismo enzimático que usan estas bacterias para
degradar el MTBE. Algunos microorganismos que no pueden usar el
MTBE como única fuente de carbono y energía pueden degradar el MTBE
durante o después de crecimiento en un sustrato inductor. Usando
pentano como fuente de carbono y energía, se ha mostrado que
Pseudomonas aeruginosa degrada el MTBE (14). El hongo
filamentoso Graphium sp. y Pseudomonas putida
degradan el MTBE después de crecimiento en n-butano
y alcanfor, respectivamente (17,35). Se mostró que las bacterias
que oxidan propano, incluyendo Mycobacterium vaccae JOBS,
degradan el MTBE y ETBE después de crecer en propano (35). El MTBE y
ETBE se oxidaban a alcohol terc-butílico (TBA) que después
se oxidaba a productos que no eran eficaces para el crecimiento de
los oxidadores de propano. La oxidación tanto de MTBE como de TBA
implican un citocromo P-450 soluble que es probable
que corresponda a la propano monooxigenasa (PMO).
Fayolle y col. aislaron por primera vez dos
cepas de bacterias capaces de usar el ETBE como única fuente de
carbono y energía (11). Identificaron estas dos cepas como
actinomicetos Gordonia terrae y Rhodococcus equi, pero
estudios posteriores basados en el análisis de las secuencias de ARN
de 16S, mostraron que estas cepas eran Rhodococcus ruber y
Rhodococcus zopfii, respectivamente. Ambas cepas convierten
ETBA en TBA de forma estequiométrica, que acumulan en el medio de
cultivo. R. ruber no puede usar METBE o
terc-amil-metil-éter (TAME) como única fuente
de carbono y energía, pero puede degradar el MTBE o TAME en TBA o
alcohol terc-amílico (TAA), respectivamente, después de
crecimiento en ETBE (18). El mismo sistema enzimático explica la
degradación de MTBE, TAME, ETBE y es de suponer que otros
combustibles de tipo éter, como se muestra en el Ejemplo 9. Se
consume un mol de oxígeno por mol de ETBE degradado, lo cual sugiere
que la escisión del enlace éter se produce por hidroxilación por
una monooxigenasa, dando un hemiacetal intermedio que dismuta
espontáneamente en TBA y acetaldehído. El candidato de monooxigenasa
más probable es un citocromo P-450 inducible, que
se detectó como un pico a 447 nm en el espectro diferencial de
monóxido de carbono de extractos brutos reducidos de R.
ruber cultivado en ETBE (18).
La invención proporciona medios para la escisión
del combustible de tipo éter por un procedimiento oxidativo,
proporcionando por lo tanto medios para degradar los componentes de
la gasolina que producen problemas cuando se vierten en el entorno
debido a su alta solubilidad en agua o a sus poca
biodegradabilidad. Resulta de la caracterización genómica de R.
ruber de tipo natural y de mutantes espontáneos de R.
ruber que no pueden usar ETBE como única fuente de carbono y
energía. Se ha mostrado que la pérdida de capacidad de degradar
aditivos de combustible de tipo éter tales como ETBE resulta de una
deleción cromosómica secundaria de una recombinación entre
repeticiones directas. La deleción conduce a la eliminación de un
operón (en lo sucesivo denominado conjunto de genes eth) que
codifica un sistema citocromo P-450, cuya expresión
era inducida por el ETBE, lo que demuestra su función esencial en
la escisión de los combustibles de tipo éter por R.
ruber.
El análisis de los genomas de R. ruber de
tipo natural y mutantes espontáneos, realizado como se describe en
la sección experimental, muestra una organización en la que el
mutante espontáneo resulta de una recombinación homóloga entre dos
repeticiones directas idénticas de la misma secuencia, que es un
transposón de clase II. Esta recombinación homóloga da como
resultado la deleción de secuencias comprendidas entre el extremo 5'
del primer transposón y el extremo 5' del segundo transposón.
Se ha mostrado que este fragmento contiene el
conjunto de genes eth, y el mutante no puede escindir los
combustibles de tipo éter. Este fenómeno aparece claramente en la
figura 4, en la que el mapa de restricción de la región genómica en
la que se produce esta deleción se compara con el de la misma
región de la cepa de tipo natural.
La Figura 4A representa el mapa de restricción
de un fragmento BamHI de 23,7 kpb de ID SEC Nº: 1, que
comprende una región duplicada de 5,6 kpb (recuadros sombreadas, ID
SEC Nº: 4) que flanquea una región de 8,7 kpb (ID SEC Nº: 3) que
incluye el conjunto de genes eth. La Figura 4B representa el
mismo fragmento BamHI, después de la deleción de 14,3 kpb de
ID SEC Nº: 2, por reorganización cromosómica entre las dos regiones
duplicadas.
Además, el conjunto de genes eth está
presente y se expresa más probablemente en Rhodococcus equi
(ahora identificado como Rhodococcus zopfii), que es otra
cepa bacteriana que puede degradar el ETBE (11). Realmente, los
autores de la invención han mostrado que el gen ethB presente
en R. zopfii presenta más de 98% de identidad con el de
R. ruber (previamente identificado como G. terrae)
(Ejemplo 10). Las sondas derivadas del gen ethB de R.
ruber hibridan con los fragmentos de restricción del genoma de
R. zopfii que tienen el mismo tamaño que los del ADN de R.
ruber.
Otras bacterias que degradan el ETBE tienen
sistemas de citocromos P-450 muy similares a los de
R. ruber, como se muestra en los Ejemplos 9 y 10.
Los autores de la invención también han mostrado
(Ejemplo 12) que el mutante de R. ruber que carece del
conjunto de genes eth puede recuperar la capacidad de usar
el ETBE como una fuente de carbono después de transformarlo con un
plásmido que comprende el conjunto de genes eth.
Estos resultados añadidos a los obtenidos con
R. ruber y detallados en la parte experimental, demuestran
que los productos del conjunto de genes eth están
implicados, de forma individual o colectiva, en la escisión de los
combustibles de tipo éter.
Por lo tanto, la invención se refiere a
secuencias de ácido nucleico aisladas que hibridan con las
secuencias de ADN de los genes responsables de la degradación del
ETBE en una cepa inicialmente identificada como Gordonia
terrae (11), y ahora identificada como Rhodococcus ruber
basándose en el análisis de secuencia de ARN de 16S. Esta cepa se
depositó en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos
(CNCM) con la referencia 1-1889. Esta invención
también se refiere a vectores que comprenden al menos una de estas
secuencias de ácido nucleico, y a bacterias recombinantes que
contienen al menos uno de estos vectores. La invención también se
refiere a sondas y cebadores específicos para el conjunto de genes
eth, a procedimientos y biosensores para identificar la
presencia en una muestra de un microorganismo que comprende este
conjunto de genes y, si es necesario, para aislar dichos
microorganismos. La presente invención también se refiere a
biosensores para detectar una contaminación por ETBE u otros
aditivos de combustibles de tipo éter, así como a procedimiento para
descontaminar un efluente, un suelo o un lodo contaminado con un
combustible de tipo éter, mediante el uso de un microorganismo,
recombinante o no, que presenta las propiedades del conjunto de
genes eth.
A lo largo de esta solicitud se usan varias
palabras y expresiones, cuyos significados se deben entender de
acuerdo con las siguientes definiciones:
La frase "aditivo de combustible de tipo
éter" indica un compuesto que comprende una función éter y que
se usa en la gasolina para mejorar la eficacia de la combustión y/o
para potenciar el número de octanos de dicha gasolina. Los aditivos
de combustible de tipo éter más usados normalmente son el
metil-terc-butil-éter (MTBE) ampliamente usado en EE.UU., y
el etil-terc-butil-éter (ETBE) usado principalmente en
Europa.
Actualmente se están ensayando otros aditivos de
combustibles de tipo éter, tales como el
terc-amil-metil-éter (TAME) y el
terc-amil-etil-éter (TAEE). En el futuro se
podrán usar otros éteres como aditivos de combustibles y
presentarán superioridad técnica comparada con los aditivos de
combustibles de tipo éter usados actualmente. En esta solicitud y en
la bibliografía técnica, la frase "combustible de tipo éter"
también se usa para indicar los compuestos definidos antes.
Las "condiciones de hibridación
restrictivas" se definen en el presente documento como
condiciones que permiten la hibridación específica de dos moléculas
de ADN monocatenarias a aproximadamente 65ºC, por ejemplo en una
solución de SSC 6X, SDS al 0,5%, solución de Denhardt 5X y ADN no
específico desnaturalizado 100 \mug/ml, o cualquier otra solución
de fuerza iónica equivalente, y después de una etapa de lavado
realizada a 65ºC, por ejemplo, en una solución de como mucho SSC
0,2X y SDS al 0,1%, o cualquier otra solución de fuerza fónica
equivalente. Sin embargo, el experto en la materia puede adaptar
las condiciones restrictivas, dependiendo del tamaño de la
secuencia de hibridación, su contenido de GC y cualquier otro
parámetro, por ejemplo, de acuerdo con los protocolos que se
describen en Sambrook y col., 2001 (Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 3ª Ed., laboratory press, Cold Spring Harbor, Nueva
York).
Una secuencia S2 "es derivada de" una
secuencia S1, si S2 es un fragmento de S1, o una variante de S1, o
una variante de un fragmento de S1. Una secuencia que comprende S1
o un fragmento de S1, o una variante de S1, o una variante de un
fragmento de S1 se dice también que "deriva de" S1. En esta
definición, un "fragmento" es más largo que 10 nucleótidos,
preferiblemente más largo que 20 nucleótidos, e incluso más
preferiblemente más largo que 50 nucleótidos. En toda la solicitud,
una "variante" de una secuencia de nucleótidos indica una
secuencia que es al menos 60%, y más preferiblemente al menos 80%
idéntica a dicha secuencia de nucleótidos, y el porcentaje de
identidad de ácidos nucleicos entre dos secuencias de ácidos
nucleicos se calcula usando el software BLAST (Versión 2.06 de
septiembre de 1998).
Se dice que una bacteria B2 "es derivada
de" una bacteria B1, si B2 se ha obtenido subclonando células
B1, opcionalmente después de cultivar B1 en condiciones
específicas, o después de introducir un ADN extraño en células B1.
En particular, una bacteria B2 puede derivar de B1 por
reorganización cromosómica.
En esta solicitud, una "variante funcional"
de una proteína P1 indica una proteína P2 que puede complementar la
ausencia de P1 en un proceso biológico en el que normalmente está
implicada P1. Por ejemplo, una variante funcional de EthB puede
sustituir a EthB nativo en el sistema citocromo
P-450 de modo que este sistema mantenga su
capacidad de degradar el ETBE.
Una bacteria "negativa para ETBE" significa
en este documento una bacteria que no puede degradar ETBE, mientras
que una bacteria "positiva para ETBE" significa una bacteria
que puede degradar ETBE, cualquiera que sea el producto o productos
de degradación obtenidos.
Una primera realización de la presente invención
es una secuencia de ácido nucleico aislada que hibrida
específicamente en las condiciones restrictivas con el ID SEC Nº 2.
El genoma de Rhodococcus ruber I-1889 se
depositó en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos
(CNCM).
Los ácidos nucleicos designados en este
documento son ácidos nucleicos que hibridan con el fragmento de ADN
que está ausente en una célula bacteriana derivada de
Rhodococcus ruber I-1889 por reorganización
cromosómica que da como resultado una deleción de 14,3 kpb que
incluyen el gen eth, y no hibridan con la secuencia que
flanquea dicho conjunto de genes eth. En otras palabras, los
ácidos nucleicos designados en este documento son ácidos nucleicos
que hibridan con el fragmento de ADN del conjunto de genes
eth de Rhodococcus ruber I-1889 que es
un fragmento de 8,7 kpb representado por el recuadro blanco entre
los dos recuadros sombreados en la figura 4A (ID SEC Nº 3). Dicho
ácido nucleico también puede "derivar de" la ID SEC Nº 3, como
se ha definido antes.
En otro aspecto de la invención, la solicitud se
refiere a una secuencia de ácido nucleico aislada que hibrida
específicamente en condiciones restrictivas con al menos uno de los
ácidos nucleicos de ID SEC Nº: 5, 7, 9, 11 ó 13 (ORF de
ethA, B, C, D o R, respectivamente), en el que dicha
secuencia de ácido nucleico codifica una proteína de ID SEC Nº: 6,
8, 10, 12 ó 14, respectivamente, o una variante funcional de la
misma, de acuerdo con la definición anterior.
Un tercer aspecto de esta invención se refiere a
una secuencia de ácido nucleico aislada que tiene las siguientes
propiedades:
- a)
- hibrida en condiciones restrictivas con un ácido nucleico de ID SEC Nº 2, y preferiblemente hibrida también en condiciones restrictivas con un ácido nucleico de ID SEC Nº 3.
- b)
- cuando se transfiere a una célula bacteriana derivada de Rhodococcus ruber I-1889 por reorganización cromosómica que da como resultado una deleción de 14,3 kpb que incluyen el conjunto de genes eth, confiere a esta bacteria la capacidad de degradar el ETBE.
En esta realización, la solicitud de este
documento se refiere a un ácido nucleico que puede
transcomplementar el genoma de una bacteria Rhodococcus
ruber negativa para ETBE, con el fin de hacer que esta bacteria
sea positiva para ETBE. Este ácido nucleico no contiene
necesariamente la ID SEC Nº: 2 entera. Al contrario, se pueden
eliminar y/o sustituir algunas partes de esta secuencia por una
secuencia diferente. Por ejemplo, el gen ethR se puede
eliminar y el promotor de eth sustituir por un promotor
constitutivo fuerte. Alternativamente, cualquiera de los ORF de
ethA, B, C y D, se puede sustituir por una secuencia
que codifica una variante funcional de EthA, B, C y
D, respectivamente. Dicha variante se puede obtener por
mutagénesis o por cambio de ADN entre genes homólogos de bacterias
diferentes, y cribado funcional para encontrar una variante que sea
al menos funcional como EthA, B, C o D
naturales.
naturales.
La presente invención también se refiere a un
vector que comprende cualquier ácido nucleico de la invención como
se ha descrito antes. Por ejemplo, un vector que codifica EthR como
un activador de la transcripción para un gen heterólogo, está
dentro del alcance de la presente invención. Un vector de la
invención puede ser por ejemplo, un plásmido, un cósmido, un fago o
un virus.
Se depositó una bacteria Escherichia coli
recombinante que comprende un vector como se ha descrito antes en
la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) el 19
de abril de 2001, con el nombre de Escherichia coli K12
(pGT220) y número I-2662. Esta bacteria también es
parte de la invención.
La invención también se refiere a una sonda de
ácido nucleico para detectar o caracterizar cepas bacterianas
capaces de degradar aditivos de combustibles de tipo éter, que
hibridan en condiciones restrictivas con
- a)
- un ácido nucleico de 23,7 kb de ID SEC Nº: 1, que comprende el conjunto de genes eth de R. ruber, en el que este ácido nucleico corresponde a un fragmento que resulta de la digestión parcial del ADN de R. ruber por la endonucleasa de restricción BamHI, y/o
- b)
- un ácido nucleico de 14,3 kb que corresponde al fragmento eliminado en la bacteria R. ruber negativa para ETBE derivada de Rhodococcus ruber I-1889 por reorganización cromosómica que da como resultado una deleción de 14,3 kpb que incluyen el conjunto de genes eth (ID SEC Nº: 2) y/o
- c)
- un ácido nucleico de 8,7 kb que corresponde al fragmento genómico que está ausente en las bacterias negativas para ETBE derivadas de Rhodococcus ruber I-1889 por reorganización cromosómica que da como resultado una deleción de 14,3 kpb que incluyen el conjunto de genes eth (ID SEC Nº: 3).
Otro objeto de la presente invención es un
cebador de ácido nucleico que hibrida específicamente con una
secuencia de ADN de ID SEC Nº: 1, en el que dicho cebador se puede
usar para la amplificación de una secuencia de ADN incluida en la
ID SEC Nº: 1 por cualquier medio, por ejemplo por PCR. Un cebador
preferido de la invención hibrida específicamente con una secuencia
de ADN de ID SEC Nº: 3.
La invención también se refiere a un anticuerpo
que se une específicamente a un polipéptido de ID SEC Nº: 6, 8, 10,
12 ó 14. Dicho anticuerpo se puede obtener, por ejemplo, por
inmunización de un animal con un polipéptido de ID SEC Nº: 6, 8,
10, 12 ó 14, o con una forma truncada de estos polipéptidos, o con
una proteína de fusión que comprende parte de estos polipéptidos.
Con el fin de saber si un anticuerpo está en el alcance de la
invención, se puede llevar a cabo un ensayo de unión con dicho
anticuerpo, usando los extractos de proteína de Rhodococcus
ruber I-1889 y de una bacteria R. ruber
negativa para ETBE derivada de Rhodococcus ruber
I-1889 por reorganización cromosómica que da como
resultado una deleción de 14,3 kpb que incluyen el conjunto de
genes eth. Si la señal que se obtiene con el extracto de la
bacteria positiva para ETBE es significativamente mayor que la que
se obtiene con el extracto del mutante negativo para ETBE, el
anticuerpo ensayado está dentro del alcance de la presente
invención. Este ensayo se puede realizar usando el protocolo de
Sambrook y col., 2001 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª
Ed., laboratory press, Cold Spring Harbor, Nueva York) para
preparar extractos de proteína y para ensayar la afinidad de unión
del anticuerpo a dichos extractos, por ejemplo, por transferencia
Western.
Como se explica en los siguientes ejemplos
experimentales, los autores de la invención han demostrado que el
gen ethB codifica un citocromo P-450 de ID
SEC Nº: 8, o una variante del mismo, que cataliza la oxidación del
ETBE. Este citocromo P-450 también es parte de la
presente invención, así como las otras proteínas EthA, EthC, EthD y
EthR expresadas por los marcos de lectura abiertos ethA, ethC,
ethD y ethR, respectivamente.
Como se describe en el Ejemplo 5, EthA es
similar a una ferredoxina de tipo glutatión reductasa, y
EthC es una ferredoxina [2Fe-2S] de tipo
putidaredoxina que probablemente sirve como un transportador de
electrones entre la ferredoxina reductasa dependiente de NADH
(EthA) y el citocromo P-450 (EthB). Es muy probable
que estos dos polipéptidos estén implicados en un complejo con el
citocromo P-450 de ID SEC Nº: 11. El hecho de que
EthD sea más abundante en R. ruber en presencia de ETBE
sugiere que este polipéptido también interacciona con el citocromo
P-450. Cualquier complejo de al menos dos
polipéptidos del grupo EthA, EthB, EthC y EthD,
también es parte de esta invención.
Los autores de la invención también han
demostrado que Rhodococcus ruber I-1889 a
menudo pierde su capacidad para degradar el ETBE por reorganización
cromosómica que da como resultado la deleción de 14,3 kpb que
incluyen el conjunto de genes eth, y que esta reorganización
ocurre entre dos secuencias duplicadas de 5,6 kpb (de ID SEC Nº: 4).
Con el fin de prevenir esta reorganización y así obtener bacterias
positivas para ETBE más estables, se puede eliminar todo o parte de
al menos una copia de esta secuencia duplicada. Por lo tanto, una
bacteria recombinante derivada de Rhodococcus ruber
I-1889 por deleción de todo o parte de al menos una
copia del fragmento de ADN de ID SEC Nº: 4, también está dentro del
alcance de esta solicitud.
La invención también se refiere a una bacteria
recombinante que comprende cualquiera de las moléculas o vectores
de ácido nucleico de la invención descritos antes. Esta bacteria
puede comprender un vector que codifica el conjunto de genes
eth entero, o solo parte de este conjunto de genes. Por
ejemplo, una bacteria que comprende un plásmido que codifica un gen
responsable de la degradación del TBA (que es un producto de
degradación del ETBE), estando dicho gen controlado por un promotor
que incluye el ORF de ethR, está dentro del alcance de esta
invención. Dicha bacteria se podría usar ventajosamente con
Rhodococcus ruber I-1889 para degradar
completamente el ETBE, porque los genes tanto para la degradación
del ETBA como del TBA serían inducidos por el ETBE.
Una realización preferida de esta invención, es
una bacteria recombinante como se ha descrito antes, que puede
degradar el ETBE y otros combustibles de tipo éter. Otra
realización preferida de esta invención es una bacteria
recombinante que puede usar ETBE como única fuente de carbono.
La identificación de un sistema citocromo
P-450 implicado en la degradación del ETBE por
R. ruber proporciona una nueva percepción del mecanismo de
la biodegradación y por lo tanto en el procedimiento de
biorremediación de los productos oxigenados de gasolinas. Por
ejemplo, sería interesante transferir los genes eth a una
cepa que degrada TBA, con el fin de producir una cepa recombinante
que mineralizara completamente el ETBE. Por lo tanto, una bacteria
recombinante que comprende un vector que codifica los genes
eth, que es capaz de degradar un combustible de tipo éter y
sus productos de degradación, por ejemplo que escinde el ETBE y
también es capaz de degradar el TBA, está dentro del alcance de la
presente invención. En una realización preferida de las bacterias
recombinantes de la invención, estas bacterias pueden mineralizar
completamente el ETBE, lo que significa degradar estos compuestos a
compuestos inocuos, tales como CO_{2} y agua.
Otro aspecto de la invención es un procedimiento
para hacer que una célula pueda escindir aditivos de combustible de
tipo éter, que comprende la etapa de introducir en dicha células un
ácido nucleico o un vector que codifica al menos parte de las
proteínas Eth, o variantes funcionales de las mismas, como se ha
descrito antes. También se considera en este documento un
procedimiento para mejorar la eficacia de la degradación de los
combustibles de tipo éter. Esto se puede lograr, por ejemplo,
aumentando el número de copias del conjunto de genes eth en
una célula, o conduciendo la expresión de los genes eth a
partir de un promotor más fuerte que el natural. Alternativa o
adicionalmente, se puede aumentar la funcionalidad de al menos una
de las proteínas Eth, por ejemplo el citocromo
P-450 (EthB), por ejemplo, llevando a cabo el cambio
de ADN entre varios genes homólogos de ethB, y cribado de
las proteínas obtenidas según su capacidad para complementar EthB en
el sistema de citocromo P-450, en experimentos de
degradación de
ETBE.
ETBE.
En el procedimiento anterior, la célula que se
va a convertir en capaz de escindir aditivos de combustibles de
tipo éter es preferiblemente una bacteria. Alternativamente, este
método se puede llevar a cabo en una célula vegetal, hongo o
levadura.
Además, puede ser muy útil evaluar el potencial
de la escisión de combustibles de tipo éter en un área contaminada
con otros combustibles, con el fin de determinar que acciones
deberían emprenderse para proteger el entorno. Por lo tanto, la
invención también se refiere a un procedimiento para identificar en
una mezcla compleja, la presencia de un microorganismo que
comprende al menos parte del conjunto de genes eth que puede
conferir a una cepa bacteriana la capacidad de escindir un aditivo
de combustible de tipo éter, que comprende la etapa de poner en
contacto dicha muestra con una sonda de ácido nucleico y/o un
anticuerpo como se ha mencionado antes.
Por la misma razón, también es parte de la
presente invención un procedimiento para identificar en una mezcla
compleja la presencia de un microorganismo que comprende al menos
parte del conjunto de genes eth que puede conferir a una
cepa bacteriana la capacidad de escindir un aditivo de combustible
de tipo éter, que comprende la etapa de llevar a cabo una
amplificación del ADN con al menos un cebador como se ha descrito
antes.
Tanto si se hace la detección usando hibridación
con una sonda, unión a anticuerpo o amplificación con cebadores, el
experto en la materia puede adaptar los medios de detección a la
clase y cantidad de muestra tratada y el tratamiento usado. Por
ejemplo, la sonda o los cebadores pueden estar radiomarcados o ser
fluorescentes, o incluso pueden estar acoplados a una enzima.
En los procedimientos anteriores descritos, la
mezcla compleja puede ser, por ejemplo, una muestra de agua, suelo,
lodo, sedimento, desechos de dragados, gas o residuos químicos.
Para determinar la presencia o ausencia en una
muestra contaminada, de microorganismos que es probable que
escindan combustibles de tipo éter, la invención se refiere además
a un biosensor que comprende un ácido nucleico como se ha descrito
antes (fragmento aislado, vector, sonda, cebador...) y/o un
anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido codificado
por uno de los genes del conjunto de genes eth, es decir un
polipéptido de cualquiera de las ID SEC Nº: 6, 8, 10, 12 ó 14.
La invención también se refiere a un
procedimiento para aislar un microorganismo que pueda escindir
aditivos de combustibles de tipo éter, que comprende la etapa de
detectar la presencia o ausencia en una muestra de un conjunto de
genes eth incluido en el ID SEC Nº: 3 o una secuencia
derivada del ID SEC Nº: 3. El ID SEC Nº: 3 corresponde al fragmento
de ADN que está ausente del genoma de una célula bacteriana
derivada de Rhodococcus ruber I-1889 por
reorganización cromosómica que da como resultado la deleción de
14,3 kpb que incluyen el conjunto de genes eth y la pérdida
de la capacidad para degradar el ETBE. El experto en la materia
puede determinar el medio para detectar la presencia o ausencia en
una muestra de este fragmento de ADN, por ejemplo, usando una sonda
que híbrida específicamente con este fragmento, o llevando a cabo
la amplificación del ADN con al menos un cebador específico para
este fragmento. Un procedimiento para aislar un microorganismo
capaz de escindir aditivos de combustibles de tipo éter, que
comprende la etapa de detectar la presencia o ausencia en una
muestra de un ácido nucleico que hibrida en condiciones
restrictivas con una sonda de ácido nucleico como se ha descrito
antes, también es parte de la invención. En una realización
preferida de este procedimiento, la sonda de ácido nucleico es
específica para la secuencia ID SEC Nº: 3.
La invención también se refiere a una bacteria
que puede escindir un aditivo de combustible de tipo éter, y que se
ha identificado y/o aislado por un procedimiento como se ha
descrito antes.
Se puede usar una bacteria que comprende una
fusión de transcripción entre el conjunto de genes eth (que
implica al menos el promotor de eth y ethR) y un gen
indicador para la detección de una contaminación por ETBE. El gen
indicador puede codificar cualquier proteína indicadora conocida en
la técnica, por ejemplo una proteína bioluminiscente tal como
luciferasa, o una enzima tal como peroxidasa o
beta-galactosidasa, y los medios para poner de
manifiesto la expresión de dicho gen indicador son conocidos por los
expertos en la materia.
Se puede usar una bacteria como se ha descrito
en el párrafo anterior en un procedimiento para detectar una
contaminación por un aditivo de combustible de tipo éter tal como
ETBE en un efluente acuoso, un suelo, un lodo, un sedimento, un
desecho de dragados, un gas o un residuo químico, que comprende la
etapa de poner en contacto dicho efluente, suelo, lodo, sedimento,
desecho de dragado, gas o residuo químico con dicha bacteria. Este
procedimiento también es parte de la presente invención, así como un
biosensor de célula microbiana entera que comprende una bacteria
como se ha descrito en el párrafo anterior, para detectar la
presencia de una contaminación por un aditivo de combustible de
tipo éter, tal como el ETBE, en una mezcla compleja.
Otro aspecto de la presente invención es un
procedimiento para descontaminar un efluente acuoso, un suelo, un
lodo, un sedimento, un desecho de dragado, un gas o un residuo
químico contaminado con un combustible de tipo éter tal como el
ETBE, que comprende la etapa de poner en contacto dicho efluente,
suelo, lodo, sedimento, desecho de dragado, gas o residuo químico,
con una bacteria capaz de degradar al menos dicho combustible de
tipo éter, como se ha descrito antes. En una realización preferida,
dicha bacteria que pude degradar el combustible de tipo éter es una
bacteria recombinante que lleva todo o parte del conjunto de genes
eth. En otra realización preferida, dicha bacteria que puede
degradar el combustible de tipo éter es una bacteria que se ha
identificado por un procedimiento como se ha descrito antes.
En una realización de este procedimiento de la
invención, la descontaminación se produce en un biorreactor. Se
puede usar una variedad de biorreactores que conocen los expertos
en la materia, en la práctica de la presente invención. Se pueden
usar reactores de crecimiento suspendido, tales como biorreactores
de membrana, reactores de depósito de agitación continua
convencional (CSTR) y sistemas de lodos activados, en la práctica de
esta invención. Alternativamente, y debido a que las bacterias se
adhieren fuertemente a las superficies, también se pueden usar, si
se desea, reactores de película fija, tales como reactores de lecho
fluido o reactores de soporte fijo.
En otra realización del procedimiento de
descontaminación de la invención, la descontaminación se produce en
el sitio, por adición de bacterias recombinantes capaces de escindir
aditivos de combustible de tipo éter, como se ha descrito antes, al
medio contaminado. En este caso, las bacterias pueden contener
además un gen de susceptibilidad que previene su expansión
incontrolada en el ambiente, por adición de un producto que las
matará selectivamente cuando ya no sean necesarias.
Alternativamente o de forma complementaria, las
bacterias se pueden confinar en biobarreras, biofiltros y/o
biopilas. Los expertos en la materia usan habitualmente dichas
biobarreras, biofiltros y biopilas para prevenir la propagación de
un contaminante, por ejemplo, cuando se disponen entre la fuente de
contaminación y el agua subterránea que se encuentra corriente
abajo de dicha polución.
La presente invención también incluye en su
alcance el uso de uno o más microorganismos combinados con uno o
más de los microorganismos descritos en este documento para lograr
la degradación complementaria frente a una mezcla de contaminantes
que incluyen un éter, por ejemplo, en el tratamiento de corrientes
residuales mixtas. Dicha combinación usa las diferentes
especificidades de degradación de los microorganismos implicados.
Por consiguiente, para algunas aplicaciones, un medio contaminado
dado se puede tratar con microorganismos que tienen diferentes
especificidades para contaminantes dados o sus productos de
degradación intermedios.
Otras características de la invención serán
evidentes también en el transcurso de la siguiente descripción de
los ensayos biológicos que se han llevado a cabo en el marco de
trabajo de la invención, y que se proporcionan con el apoyo
experimental requerido, sin limitar su alcance.
Figura 1 Electroforesis en gel con gradiente de
poliacrilamida al 10-15% que contiene SDS. Se
analizaron los extractos brutos de R. ruber de tipo natural
(I-1889 designado como IFP 2001) y el mutante
constitutivo (I-2194 designado como IFP 2007)
después de crecimiento en presencia de etanol (EtOH) o ETBE como
única fuente de carbono. A la derecha se indica la migración de los
marcadores de tamaño molecular (en kDa).
Figura 2 Electroforesis en gel de campo pulsante
de ADN cromosómico digerido con XbaI de R. ruber de
tipo natural (I-1889) y mutantes negativos para
ETBE. Las flechas indican la banda de 125 kb de la cepa de tipo
natural y la banda de 110 kb de los mutantes. A la izquierda se
indica la migración de los concatémeros de 50 kb del ADN lambda
(vendido por Biolabs).
Figura 3 Hibridación por transferencia Southern
de ADN cromosómico digerido con BamHI de la cepa de tipo
natural (1) y un mutante negativo para ETBE (2), usando el
fragmento BamHI de 7,4 kpb como sonda. El tamaño de las
bandas que hibridan se indica en kpb.
Figura 4 Organización genética en la cepa de
tipo natural de la región de 23,7 kpb que lleva los genes
implicados en la degradación del ETBE (A) y mapa de restricción del
fragmento BamHI de 9,3 kpb del mutante negativo para ETBE
(B). Los genes eth codifican un activador de la
transcripción (EthR), una ferredoxina reductasa (EthA), el
citocromo P-450 inducible por ETBE (EthB), una
ferredoxina (EthC) y una proteína desconocida inducible por ETBE
(EthD). Los otros marcos de lectura abiertos mostrados corresponden
a una resolvasa (TnpR), transposasa (TnpA), sistema de dos
componentes regulador de respuesta (Orf1' truncado), proteína
integral de membrana (Orf2), cotransportador de sodio:soluto
(Orf3), proteína de membrana (Orf7' truncado) y tres proteínas no
identificadas (Orf4, Orf5 y Orf6).
Figura 5 Organización genética de los sistemas
de citocromo P450 de R. ruber (A) y R. erythropolis
(B) (28). Los activadores de transcripción 100
citocromos P-450 101 ferredoxina
reductasas 102 ferredoxinas 103 y
proteínas desconocidas 104 son 31%, 24%, 47%, 48% y
40% idénticos, respectivamente.
Figura 6 Regiones de los genomas de las cepas
R. ruber I-1889, R. zopfii
I-2053, y Gordonia sp IFP 2009 que
probablemente comparten una alta similitud. La posición de la sonda
de ethB de R. ruber se muestra con un rectángulo
blanco. Los fragmentos genómicos de tamaño similar que hibridan con
sonda de ethB de R. ruber I-1889 y en
las otras cepas ensayadas, se muestran con rectángulos negros.
Los siguientes ejemplos se pueden realizar
usando los materiales y procedimientos descritos a
continuación:
Cepas bacterianas y condiciones de
cultivo. Se cultivaron R. ruber I-1889 o
I-2194 a 30ºC en medio de
Luria-Bertani (LB), o medio mínimo MM1 que contenía
KH_{2}PO_{4} 50 mM, K_{2}HPO_{4} 50 mM, MgSO_{4} 0,16 mM,
Na_{2}HPO_{4} 1,9 mM, NH_{4}Cl 28 mM, CaCl_{2} 0,27 mM,
FeCl_{3} 4,4 \muM, biotina 200 \mug/l, riboflavina 50
\mug/l, ácido nicoctínico 50 \mug/l, pantotenato de calcio 50
\mug/l, ácido p-aminobenzoico 50 \mug/l, ácido
fólico 20 \mug/l, clorhidrato de tiamina 15 \mug/l,
cianocobalamina 1,5 \mug/l, con ETBE 200 mg/l (Aldrich Chemical
Co.) o etanol al 0,5% como única fuente de carbono. El cultivo en
medio sólido usando ETBE como una fuente de carbono se llevó a cabo
en placas de Petri de vidrio que contenían medio MM1 con agar al
1,5%. El ETBE se suministró en la fase gaseosa mediante un trozo de
papel de filtro pegado a la tapa de la placa, que se humedeció con
200 \mul de ETBE. Las placas se cerraron con envuelta de alimento
de politeno. Se cultivó Escherichia coli TG1 a 37ºC en
LB.
Aislamiento de mutantes espontáneos que no
pueden degradar el ETBE. Se cultivó en placa R. ruber en
agar MM1 con vapor de ETBE como fuente de carbono, y se
transfirieron clones independientes al medio LB líquido. Después de
crecimiento hasta saturación, los clones se diluyeron en medio LB
reciente y se repitió el procedimiento durante 60 generaciones.
Después los cultivos se cultivaron en placas, en placas con LB, y se
pusieron colonias individuales en placas con LB y placas con MM1
que contenían ETBE, incluyendo controles de tipo natural. Después de
8-10 días, se seleccionaron los clones que
mostraban un crecimiento notablemente menor en las placas con ETBE.
Se ensayó la producción de TBA en los líquidos sobrenadantes de
cultivos sin células usando un cromatógrafo de gases
Peri-2000 (Perichrom) equipado con una columna FFAP
3-m.
Electroforesis en gel de campo pulsante.
Se cultivó R. ruber en 40 ml de LB hasta DO_{600} = 1.
Después las células se centrifugaron, se volvieron a suspender en
20 ml de Triton X-100 al 1% (v/v) y se incubaron
durante 2 h a 37ºC. Las células se volvieron a centrifugar, se
lavaron con EDTA 0,05 M y se volvieron a suspender en 1 ml de
Tris-HCl 10 mM, pH 8, EDTA 10 mM que contenía
lisozima 1 mg/ml. Después la suspensión se mezcló con un volumen
igual de agarosa de bajo punto de fusión al 1% (p/v) y se dispensó
en un formador de ranuras de 60 \mul. Se incubaron los bloques en
EDTA 0,5 M durante 24 h a 37ºC, después se lavaron en TE y se
incubaron en N-lauroil-sarcosinato
sódico al 1% (p/v) (Fluka) y proteinasa K 2 mg/ml durante una noche
más a 55ºC. Los bloques se lavaron con TE y se incubaron en TE que
contenía fluoruro de fenilmetilsulfonilo 4 \mug/ml (Sigma Chemical
co.) durante 1 h a 55ºC para inactivar la proteinasa K Finalmente,
los bloques se lavaron bien en TE y se hicieron digerir con
XbaI 3 U/ml. Después de digestión, los bloques se cargaron
en gel de agarosa al 1% (p/v). Se llevó a cabo la PFGE en un
aparato de campo eléctrico homogéneo de contorno cerrado (CHEF)
(Bio-Rad, Munich, Alemania), en el que la
distribución de electrodos se dispuso de forma que el ángulo de
reorientación de las moléculas de ADN era 120º. Se separaron
fragmentos de restricción grandes a 14º con un aumento de pulso de
1,6 a 21,3 s durante 23 h.
Extracción de ADN cromosómico. Se
recogieron 400 ml de un cultivo de R. ruber con DO_{600}
\sim 1,3, 15 min a 5.000 x g. Las células se volvieron a
suspender en 15 ml de Tris-HCl 0,1 M pH 8, EDTA 0,1
M, NaCl 0,15 M (TEN) complementado con 150 \mul de Triton
X-100 y 100 mg de lisozima, y se incubaron toda la
noche a 37ºC con agitación. Después el lisado se incubó 1 h a 60ºC
en presencia de RNAsa A 1,3 mg/ml, seguido de tratamiento con
proteinasa K 0,6 mg/ml y SDS al 2% a 40ºC durante 2 h. El ADN
cromosómico se extrajo con fenol y con cloroformo. La precipitación
se llevó a cabo con 1/10 de volumen de NaCl 1 M y 2 volúmenes de
etanol. Se recuperaron aproximadamente 800 \mug de ADN
enganchándolo en el extremo de una pipeta Pasteur y se volvió a
suspender en TEN.
Construcción de bibliotecas genómicas y
cribado de colonias. Se hizo digerir ADN cromosómico con
BamHI y se electroeluyeron los fragmentos de tamaño adecuado
de un gel de agarosa. La clonación se llevó a cabo usando pUC18
(37) linearizado con BamHI, tratado con fosfatasa alcalina
bacteriana y formulada con ADN ligasa T4
(Ready-To-Go de
Amersham-Pharmacia-Biotech). Se
transformó E. coli por electroporación y cultivo en placa en
presencia de ticarcilina 100 \mug/ml. La colonias de clones
recombinantes se transfirieron a filtros de nailon
(Hybond-N+;
Amersham-Pharmacia-Biotech). Los
filtros se pusieron con la colonia de cara hacia arriba en todas
las operaciones posteriores. Se llevó a cabo la lisis celular
poniendo los filtros en un papel de filtro absorbente empapado en
SSC 2 X (NaCl 0,3 M, citrato sódico 0,03 M), SDS al 5% e incubando
durante 10 min. Después las membranas se transfirieron a papel de
filtro seco. La fijación del ADN y desnaturalización se llevaron a
cabo por exposición a microondas de 650 vatios durante 2 min. Los
filtros se lavaron en SSC 5 X, SDS al 0,1% a 65ºC durante 30 min.
El lisado que quedó en la superficie de los filtros se raspó con un
dedo con guante. Las membranas se aclararon en SSC 2 X y se
transfirieron a papel de filtro seco. Las hibridaciones de las
sondas de ADN se realizaron en incubaciones en tampón
Rapid-Hyb
(Amersham-Pharmacia-Biotech) de 2 h
a toda la noche a 65ºC. Las hibridaciones no específicas se
separaron lavando las membranas dos veces en SSC 1 X, SDS al 0,1% a
65ºC durante 30 min.
Preparación de las sondas de ADN. Se
purificaron fragmentos de ADN de los geles de agarosa usando el kit
de extracción de gel QlAquick (Qiagen). El ADN se marcó con
[^{32}P]dCTP usando un sistema de marcaje de cebador
aleatorio (rediprime II,
Amersham-Pharmacia-Biotech). EL ADN
marcado se purificó de los nucleótidos no incorporados usando una
columna Sephadex G-50 (Nick Columns,
Amersham-Pharmacia-Biotech).
Secuenciación de ADN. Los plásmidos
pGT200 y pGT220 obtenidos por la construcción de bibliotecas
genómicas como se ha descrito antes y que contenían insertos de 7,4
y 16,3 kpb, respectivamente, se usaron como material de partida
para construir una biblioteca de insertos pequeños. Los plásmidos
se fragmentaron por nebulización y los fragmentos purificados en
gel en el intervalo de 1-2 kpb se clonaron en el
vector pvDNA2.1 usando el procedimiento de clonación no
palindrómica como se ha descrito antes (12). Los insertos de clones
elegidos aleatoriamente de la biblioteca de insertos pequeños se
secuenciaron desde ambos extremos usando un secuenciador automático
Perkin Elmer ABI 3700. Las secuencias se montaron usando las
herramientas de software Phred, Phrap y Consed (9,10). Durante el
procedimiento de montaje, se observó la presencia de una secuencia
repetida de 5,6 kpb. Se comprobó otra vez la secuencia de las
repeticiones mediante secuenciación de nuevo usando los plásmidos
individuales pGT200 y pgT220 como moldes. Una copia de la
repetición se encuentra en pGT200 y la segunda copia en pGT220.
Como se esperaba, se obtuvieron dos cóntigos correspondientes a los
insertos de 7,4 y 16,3 de pGT200 y pGT220. Una reacción de PCR
usando gt1
(5'-ACCCCCGCAATCGTCGGC-3') (ID SEC
Nº: 15) y gt2 (5'-TGCCGGCGGCTCCGCT
GA-3') (ID SEC Nº: 16) como cebadores, dio como resultado la amplificación de un producto que solapaba con el hueco entre los dos cóntigos. Finalmente, se obtuvo la secuencia completa como un solo cóntigo de 23.696
bases.
GA-3') (ID SEC Nº: 16) como cebadores, dio como resultado la amplificación de un producto que solapaba con el hueco entre los dos cóntigos. Finalmente, se obtuvo la secuencia completa como un solo cóntigo de 23.696
bases.
Preparación de extractos brutos y
análisis. Se recogieron células R. ruber en fase de
crecimiento exponencial 15 min a 5.000 x g. Los sedimentos se
volvieron a suspender en Tris 50 mM pH 7,5 y las células de
alteraron tres veces mediante una prensa de French a 200 MPa
(SLM-Aminco). Los restos celulares se separaron por
centrifugación a 27.000 x g durante 15 min. Las proteínas totales
del líquido sobrenadante se ensayaron con el reactivo azul de
Coomassie (Bio-Rad) y se analizaron mediante una
electroforesis en gel de desnaturalización de poliacrilamida con
gradiente de 10-15%.
Secuenciación de péptidos de dos proteínas
inducidas por ETBE. Los extractos brutos de R. ruber
inducidos por ETBE se centrifugaron 1 h a 100.000 x g y el líquido
sobrenadante se sometió a electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida. Se cortó una banda principal
inducida por ETBE de 43 kDa de un gel de
Tris-glicina que contenía poliacrilamida al 7,5%, y
se cortó una banda minoritaria inducida por ETBE de 10 kDa de un
gel de Tris-tricina que contenía poliacrilamida al
20%. Las bandas posteriormente se hicieron digerir con tripsina y
los péptidos se separaron por cromatografía en fase inversa
DEAE-C18 usando un gradiente de agua/acetonitrilo en
presencia de ácido trifluoroacético al 0,1%. Los péptidos
seleccionados se secuenciaron por el método de Edman usando un
secuenciador modelo 473 A (Applied Biosystems).
La Figura 1 muestra un análisis en gel de
SDS-poliacrilamida de extractos brutos preparados a
partir de células de R. ruber cultivadas en etanol y en
ETBE. En las células de tipo natural se indujeron claramente dos
polipéptidos de 43 y 10 kDa tras el crecimiento en ETBE. También
estaban presentes, aunque menos abundantes, en las células de un
mutante constitutivo previamente aislado I-2194
(18). La microsecuenciación de péptidos dio las secuencias
parciales HALGDWQTFSSAQGI, FDSVAQWFTR y SVSNTEMIALWTELG para la
proteína de 43 kDa y GQPTDTEAFDTYYS para la proteína de 10 kDa. La
primer secuencia, HALGDWQTFSSAQGI, era 66% idéntica a un citocromo
P-450 putativo de Mycobacterium tuberculosis
H37Rv (Genpept Z177137_5), lo que sugiere que el polipéptido de 43
kDa puede ser el citocromo P-450 inducible
observado en las células G. terrae cultivadas en ETBE por
Hernandez-Perez y col. (18). La secuencia
GQPTDTEAFDTYYS era 47% idéntica al Orf4 de Rhodococcus
erythropolis (Genpept U17130_4). El gen orf4 de R.
erythropolis es parte de un conjunto de genes de citocromo
P-450, lo que sugiere que el polipéptido de 10 kDa
inducible está relacionado con un sistema de citocromo
P-450.
Ninguna de las otras dos secuencias mostró una
similitud significativa con ninguna de las proteínas caracterizadas
presentes en la base de datos.
En un intento de verificar la estabilidad del
fenotipo positivo para ETBE, se cultivaron cinco clones
independientes de R. ruber en caldo de LB durante 60
generaciones. Después se cribaron los cultivos según la presencia
de mutantes que no podían crecer en presencia de ETBE como única
fuente de energía y carbono. Se encontró que de 20 a 100% de los
clones ensayados no podían degradar el ETBE. Se caracterizaron con
más detalle cinco mutantes independientes derivados de los clones de
tipo natural originales. Cuando se cultivaron hasta saturación en
medio mínimo que contenía glucosa al 0,5% y ETBE 18 mM, ninguno de
los mutantes convirtió más de ETBE 0,3 mM en TBA, mientras que en
las mismas condiciones, la cepa de tipo natural produjo TBA 10,6
mM. La inversión del fenotipo ETBE^{+} no era detectable (no
había colonias positivas en 3 x 10^{7} células viables en placa),
lo que sugería que se producía una reorganización genética
irreversible. Se compararon las cepas de tipo natural y mutantes
después de crecimiento en presencia de glucosa al 0,5% + ETBE 18
mM. El análisis de los extractos brutos mostró que a diferencia del
tipo de tipo natural, ninguno de los mutantes producía las
proteínas de 43 y 10 kDa inducidas. Igualmente, las células mutantes
en reposo perdieron la capacidad de degradar el MTBE y TAME.
Las digestiones genómicas con XbaI de las
cepas de tipo natural y mutante se analizaron por electroforesis en
gel de campo pulsante (Figura 2). Había un fragmento de 125 kpb
presente en la cepa de tipo natural y estaba ausente en los
mutantes negativos para ETBE. Además, se observó un fragmento de
110 kpb sólo en los mutantes negativos para ETBE. La hibridación de
Southern puso de manifiesto que el fragmento de 125 kpb de la cepa
de tipo natural usado como una sonda hibridaba con el fragmento de
110 kpb de la cepa mutante, mostrando que el fragmento de 110 kpb
era una forma eliminada del fragmento de 125 kpb. Este resultado
indicaba que los mutantes negativos para ETBE resultaban de una
deleción cromosómica de 15 kpb. Puesto que todos los mutantes
independientes mostraron el mismo genotipo, se usó un solo mutante
para la investigación posterior.
El fragmento XbaI de tipo natural de 125
kpb se purificó de un gel de electroforesis en gel de campo
pulsante y se usó como sonda en un análisis de transferencia
Southern. La hibridación de la sonda XbaI de 125 kb con las
digestiones genómicas con BamHI mostró que una banda de 7,4
kpb y una banda de 16,3 kpb que estaban presentes en la cepa de
tipo natural, desaparecían en el mutante negativo para ETBE. Al
contrario, una banda nueva de 9,3 kpb, que estaba ausente en la cepa
de tipo natural, se detectó en el mutante negativo para ETBE. Esto
demostraba que la deleción de 15 kpb identificada por la
electroforesis en gel de campo pulsante implicaba los dos
fragmentos BamHI de 7,4 y 16,3 kpb que se volvieron a
arrastrar a un nuevo fragmento BamHI de 9,3 kpb. Con el fin
de determinar la secuencia de la región correspondiente a la
deleción, se clonaron los dos fragmentos de BamHI de tipo
natural de 7,4 y 16,3 kpb. El fragmento BamHI de 7,4 kpb se
seleccionó por hibridación de la colonia usando el fragmento
XbaI de 125 kpb como una sonda. El fragmento de 7,4 kpb
donado después se usó como una sonda en una hibridación Southern
(Figura 3). Además de la autohibridación, la sonda de BamHI
de 7,4 kpb también hibridó con el fragmento BamHI de 16,3
kpb del tipo de tipo natural y con el fragmento BamHI de 9,3
kpb mutante negativo para ETBE. Esto indicaba que el fragmento de
7,4 kpb de tipo natural llevaba una secuencia que también estaba
presente en estos dos fragmentos. Por lo tanto, el fragmento
BamHI de 16,3 kpb de tipo natural y el fragmento
BamHI de 9,3 kpb del mutante se clonaron por hibridación de
la colonia usando el fragmento BamHI de 7,4 kpb como
sonda.
Las características de la región de 23,7 kpb
cubierta por los dos fragmentos de BamHI de tipo natural se
muestran en la Figura 4. Se identificó un conjunto de cuatro marcos
de lectura abiertos con la misma orientación denominados ethA,
B, C, D. Basándose en el alineamiento de proteínas, ethA,
B y C se podían asignar a componentes individuales de un
sistema de P-450 que contenía monooxigenasa.
EthA (412 aminoácidos) es similar a las
ferredoxina reductasas de tipo glutatión reductasa. Contiene los
aminoácidos típicos de dos pliegues \beta\alpha\beta que unen
ADP que engloban completamente la región consenso conservada GXGXXG
(36). El sitio de unión de ADP N-terminal
(Val-1 a Asp-31) puede constituir
el sitio de unión de FAD y el sitio de unión de ADP situado en el
centro (Arg-144 a Asp-172) puede
constituir el sitio de unión de NAD.
EthB (400 aminoácidos) corresponde a la
proteína inducida por ETBE de 43 kDa, puesto que contiene los tres
péptidos que se secuenciaron. Además, EthB es similar a los
citocromos P-450, lo cual sugiere que EthB es el
citocromo P-450 que cataliza la oxidación del ETBE.
EthB lleva un resto de cisteína en la posición 349, que está
estrictamente conservado en todos los citocromos
P-450. El residuo es parte de FGXGXHXCXG de consenso
y posiblemente proporciona anclaje del hemo en el sitio activo del
citocromo P-450. La más alta puntuación de
similitud de EthB (33% de identidad) se encontró con un citocromo
P-450 putativo del actinomiceto que degrada
fenantreno Nocardioides sp. (22). Entre los citocromos
P-450 caracterizados, EthB muestra la similitud más
alta (25% de identidad) con el citocromo P-450terp
de Pseudomonas sp., que hidroxila el monoterpeno
\alpha-terpineol como una etapa en el proceso de
su asimilación catabólica (29). Dos citocromos P-450
de actinomicetos muestran también 25% de identidad con EthB: NikQ
de Streptomyces tendae que produce el antibiótico nikomicina
(24) y Orf3 de Streptomyces lavendulae que produce el
fármaco mitomicina C (25).
EthC (106 aminoácidos) es una ferredoxina
[2Fe-2S] de tipo putidaredoxina que probablemente
sirve como un transportador de electrones entre ferredoxina
reductasa dependiente de NADH (EthA) y el citocromo
P-450 (EthB). Los cuatro restos de cisteína
situados en las posiciones 40, 46, 49 y 76 de EthC corresponden a
los restos perfectamente conservados que son necesarios para
coordinar el grupo prostético.
EthD (103 aminoácidos) corresponde a la
proteína inducida por ETBE de 10 kDa, puesto que lleva el péptido
secuenciado. EthD es similar a los tres Orf de función desconocida:
OrfY de Pseudonocardia sp. (Genpept AJ296087_1), un Orf de
Bacillus halodurans (Genpept AP001507_200) y Orf4 de
Rhodococcus erythropolis (Genpept U17130_4), que son 40, 34 y
40% idénticos a EthD, respectivamente. El orf4 de R.
erythropolis pertenece al conjunto de genes thc que
codifica un sistema de citocromo P-450 que cataliza
la N-desalquilación de tiocarbamatos (28). Además
del orf4, el conjunto de genes thc contiene genes
homólogos a los genes eth de R. ruber. El gen
thcB codifica un citocromo P-450 que muestra
24% de identidad con EthB. Los genes thcC y thcD
codifican una ferredoxina (llamada rodocoxina) y una ferredoxina
reductasa, respectivamente, que son los parientes más cercanos a
EthC (48% de identidad) y EthA (47% de identidad), respectivamente
(Figura 5).
El gen ethR se sitúa 183 pb corriente
arriba de ethA (Figura 4). EthR (331 aminoácidos) es muy
similar a los reguladores de la transcripción positivos de la
familia AraC/XylS. El dominio C-terminal altamente
conservado de los reguladores de la familia AraC/XylS está
comprendido entre los aminoácidos 250 y 325 de EthR (13). Como se
esperaba, se encontró un motivo de unión a ADN en EthR entre los
residuos 224 y 265 usando el método de Dood y Egan (7). El miembro
más estrechamente relacionado es ThcR de R. erythropolis que
es 31% idéntico a EthR (28). Además, ThcR es el único miembro de la
familia AraC/XylS que muestra una similitud significativa con EthR
fuera del dominio C-terminal conservado de la
familia. El gen thcR se sitúa corriente arriba del operón
putativo que codifica el sistema de citocromo P-450
implicado en la N-desalquilación de
tiocarbamatos.
Dos secuencias directamente idénticas de 5,6 kpb
flanquean los genes eth (Figura 4). La primera repetición
termina 880 pb corriente arriba de ethR y la segunda
repetición empieza 3.908 pb corriente abajo de ethD. Se
identificaron tres regiones codificantes potenciales (orf4,
orf5 y orf6) en la región de 3.908 pb usando la
aproximación heurística del programa GeneMark (3). La comparación
de aminoácidos de Orf4, Orf5 y Orf6 usando el programa Blast no
mostró ninguna similitud significativa con las bases de datos
bacterianas de Genpept (1).
La repetición de 5,6 kpb consiste en un
transposón de clase II que contiene una repetición terminal
invertida de 38 pb, un gen tnpA que codifica una transposasa
putativa y un gen tnpR interrumpido con IS. Descontando la
secuencia IS entera, el gen tnpR inacto puede codificar una
resolvasa putativa de 311 aminoácidos. Las proteínas TnpA (1008
aminoácidos) y TnpR (311 aminoácidos) muestran una similitud de
aminoácidos muy alta con TnpA y Orf5, respectivamente del
transposón Tn4556 de Streptomyces fradiae (34). La
transposasa TnpA de S. fradiae es el pariente más próximo de
TnpA de G. terrae con 49% de identidad. Orf5 de Tn4556 de
S. fradiae es una potencial resolvasa de Tn4556 cuya
similitud con TnpR de R. ruber se extiende a la región
corriente arriba de este Off, sin hacer caso de un codón de parada
TAG mencionado por De Mot y col. (6). El polipéptido deducido de
324 restos es 31% idéntico a TnpR de R. ruber. El pariente
más próximo de TnpR de R. ruber es PmrA de Rhodococcus
erythropolis (62% de identidad), que es una recombinasa
específica de sitio de la familia de las integrasas y puede estar
implicada en la estabilización del plásmido críptico pFAJ2006 (6).
Las comparaciones de aminoácidos pusieron de manifiesto que otras
proteínas relacionadas con TnpR de R. ruber son casi
exclusivamente recombinasas específicas de sitio de la familia de
las integrasas. Esto sugiere que a diferencia de la mayoría de las
resolvasas de transposones de clase II, TnpR pertenece a la familia
de las integrasas y no a la familia de las
resolvasa-invertasas de recombinasas específicas de
sitio.
La región que codifica TnpR está interrumpida
por una inserción de 1409 pb en el codón 180, que introduce un
codón de parada en la posición 181. Esta inserción de 1409 pb
presenta todas las características estructurales de los elementos
móviles de la familia IS3. Las repeticiones invertidas de 45 pb
imperfectas flanquean un solo marco de lectura abierto con un
desplazamiento de marco de traducción. La proteína predicha tiene
420 aminoácidos de largo y muestra una similitud extendida con
varias transposasas de la familia IS3. La más estrechamente
relacionada es la transposasas 18999 de Mycobacterium avium
(Genpept AF232829_2) que es 40% idéntica a la transposasa de tipo
IS3 de R. ruber. La región que codifica la transposasa de
R. ruber de 420 aminoácidos superpone dos marcos de lectura
abiertos en la fase 0 y -1 que codifican, respectivamente, las
regiones N-terminal (108 aminoácidos) y la
C-terminal (312 aminoácidos) de la potencial
transposasa. Como para otros miembros de la familia IS3, el marco
de traducción puede ser un medio para producir varias proteínas
usando la misma región de codificación (5).
Para elucidar el mecanismo molecular responsable
de la deleción de 14,3 kpb, se clonó el fragmento BamHI de
9,3 kpb que es específico de los mutantes negativos para ETBE. La
organización genética del fragmento BamHI de 9,3 kpb se
determinó por secuenciación de cada extremo del fragmento (68 y 452
nucleótidos, respectivamente) y por análisis de restricción (Figura
4). El fragmento BamHI de 9,3 kpb corresponde a la región
23,7 kpb de tipo natural eliminada para una copia del transposón de
5,6 kpb y para la región intergénica entre las dos copias del
transposón. Esta deleción abarca el conjunto de genes eth que
está implicado en la degradación del ETBE. Por lo tanto, las
organizaciones genéticas de las cepas de tipo natural y mutantes
negativos para ETBE sugieren que la pérdida espontánea de la
capacidad para degradar el ETBE resulta de una recombinación
homóloga entre las dos repeticiones directas idénticas del
transposón de 5,6 kpb.
Rhodococcus ruber I-1889
es capaz de degradar el MTBE y el
terc-amil-metil-éter (TAME) a TBA y alcohol
terc-amílico (TAA) cuando los éteres se añaden junto con un
sustrato que permite el crecimiento como fuente de carbono (ref.
18: Hernandez-Pérez, Fayolle & Vandecasteele).
Con el fin de investigar si el sistema de enzimas responsable de la
escisión del ETBE también estaba implicado en la escisión de MTBE y
TAME, se compararon las actividades de degradación de las células
de tipo natural y mutantes en reposo cultivadas hasta la fase
logarítmica tardía en medio mineral que contenía glucosa al 0,5% y
ETBE 18 mM. Las actividades se determinaron midiendo la liberación
de TBA o TAA, respectivamente. El TBA y TAA se ensayaron por
cromatografía de gases usando un cromatógrafo Peri 2000 (Perichrom)
equipado con FFAP al 10%/Chromosorb 3 m número de malla
80-100 y un detector de ionización de llama. Las
células de tipo natural tenían una actividad específica de 31,9,
20,5 y 33,4 pmol.min^{-1}, DO_{600} -1, frente a ETBE, MTBE y
TAME, respectivamente. La actividad específica de la cepa mutante
era menor que 1 pmol.min^{-1} DO_{600} -1, lo que mostraba que
los genes presentes en el segmento eliminado eran necesarios para
la degradación de los tres sustratos.
Se ensayó en otras dos bacterias que degradan
ETBE, Rhodococcus zopfii depositadas en el CNCM el 20 de
julio, 1998, con el número de registro I-2053 y
Gordonia sp. IFP 2009, la presencia de sistemas de citocromo
P-450 similares a los codificados por el conjunto
de genes ethRABCD de R. ruber I-1889.
Se extrajo el ADN genómico entero de Rhodococcus zopfii
I-2053 y Gordonia sp. IFP 2009 como se ha
descrito antes, y se usaron en reacciones de PCR cebadas con los
oligonucleótidos CAY GCI YTI GAY TGG CAG ACS TT y TCI GTC CAI AGI
GCK ATC ATY TCI GTG U (1 = inosina, Y = T o C, S = G o C, K = G o
T). Estos corresponden a las posiciones 12216-12241
y 13107-13135, respectivamente, de la secuencia ID
SEC Nº 1. El segmento de ADN esperado corresponde a la región que
codifica los restos 59 a 365 del polipéptido del citocromo
P-450 de R. ruber. Las mezclas de reacción
contenían 100 pmol de cada cebador, 50-100 ng de ADN
molde, 400 M de cada dNTP, y 2,5 unidades de ADN polimerasa
LaTag^{TM} (Takara Biomedicals) en 50 1 de tampón GC 1
(suministrado por el fabricante con la ADN polimerasa). El programa
del ciclador para la PCR era el siguiente: 4 min a 94ºC, seguido de
35 ciclos: 1 min a 94ºC, 1 min a 65ºC, 1 min a 72ºC. En cada caso se
obtuvo un fragmento de 919 pb, clonado en el vector pCR®
2.1-TOPO® suministrado con el kit de clonación TOPO
TA (Invitrogen), y se secuenció. Tanto para R. zopfii
I-2053 como para Gordonia sp. IFP 2009, la
secuencia de ADN amplificada por los cebadores derivados de
ethB de R. ruber era al menos 98% idéntica a la de la
región correspondiente en R. ruber I-1889.
Además, el segmento de ADN amplificado de R. ruber
I-1889 se marcó y se usó como una sonda frente a
transferencias Southern de R. ruber I-1889,
R. zopfii I-2053 y Gordonia sp. IFP
2009 digeridos con diferentes enzimas de restricción. Como se
muestra en la Figura 6, en las tres cepas, la sonda hibridó con un
fragmento KpnI de 3 kb que cubría los genes ethABCD y
parte del gen ethR de R. ruber
I-1889. Además R. ruber
I-1889 y R. zopfii I-2053
compartían un fragmento PstI de 6,1 kb común que hibridaba
con la sonda de ethB, lo cual no se observó en
Gordonia sp. IFP 2009.
Estos resultados muestran que el gen ethB
es altamente conservado en varias especies bacterianas que tienen
la capacidad de degradar el ETBE, y que su presencia se puede
demostrar adecuadamente por PCR usando cebadores adecuados.
Sugieren que la similitud de secuencia se extiende al conjunto de
genes ethRABCD entero. La región que se extiende corriente
abajo del conjunto de genes puede ser más conservada en R.
ruber I-1889 y R. zopfii
I-2053 que en Gordonia sp. IFP 2009, puesto
que el tamaño del fragmento PstI que hibrida con la sonda de
ethB no está conservado en este último.
Se cultivaron clones individuales de R.
zopfii I-2053 y Gordonia sp. IFP 2009
hasta saturación en caldo de Luria y se subcultivaron durante 35
generaciones en el mismo medio. Los cultivos después se cribaron
según la presencia de variantes que ya no podían usar el ETBE como
una fuente de carbono, como se ha descrito para R. ruber
I-1889. En ambos casos se obtuvieron segregantes
que ya no podían crecer en ETBE, con una frecuencia mayor que 50%.
Se extrajo el ADN genómico de las cepas de tipo natural y mutante
para ambas especies, y se sometió a análisis Southern usando la
sonda derivada de ethB (véase antes) o una sonda derivada del
transposón duplicado que flanquea el conjunto de genes
ethRABCD en R. ruber I-1889. Este
último se obtuvo por amplificación de la PCR de la región que
comprende los nucleótidos 3630 a 9030 de la secuencia ID SEC Nº 1.
Para ambas especies, las cepas que ya no podían degradar el ETBE no
pudieron hibridar con la sonda de ethB, a diferencia de las
cepas de tipo natural (véase antes). Cuando se llevó a cabo la
hibridación con la sonda de transposón, se pusieron de manifiesto
dos fragmentos en las cepas de tipo natural, pero solo uno en las
cepas mutantes. Estas observaciones sugerían que en R. zopfii
I-2053 y en Gordonia sp. IFP 2009, el
conjunto de genes de ethRABCD está flanqueado por las
secuencias de tipo transposón duplicadas similares a las encontradas
en R. ruber I-1889. Esto conduce de la misma
forma a la inestabilidad de los genes responsables del fenotipo de
degradación de ETBE, que se pierden por recombinación entre las
regiones duplicadas.
El segmento de ADN
NheI-SacI situado entre los nucleótidos 9328
y 14253 se volvió a clonar entre los sitios XbaI y
SacI del vector pRE-7 (ref. Zheng, H.,
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shuttle vector. Plasmid 38, 180-187). El plásmido
recombinante, denominado pGT222, se reintrodujo en la cepa de R.
ruber que albergaba la deleción espontánea descrita antes. Los
transformantes se seleccionaron en LB que contenía kanamicina 100
g/ml. Se mostró que uno de los transformantes de R. ruber
recuperaba la capacidad para crecer usando ETBE como una fuente de
carbono. Esto indica que la región situada corriente abajo del
conjunto de genes ethRABCD no es necesario para el uso del
ETBE.
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1239
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1239)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína de Rhodococcus
ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 412
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1203
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1203)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína de Rhodococcus
ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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<210> 8
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<211> 400
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Rhodococcus ruber
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 321
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(321)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína de Rhodococcus
ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 312
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(312)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Rhodococcus ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4398
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(4398)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína de Rhodococcus
ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 331
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótidos sintéticos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacccccgcaa tcgtcggc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótidos sintéticos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgccggcggc tccgctga
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Instituto Pasteur
\hskip1cmInstituto francés del petróleo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> CONJUNTO DE GENES DEL CITOCROMO
P-450 DE RHODOCOCCUS RUBER Y SUS USOS EN LA
ESCISIÓN DE COMBUSTIBLE DE TIPO ÉTER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> B4851-IP/IFP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> XXXXXXXXXXXXXXXX
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-06-22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23656
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12342
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8766
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5576
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1239
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1239)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína de Rhodococcus
ruber
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 412
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1203
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1203)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína de Rhodococcus
ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 400
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 321
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(321)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína de Rhodococcus
ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 312
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(312)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Rhodococcus ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4398
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(4398)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína de Rhodococcus
ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 331
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhodococcus ruber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótidos sintéticos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacccccgcaa tcgtcggc
\hfill18
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótidos sintéticos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgccggcggc tccgctga
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm38
Claims (38)
1. Un ácido nucleico aislado que hibrida
específicamente en condiciones restrictivas con la ID SEC Nº 2.
2. Un ácido nucleico aislado que hibrida
específicamente en condiciones restrictivas con al menos uno de los
ácidos nucleicos de las ID SEC Nº: 5, 7, 9, 11 ó 13, en el que
dicho ácido nucleico codifica una proteína de ID SEC Nº: 6, 8, 10,
12 ó 14, respectivamente, o una variante funcional de la misma.
3. Un ácido nucleico que tiene las siguientes
propiedades:
- a)
- hibrida en condiciones restrictivas con un ácido nucleico de ID SEC Nº 2;
- b)
- cuando se transfiere a una célula bacteriana derivada de Rhodococcus ruber depositada en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) con el número de registro I-1889 por reorganización cromosómica que da como resultado una deleción de 14,3 kpb, confiere a esta bacteria la capacidad de escindir aditivos de combustible de tipo éter.
4. Un vector que comprende un ácido nucleico de
la reivindicación 1.
5. Un vector que comprende un ácido nucleico de
la reivindicación 2 o reivindicación 3.
6. El vector de la reivindicación 4, que es un
plásmido, un cósmido, un fago o un virus.
7. El vector de la reivindicación 5, que es un
plásmido, un cósmido, un fago o un virus.
8. Una bacteria Escherichia coli
recombinante que comprende un vector de la reivindicación 4 ó 5,
depositada en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos
(CNCM) el 19 de abril, 2001, con el nombre de Escherichia
coli K12 (pGT220) y el número de registro
I-2662.
9. Una sonda de ácido nucleico para detectar o
caracterizar cepas bacterianas que pueden escindir aditivos de
combustibles de tipo éter, que hibrida en condiciones restrictivas
con
- a)
- un ácido nucleico de ID SEC Nº: 1 y/o
- b)
- un ácido nucleico de ID SEC Nº: 2 y/o
- c)
- un ácido nucleico de ID SEC Nº: 3.
10. Un cebador de ácido nucleico que hibrida
específicamente con una secuencia de ADN de ID SEC Nº: 1, en el que
dicho cebador se puede usar para amplificar una secuencia de ADN
incluida en la ID SEC Nº: 1.
11. Un anticuerpo que se une específicamente a
un polipéptido de ID SEC Nº: 6, 8, 10, 12 ó 14.
12. Un citocromo P-450 de ID SEC
Nº: 8, o una variante del mismo, que cataliza la oxidación del
ETBE.
13. Un polipéptido de ID SEC Nº: 6, o una
variante del mismo.
14. Un polipéptido de ID SEC Nº: 10, o una
variante del mismo.
15. Un polipéptido de ID SEC Nº: 12, o una
variante del mismo.
16. Un polipéptido de ID SEC Nº: 14, o una
variante del mismo.
17. Un complejo de al menos dos de los
polipéptidos de acuerdo con las reivindicaciones 12 a 15.
18. Una bacteria recombinante derivada de la
cepa de Rhodococcus ruber depositada en la Colección Nacional
de Cultivos de Microorganismos (CNCM) con el número de registro
I-1889, por deleción de todo o parte de al menos
una copia del fragmento de ADN de la ID SEC Nº: 4.
19. Una bacteria recombinante en la que se ha
introducido una molécula de ácido nucleico de las reivindicaciones
2 ó 3, o un vector de la reivindicación 5 ó 7.
20. La bacteria recombinante de la
reivindicación 18 ó 19, que es capaz de escindir un aditivo de
combustible de tipo éter.
21. La bacteria recombinante de la
reivindicación 20, que puede usar ETBE como única fuente de
carbono.
22. La bacteria recombinante de las
reivindicaciones 18 a 21, que es capaz de degradar el TBA.
23. La bacteria recombinante de las
reivindicaciones 18 a 22, que es capaz de mineralizar completamente
un aditivo de combustible de tipo éter.
24. La bacteria recombinante de la
reivindicación 23, que es capaz de mineralizar completamente el
ETBE.
25. Un procedimiento para hacer que una célula
sea capaz de escindir un aditivo de combustible de tipo éter, que
comprende la etapa de introducir en dicha célula un ácido nucleico
de las reivindicaciones 2 a 3, o un vector de la reivindicación 5 ó
7.
26. El procedimiento de la reivindicación 25,
en el que dicha célula es una bacteria.
27. El procedimiento de la reivindicación 25,
en el que dicha célula es una célula vegetal, un hongo o una
levadura.
28. Un procedimiento para identificar en una
mezcla compleja la presencia de un microorganismo que comprende al
menos parte de la ID SEC Nº: 3 y que puede conferir a la cepa
bacteriana la capacidad de escindir un aditivo de combustible de
tipo éter, que comprende la etapa de poner en contacto una muestra
con una sonda de ácido nucleico de la reivindicación 9 y/o un
anticuerpo de la reivindicación 11.
29. Un procedimiento para identificar en una
mezcla compleja la presencia de un microorganismo que comprende al
menos parte de la ID SEC Nº: 3 y que puede conferir a una cepa
bacteriana la capacidad de escindir un aditivo de combustible de
tipo éter, que comprende la etapa de llevar a cabo una
amplificación de ADN con al menos un cebador de la reivindicación
10.
30. El procedimiento de la reivindicación 28 ó
29, en el que la mezcla compleja es una mezcla de agua, suelo,
lodo, sedimento, desechos de dragado, gas o residuos químicos.
31. Un biosensor para detectar la presencia en
una muestra de un microorganismo capaz de degradar el ETBE,
comprendiendo dicho biosensor un ácido nucleico de cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, 9 y 10, y/o un anticuerpo de la
reivindicación 11.
32. Un procedimiento para aislar un
microorganismo capaz de escindir un aditivo de combustible de tipo
éter, que comprende la etapa de detectar la presencia o ausencia en
una muestra, de al menos una parte de la ID SEC Nº: 3 y que puede
conferir a dicho microorganismo la capacidad de escindir un aditivo
de combustible de tipo éter.
33. Un procedimiento para aislar un
microorganismo capaz de escindir un aditivo de combustible de tipo
éter, que comprende la etapa de detectar la presencia o ausencia en
una muestra, de un ácido nucleico que hibrida en condiciones
restrictivas con una sonda de ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 9.
34. Un procedimiento para descontaminar un
efluente acuoso, un suelo, un lodo, un sedimento, un desecho de
dragado, un gas o un residuo químico contaminados con ETBE, que
comprende la etapa de poner en contacto dicho efluente, suelo,
lodo, sedimento, desecho de dragado, gas o residuo químico, con una
bacteria de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24.
35. El procedimiento de la reivindicación 34,
en el que la descontaminación se produce en un biorreactor.
36. El procedimiento de la reivindicación 34,
en el que la descontaminación se produce en el sitio, por adición
de bacterias de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24, al
medio contaminado.
37. El procedimiento de la reivindicación 34,
en el que las bacterias están confinadas en biobarreras, biofiltros
y/o biopilas.
38. El procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 34 a 37, en el que el efluente, suelo,
lodo, sedimento, desecho de dragado, gas o residuo químico que se
va a descontaminar se pone en contacto adicionalmente con otros
microorganismos capaces de degradar el contaminante o sus
subproductos de degradación.
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP01401667A EP1270722B1 (en) | 2001-06-22 | 2001-06-22 | Cytochrome p-450 gene cluster from rhodococcus ruber and uses thereof in ether fuel cleavage |
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ES2280325T3 true ES2280325T3 (es) | 2007-09-16 |
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Family Applications (1)
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