Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania biologicznie czynnego, niskosodowego, bezpirogenowego, jalowego i bezantygenowego ekstraktu calkowitego z narzadów ssaków i z ho¬ dowli komórkowych, skladajacego sie z mieszaniny substancji biologicznie czynnych o masie czasteczkowej ponizej 10000, na drodze rozdrabniania narzadów i roztwarzania komórek, od¬ wirowania, ultrafiltracji i elektrodializy# Znane sa sposoby wytwarzania ekstraktów z narzadów polegajace na zwyklej ekstrakcji przewaznie roztworem wodnym lub na mechanicznej obróbce narzadu. Rosnace znaczenie prze- szczepien szpiku kostnego, nerek, serca, krwi itp. i rozpoznanie biologicznej czynnosci organów, zwlaszcza grasicy (Hess, 1968), w zwiazku z szybkim rozwojem immunologii komórko¬ wej, spowodowalo intensywne badania w dziedzinie metod i sposobów wytwarzania biologicznie czynnych ekstraktów z narzadów do stosowania terapeutycznego. W zaleznosci od wymagan sta¬ wianych preparatowi podczas wytwarzania stosuje sie srodki zle tolerowane biologicznie, takie jak kwasy, aceton lub alkohol. Produkty te od ekstraktu calkowitego róznia sie zasad¬ niczo tym, ze chodzi w nich albo o czysty, dokladnie scharakteryzowany zwiazek, albo o do¬ kladnie zdefiniowana analitycznie mieszanine substancji z odpowiedniego narzadu.Stwierdzono nieoczekiwanie, ze znane przy wytwarzaniu ekstraktów z narzadów reakcje straceniowe mozna calkowicie pominac i z korzyscia zastapic przez denaturowanie na goraco - w wyroienniku cieplnym z na przemian pracujacymi nosnikiem ciepla i czynnikiem chlodzacym.Z publikacji J. luleckiego pt. "Technologia srodków leczniczych", PZWL, 1978, str. 268 znane jest wprawdzie doprowadzanie bialek do koagulacji droga ogrzewania w okreslonej tem¬ peraturze i ich usuwanie z ekstraktów substancji naturalnych, lecz w porównaniu z tym zna¬ nym postepowaniem sposób wedlug wynalazku odznacza sie tym, ze zarówno podwyzszanie jak i obnizanie temperatury przeprowadza sie najszybciej jak to jest mozliwe po to, zeby w trakcie2 145 552 termokoagulacji bialka nieczynnymi staly sie bakterie i enzymy zawarte w ekstrakcie, bez mozliwosci ich ponownego rozmazania w zakresie srednich temperatur lub ich ponownego uaktyw¬ nienia* Sposób wytwarzania omówionego ekstraktu calkowitego polega wedlug wynalazku na tym, ze rozdrabnianie i roztwarzanie prowadzi sie z otrzymanym w warunkach o mozliwie malej ilosci zarazków lub w warunkach jalowych i ewentualnie przechowywanym materialem wyjscio¬ wym* Tak przygotowany material ogrzewa sie w wymienniku ciepla w ciagu 3-10 minut do tem¬ peratury 70-90°C i w ciagu okolo 6 minut chlodzi sie do temperatury A-10°Cla po oddziele¬ niu droga odwirowania produktów wytraconych usuwa sie z roztworu droga ultrafiltracji za pomoca ukladu wlókien lumenizowanych substancje o masie czasteczkowej powyzej 10000, a z otrzymanego jako pozostalosc roztworu odbiera sie Jony soli droga elektrodializy w tempe¬ raturze 30-4o°C, Chociaz ekstrakt otrzymany w tym sposobie wytwarzania jest juz Jalowy i bezpiroge- nowy, to ewentualnie Jako srodek zabezpieczajacy mozna dodatkowo przeprowadzic saczenie wyjalawiajace, W wyraznym przeciwienstwie do juz znanych sposobów do ukladu w sposobie wedlug wy¬ nalazku wcale nie wprowadza sie z wyjatkiem wody - zadnych obcych substancji. W szczegól¬ nosci do materialu wyjsciowego, do rozmaitych produktów posrednich i do produktu koncowego nie dodaje sie ani srodków konserwacyjnych, ani jakichkolwiek dodatków chemicznych, ta¬ kich jak srodki bakteriobójcze (np. azydki), zwyczajowo zapewniajacych jalowosc i bezpiro- genowosc,a otrzymany ekstrakt jest bezpirogenowy i jalowy z powodu drogi wytwarzania.Wyrugowanie jakiegokolwiek dodawania obcych substancji w toku postepowania oznacza dla pacjentów zalete zwiekszonego bezpieczenstwa, dla wladz rejestrujacych leki zalete latwe¬ go opiniowania, a dla producenta zalete mniejszych nakladów.Szczególnie godnym wspomnienia w przypadku sposobu wedlug wynalazku Jest swiadoma rezygnacja ze stosowania Jakichkolwiek materialów nosnikowych lub ze stosowania wszelkiego rodzaju rozdzielania na drodze chromatografii kolumnowej. Równiez dzieki temu nowy sposób stanowi jaskrawe przeciwienstwo znanych sposobów ekstrakcyjnych; produkt takiego postepo¬ wania w swym skladzie odpowiada tej znaczacej róznicy.Jezeli bowiem substancje ekstraktu podzieli sie na grupy ze wzgledu na ich podsta¬ wowe zachowania fizyko-chemiczne, to dla ekstraktu wytworzonego sposobem wedlug wynalazku rysuje sie nastepujacy obraz: 1 grupa: substancje hydrofilowe (przewaznie czesc A na pozytywne wskazanie ninhydryny) fig# 1 2 grupa: jony soli 3 grupa: substancje hydrofobowe (przewaznie czesc B na pozytywne wskazanie aldehydu anyzowego) fig. 1 W fig. 1 na rysunku przedstawiono schemat podzialu na te trzy grupy.W przypadku usuwania droga chromatografii kolumnowej niepozadanej czesci jonów soli, np. w kolumnie z warstwa Sephadex (R), w produkcie koncowym zaledwie pozostaje omówiona wyzej czesc A substancji, natomiast czesc B, tj. obok jonów soli wszystkie substancje hy¬ drofobowe, a nawet tez czesc substancji pozytywnie reagujacych na ninhydryne stanowi strate.Substancje z czesci B, jak dowiedziono, wykazuja dzialanie biologiczne; ich strata oznacza zatem dla odpowiedniego preparatu dotkliwa wade w porównaniu z ekstraktem calkowitym, wy¬ tworzonym sposobem wedlug wynalazku.Rza tym droga chromatografii kolumnowej do ukladu wprowadza sie obca substancje, a mianowicie material nosnikowy. Skutkiem tego zachodzi z reguly niebezpieczenstwo bakteryj¬ nego zanieczyszczenia produktu, prowadzace do pirogenicznych produktów koncowych, podczas gdy otrzymany sposobem wedlug wynalazku produkt koncowy jest bezpirogenowy.145 552 3 Dzieki pominieciu rozdzielania chromatograficznego odpada po pierwsze duzy naklad czasu zwiazany z eluowaniem^a po drugie naklad pracy niezbednej nastepnie dla usuniecia stosowanych wielkich ilosci eluenta (wody).Otrzymuje sie zatem ekstrakt calkowity, który - w porównaniu z produktami juz zna¬ nych sposobów ekstrakcyjnych - zawiera wszystkie biologicznie czynne substancje, zwlaszcza wszystkie malo czasteczkowe ( < 10000) peptydy i który dzieki malej zawartosci soli oraz bezpirogenowosci i bezantygenowosci moze byc aplikowany bezposrednio, bez zadnych dalszych zabiegów.Sposób ten mozna stosowac do wytwarzania wszelkich mozliwych ekstraktów z narzadów.Najwazniejszymi materialami wyjsciowymi sa nastepujace narzady i tkanki: sledziona, grasica, watroba, serce, lozysko, szpik kostny i krew; ltozna tez jednak wytwarzac ekstrak¬ ty z hodowli komórkowych, zwlaszcza z hodowli komórek zwierzecych, np. z hodowli tyroo- cytów (komórek grasicy), z komórek nerkowych plodu cielecego, z leukocytów, z komórek hy¬ brydowych, z fibroblastów itp. Oczywiscie mozna jako material wyjsciowy stosowac nie tylko hodowle komórek same, lecz tez wyrosle masy komórkowe z odpowiednich hodowli* Sposób ten nie ogranicza pochodzenia i wstepnej obróbki materialu wyjsciowego. Dzia¬ lanie biologiczne ekstraktu nie ogranicza sie do Jednej klasy substancji lub do jednego wskazania lekarskiego. Ekstrakt powstaly w tym sposobie mozna na drodze dalszych etapów rozdzielac na frakcje i mozna z niego wyodrebniac czyste substancje. a) Rozdrabnianie i roztwarzanie komórek* Pozyskiwanie narzadów lub hodowli komórkowych zachodzi kazdorazowo z zachowaniem su¬ rowych przepisów pracy w warunkach malej ilosci zarazków lub w warunkach jalowych. W przy¬ padku narzadów zwierzecych material odtluszczony poddaje sie obróbce bezposrednio po jego uzyskaniu, tj. rozdrabnia i roztwarza sie. Jezeli to nie jest natychmiast mozliwe, zamraza sie ten material do niskiej temperatury, np. do temperatury -25°C, lub tez w cieklym azocie, i w tym nisko zamrozonym stanie przechowuje az do jego obróbki; dzieki temu zawarte bakte¬ rie i enzymy sa nieczynne. Te ewentualnie, nisko zamrozone narzady przeprowadza sie w kutrze w subtelna brzeczke, a komórki przez rozcienczenie w stosunku 1:1 (wagowo robjeto sciowo) bezpirogenowa, jalowa woda redestylowana przeprowadza sie do roztworu.W przypadku hodowli komórkowych powinno pozyskiwanie i ewentualnie przechowywanie nastepowac w warunkach jalowych. Rozdrabnianie i roztwarzanie prowadzi sie korzystnie droga dzialania ultradzwiekami. Obróbka utradzwiekowa powinna nastepowac wobec chlodzenia, ko¬ rzystnie w temperaturze okolo 0-10°C. b) Stracanie protein droga ogrzewania.Brzeczke te ogrzewa sie w ukladzie przeplywowym, a nastepnie w drugim takim ukladzie chlodzi sie. Brzeczka przeplywa przy tym przez spiralnie ulozona rure stalowa, tkwiaca w plaszczu rurowym omywanym przez nosnik ciepla lub czynnik chlodzacy. Iredkosc przeplywu brzeczki mozna kontrolowac. W porównaniu z tradycyjnym ogrzewaniem w kolbach kulistych mozna znacznie zaoszczedzic na czasie i osiagnac powtarzalne stracanie protein.Ten rodzaj i ta droga denaturowania na goraco wnosza ze soba rzeczywiscie rózne swoiste korzystne cechy. Wskutek efektywnej i szybkiej wymiany ciepla czynnika grzewczego lub chlodzacego z produktem, który dzieki ukladowi mieszajacemu w rurze jest nieprzerwanie mieszany tak, ze wszystkie czasteczki ogrzewaja sie równomiernie, mozliwe Jest ciagle prowadzenie postepowania z dowolnie duzymi ilosciami produktu.System konstrukcji zespolowej wymiennika cieplnego umozliwia w danym przypadku dopasowanie warunków do wrazliwosci preparatu lub do wymagan, np. dajaca sie regulowac temperature, dajacy sie regulowac czas przebywania lub czas reakcji, stopniowo dajace sie regulowac podwyzszenie temperatury. Ten sposób konstrukcji pozwala wiec na lagodna i optymalna zarówno fizycznie jak i biochemicznie obróbke produktu.k 145 552 Szybka zmiana temperatury skraca czas postepowania, np, czas denaturowania na go¬ raco, o 7596 i wiecej w porównaniu z tradycyjnym sposobem za pomoca kolby kulistej. Dzieki temu oszczedza sie nie tylko czas, lecz takze dzieki lepszemu stopniowi sprawnosci oszczedza sie energie, c) Oddzielanie straconego materialu.Rozdzielanie warstwy stalej i cieklej nastepuje na drodze odwirowania, korzystnie w wirówce sedymentacyjnej, Rmiewaz za pomoca wirówki laboratoryjnej rozdzielac mozna tylko dosc male ilosci (dla 10 litrów potrzeba dwóch pelnych godzin), szczególnie korzystne okazalo sie stosowanie ukladu przeplywowego zarówno dla tego etapu postepowania, jak i dla ciaglego wytwarzania, Vfykorzystuje sie np, szybka wirówke sedymentacyjna o nazwie Schnell- dekanter von Flottweg Werk (firmy Dr, Georg Bruckmayef OnbH und Co, KG, Vilsbiburg, Republi¬ ka Federalna Niemiec), Ebdczas gdy substancje stale moga znalezc zastosowanie jako pro¬ dukty uboczne, to warstwe ciekla doprowadza sie do nastepnego etapu, d) ULtrafiltracja za pomoca ukladu wlókien lumenizowanych.Wyklarowany roztwór wodny z wirówki sedymentacyjnej zadaje sie sukcesywnie 3 obje- tosciami bezpirogenowej, jalowej i redestylowanej wody, po czym poddaje ultrafiltracji.Ultra filtracja ta moze tez zachodzic przy ciaglym dodawaniu kilkukrotnych objetosci wody, !fa to te zalete, ze w mozliwie takich samych warunkach droga filtracji osiaga sie opty¬ malna wydajnosc czastek o masie czasteczkowej < 10000, Równiez na drodze regulowania predkosci przeplywu i cisnienia wywiera sie wplyw na jakosc i ilosc skladników swoistych przesaczu, Ultrafiltracja zachodzi w urzadzeniach ultrafiltracyjnych z wloknem.lumenizo- wanym o nazwie Romicon HF /"firmy: Romicon Ihc,, Woburn (MA, Stany Zjedn, Am,)/ lub Amicon /"firmy: Amicon Corporation, Danvers (MA, Stany Zjedn, Am,)/ z h ladunkami po 2,5 m po¬ wierzchni przepony. Oddziela sie przy tym wszystkie czasteczki o masie czasteczkowej 10000 W ciagu godziny mozna poddac ultrafiltracji w temperaturze 4°C 160 litrów, Eteieki ciaglemu rozcienczaniu przesacza sie mozliwie wszystkie male czasteczki.Dalsza zaleta sposobu polega na tym, ze trzy wyzej omówione etapy b, c i d mozna zlaczyc w jeden uklad, za pomoca którego mozliwe Jest ciagle wytwarzanie. Kazde urzadzenie mozna wykorzystac pojedynczo lub ponownie razem w szeregu dolaczyc do wymiennika cieplnego.Otrzymany ultrafiltrat doprowadza sie nastepnie do malej objetosci, np, na drodze destylacji prózniowej. Korzystnie zateza sie do jednej dziesiatej lub dwudziestej czesci pierwotnej objetosci, e) ELektrodializa, W przyrzadzie do elektrodializy o nazwie Elektrodialyse-Oerót (np. model BEL II firmy Berghof GmbH, TUbingen, Republika Federalna Niemiec) z zatezonego ultrafiltratu od¬ biera sie jony rozpuszczonej soli przez przylozenie róznicy potencjalów w polu elektrycz¬ nym. Ifejszybciej wedruja najmniejsze jony z pojedynczym ladunkiem, co stwarza zalete ograniczenia selektywnej drogi postepowania. Wlasnie tak przez przepone wedruja tylko jony o masie czasteczkowej < 400. Efekt odsalania jest zalezny od czasu przylozonej róznicy potencjalów, jakosci przepony i skladu ekstraktu. Rózne czynniki w ekstrakcie wywieraja wplyw na teoretyczne podstawy procesu elektrodializy, tak wiec optymalne warunki dla odsalania ekstraktu nie moga byc obliczone z powodu wielu nieznanych i musza byc wypra¬ cowane jako wartosci doswiadczalne. Ustalono, ze male jony soli, takie jak Cl" i Tfe* mozna w ciagu 2 godzin usunac z ekstraktu praktycznie ilosciowo. Optimum jednak nie musi znajdowac sie przy I00°4-owym odsoleniu jonów Cl" i Na+, gdyz wystepujaca przy tym strata innych wolno wedrujacych malych jonów, takich jak aminokwasy, peptydy, itp., moze oznaczac uszczerbek czynnosci biologicznej.Rmiewaz napiecia nie mozna dowolnie podwyzszac (elektroliza), po kazdej, przy¬ rzadowi odpowiadajacej, ilosci dializowanego ekstraktu z narzadów przepony musza byc oczysz¬ czane droga odwrócenia biegunowosci i przemywania. Stwierdzono równiez, ze elektrodializa w temperaturze 30-4o°C zachodzi szybciej, a w temperaturze okolo 37°C nawet trzykrotnie szybciej niz w temperaturze 2o°C, nie powodujac przy tym zadnych róznic w produkcie. Obok145 552 5 przyspieszonego transportu jonów obnizala sie skutecznosc polaryzacji i przylaczanie nienaladowanych lub organicznych naladowanych czasteczek (galaretyzacja )f które zmienia przegrode selektywna dla jonów.Rmiewaz energia wydatkowana w celu oddzielenia jonów przeksztalca sie w wiekszej czesci w cieplo, nalezy dla utrzymania temperatury 37°C stosowac wiec tylko nieznaczna ilosc energii, co lacznie ze skróceniem czasu daje korzystny skutek dla produkcji* Znane jest Jako bardzo kosztowne dotychczas ogólnie stosowane odsalanie chroma¬ tograficzne w kolumnie, zas niebezpieczenstwo bakteryjnego zanieczyszczenia, zwlaszcza w przypadku odczynu o obojetnych wartosciach pH, jest przy tym bardzo duze; nadto w przy¬ padku chromatograficznego odsalania kolumnowego wraz z frakcja soli oddziela sie rózne substancje biologicznie czynne, Z tego klarownie widac zalety zwiazane z odsalaniem na drodze elektrodializy.Otrzymane sposobem wedlug wynalazku ekstrakty calkowite bada sie na Jalowosc, pi- rogenicznosc i antygenicznosc wedlug nastepujacych metod: - jalowosc: farmakopea St. Zjedn. Am. o nazwie US-Fharmacopoe XX (1980), str, 878-882; europejska farmakopea o nazwie Europaische Riarmacopoe, 2#Auflage (wydanie), 1* ffechtrag (suplement), str, 52-555 - pirogenicznosc: Europaische Riarmacopoe, tom II, Schweizer Ausgabe (edycja), str, 56-59; - antygenicznosc: US-Riarmacopoe XX (1980), str, 688 (zmodyfikowana dla dializatu).Biologiczne dzialania ekstraktów mozna stwierdzac zarówno w tescie ferburg'af na drodze podwyzszania oddychania homogenizatów watroby, Jak i na drodze unormowania proli¬ feracji hodowli odwracalnie uszkodzonych fibroblastów, W badaniu klinicznym ekstrakt cal¬ kowity sledziony i ekstrakt calkowity grasicy wykazuja dzialanie regulujace lub normali¬ zujace wzgledem zaklóconego ukladu immunologicznego ludzi.Wspomniane dzialanie biologiczne dla ekstraktów, wytworzonych wedlug podanych na¬ stepnie przykladów, przedstawiono w tablicach 1 i 2 lub w fig, 2, 3 i 4 na rysunku.Tablica 1 Wspólczynnik podwyzszania zuzycia Ou w tescie \farburg'a przez ekstrakt calkowity /10 mg testowanej substancji/ml/ Czas Wartosc R^epa- Sledzie- CFasi- Sfcpik Rdzen 9uro- Krew Krew Lozysko pomiaru spraw- rat po- na (cie- ca (cie- kos- krego- wica (cie- odwlók-(owcy) dzianowa równaw- leca) leca) tny wy krwi leca) niona bez sub- czy (ciele-(cie- (cie- (ciele- stancji cy) lecy) leca) ca) testowa¬ nej 30 min. 1 2,2 2,7 3,9 2,5 2,6 2,2 1,9 2,0 2,7 45 min. 1 2,3 2,7 4,0 2,5 2,7 2,3 1,9 2,1 2,8 60 min. 1 2,5 2,8 4,1 2,6 2,9 2,3 2 2,2 3,0 Metoda: 1,1 ml buforu Só'rensen'a, 1,0 ml homogenizatu watroby, 0,2 ml roztworu testowanego, 0,2 ml KOH 10#-owego, Aparatura: respirometr róznicowy, kapiel wodna, 37°C, czestosc wstrzasania 100/minute; Homogenizat watroby: 2 g watroby na 15 ml buforu; Roztwory testowane: 10 mg substancji testowanej na 1 ml; Preparat porównawczy: wedlug opisu patentowego Republiki Federalnej Niemiec nr 1 076 8886 145 552 Tablica 2 Wspólczynnik podwyzszenia zuzycia 0^ w tescie Warburg 'a przez ekstrakt calkowity grasicy lub sledziony Wartosc spraw- Ireparat porównawczy Ekstrakt grasicy Ekstrakt sledziony Domiaru dzianowa bez mg/ml mg/ml mg/ml sSSnejJi tG" 50 12'5 6»25 50 12'5 6'25 50 12*5 6'25 Czas 30 min. 1 4,3 2,2 1,3 5,4 4,0 2,1 5,2 3,3 1,8 45 min, 1 4,6 2,2 1,2 -5,8 4,0 1,9 5,6 3,3 1,6 60 min. 1 4,9 2,2 1,1 6,5 4,1 1,8 6,3 3,3 1,5 Metoda: 1,1 ml buforu Sórensen'a, 1,0 ml homogenizatu watroby, 0,2 ml roztworu testowanego, 0,2 ml KOH I0#-owego; Aparatura: respirometr róznicowy, kapiel wodna, 37°C, czestosc wstrzasania 100/minute; Homogenizat watroby: 2 g watroby na 15 ml buforu; Roztwory testowane: 10 mg substancji testowanej na 1 ml; Freparat porównawczy: wedlug opisu patentowego Republiki Federalnej Niemiec nr 1 076 888 Figury 2, 3 i 4 unaoczniaja wbudowanie H-tymidyny w DNA uszkodzonych fibroblastów po dodaniu róznych roztworów testowanych. Fibroblasty te uszkadza sie odwracalnie w fazie wzrostu przez odebranie weglanu. R) dodaniu substancji testowanej normalizuje sie proli¬ feracja fibroblastów, mierzona na wbudowaniu 5H-tymidyny.Roztwór preparatu porównawczego mial stezenie 42 mg/ml, natomiast wszystkie inne roztwory testowane wykazywaly 10 mg substancji suchej w 1 ml. Freparat porównawczy testowa¬ no dla stezenia ^% i 3% objetosciowo/objetosciowych, a wszystkie inne dla stezenia 0,2, 0f5, 1, 3 i 5% objetosciowo/objetosciowyeh.W fig. 2, 3 i 4 skrót 0.Z. oznacza: bez dodatku, US 200 stanowi preparat porównawczy wedlug opisu patentowego Republiki Federalnej Niemiec nr 1 076 888 (K.-H. Jaeger), placebo sklada sie z mieszaniny substancji o masie czasteczkowej < 1 0000'wystepujacych zazwyczaj w krwi ssaków.Charakterystyka produktów spbsobu: cieczowa chromatografia cisnieniowa, zwana tez HPLC, nadaje sie znakomicie do scharakteryzowania ekstraktów z narzadów, poniewaz metoda ta przede wszystkim gwarantuje dobre rozdzielenie poszczególnych substancji i dobra powta¬ rzalnosc. Dzieki temu mozna dosc latwo stwierdzic róznice w skladach róznych preparatów.Metoda ta pozwala tez na dostosowanie ukladu do postawionego zadania. Stosowane warunki wzorcowe sa nastepujace: uklad buforowy: 0,01 M (N^J^PO^ faza ruchoma A: 0,01 M (NH, )2P0a w 0,1%-owym kwasie propionowym faza ruchoma B: 90#~owy metanol stopniowanie: 0% B do 95% B czas: 30 minut przeplyw: 1,5 ml/minute, zapis: 10 mm/minute dlugosc fali ^ : 254 nm kolumna: RP 8 (firma: E.Merck AG, Darmstadt, RFN).Metoda ta pozwala, w przypadku otrzymanych ekstraktów, np. ekstraktu sledziony, na stwierdzenie wyraznych róznic miedzy tradycyjnym lub starym sposobem dializy wedlug opisu patentowego Republiki Federalnej Niemiec nr 1 076 888 (fig. 5) a sposobem wytwarzania wedlug wynalazku czyli nowym sposobem (fig. 6): wykresy róznia sie zwlaszcza w dwóch miejscach:145 552 7 na poczatku wykresu, rozpoczynajac z prawej strony, stary sposób w porównaniu z nowym wykazuje tylko maly pik* Trzy dominujace piki w lewej polowie wykresu w fig* 5 wskazuja na obecnosc srodka konserwujacego /Nipagin/Niapsol/, natomiast w przypadku nowego sposobu (fig* 6) Jest calkowity brak tego srodka konserwujacego, Ekstrakt grasicy wytworzony sposobem wedlug wynalazku daje podobny zarys eluowania (fig* 7) jak odpowiednio wytworzony ekstrakt sledziony (fig. 6). Po hydrolizie ekstraktu grasicy (6N HClf 18 hf 110°C) znikaja charakterystyczne piki (fig* 8)* lfe drodze frakcjo¬ nowania i chromatografii cienkowarstwowej z odpowiednim barwieniem mozna stwierdzic, ze zanikle piki wywodza sie z substancji pozytywnie reagujacych na ninhydryne* Dalszego dowodu na to, ze udzial peptydów w ekstraktach wytworzonych sposobem wedlug wynalazku Jest o wiele wiekszy, dostarcza zogniskowanie izoelektryczne (rozdziela¬ nie wedlug punktu izoelektrycznego). W ekstraktach wytworzonych nowym sposobem mozna stwierdzic powyzej 30 wyraznych pasm blekitu Gomassie 'go, natomiast w przypadku znanych ekstraktów sa widoczne tylko pojedyncze, slabo dajace sie barwic pasma* Przyklad I* Orasica* 5 kg grasicy cielecej, natychmiast bez tkanki tluszczo¬ wej nisko zamrozonej i przechowywanej w temperaturze -25°C, rozdrabnia sie w kutrze do postaci brzeczki* Do brzeczki tej doprowadza sie 5 litrów bezpirogenowej, redestylowanej wody i w podgrzewaczu przeplywowym w ciagu 10 minut w temperaturze 80°C straca sie sklad¬ niki wielkoczasteczkowe, lfestepnie na drodze odwirowania (wirówka, dekanter) oddziela sie warstwe stala od ochlodzonej brzeczki* Do cieklej pozostalosci w celu ciaglej ultrafil- tracji doprowadza sie ponownie 10 litrów bezpirogenowej /"powierzchnia przepony 2,5 m , BMO systemu Romicon HF 1/3 Sj* Z zatezonego ultrafioletu odbiera sie droga elektrodiali- zy jony soli* Otrzymuje sie niskosodowy, bezpirogenowy i bezantygenowy ekstrakt grasicy* Przyklad II* sledziona* a) 5 kg swiezego narzadu sledziony ze zdrowych cielat natychmiast bez tkanki tlusz¬ czowej zamraza sie w niskiej temperaturze* Nisko zamrozone bloki przetwarza sie w kutrze do postaci jednorodnej brzeczki, która razem z 6 litrami bezpirogenowej wody ogrzewa sie w podgrzewaczu przeplywowym (o dlugosci rury 5 m) w ciagu 5 minut w temperaturze 80°C i utrzymuje w obiegu w ciagu 8 minut w niezmienionej temperaturze 80°C* R ochlodzeniu w ciagu 6 minut w chlodnicy przeplywowej do temperatury 4°C oddziela sie droga odwirowania substancje wytracone. Ciekla pozostalosc wraz z 18 litrami bezpirogenowej wody poddaje sie ciaglej ultrafiltracji (masa czasteczkowa < 10000)* Jbny soli odbiera sie mozliwie dokladnie z tego koncentratu droga elektrodializy* Tfesty oznaczania wzrostu mikroorganizmów, przeprowadzone po wszystkich etapach tego postepowania, byly negatywne* b) 250 kg swiezego narzadu sledziony zdrowych cielat natychmiast (bez tkanki tlusz¬ czowej) zamraza sie do niskiej temperatury* Nisko zamrozone bloki przetwarza sie w kutrze do postaci jednorodnej brzeczki, która nastepnie razem z 250 litrami bezpirogenowej wody ogrzewa sie w podgrzewaczu przeplywowym (dlugosc rury 20 m) w ciagu 5 minut (5 minut = czas przebywania czastki w rurze ) do temperatury 80°C, po czym w chlodnicy przeplywowej chlodzi sie w ciagu 6 minut do temperatury 4°C* W kolejno podlaczonym dekanterze oddziela sie wytracone substancje stale. Vlbdna pozostalosc po dodaniu 900 litrów bezpirogenowej wody poddaje sie ciaglej ultr^filtracji (masa czasteczkowa < 10000). Ultrafiltrat zateza sie w wyparce z obiegiem cieczy, po czym saczy w warunkach Jalowych. Z porcji koncentratu odbiera sie droga elektrodializy jony soli, tak wiec powstaje niskosodowy roztwór wodny substancji maloczasteczkowych sledziony. Rstepowanie nastepuje w ukladzie zamknietym.Przyklad III. Surowica krwi cielecej. Do 6 litrów surowicy ze swiezej krwi cielecej dodaje sie 3 litry bezpirogenowej wody. Zawiesine te ogrzewa siew podgrzewaczu przeplywowym do temperatury 75°C, utrzymuje w ciagu 5 minut w niezmienionej temperaturze 75°C, po czym chlodzi do temperatury 4°C w takim samym ukladzie rurowym. Wytracone sub¬ stancje oddziela sie na drodze odwirowania. 5,5 litra wodnej pozostalosci wraz z 15 litrami bezpirogenowej wody poddaje sie ciaglej ultrafiltracji (masa czasteczkowa < 10000). Fb8 1^5 552 mozliwie najdokladniejszym usunieciu soli droga elektrodializy otrzymuje sie jalowy i bezpirogenowy roztwór. Ten malo czasteczkowy ekstrakt surowiczy powoduje w przypadku fibroblastów, uszkodzonych odwracalnie w hodowli, unormowanie proliferacji.Przyklad IV. Swieza krew cieleca* 5 litrów swiezej krwi cielecej miesza sie z 5 litrami bezpirogenowej wody i ogrzewa w podgrzewaczu przeplywowym do temperatury 80°C# Fb trzyminutowym utrzymywaniu w niezmienionej temperaturze 80°C zawiesine chlodzi sie w chlodnicy przeplywowej do temperatury 4°C, a wytracone produkty usuwa sie droga odwirowania. 6 litrów wodnej pozostalosci wraz z 18 litrami bezpirogenowej wody poddaje sie ciaglej ultrafiltracji (masa czasteczkowa < 10000). Fb mozliwie starannym wyelimino¬ waniu soli droga elektrodializy otrzymuje sie Jalowy i bezpirogenowy roztwór» Tkk uzys¬ kany maloczasteczkowy ekstrakt krwi cielecej powoduje w przypadku fibroblastów, uszko¬ dzonych w hodowli, unormowanie proliferacji.Przyklad V# Odwlókniona krew cieleca. 5t1 kg odwlóknionej krwi cielecej wraz z 5 litrami bezpirogenowej wody ogrzewa sie w podgrzewaczu przeplywowym do tempera¬ tury 80°C i utrzymuje sie w ciagu 5 minut w równie wysokiej temperaturze. Jfestepnie brzecz¬ ke te chlodzi sie w chlodnicy przeplywowej do temperatury 4°C, a wytracenia oddziela sie droga odwirowania. 7 litrów wodnej pozostalosci wraz z 18 litrami bezpirogenowej wody poddaje sie ciaglej ultrafiltracji (masa czasteczkowa < 10000). Fb przeprowadzonej na¬ stepnie elektrodializie otrzymuje sie niskosodowy, jalowy i bezpirogenowy roztwór zatezony.Roztwór powoduje w przypadku fibroblastów, uszkodzonych odwracalnie w hodowli, unormowanie proliferacji.Przyklad VI. Rdzen kregowy cielecy. Z kregu swiezo ubitych zdrowych cielat wyodrebnia sie 5 kg rdzenia i wraz z 5 litrami bezpirogenowej wody ogrzewa sie w podgrze¬ waczu przeplywowym do temperatury 80°C i utrzymuje w ciagu 5 minut w tej samej tempera¬ turze. Ifestepnie brzeczke te chlodzi sie w chlodnicy przeplywowej do temperatury A°C.R odwirowaniu mozna stosowac 1/3 objetosci jako pozostalosc w nastepnym etapie. Te 3 litry wraz z 9 litrami bezpirogenowej wody poddaje sie ultrafiltracji (masa czasteczkowa K. 10000).Z zatezonego koncentratu odbiera sie Jony soli droga elektrodializy.Niskosodowy roztwór byl jalowy i bezpirogenowy. W przypadku fibroblastów, odwra¬ calnie uszkodzonych w hodowli, powodowal on unormowanie proliferacji, a w komórkach szpiku kostnego podwyzszenia czynnosci dezoksytransferazy koncowej.Przyklad VII. Rdzen z kosci udowej. Brzeczke 3,5 kg rdzenia z 30 kg kosci udowych ze swiezo ubitych cielat ogrzewa sie wraz z 5 litrami bezpirogenowej wody w pod¬ grzewaczu przeplywowym do temperatury 75°C. Zawiesine te utrzymuje sie w ciagu 5 minut w temperaturze 75°C. R ochlodzeniu w chlodnicy przeplywowej do temperatury 4°C oddziela sie zakrzeply tluszcz od pozostalego roztworu. Fb odwirowaniu odtluszczonego roztworu 5 litrów wodnej pozostalosci wraz z 15 litrami bezpirogenowej wody poddaje sie ciaglej ultra¬ filtracji (masa czasteczkowa ^10000). Z zatezonego preparatu odbiera sie droga elektro- dializy jony soli. Niskosodowy roztwór jest jalowy i bezpirogenowy. W przypadku fibroblas¬ tów, odwracalnie uszkodzonych w hodowli, powoduje on unormowania proliferacji i podwyz¬ szenie aktywnosci dezoksytransferazy koncowej.Przyklad VIII. Lozysko owcy. A,700 kg brzeczki z nisko zamrozonych rozet swiezych lozysk owczych ogrzewa sie wraz z 5 litrami bezpirogenowej wody w podgrzewaczu przeplywowym do temperatury 80°C i utrzymuje w obiegu w ciagu 5 minut w temperaturze 80°C.Fb ochlodzeniu do temperatury h°C oddziela sie wytracenia droga odwirowania, a 7 litrów wodnej pozostalosci wraz z 10 litrami bezpirogenowej wody poddaje sie ciaglej ultrafiltracji (masa czasteczkowa ^10000). Niskosodowy roztwór otrzymany po elektrodializie jest jalowy i bezpirogenowy. W przypadku fibroblastów, odwracalnie uszkodzonych w hodowli, powoduje on unormowanie proliferacji.1.45 552 9 Przyklad IX* Tymocyty. 10 kg swiezego narzadu grasicy cielecej rozciera sie z 10 litrami buforowanego fosforanem roztworu chlorku sodowego (pH = 7,2) na drobno- oczkowym sicie za pomoca gumowego korka. Dzieki temu rozpuszcza sie tymocyty z tkanki narzadu, pozostale czesci tkanki odrzuca sie. Tymocyty te nastepnie 2-krotnie przemywa sie buforowanym przez fosforan roztworem chlorku sodowego, po czym rozprowadza w 10 litrach redestylowanej, bezpirogenowej wody /18.10 komórek/ml/. Tymocyty te v 100 ml porcjach roztwarza i rozdrabnia sie za pomoca ultradzwieków (Soniprep 150tamplituda 4, srednia czestotliwosc) w ciagu 1 minuty. Brzeczke tymocytowa wraz z dalszymi 10 litrami redestylo¬ wanej, bezpirogenowej wody ogrzewa sie w podgrzewaczu przeplywowym do temperatury 80°C i po uplywie 10 minut ponownie chlodzi do temperatury 10°C. Denaturowane proteiny i inne nierozpuszczalne fragmenty komórek oddziela sie droga-odwirowania w wirdwce 9orvall'a z przelotowym rotorem TZ-28 /20000 obrotów/minute, czas przebywania 10 minut/. Wstepnie wodna pozostalosc wraz z dals*a porcja 2o litrów redestylowanej, bezpirogenowej wody poddaje sie ciaglej ultrafiltracji (granica wylaczenia masy czasteczkowej 10000).Ultrafiltrat zateza sie do 2000 ml i poddaje elektrodializie. W przypadku fibroblastów, uszkodzonych przy C02, produkt peptydonosny wykazuje czynnosc wzmagajaca wzrost.Przyklad X. Komórki nerkowe plodów cielecych. Komórki nablonkowe nerek plo¬ dów cielecych (FKNF) w butlach cylindrycznych o pojemnosci do 850 ml poddaje sie hodowli z "Minimal Essential Medium" /"Science 130, 432 (1958)/ i 7% surowicy cielecej, te krótko przed utworzeniem zamknietej okrywy komórkowej przemywa sie warstwy komórkowe buforowanym przez fosforan roztworem chlorku sodowego (pH»7,2), rozpuszcza za pomoca etylenodwuamino- czterooctanu i wody oraz skrobaka gumowego, i rozprowadza w lacznie 4 litrach redestylo- wanej, bezpirogenowej wody. Te komórki -FKNE /4.10 /ml7 w 100 ml porcjach roztwarza i roz¬ drabnia sie za pomoca ultradzwieków (Soniprep 150: amplituda 4, srednia czestotliwosc) w ciagu 1 minuty. Brzeczke komórek-FKNE wraz z dalsza porcja 4 litrów wody ogrzewa sie w podgrzewaczu przeplywowym do temperatury 80°C i po uplywie 10 minut ponownie chlodzi sie do temperatury 10°C. Denaturowane proteiny i inne nierozpuszczalne fragmenty komórkowe oddziela sie droga odwirowania w wirówce Sorvall'a z rotorem przelotowym TZ-28 [20000 obro¬ tów/minute, czas przebywania 10 minutJ0 Ifestepnie wodna pozostalosc wraz z dalsza porcja 8 litrów redestylowanej, bezpirogenowej wody poddaje sie ciaglej ultrafiltracji. Ultra¬ filtrat zateza sie do objetosci 500 ml i poddaje elektrodializie. W przypadku fibroblastów, uszkodzonych przy -CO^, produkt peptydonosny wykazuje czynnosc wzmagajaca wzrost.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania biologicznie czynnego, niskosodowego, bezpirogenowego, jalo¬ wego i bezantygenowego ekstraktu calkowitego z narzadów ssaków i z hodowli komórkowych, skladajacego si*e z mieszaniny substancji biologicznie czynnych o masie czasteczkowej ponizej 10000, na drodze rozdrabniania narzadów i roztwarzania komórek, odwirowania, ultrafiltracji i elektrodializy, znamienny tym, ze material wyjsciowy, ewentualnie przecho¬ wywany rozdrabnia sie i roztwarza w warunkach o mozliwie malej ilosci zarazków lub w wa¬ runkach jalowych, nastepnie material ogrzewa sie w wymienniku ciepla w ciagu 3-10 minut do temperatury 70-90°C i w ciagu okolo 6 minut chlodzi sie do temperatury 4-10oC, a po oddzieleniu droga odwirowania produktów wytraconych usuwa sie z roztworu droga ultrafiltracji za pomoca ukladu wlókien lumenizowanych substancje o masie czasteczkowej powyzej 10OOO, zas z otrzymanego jako pozostalosc roztworu odbiera sie jony soli droga elektrodializy w temperaturze 30-4o°C.10 145 552 2# Sposób wedlug zastrz. 1f znamienny tym, ze etapy ogrzewania, oddzielania wytraconych produktów i ultrafiltracji prowadzi sie metoda ciagla* 3# Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze otrzymany ekstrakt calkowity poddaje sie dodatkowo wyjalawianiu.Substancje hydnofilowe .Substancje hydrofobowe _ czesc A czesc B Fig.1 TEST FIBROBLASTÓW 15000 r 12500 10000 75C0 h 5000 \- 2500 |a)Sledziona (cieleca) ]b)Grasica (cieleca) rh A rli rti J__CL v <* <" ^v Fig. 2145 552 TEST FIBROBLASTOW |c)Szpik kosfnyfcielecy) KJlRdzen kregowyfcielecy) !e)Surowica krwi(cieleca) rii * rfl rh rh rh r-, n r*i ii li %*f *A* TEST FIBROBLASTOW f) Krew (cieleca) rfl rfi rfi glKrew odwlókniona (cieleca) rh _CL hltozysko (owcy) rli .V A- ^- ^ ,.\. ^ Fig.A 'UlJ LaW kv Fig.5 Fig.6145 552 Fig.7 \J \k_ Fig.8 Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklad 100 egz.Cena 400 zl PL PL PL