CN108929376B - 一种胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体的洗涤方法 - Google Patents

一种胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体的洗涤方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体的洗涤方法。该方法采用中空纤维膜处理胰岛素结晶悬液或胰岛素类似物结晶悬液，将晶体洗涤、换液和结晶悬液浓缩有效结合，加强了洗涤效果，产品溶剂残留和炽灼残渣低；可实现连续自动操作，工艺过程简单，操作方便，提高了工艺稳定性和生产效率，特别适合于大规模工业化生产上的应用。

Description

一种胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体的洗涤方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体的洗涤方法，特别涉及了一种利用中空纤维膜对胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体进行洗涤的方法。
背景技术
胰岛素及其类似物是利用基因重组技术生产的一种有效用于糖尿病治疗的多肽。在利用基因重组技术生产胰岛素及其类似物的过程中，一般有需要结晶步骤，以制备结构均一、性能稳定、有利于保存的胰岛素或胰岛素类似物原料药。
在胰岛素或胰岛素类似物的结晶过程中，其母液中常含有有机溶剂，一般需要结晶及后续晶体洗涤、冻干过程中去除，有机溶剂残留将给最终产品质量带来风险；同时，由于结晶液中无机盐的存在和pH的调节，晶体洗涤不彻底将会导致盐分等残留从而影响产品的质量。另外，传统的结晶液浓缩收集多使用高速离心或简单过滤来完成，由此带来一系列的问题，如工艺放大困难、生产成本高昂、自动化程度低、操作繁琐、洗涤液去除不彻底、容易产生污染等。因此探索一种适合工业化生产的胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体洗涤及收集方法是我们面临的一大难题。
CN103709244采用易挥发、低毒性的有机溶剂在短时间内冲洗并淋洗胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体以除去毒性高的有机溶剂，然后通过干燥除去引入的有机溶剂，未对晶体进行洗涤，溶剂残留有超标的风险，且晶体收集采用抽滤的形式，不适合与放大生产。CN105753966A公开了一种通过多次结晶方法，减小了有机溶剂残留风险，但未对晶体进行洗涤，结晶母液残留不易控制，易导致乙酸或炽灼残渣超标，且对晶体进行多次无菌滤芯过滤和转移，自动化程度低、操作繁琐。CN105585628A公开了一种离心收集晶体再用水洗涤晶体的重组甘精胰岛素结晶洗涤方法，需多次离心转移物料，自动化程度低、污染风险大，且工艺放大成本高昂，不适于大规模工业化生产。
基于以上现有技术的缺陷和不足，很有必要提供一种工艺过程简单，可连续性操作，适合工业化生产的胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体的洗涤方法来控制产品的相关残留，从而得到高质量的胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体。由于结晶液浓缩与晶体洗涤处于原料药工艺末端，对设备及操作要求较高，晶体经中空纤维处理后相关质量指标尤其高分子蛋白含量、有关蛋白含量、生物活性等是否能够符合要求还需要严格控制。中空纤维膜以其独特的开放式流路结构，温和低剪切力，可以很好地满足对剪切力敏感的生物大分子以及成分较复杂的生物样品不同规模的浓缩和过滤需要，广泛用于单抗、病毒类疫苗、菌苗、多糖、核酸、中草药、生化药以及乳品饮料等各个领域。可以直接处理菌体发酵液或高密度细胞培养液等复杂料液而不堵塞流路，省去离心等繁琐的前处理步骤，较彻底的完成洗涤、换液与浓缩过程。然而目前还没有将中空纤维膜用于晶体洗涤的文献报道。
发明内容
为了解决现有胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体洗涤工艺中存在的问题，达到加强洗涤效果，减少相关残留，操作简单易于工业化生产的目的，本发明人经过大量实验，发现采用中空纤维系统对胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体进行洗涤，将晶体收集和洗涤有效结合，可以有效加强洗涤效果，提高操作的自动化程度，提高工艺稳定性，提高收率，尤其适合于放大生产。
本发明的目的是这样实现的：
一种胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体的洗涤方法，包括如下步骤：
a、膜平衡：取中空纤维膜，先用注射用水润洗平衡，再用洗涤缓冲液充分浸润平衡待用；
b、结晶液浓缩：向上述平衡后的中空纤维膜中泵入胰岛素结晶悬液或胰岛素类似物结晶悬液，浓缩10～20倍时停止，得结晶浓缩液；
c、晶体洗涤：将洗涤缓冲液泵进上述中空纤维膜，胰岛素结晶悬液或胰岛素类似物结晶悬液再次被浓缩至洗涤前体积时停止，收集胰岛素及其类似物结晶浓缩液，用适量洗涤缓冲液洗涤中空纤维膜，收集洗涤流出液，合并所得结晶浓缩液和洗涤流出液。
所述的一种胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体的洗涤方法，洗涤缓冲液为乳酸，盐酸，乙酸或柠檬酸中的一种，优选盐酸或乙酸；浓度为0.01～0.2mol/L。
所述的一种胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体的洗涤方法，步骤c中洗涤缓冲液与步骤b所得结晶浓缩液的体积比为5～10:1。
所述的一种胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体的洗涤方法，步骤a中空纤维膜压力为5～15bar，透过通量为10～30LMH；步骤b中空纤维膜压力为5～15bar，透过通量为10～30LMH；步骤c中空纤维膜压力为5～15bar，透过通量为10～30LMH。
所述的一种胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体的洗涤方法，所述中空纤维膜的材质为聚醚砜，再生纤维素，醋酸纤维素，聚砜或亲水性聚偏氟乙烯。
所述的一种胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体的洗涤方法，所述中空纤维膜的纤维管内径为0.75～2mm。
所述的一种胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体的洗涤方法，所述中空纤维膜的滤膜孔径为750k，0.1μm，0.2μm或0.45μm。
本发明洗涤缓冲液的pH随待洗涤蛋白样品的等电点不同而不同，一般应接近蛋白等电点以减少样品的溶解损失。对于重组甘精胰岛素晶体，洗涤液pH值优选6.5～7.5；对于重组人胰岛素晶体，洗涤液pH值优选4.5～6.0。洗涤缓冲液pH调节所用溶液采用本领域常规的酸或碱的水溶液，如盐酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、氢氧化钠、氨水、氢氧化钾等。优选地，为盐酸或氨水溶液。
另外，本发明步骤c晶体洗涤过程可根据需要重复操作。洗涤结束后将收集的结晶浓缩液和洗涤流出液用高速冷冻离心机离心，离心后将晶体放入冻干机中冻干即得胰岛素冻干粉或胰岛素类似物冻干粉。
本发明与现有技术相比具有如下优点和显著的进步：
本发明采用中空纤维膜系统对胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体洗涤和浓缩，较方便彻底地完成换液与浓缩，省去多次离心或过滤、挖料等繁琐的步骤。本发明的晶体洗涤方法可实现连续自动操作，工艺过程简单，操作时间短，操作方便，提高了生产效率。洗涤效果好，收率高，溶剂残留和炽灼残渣低，工艺放大简单易行且成本低，特别适合于大规模工业化生产上的应用。
具体实施方式
现通过以下实施例来进一步描述本发明的有益效果，实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围，同时，本领域技术人员根据本发明所作的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围内。
以下大肠杆菌表达重组人胰岛素晶体和大肠杆菌表达重组甘精胰岛素晶体由以下方法制备：将用反相层析等方法制备的重组人胰岛素或重组甘精胰岛素层析液，加注射用水适当稀释，调节pH至接近等电点后加入处方量的锌，控温析晶12h以上，得大肠杆菌表达重组人胰岛素结晶悬液或大肠杆菌表达重组甘精胰岛素结晶悬液。
实施例1大肠杆菌表达重组人胰岛素晶体(0.2公斤)的洗涤
中空纤维膜(聚醚砜材质，纤维管内径为1mm，滤膜孔径为0.1μm)先用注射用水润洗平衡，调整进水流速使过膜压力为15bar，透过通量为30LMH。用3L洗涤缓冲液(0.15mol/L盐酸用氨水调pH5.5)充分浸润中空纤维膜，将60L含0.2公斤大肠杆菌表达重组人胰岛素的结晶液(含17％乙腈，1.1％异丙醇)搅拌使成悬浮液，泵进中空纤维膜，使过膜压力为5bar，透过通量为10LMH，结晶液悬液被浓缩至约4L时停止。将20L洗涤缓冲液(0.15mol/L盐酸用氨水调pH5.5)泵入中空纤维膜，使过膜压力为5bar，透过通量为10LMH，维持泵入的速度和透过通量相同，结晶液悬液再次被浓缩至约4L时停止，收集结晶浓缩液，用0.5L洗涤缓冲液洗涤中空纤维膜，收集洗涤流出液，合并结晶浓缩液和洗涤流出液，用高速冷冻离心机离心后放入冻干机中冻干，即得重组人胰岛素冻干粉。
对比实施例1大肠杆菌表达重组人胰岛素晶体(0.2公斤)的洗涤
取60L含0.2公斤大肠杆菌表达重组人胰岛素的结晶液(含17％乙腈，1.1％异丙醇)，用高速冷冻离心机离心，离心完毕倾倒上清，向离心杯中加入结晶液继续离心，重复操作至所有结晶液离心完毕。将晶体用10L洗涤缓冲液(0.15mol/L盐酸用氨水调pH5.5)搅拌洗涤半小时，洗涤完毕用高速冷冻离心机离心收集沉淀。重复操作将晶体再洗涤一次。将沉淀放入冻干机中冻干得重组人胰岛素冻干粉。
对获得的重组人胰岛素晶体冻干产品进行各项指标检测。其中的乙腈、异丙醇溶剂残留参照《中国药典》2015年版第四部通则0861测定；炽灼残渣、高分子蛋白、生物活性检测均参照《中国药典》2015年版二部“重组人胰岛素”项下的各方法检测；结果见表1。
表1重组人胰岛素冻干粉中各项指标检测结果
Figure BDA0001301671040000041
对比实施例1和对比实施例1的两种洗涤浓缩方式，实施例1中空纤维膜处理后产品的有机溶剂残留和炽灼残渣均好于对比实施例1离心方式处理的样品，生物活性和高分子含量等未见有明显差别。但用中空纤维膜处理，时间由约8h缩短至约4h，收率相当，料液几乎在全封闭条件下处理，避免反复挖料及频繁的物料转移，保证了产品质量及工艺稳定性。
实施例2大肠杆菌表达重组人胰岛素晶体(1公斤)的洗涤
中空纤维膜(聚砜材质，纤维管内径为1.75mm，滤膜孔径为0.2μm)先用注射用水润洗平衡，调整进水流速使过膜压力为15bar，透过通量为20LMH。用5L洗涤缓冲液(0.1mol/L乳酸用氨水调pH5.0)充分浸润中空纤维膜，将300L含1.0公斤大肠杆菌表达重组人胰岛素结晶液(含15％乙醇，1.0％乙酸)搅拌使成悬浮液，泵进中空纤维系统，使过膜压力为5bar，透过通量为10LMH，结晶液悬液被浓缩至约20L时停止。将200L洗涤缓冲液(0.1mol/L乳酸用氨水调pH5.0)泵入中空纤维系统，使过膜压力为10bar，透过通量为10LMH，维持泵入的速度和透过通量相同，结晶液悬液再次被浓缩至约20L时停止，收集结晶浓缩液，用3L洗涤缓冲液洗涤中空纤维膜，收集洗涤流出液。合并结晶浓缩液和洗涤流出液，用高速冷冻离心机离心，收集沉淀，放入冻干机中冻干，即得重组人胰岛素冻干粉。
对获得的重组人胰岛素晶体冻干产品中各项指标进行检测。其中的乙醇、乙酸溶剂残留参照《中国药典》2015年版第四部通则0861测定；炽灼残渣、高分子蛋白、生物活性检测方法同实施例1；结果见表2。
表2重组人胰岛素冻干粉中各项指标检测结果
Figure BDA0001301671040000051
实施例3大肠杆菌表达重组甘精胰岛素晶体(0.2公斤)的洗涤
中空纤维膜(再生纤维素材质，纤维管内径为1mm，滤膜孔径为0.1μm)先用注射用水润洗平衡，调整进水流速使过膜压力为15bar，透过通量为30LMH。用3L洗涤缓冲液(0.2mol/L柠檬酸用氢氧化钠溶液调pH7.0)充分浸润中空纤维膜，将50L含0.2公斤大肠杆菌表达重组甘精胰岛素结晶液(含16.5％乙醇，0.9％异丙醇)搅拌使成悬浮液，泵进中空纤维系统，使过膜压力为5bar，透过通量为10LMH，结晶液悬液被浓缩至约5L时停止。将30L洗涤缓冲液(0.2mol/L柠檬酸用氢氧化钠溶液调pH7.0)泵入中空纤维系统，使过膜压力为5bar，透过通量为10LMH，维持泵入的速度和透过通量相同，结晶液悬液再次被浓缩至约5L时停止，收集结晶液浓缩液，用0.5L洗涤缓冲液洗涤中空纤维膜，收集洗涤流出液。合并结晶浓缩液和洗涤流出液，用高速冷冻离心机离心，收集沉淀，放入冻干机中冻干，即得重组甘精胰岛素冻干粉。
对获得的重组甘精胰岛素晶体冻干产品进行各项指标检测。其中的异丙醇、乙醇溶剂残留参照《中国药典》2015年版第四部通则0861测定；炽灼残渣参照《中国药典》2015年版第四部通则0841测定；高分子蛋白和总有关蛋白参照《药物分析杂志》，2006，26(9):1192-1194测定；结果见表3。
表3重组甘精胰岛素冻干粉中各项指标检测结果
Figure BDA0001301671040000061
实施例4大肠杆菌表达重组甘精胰岛素晶体(1公斤)的洗涤
中空纤维膜(醋酸纤维素材质，纤维管内径为1.75mm，滤膜孔径为0.2μm)先用注射用水润洗平衡，调整进水流速使过膜压力为5bar，透过通量为20LMH。用5L洗涤缓冲液(0.05mol/L盐酸用氢氧化钠溶液调pH6.5)充分浸润中空纤维膜，将250L含1.0公斤大肠杆菌表达重组甘精胰岛素结晶液(含15.4％乙腈，0.8％异丙醇)搅拌使成悬浮液，泵进中空纤维系统，使过膜压力为5bar，透过通量为10LMH，结晶液悬液被浓缩至约25L时停止。将150L洗涤缓冲液(0.05mol/L盐酸用氢氧化钠溶液调pH6.5)泵入中空纤维系统，使过膜压力为10bar，透过通量为15LMH，维持泵入的速度和透过通量相同，结晶液悬液再次被浓缩至约25L时停止，收集结晶液浓缩液，用3L洗涤缓冲液洗涤中空纤维膜，并收集洗涤流出液。合并结晶浓缩液和洗涤流出液，用高速冷冻离心机离心，收集沉淀，放入冻干机中冻干，即得重组甘精胰岛素冻干粉。
对获得的重组甘精胰岛素晶体冻干产品进行各项指标检测。其中的乙腈、异丙醇溶剂残留参照《中国药典》2015年版第四部通则0861测定；炽灼残渣、高分子蛋白、总有关蛋白检测方法同实施例3；结果见表4。
表4重组甘精胰岛素冻干粉中各项指标检测结果
Figure BDA0001301671040000062
实施例5大肠杆菌表达重组甘精胰岛素晶体(1公斤)的洗涤
中空纤维膜(聚砜材质，纤维管内径为1.75mm，滤膜孔径为0.2μm)先用注射用水润洗平衡，调整进水流速使过膜压力为5bar，透过通量为20LMH。用5L洗涤缓冲液(0.1mol/L乙酸用氨水调pH7.5)充分浸润中空纤维膜，将400L含1.0公斤大肠杆菌表达重组甘精胰岛素结晶液(含10％乙醇，0.5％乙酸)搅拌使成悬浮液，泵进中空纤维系统，使过膜压力为5bar，透过通量为10LMH，结晶液悬液被浓缩约20L停止。将160L洗涤缓冲液(0.1mol/L乙酸用氨水调pH7.5)泵入中空纤维系统，使过膜压力为5bar，透过通量为10LMH，维持泵入的速度和透过通量相同，结晶液悬液再次被浓缩至约20L时停止，收集结晶浓缩液，用3L洗涤缓冲液洗涤中空纤维膜，收集洗涤流出液。合并结晶浓缩液和洗涤流出液，用高速冷冻离心机离心，收集沉淀，放入冻干机中冻干，即得重组甘精胰岛素冻干粉。
对获得的重组甘精胰岛素晶体冻干产品进行各项指标检测。其中乙酸、乙醇溶剂残留参照《中国药典》2015年版第四部通则0861测定；炽灼残渣、高分子蛋白、总有关蛋白、检测方法同实施例3；结果见表5。
表5重组甘精胰岛素冻干粉中各项指标检测结果
Figure BDA0001301671040000071
实施例6大肠杆菌表达重组甘精胰岛素晶体(1公斤)的洗涤
中空纤维膜(聚砜材质，纤维管内径为1mm，滤膜孔径为0.1μm)先用注射用水润洗平衡，调整进水流速使过膜压力为5bar，透过通量为20LMH。用5L洗涤缓冲液(0.05mol/L磷酸用氢氧化钠溶液调pH6.5)充分浸润中空纤维膜，将400L含1.0公斤大肠杆菌表达重组甘精胰岛素结晶液(含10％乙醇，0.5％乙酸)搅拌使成悬浮液，泵进中空纤维系统，使过膜压力为5bar，透过通量为10LMH，结晶液悬液被浓缩约20L停止。将160L洗涤缓冲液(0.05mol/L磷酸用氢氧化钠溶液调pH6.5)泵入中空纤维系统，使过膜压力为5bar，透过通量为10LMH，维持泵入的速度和透过通量相同，结晶液悬液再次被浓缩至约20L时停止，收集结晶浓缩液，用3L洗涤缓冲液洗涤中空纤维膜，收集洗涤流出液。合并结晶浓缩液和洗涤流出液，用高速冷冻离心机离心，收集沉淀，放入冻干机中冻干，即得重组甘精胰岛素冻干粉。
对获得的重组甘精胰岛素晶体冻干产品进行各项指标检测。其中乙酸、乙醇溶剂残留参照《中国药典》2015年版第四部通则0861测定；炽灼残渣、高分子蛋白、总有关蛋白、检测方法同实施例3；结果见表6。
表6重组甘精胰岛素冻干粉中各项指标检测结果
Figure BDA0001301671040000072
实施例7大肠杆菌表达重组人胰岛素晶体(1公斤)的洗涤
中空纤维膜(聚醚砜材质，纤维管内径为2mm，滤膜孔径为0.2μm)先用注射用水润洗平衡，调整进水流速使过膜压力为15bar，透过通量为20LMH。用5L洗涤液(乙醇)充分浸润中空纤维膜，将300L含1.0公斤大肠杆菌表达重组人胰岛素结晶液(含15％乙醇，1.0％乙酸)搅拌使成悬浮液，泵进中空纤维系统，使过膜压力为5bar，透过通量为10LMH，结晶液悬液被浓缩至约20L时停止。将200L洗涤液(乙醇)泵入中空纤维系统，使过膜压力为10bar，透过通量为10LMH，维持泵入的速度和透过通量相同，结晶液悬液再次被浓缩至约20L时停止，收集结晶浓缩液，用3L洗涤液洗涤中空纤维膜，收集洗涤流出液。合并结晶浓缩液和洗涤流出液，用高速冷冻离心机离心，收集沉淀，放入冻干机中冻干，即得重组人胰岛素冻干粉。
对获得的重组人胰岛素晶体冻干产品中各项指标进行检测。其中的乙醇、乙酸溶剂残留参照《中国药典》2015年版第四部通则0861测定；炽灼残渣、高分子蛋白、生物活性检测方法同实施例1；结果见表7。
表7重组人胰岛素冻干粉中各项指标检测结果
Figure BDA0001301671040000081
由以上结果可以看出，本发明所述的技术方案对重组人胰岛素晶体和重组甘精胰岛素晶体洗涤后有机溶剂残留少，炽灼残渣低，洗涤效果良好。经试验证明，本技术方案对于其他胰岛素类似物晶体洗涤也具有很好的效果。

Claims (5)

1.一种胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体的洗涤方法，其特征在于包括如下步骤：
a、膜平衡：取中空纤维膜，先用注射用水润洗平衡，再用洗涤缓冲液充分浸润平衡待用；
b、结晶液浓缩：向上述平衡后的中空纤维膜中泵入胰岛素结晶悬液或胰岛素类似物结晶悬液，浓缩10～20倍时停止，得结晶浓缩液；
c、晶体洗涤：将洗涤缓冲液泵入上述中空纤维膜，胰岛素结晶悬液或胰岛素类似物结晶悬液再次被浓缩至洗涤前体积时停止，收集胰岛素或胰岛素类似物结晶浓缩液，用适量洗涤缓冲液洗涤中空纤维膜，收集洗涤流出液，合并所得结晶浓缩液和洗涤流出液；
其中所述洗涤缓冲液为乳酸、盐酸、乙酸或柠檬酸中的一种；所述洗涤缓冲液浓度为0.01～0.2mol/L；步骤c中洗涤缓冲液与步骤b所得结晶浓缩液的体积比为5～10：1；步骤a中空纤维膜压力为5～15bar，透过通量为10～30LMH；步骤b中空纤维膜压力为5～15bar，透过通量为10～30LMH；步骤c中空纤维膜压力为5～15bar，透过通量为10～30LMH。
2.根据权利要求1所述的一种胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体的洗涤方法，其特征在于洗涤缓冲液为盐酸或乙酸。
3.根据权利要求1所述的一种胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体的洗涤方法，其特征在于所述中空纤维膜的材质为聚醚砜，再生纤维素，醋酸纤维素，聚砜或亲水性聚偏氟乙烯。
4.根据权利要求1所述的一种胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体的洗涤方法，其特征在于所述中空纤维膜的纤维管内径为0.75～2mm。
5.根据权利要求1所述的一种胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体的洗涤方法，其特征在于所述中空纤维膜的滤膜孔径为750K，0.1μm，0.2μm或0.45μm。
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